背景

病毒性出血熱(vhf)指與由屬于以下四種不同的有包膜、反義、單鏈rna病毒科之一的病毒引起的發(fā)熱和出血素質(zhì)(bleedingdiathesis)相關(guān)的臨床疾患：絲狀病毒科，布尼亞病毒科，黃病毒科和沙粒病毒科。這四個科中的很多病毒在a類別生物威脅列表上，因為它們可導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率，并且是氣溶膠傳播高度傳染性的[1]。這些病毒引起類似的疾病譜，具有相似的潛在病理生理學(xué)[2、3]。在4-10天的潛伏期后，患有vhf的患者突然發(fā)展為發(fā)熱，伴有突出的持續(xù)性癥狀，諸如虛脫、脫水、肌痛和全身不適。隨著疾病的進(jìn)展，患者發(fā)展出臨床出血征象，諸如瘀點(diǎn)狀出血、斑狀丘疹，伴有凝結(jié)障礙。在疾病的終末階段期間，致死病例發(fā)展為彌漫性血管內(nèi)凝血(dic)、嚴(yán)重出血、低血壓、多器官衰竭和休克。

患有嚴(yán)重vhf的患者通常死于終末臨床病程，所述終末臨床病程通常與也稱為膿毒癥的全身炎癥反應(yīng)綜合征(sirs)無法區(qū)分，所述全身炎癥反應(yīng)綜合征是嚴(yán)重細(xì)菌和病毒感染的常見后遺癥。一些vhf病毒特別容易引起sirs；它們包括絲狀病毒科中的埃博拉病毒(ebov)和馬爾堡病毒(marv)、布尼亞病毒科中的裂谷熱病毒(rvfv)和漢坦病毒、以及黃病毒科中的登革病毒[4、5]。

概述

本文描述了用于通過施用大腸桿菌素多肽治療全身炎癥反應(yīng)綜合征或病毒性出血熱的方法。

本文描述了一種多肽，所述多肽包含seqidno：2-9和11-18中任一個的氨基酸序列。還描述了以下：一種多肽，所述多肽包含前面是甲硫氨酸的seqidno：11-18中任一個的氨基酸序列；一種多肽，所述多肽包含seqidno:11-18中任一個的具有至多5個單氨基酸改變或缺失的氨基酸序列，條件是該多肽不包含seqidno:10的氨基酸序列；一種多肽，所述多肽具有至多4個單氨基酸改變，條件是該多肽不包含seqidno：10的氨基酸序列；一種多肽，所述多肽具有至多3個單氨基酸改變，條件是該多肽不包含seqidno：10的氨基酸序列；一種多肽，所述多肽具有至多2個單氨基酸改變，條件是該多肽不包含seqidno：10的氨基酸序列；一種多肽，所述多肽具有不超過1個氨基酸改變，條件是該多肽不包含seqidno：10的氨基酸序列；一種多肽，所述多肽包含seqidno：2-9和11-18中任一個的具有至多5個單氨基酸改變或缺失的氨基酸序列，條件是該多肽不包含seqidno：1或10的氨基酸序列；一種多肽，所述多肽具有至多4個單氨基酸改變，條件是該多肽不包含seqidno：1或10的氨基酸序列；一種多肽，所述多肽具有至多3個單氨基酸改變，條件是該多肽不包含seqidno：1或10的氨基酸序列；一種多肽，所述多肽具有至多2個單氨基酸改變，條件是該多肽不包含seqidno：1或10的氨基酸序列；一種多肽，所述多肽具有不超過1個氨基酸改變，條件是該多肽不包含seqidno：1或10的氨基酸序列；以及前面是甲硫氨酸的任何此類多肽。

還描述了包含本文描述的多肽和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。還公開了用于治療被導(dǎo)致病毒性出血熱的微生物感染的患者的方法，該方法包括施用本文描述的藥物組合物或多肽。在多種實施方案中，患者被來自選自由以下組成的組的科的病毒感染：絲狀病毒科、布尼亞病毒科、黃病毒科和沙粒病毒科；并且患者被選自埃博拉病毒(ebov)、馬爾堡病毒(marv)、裂谷熱病毒(rvfv)、漢坦病毒和登革熱病毒的病毒感染。

還描述了包含編碼本文描述的多肽的序列的核酸分子以及還包含可操作地連接至編碼多肽的序列的表達(dá)調(diào)控序列的此類核酸分子。還描述了包含本文描述的核酸分子的重組細(xì)胞和產(chǎn)生多肽的方法，所述方法包括在適于表達(dá)編碼的多肽的條件下培養(yǎng)本文描述的重組細(xì)胞，和從重組細(xì)胞分離所編碼的多肽。

在以下的附圖和說明中闡述了本發(fā)明的一種或更多種實施方案的細(xì)節(jié)。本發(fā)明的其他特征、目標(biāo)和優(yōu)勢將由說明書和附圖，以及由權(quán)利要求而明顯。

附圖

圖1a-b.nb109和nb101對人血液體外凝結(jié)的影響。將遞增濃度的nb109和nb101在37℃與人血漿樣品一起預(yù)孵育持續(xù)15min。(a)pt測定和(b)aptt測定利用acl100自動凝血計使用標(biāo)準(zhǔn)試劑進(jìn)行。凝固時間的延長計算為(候選處理樣品中的值)/(對照樣品中的值)，并對藥物濃度作圖。pt和aptt的分別為對照的1.2倍和1.5倍的凝固時間用虛線表示。誤差線表示sem，n＝來自3個不同供體的3種血漿。

圖2.nb101和nb109在小鼠內(nèi)毒素血癥模型中的作用。使balb/c雌性小鼠(n＝5)經(jīng)歷兩次注射脂多糖(lps)作為dic的模型。在t＝0小時，將5μg/小鼠先導(dǎo)劑量的lps注射到足墊中，然后24小時后是400μg/小鼠的腹膜內(nèi)誘發(fā)劑量。在誘發(fā)前1小時施用nb101、nb109或pbs。按小時監(jiān)測小鼠的存活，持續(xù)直至誘發(fā)后70小時。利用graphpadprism4.2通過kaplan-meierlogrank測試來評價存活曲線中的統(tǒng)計學(xué)差異。星號表示nb101和pbs之間以及nb142和pbs之間的顯著差異^*p<0.05，^***p<0.0001。

圖3.在clp模型中，nb109對動物存活的影響。對小鼠進(jìn)行clp外科手術(shù)。在clp前18小時皮下給予nb109處理(預(yù)荷載)，并且接著每日兩次。第2組接受60mg/kgnb109用于預(yù)荷載，并且接著40mg/kg。第3組接受30mg/kgnb109用于預(yù)荷載，并且接著20mg/kg。通過皮下注射進(jìn)行液體復(fù)蘇，每日1ml持續(xù)5天。每12小時觀察存活。

圖4a-b.nb101和nb109在豚鼠中的ebov感染中的作用。在第0天，通過皮下注射1000pfu的ebov來感染品系13豚鼠(n＝2)。通過i.p.注射施用化合物先導(dǎo)(compoundleads)，從感染后24小時開始，每天一次，持續(xù)7天。每天監(jiān)測存活和體重。利用graphpadprism4.2通過kaplan-meierlogrank測試評價生存曲線中的統(tǒng)計學(xué)差異(^*p<0.05)。

圖5.用nb109處理的小鼠中的凝結(jié)參數(shù)。給予單i.p.劑量的nb109的balb/c小鼠。在給藥后4、8和24小時，分析pt和aptt。在每個時間點(diǎn)展示了來自每組3-4只小鼠的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。^*：單數(shù)據(jù)點(diǎn)。^**:>180秒。

圖6.在經(jīng)由不同遞送途徑的小鼠中的nb-109血漿濃度。通過靜脈內(nèi)注射(i.v.)、腹膜內(nèi)注射(i.p.)和皮下注射(s.c.),以72mg/kg向小鼠(n＝3)施用nb109。在不同的時間點(diǎn)獲取血液樣品。數(shù)據(jù)以平均值±sd顯示。

圖7.單劑量施用后，豚鼠中的nb109的血漿濃度和凝固參數(shù)。平均值±sd，n＝3

圖8.單劑量施用后，豚鼠中的nb109的血漿濃度和凝固參數(shù)在每次給藥后24小時和最后一次給藥后96小時收集的血液樣品。平均值±sd，n＝3。

圖9.在小鼠lps模型中的作用。在t＝0小時，balb/c小鼠(n＝10)接受注射到足墊中的40μg先導(dǎo)劑量的lps，然后24小時后是400μg的腹膜內(nèi)(i.p.)誘發(fā)劑量的lps。在誘發(fā)劑量之前1小時，用經(jīng)i.p遞送的45mg/kgnb101、nb109或nb142處理小鼠。在誘發(fā)后2、4和6小時，從動物取血以獲得血漿細(xì)胞因子水平。利用graphpadprism4.2通過kaplan-meierlogrank測試來評價存活曲線中的統(tǒng)計學(xué)差異。星號表示nb101和pbs之間以及nb142和pbs之間的顯著差異^*p<0.05，^***p<0.0001。

圖10a-c.在聚(i:c)攻擊的小鼠中，nb109和nb142對動物存活的影響。將10周齡的雌性balb/c小鼠隨機(jī)分成媒介物組和藥物處理組(n＝6)。從第0天到第3天，i.p.施用200μg的聚(i:c)(聚肌苷酸:聚胞苷酸),每天兩次。如圖中所示，在第0天、第1天或第2天開始,以45mg/kg/天i.p.給予nb109或nb142處理，每天一次。

圖11.在聚(i:c)攻擊的小鼠中，nb101、nb109和nb142對細(xì)胞因子和d-二聚體的影響。在聚(i:c)攻擊之前1小時，對balb/ci.p.注射45mg/kgnb101、nb109、nb142或媒介物。在0時刻(t＝0hr)，每只小鼠注射200μg聚(i:c)或pbs。

圖12.nb142和nb109在豚鼠中的ebov感染中的作用。在第0天，通過皮下注射1000pfu的ebov感染品系13豚鼠(n＝3)。通過i.p.注射施用先導(dǎo)化合物，從感染后24小時開始每天一次持續(xù)7天。每天監(jiān)測存活和體重。利用graphpadprism4.2通過kaplan-meierlogrank測試評價生存曲線中的統(tǒng)計學(xué)差異(*p<0.05)。

圖13.候選物的藥效動力學(xué)。

使balb/c雌性小鼠(n＝15)經(jīng)歷兩次lps注射。在t＝0小時，將5μg/小鼠先導(dǎo)劑量的lps注射到足墊中，然后24小時后是400μg/小鼠的腹膜內(nèi)誘發(fā)劑量。在誘發(fā)前1小時，施用單劑量的45mg/kg的nb101、nb109或nb142或者pbs。在所示出的處理后時間點(diǎn)，進(jìn)行aptt&pt測量。

圖14.nb109生產(chǎn)工藝流程圖。

詳細(xì)說明

下文描述了對野生型大腸桿菌素(nb101；seqidno：1)和大腸桿菌素變體(nb109；seqidno：2)的研究。nb109在所謂的反應(yīng)性中心環(huán)(“rcl”；氨基酸82-88；突變的氨基酸數(shù)涉及缺少前20個氨基酸(mktilpavlfaafattsawa；seqidno:19)的成熟大腸桿菌素序列即seqidno:1，如seqidno：10所示)的p1位置處的一個氨基酸殘基上與大腸桿菌素不同，m84r。

nb101是靶向絲氨酸彈性蛋白酶(也被稱為中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(ne)或粒細(xì)胞彈性蛋白酶(ge))凝血因子(xa、xiia、viia)和激肽釋放酶(表1)的廣譜蛋白酶抑制劑。除了nb101的經(jīng)由ne抑制的潛在抗炎功能之外，其還直接靶向“sirs三角(sirstriangle)”中的兩個組分：凝血因子和激肽釋放酶。但是，nb101不抑制纖維蛋白溶解。因此，對rcl的p1位置處的所有可能的點(diǎn)突變進(jìn)行篩選，得到nb109。不同于nb101，nb109抑制纖維蛋白溶酶和凝血酶。結(jié)果，它直接靶向“sirs三角”中的所有三個組分。

表1.nb101和nb109的抑制常數(shù)ki(nm)^*

nb109與大腸桿菌素共有化學(xué)和物理性質(zhì)。nb109具有相當(dāng)數(shù)目的帶負(fù)電荷的殘基(asp+glu)和帶正電荷的殘基(arg+lys)，并且計算出的pi為6.85[61]。一個單位的化合物活性被定義為在標(biāo)準(zhǔn)測定條件下抑制50％胰蛋白酶所需化合物的量。根據(jù)該定義，nb109具有1x10⁵單位/mg的比活度，這與nb101相等。

在人血漿中的抗凝結(jié)活性

測試nb101和nb109以確定其抑制血液凝結(jié)的能力，特別是其經(jīng)由抑制炎癥和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)抑制內(nèi)源性血液凝結(jié)途徑的能力。通過進(jìn)行pt測定(凝血酶原時間；外源性凝結(jié)途徑)和aptt測定(部分激活促凝血酶原激酶時間；內(nèi)源性凝結(jié)途徑)，針對人血液體外凝結(jié)測試這些劑。兩種分子均表現(xiàn)出強(qiáng)有力的劑量依賴性抗凝結(jié)作用，并且可能是由于nb109抵抗凝血酶的活性，其效力比nb101強(qiáng)約2倍(圖1)。另外，nb109和nb101兩者均展示出對內(nèi)源性凝結(jié)途徑(如通過aptt測量的)比對外源性途徑(通過pt測量的)更強(qiáng)的抑制(大約兩倍)(圖1)。

重要的是要注意，pt和aptt升高是候選物的預(yù)期藥理作用。pt或aptt升高自身并不意味著自發(fā)性出血是不利影響。自發(fā)性出血傾向與未受抑制的纖維蛋白溶解和增加的血管通透性有關(guān)[62]。nb101和nb109可具有降低的自發(fā)性出血風(fēng)險，因為它們抑制血管高滲透性或血管高滲性和纖維蛋白溶解兩者。

抵抗sirs的體內(nèi)效果

在小鼠內(nèi)毒素血癥模型中測試nb101和nb109，所述模型是由相距24小時施用的兩次連續(xù)全身性內(nèi)毒素(lps)暴露引起的致死性休克模型。病理生理學(xué)上，該模型的特征在于炎癥、出血、組織壞死和dic[63]。

所有的媒介物處理的小鼠都在lps攻擊的一天內(nèi)快速死亡，但用nb101和nb109處理具有顯著的存活益處(圖2)。在該研究中，nb101和nb109都以類似的方式增加了動物的存活，并且它們均很有利地與目前的標(biāo)準(zhǔn)抗-dic處理，低分子量肝素(lmwh)進(jìn)行了比較。在lps誘發(fā)前兩次給予lmwh只將被處理的小鼠的30小時存活提高25％(在處理組中50％存活以及在對照組中25％存活)[64]。

盲腸結(jié)扎和穿刺(clp)是sirs的另一種常用動物模型。在clp模型中，sirs由腸損傷并被通常存在于腸中的多種細(xì)菌感染之后的腹膜炎產(chǎn)生。它被認(rèn)為更好地模擬了膿毒癥的自然成因[65]。在初步研究中，nb109在clp模型中獲得了顯著(p<0.005)的存活優(yōu)勢(圖3)。

抵抗vhf的體內(nèi)效果

在用ebov的扎伊爾(zaire)毒株感染的豚鼠中評價nb101和nb109。媒介物處理的動物總是到第9天時死亡。nb101和nb109處理在感染后24小時開始，并通過腹膜內(nèi)注射給予,一天一次，持續(xù)7天。雖然nb101不影響動物存活或體重減輕，但nb109達(dá)到了50％存活，并拯救存活動物免于致死性體重減輕(圖4)。該結(jié)果提供了概念驗證?？偠灾?，體外和體內(nèi)結(jié)果表明nb109和nb101是作為抗sirs和抗vhf化合物和藥物制劑的潛在的有效候選物。

安全&pk研究-對原代細(xì)胞的影響

將高達(dá)250μm的nb109與包括原代人腎近端小管細(xì)胞、腎皮質(zhì)上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞或肝細(xì)胞在內(nèi)的人原代細(xì)胞以及細(xì)胞系a549和beas-2b的集合一起孵育。在4天的孵育內(nèi)，利用mts測定評價細(xì)胞毒性。

nb109不引起細(xì)胞毒性，并且對細(xì)胞的成活力無影響。

對溶血的影響

檢查nb109的經(jīng)由補(bǔ)體的活化的間接溶血或直接溶血。作為補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血的陽性對照，使用針對紅細(xì)胞(rbc)的物種特異性抗體以活化經(jīng)典補(bǔ)體途徑并引發(fā)信號級聯(lián)，導(dǎo)致rbc的裂解。為了評價nb109的直接溶血活性，洗滌rbc以去除任何補(bǔ)體蛋白，并且然后用含有nb109的熱滅活的血漿或血清重懸。在人血液中，高達(dá)1mg/ml的濃度的nb109不誘發(fā)溶血反應(yīng)，不誘發(fā)直接的溶血反應(yīng)也不誘發(fā)補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血反應(yīng)。

在小鼠中nb109處理的系統(tǒng)安全性

在5組16只balb/c小鼠中評價在小鼠中nb109系統(tǒng)性處理的安全性和耐受性。四組中的每組分別接受5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg和90mg/kg的nb109的一次腹腔內(nèi)注射；第五組接受pbs。在給藥后4小時和24小時處死小鼠，并進(jìn)行尸檢、凝結(jié)分析和臨床化學(xué)。

尸檢后，所有動物似乎都是正常的而沒有出血跡象。如預(yù)期的，凝結(jié)參數(shù)以劑量依賴性方式受影響；該效應(yīng)在治療后4小時達(dá)到峰值，并在處理后24小時前恢復(fù)到基線(圖5)，這表明nb109在24小時內(nèi)從血液清除。與在人血液中觀察到的一致，aptt對nb109更敏感，并且在5mg/kg觀察到效果，而pt直到15mg/kg不受影響。pt在aptt恢復(fù)到基線水平之前恢復(fù)到基線水平。應(yīng)該注意的是，pt和aptt的升高是藥理作用，并且不被認(rèn)為是不利影響。

在豚鼠中的重復(fù)劑量毒性研究

通過腹膜內(nèi)施用以0.1mg/kg/天、0.5mg/kg/天、1.5mg/kg/天和5mg/kg/天的劑量對hartley豚鼠給予nb109，持續(xù)7天。安全性參數(shù)包括臨床跡象、血清化學(xué)、凝結(jié)時間和尸檢。

所有動物經(jīng)nb109處理而存活，并且貫穿該研究進(jìn)程，nb109處理的動物的所有臨床觀察都是正常的。在組間體重變化方面不存在顯著差異，并且所有組都顯示出顯著的體重增加(到研究結(jié)束時19-23％)。所有nb109處理的動物的尸檢都不顯著。

在≥1.5mg/kg時，在第2天，存在肌酸磷酸激酶(cpk)的輕微且瞬時的升高趨勢，但該值到第7天時恢復(fù)到正常范圍。在≥1.5mg/kg時，在第14天，觀察到ast的輕微升高，但其他肝酶和膽紅素是正常的。所有其他臨床實驗室參數(shù)都在正常范圍內(nèi)。在1.5mg/kg和低于1.5mg/kg的劑量，未觀察到凝結(jié)參數(shù)的改變(注意豚鼠具有降低的fvii水平，因此具有比其他物種長的pt)。在5.0mg/kg時，從第一次給藥后8小時開始觀察到升高的pt和aptt值，并繼續(xù)到在第7天的最后一次給藥后8小時。所有pt和aptt值到第14天時恢復(fù)正常。

初步藥代動力學(xué)分析

在其中通過不同途徑施用nb109的小鼠中進(jìn)行初步藥代動力學(xué)(pk)研究。數(shù)據(jù)在圖6中示出。相對于ip或sc注射，用iv施用的初始血漿濃度要高得多。腹膜內(nèi)注射導(dǎo)致比通過sc注射注射相同劑量顯著更高的濃度，意味著通過sc途徑的nb109的生物利用度將不太理想。鑒于iv施用的血漿濃度數(shù)據(jù)的變化，提供pk暴露的任何估量是不可能的。然而，ip途徑的血漿濃度適用于藥代動力學(xué)建模(winnonlin軟件，cary，nc)。通過ip途徑的nb109的消除半衰期(t^1/2)為7.6小時。

在豚鼠中進(jìn)行nb109的研究，以評價單劑量施用和重復(fù)劑量施用后血漿藥物濃度和血液凝結(jié)參數(shù)之間的關(guān)系。將nb109以5mg/kg的劑量iv施用至hartley豚鼠(n＝3)。在單劑量iv后，nb109的血漿水平和延長的aptt之間存在極佳的相關(guān)性(圖7)。雖然aptt密切反映了到注射后8小時時幾乎恢復(fù)到背景水平的血漿藥物水平，但pt在該時間點(diǎn)維持延長。

再次以每天5mg/kg的劑量進(jìn)行重復(fù)給藥，持續(xù)5天。血漿藥物水平在第3次給藥后似乎略有增加，但數(shù)據(jù)的變化使得難以確定對于藥物累積的任何結(jié)論(圖8)。血液凝結(jié)參數(shù)與血漿nb109之間具有很好的相關(guān)性。到第7天(給藥后96小時)時，所有參數(shù)都恢復(fù)到基線。

其他大腸桿菌素變體

開發(fā)并測試了表2中所示的構(gòu)建體并在下文進(jìn)一步的描述。在表3中，構(gòu)建體的氨基酸序列顯示為seqidno.1-9。

表2.肽的抑制常數(shù)ki(nm)*

表3.具有前導(dǎo)序列的初級和優(yōu)化的先導(dǎo)候選物的氨基酸序列

表4.無前導(dǎo)序列的初級和優(yōu)化的先導(dǎo)候選物的氨基酸序列

在內(nèi)毒素血癥模型中的效果

由于鼠內(nèi)毒素血癥模型的簡單性，其被用作一線篩選模型。在該模型中，所有潛在優(yōu)化的先導(dǎo)候選物都保護(hù)動物；nb142、nb137、nb147和nb178似乎是最有效的先導(dǎo)候選物。有趣的是，在該模型中，nb142顯著地優(yōu)于nb101或nb109(圖9)。除了具有最高的動物存活率之外，nb142在抑制炎性細(xì)胞因子il-6和tnf-α方面也是最有效的(圖9)。

在vhf模型中的初步效果

表3中顯示的若干種肽，在用模擬外來rna分子的肌苷聚合物聚(i:c)注射攻擊的小鼠中。由于vhf病毒都是rna病毒，因此該模型被設(shè)計以再現(xiàn)宿主對病毒rna分子的反應(yīng)。與vhf病毒相似，聚(i:c)注射引發(fā)sirs的征象，包括炎性細(xì)胞因子的釋放、升高的d-二聚體(指示dic的纖維蛋白溶解產(chǎn)物)以及在肝、肺和腎中豐富的微血栓。

未處理的動物總是在第一次聚(i：c)注射后五天內(nèi)死亡。當(dāng)在聚(i：c)注射之前開始處理時，nb109、nb142、nb137和nb147都顯著地防止了動物死亡。當(dāng)nb109處理在聚(i：c)注射之后開始時，當(dāng)它在攻擊后的第一天首次給予時，它是有效的(圖1)。即使當(dāng)在聚(i：c)攻擊后48小時開始僅兩次處理，nb104也延長動物存活(圖10)。該結(jié)果表明，nb142和nb109兩者均能夠在誘發(fā)時防止sirs，但nb142可更有效地治療已確立的與vhf相關(guān)的sirs。

在同一模型中，當(dāng)在聚(i：c)攻擊之前給予時，nb101、nb109和nb142都顯著地抑制由聚(i：c)觸發(fā)的炎性細(xì)胞因子和d-二聚體。然而，在三個候選物中，nb142在抑制炎性細(xì)胞因子il-6和tnf-α(錯誤！未找到引用源。)方面是最有效的。

接下來，在感染ebov的zaire毒株的豚鼠的研究中比較了nb109和nb142。雖然媒介物處理的動物總是在第9天之前死亡，但1mg/kg/天的nb142和5mg/kg/天的nb109實現(xiàn)了顯著的67％的存活。再次，nb142以在較低劑量具有較好的存活以及顯著的體重增加顯示出較好的效果(圖12)。該研究結(jié)果的力度還在于這一事實，nb109和nb142處理是以未經(jīng)優(yōu)化的處理劑量并且在感染后24小時開始施用方案。

nb142、nb101和nb109的初步藥效動力學(xué)

nb142與nb101和nb109在體內(nèi)具有不同的藥效動力學(xué)(pd)。盡管nb101和nb109均導(dǎo)致pt升高，但nb142不影響pt(圖13)。所有三個候選物都以不同的效力導(dǎo)致aptt的升高。pd結(jié)果表明nb101和nb109抑制外源性凝結(jié)途徑和內(nèi)源性凝血途徑兩者，而nb142則似乎特異性地影響內(nèi)源性凝結(jié)途徑。

感染ebov的恒河猴的血液學(xué)監(jiān)測顯示，ebovhf中的消耗性凝血病是由于內(nèi)源性凝結(jié)途徑的激活，而不是外源性凝結(jié)途徑的激活[66]。內(nèi)源性凝血途徑由炎性細(xì)胞因子和激肽釋放酶直接激活，并通過纖維蛋白溶酶激活增強(qiáng)。nb142具有抗炎作用。它還有效地抑制激肽釋放酶和纖維蛋白溶酶，同時饒過(sparing)凝血酶。因此，它可以抑制觸發(fā)內(nèi)源性凝血的上游事件而不惡化消耗性凝血病。因此，nb142可具有用于vhf治療的優(yōu)選pd特征。

藥物材料

肽可以使用高密度、補(bǔ)料分批的大腸桿菌(e.coli)發(fā)酵工藝，然后周質(zhì)提取、離子交換層析和過濾步驟以去除內(nèi)毒素來制備。

發(fā)酵工藝

可以評價兩種微生物表達(dá)系統(tǒng)的先導(dǎo)化合物產(chǎn)生：大腸桿菌和酵母。利用使用葡萄糖作為碳源的時間依賴性補(bǔ)料分批大腸桿菌發(fā)酵工藝生產(chǎn)nb109，所述發(fā)酵工藝每升發(fā)酵產(chǎn)生～0.2gm純化的nb109。先導(dǎo)化合物還可以利用使用甘油作為碳源的溶解氧依賴性補(bǔ)料控制系統(tǒng)來產(chǎn)生。該發(fā)酵工藝已經(jīng)導(dǎo)致>9克/升不同蛋白藥物候選物的表達(dá)。該后一工藝可被容易地擴(kuò)大。它使用包括usp級試劑的經(jīng)認(rèn)證無動物成分的半確定成分培養(yǎng)基。

作為細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的替代，酵母菌株諸如畢赤酵母(p.pastoris)和多形漢遜酵母(h.polymorpha)也可以作為用于產(chǎn)生先導(dǎo)化合物的系統(tǒng)來評價。當(dāng)與微生物系統(tǒng)相比時，這些系統(tǒng)具有高等真核生物表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，諸如更好的蛋白加工、折疊和分泌，并且仍然具有快速生長和嚴(yán)格調(diào)控的啟動子。肽可以通過分泌到酵母培養(yǎng)基中來表達(dá)，以大大簡化純化工藝。作為本發(fā)明的一部分，已經(jīng)產(chǎn)生了畢赤酵母菌株以將先導(dǎo)化合物分泌到酵母培養(yǎng)基中。這些菌株是甲醇可誘導(dǎo)的，并且適于發(fā)酵。

通過調(diào)查多種分泌前導(dǎo)序列諸如α-交配因子、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、菊粉酶和轉(zhuǎn)化酶酵母信號序列，并轉(zhuǎn)化多種野生型和蛋白酶缺陷型酵母菌株，進(jìn)一步優(yōu)化畢赤酵母系統(tǒng)是可能的。可以從以96孔和24孔形式生長的小規(guī)模培養(yǎng)物的上清液進(jìn)行菌落的篩選。在轉(zhuǎn)移到發(fā)酵之前，選擇的克隆可以在搖瓶培養(yǎng)基中生長?？梢允褂皿w積為4升至20升的bioflo3000和biofloiv發(fā)酵罐建立發(fā)酵工藝。用于誘導(dǎo)表達(dá)的甲醇進(jìn)料可以通過可得的ysi2700selectbiochemistryanalyzer與甲醇探針來定量。發(fā)酵優(yōu)化可以改變培養(yǎng)基和進(jìn)料組成、ph、溫度、進(jìn)料時間過程和誘導(dǎo)時間以達(dá)到期望的蛋白表達(dá)水平。

純化工藝

從大腸桿菌發(fā)酵的純化工藝包括周質(zhì)提取，然后是用于純化的離子交換層析步驟和用于減少內(nèi)毒素的離子交換過濾步驟。該純化已經(jīng)對本文描述的肽起作用。在圖14中展示了該工藝的細(xì)節(jié)。

另外的下游步驟可以包括但不限于親和層析、疏水相互作用層析、尺寸排阻層析和另外的離子交換步驟。初步篩選可以在96孔過濾器板中進(jìn)行，以在不使用機(jī)器人技術(shù)下獲得高通量。待評價的結(jié)合條件可包括層析樹脂、鹽、離子強(qiáng)度和ph。微量洗脫物可以使用可得的96孔u(yù)v分光光度計通過uv吸光度來分析總濃度，并通過48-樣品sds-page(invitrogen，carlsbad，ca)與考馬斯亮藍(lán)染色來分析純度。選擇條件可以擴(kuò)大到在可得的fplc上使用標(biāo)準(zhǔn)1-10ml柱的層析術(shù)。工藝中間體的產(chǎn)率和純度可以使用以下描述的釋放測試的子集來監(jiān)測，包括sds-page、hplc和活性。

開發(fā)還可以聚焦于使純化工藝適應(yīng)于酵母表達(dá)系統(tǒng)，并添加另外的純化步驟以提高純度。另外的步驟可以包括但不限于疏水相互作用層析、反相層析和另外的離子交換步驟。

預(yù)制劑和制劑開發(fā)

先導(dǎo)化合物可以被開發(fā)成無菌、無防腐劑(non-preserved)的單位劑量腸胃外產(chǎn)品。目前的數(shù)據(jù)表明，先導(dǎo)化合物可以在寬的ph和溫度范圍內(nèi)是非常穩(wěn)健和穩(wěn)定的。

預(yù)計劑量

基于nb142在豚鼠ebov模型中的1mg/kg/天的有效劑量，人的治療劑量可以是約0.2mg/kg/天。對于7天的最長療程，預(yù)計總藥物消耗將為84毫克(對于60kg個體)至280毫克(對于200kg個體)。

已描述了本發(fā)明的很多實施方案。盡管如此，將理解的是，可以做出多種改變而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。

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