本發(fā)明涉及半乳糖改造(galactoengineered)的重組IgG1同種型抗體、用于產(chǎn)生該抗體的方法及其用途。

背景技術(shù)：

IgG是豐度最高的抗體同種型，以IgG1抗體為顯示最顯著效應(yīng)子功能程度和系列的亞類。IgG1抗體是最常用于免疫治療的抗體，其中常常認(rèn)為ADCC和CDC很重要。在抗體的結(jié)構(gòu)內(nèi)，CH2結(jié)構(gòu)域以及IgG鉸鏈區(qū)在Fc介導(dǎo)的抗體效應(yīng)子功能中發(fā)揮主要作用。每個CH2結(jié)構(gòu)域在定位于約297位(按照Kabat的EU指數(shù)的編號)的天冬酰胺殘基處包含保守的糖基化位點(diǎn)，在該位點(diǎn)處共價結(jié)合聚糖部分(Wright,A.和Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32)。在成熟IgG分子中，聚糖埋藏在CH2結(jié)構(gòu)域之間，影響IgG分子的三級結(jié)構(gòu)。已知存在于抗體Fc區(qū)中的N連接聚糖對抗體介導(dǎo)效應(yīng)子功能(如ADCC)很重要(Lifely,M.R.等Glycobiology.1995年12月；5(8):813-22；,Jefferis R.等Immunol Rev.1998年6月；163:59-76.)。

一般而言，已知三類主要的N連接聚糖，包括高甘露糖結(jié)構(gòu)(圖1A)、復(fù)雜雙觸角結(jié)構(gòu)(圖1C)及具有甘露糖殘基分支和復(fù)雜分支的雜合結(jié)構(gòu)(圖1B)?？贵wFc區(qū)的聚糖主要是圖1C中所示的高度異質(zhì)的復(fù)雜雙觸角結(jié)構(gòu)。雖然抗體Fab區(qū)內(nèi)可以存在其他非保守糖基化位點(diǎn)，但抗體糖基化對其效應(yīng)子功能的影響歸因于Fc糖基化。已顯示，N連接聚糖的組成影響IgG分子Fc區(qū)的結(jié)構(gòu)，從而改變抗體效應(yīng)子功能，如Fc受體結(jié)合、ADCC活性和CDC活性(Presta,L.Curr Opin Struct Biol.2003Aug；13(4):519-25)。在重組表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)(例如通過在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá))的抗體內(nèi)，N連接聚糖結(jié)構(gòu)在單個抗體分子間不同。因此，在重組表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的抗體可以視為“抗體群體(population of antibodies)”(本文中進(jìn)一步使用的術(shù)語)，抗體在其氨基酸序列上相同，但就其Fc區(qū)的N連接聚糖模式而言顯示異質(zhì)性。

已知Fc聚糖的組成在用于表達(dá)重組抗體的不同宿主細(xì)胞種類之間不同。兩種常用于重組表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞系是中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)和小鼠骨髓瘤細(xì)胞(例如sp2/0、P3X63Ag8.653、NS0)。CHO細(xì)胞表達(dá)的重組抗體基本不含末端唾液酸殘基，同時大部分聚糖模式巖藻糖基化。相反，小鼠骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體群體含有至多50％(相對頻率)唾液酸殘基，但巖藻糖殘基少。

已知聚糖結(jié)構(gòu)的一些末端殘基影響IgG效應(yīng)子功能。已知末端巖藻糖殘基的存在致使FcγRIIIa結(jié)合降低和ADCC降低。因此，缺乏末端巖藻糖殘基(“無巖藻糖基化(afucosylation)”抗體)的抗體與抗體群體介導(dǎo)的ADCC提高相關(guān)。雖然無巖藻糖基化對改善ADCC介導(dǎo)的影響在本領(lǐng)域內(nèi)已廣為接受，但對Fc半乳糖基化在ADCC介導(dǎo)中的作用的報(bào)道存在爭議。幾篇研究顯示，半乳糖基化對ADCC沒有影響(Boyd,P.N.等MolImmunol.1995年12月；32(17-18):1311-8；Hodoniczky J.等Biotechnol Prog.2005年11月-12月；21(6):1644-52；Raju T.S.Curr Opin Immunol.2008年8月；20(4):471-8)；而其他研究確實(shí)報(bào)道了IgG的半乳糖基化提高FcγRIIIa結(jié)合(Houde D.等Mol Cell Proteomics.2010年8月；9(8):1716-28；Kumpel B.M.等Hum Antibodies Hybridomas.1995；6(3):82-8)。

目前，改造IgG分子以改善抗體介導(dǎo)的ADCC集中在調(diào)節(jié)IgG分子的巖藻糖基化。重組表達(dá)的IgG的無巖藻糖基化可以通過在遺傳改造的宿主細(xì)胞(例如，蛋白質(zhì)巖藻糖基化缺乏的Lec13CHO細(xì)胞，或敲除細(xì)胞系，如α-1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT8)基因敲除的CHO細(xì)胞)中表達(dá)抗體來達(dá)到。

但是，通過目前的表達(dá)系統(tǒng)(例如CHO細(xì)胞)產(chǎn)生的抗體顯示異質(zhì)的聚糖模式，導(dǎo)致不同聚糖種類的分布在所產(chǎn)生的不同批次抗體內(nèi)的變異。

因此，仍存在調(diào)整重組IgG抗體的效應(yīng)子功能、尤其是提供用于改善治療性抗體介導(dǎo)的ADCC的手段的需要。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體的群體，其包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體。

本發(fā)明還涉及半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體的群體，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

本發(fā)明的一個實(shí)施方案涉及抗體群體，其中抗體在其Fab片段中不包含糖基化位點(diǎn)。

本發(fā)明的一個實(shí)施方案涉及抗體群體，其中該抗體的作用方式是誘導(dǎo)ADCC。

本發(fā)明的一個實(shí)施方案涉及抗體群體，其中抗體選自曲妥珠單抗(trastuzumab)、利妥昔單抗(rituximab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)和obinutuzumab。

本發(fā)明的另一方面是用于產(chǎn)生半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)遺傳改造該宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化，使得獲得該半乳糖改造的重組抗體群體，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體。

本發(fā)明的另一方面是用于產(chǎn)生半乳糖改造的抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得該重組抗體群體；

b)分離該重組抗體群體；

c)用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶酶處理該抗體群體，以獲得包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體的抗體群體，隨后從該酶分離該抗體群體。

本發(fā)明的另一方面是該方法在改善該重組IgG1同種型抗體群體介導(dǎo)的ADCC中的用途。

本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體群體用于介導(dǎo)ADCC。

本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體群體用作藥物。

根據(jù)本發(fā)明，借助半乳糖改造來調(diào)整IgG1分子的效應(yīng)子功能，尤其是ADCC介導(dǎo)的效應(yīng)子功能。本發(fā)明提供在其產(chǎn)生后調(diào)整重組IgG1的聚糖譜以提供基本同質(zhì)的聚糖模式的手段和方法，其在所產(chǎn)生的不同批次IgG1抗體之間可重復(fù)。本發(fā)明還允許通過糖改造提供具有某種聚糖譜的IgG1分子來改善IgG1分子介導(dǎo)的ADCC。

附圖簡述

圖1：IgG分子N連接聚糖示意圖(示意圖內(nèi)所用符號的說明：白色方形-N-乙酰葡糖胺，黑色圓形-甘露糖，黑色三角形-巖藻糖，白色圓形-半乳糖，黑色菱形-唾液酸)。重組表達(dá)的IgG分子的唾液酸通常是5-N-乙酰神經(jīng)氨酸(NANA)或5-N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NGNA)，而人IgG分子僅包含NANA。

圖1A：示例性高甘露糖類型聚糖結(jié)構(gòu)，其包含兩個N-乙酰葡糖胺，具有許多甘露糖殘基；

圖1B：示例性雜合聚糖結(jié)構(gòu)，其包含甘露糖殘基的分支和復(fù)雜分支；

圖1C：示例性復(fù)雜聚糖結(jié)構(gòu)，所顯示的是所有可能附著的糖殘基，包括二等分(bisecting)N-乙酰葡糖胺；

圖1D：巖藻糖基化和無巖藻糖基化復(fù)雜雙觸角結(jié)構(gòu)及本文所用的相應(yīng)縮寫。

圖2：來自不同生產(chǎn)批次(#1-#4)的酶處理得到的高半乳糖基化抗體的ADCC。

圖2A：來自所示各生產(chǎn)批次的未處理曲妥珠單抗(黑色圓，實(shí)線)和酶處理高半乳糖基化曲妥珠單抗(白色方形，虛線)介導(dǎo)的示例性劑量依賴性ADCC；

圖2B：未處理對照(灰色條)和酶處理高半乳糖基化材料(白色條)介導(dǎo)的ADCC的比較。誤差棒代表單個實(shí)驗(yàn)(n≥3)間的標(biāo)準(zhǔn)差。mAb1＝曲妥珠單抗；mAb2＝利妥昔單抗；mAb3＝帕妥珠單抗；mAb5＝Obinutuzumab；afu＝無巖藻糖基化。

圖3：實(shí)施例3中用于樣品制備的體外半乳糖改造方法的流程示意圖。在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生并純化重組IgG1(未處理重組IgG1)。為了制備無半乳糖基化(aGal)對照樣品，用半乳糖苷酶處理抗體。為了制備含有高相對頻率的雙半乳糖基化IgG1(biGal IgG1)的抗體群體，通過實(shí)施例3中所述的本發(fā)明的方法用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶處理未處理過的抗體。為了提供含有高相對頻率的單唾液酸化IgG1(biGal/monoSia IgG1)的IgG1群體，按針對本發(fā)明的方法及在實(shí)施例3中所述用唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理雙半乳糖基化抗體，為了產(chǎn)生含有高相對頻率的雙唾液酸化IgG1(biGal/biSia)的抗體群體，按實(shí)施例3中所述對唾液酸化抗體群體進(jìn)行再一次唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理。

圖4：通過表面等離振子共振分析的Fc-γ-R結(jié)合。所顯示的是，相對于未處理抗體群體的結(jié)合(設(shè)為100％)，通過SPR分析的實(shí)施例3的不同IgG1抗體群體(包括未處理對照樣品和無半乳糖基化比較樣品)與Fc-γRIa、Fc-γRIIa和Fc-γRIIIa的結(jié)合。所有樣品都分析三次。

圖5：通過親和層析分析的Fc-γ-R結(jié)合。所顯示的是通過親和層析分析的實(shí)施例3的不同IgG1抗體群體(包括未處理對照樣品和無半乳糖基化比較樣品)與Fc-γRIIa和Fc-γRIIIa的結(jié)合。

圖6：具有不同聚糖種類的IgG1抗體的ADCC。所顯示的是通過實(shí)施例2和7中所述基于細(xì)胞的ADCC測定分析的實(shí)施例3的不同IgG1抗體群體(包括未處理對照樣品和無半乳糖基化比較樣品)的相對ADCC。所顯示的是未處理對照IgG1群體，以及酶處理群體aGal(比較實(shí)例)、biGal、biGal/monoSia和biGal/biSia。

圖7：高半乳糖基化對Fc-γRIIIa結(jié)合和ADCC的影響。相對于參考材料的Fc-γRIIIa結(jié)合和ADCC；未處理對照(灰色條)，高半乳糖基化材料(白色條)。誤差棒代表獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(n≥3)之間的標(biāo)準(zhǔn)差。mAb2＝利妥昔單抗；mAb3＝帕妥珠單抗；afu＝無巖藻糖基化。

發(fā)明詳述

1.定義

除非文中另有明確說明，術(shù)語“一”、“一個”和“該”一般包括復(fù)數(shù)指代物。

本文中的術(shù)語“抗體”以最廣泛的含義使用，且涵蓋多種抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們顯示希望得到的抗原結(jié)合活性。

術(shù)語“全長抗體”、“完整抗體”和“全抗體”在本文中可互換使用，指具有基本類似于天然抗體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)或具有包含本文定義的Fc區(qū)的重鏈的抗體。

本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”指獲自基本同質(zhì)的抗體群體的抗體，即除了例如包含天然存在的突變或在產(chǎn)生單克隆抗體制劑期間出現(xiàn)的可能的變體抗體(這類變體通常以較小的量存在)外，包含該群體的單種抗體相同和/或結(jié)合相同的表位。與通常包含抗不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑不同，單克隆抗體制劑的每種單克隆抗體抗抗原上的單個決定簇。因此，修飾詞“單克隆”指抗體獲自基本同質(zhì)的抗體群體的特征，而不解釋為需要通過任意具體方法來產(chǎn)生該抗體。例如，將要按照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過多種技術(shù)制備，其包括但不限于雜交瘤法、重組DNA法、噬菌體展示法及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動物的方法，本文描述用于制備單克隆抗體的這類方法和其他示例性方法。

“分離的”抗體是已從其天然環(huán)境的成分分開的抗體。在一些實(shí)施方案中，將抗體純化至通過例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細(xì)管電泳)或?qū)游?例如離子交換或反相HPLC)測定的純度大于95％或99％。用于評估抗體純度的方法綜述參見例如Flatman等,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。

抗體的“種類”指其重鏈所具有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類型。存在5個主要的抗體種類：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，這些種類中的幾種可以進(jìn)一步劃分為亞類(同種型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。對應(yīng)于不同種類免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。本發(fā)明的抗體屬于IgG1同種型。

本文的術(shù)語“Fc區(qū)”用于定義免疫球蛋白重鏈的C端區(qū)域，其包含至少部分恒定區(qū)。該術(shù)語包括天然序列Fc區(qū)和變體Fc區(qū)。在一個實(shí)施方案中，人IgG重鏈Fc區(qū)從Cys226或從Pro230延伸至重鏈的羧基端。除非本文另有說明，F(xiàn)c區(qū)或恒定區(qū)中氨基酸殘基的編號按照Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU編號系統(tǒng)，也稱為EU指數(shù)。

“效應(yīng)子功能”指可歸因于抗體Fc區(qū)且隨抗體同種型而變的那些生物活性。抗體效應(yīng)子功能的實(shí)例包括：C1q結(jié)合和依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)；Fc受體結(jié)合；依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體)的下調(diào)；及B細(xì)胞激活。

“依賴抗體的細(xì)胞毒性”或“ADCC”指這樣的細(xì)胞毒性形式，其中分泌的免疫球蛋白(Ig)結(jié)合至存在于某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如NK細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上的Fc受體(FcR)上，使得這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞能夠特異性結(jié)合具有抗原的靶細(xì)胞，隨后用細(xì)胞毒素殺死靶細(xì)胞。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞NK細(xì)胞僅表達(dá)FcγRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血細(xì)胞上的Fc表達(dá)總結(jié)在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)的第464頁上的表3中。為了評估目的分子的ADCC活性，可以進(jìn)行體外ADCC測定，如描述于美國專利號5,500,362或5,821,337或美國專利號6,737,056(Presta)中的體外ADCC測定。用于這類測定的效應(yīng)細(xì)胞包括PBMC和NK細(xì)胞。備選地，或此外，可以在體內(nèi)，例如在諸如公開于Clynes等,PNAS USA 95:652-656(1998)中的動物模型的動物模型中評估目的分子的ADCC活性。

“依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性”或“CDC”指在補(bǔ)體存在下裂解靶細(xì)胞。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的激活由補(bǔ)體系統(tǒng)第一成分(C1q)與結(jié)合于其關(guān)聯(lián)抗原的(適當(dāng)亞類的)抗體的結(jié)合起始。為了評估補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述的CDC測定。Fc區(qū)氨基酸序列改變(具有變體Fc區(qū)的多肽)且C1q結(jié)合能力提高或降低的多肽變體描述于例如美國專利號6,194,551B1和WO 1999/51642中。還參見例如Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)。

“Fc受體”或“FcR”描述結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)cR是天然人FcR。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)cR是結(jié)合IgG抗體的FcR(γ受體)，且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和選擇性剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(“激活受體”)和FcγRIIB(“抑制受體”)，它們具有主要在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中不同的相似氨基酸序列。激活受體FcγRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見例如Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR綜述于例如Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等,Immunomethods 4:25-34(1994)；及de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。本文的術(shù)語“FcR”涵蓋了其他FcR，包括有待在將來鑒定的那些。

“激活Fc受體”是在與抗體(或免疫綴合物)Fc區(qū)結(jié)合后引出刺激具有受體的細(xì)胞執(zhí)行效應(yīng)子功能的信號發(fā)放事件的Fc受體。激活Fc受體包括Fc-γRIIIa(CD16a)、Fc-γRI(CD64)、Fc-γRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。

IgG1抗體的“作用方式”描述活生物暴露于抗體產(chǎn)生的細(xì)胞水平的功能變化或解剖學(xué)變化。包含IgG1Fc區(qū)的抗體有效激活免疫系統(tǒng)。IgG1的治療性應(yīng)用因此以利用不同免疫細(xì)胞和分子殺傷腫瘤靶細(xì)胞的范圍進(jìn)行。IgG1同種型抗體通過CD16A激活NK細(xì)胞，并誘導(dǎo)依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)。因此，IgG1的一種作用方式是誘導(dǎo)ADCC。IgG1同種型抗體激活補(bǔ)體產(chǎn)生依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)。因此，IgG1的另一種作用方式是誘導(dǎo)CDC。

“重組抗體”是通過重組改造的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。它可選地是分離的或純化的。

“人抗體”是具有這樣的氨基酸序列的抗體，該氨基酸序列對應(yīng)于由人或人細(xì)胞產(chǎn)生或源自利用人抗體庫或其他人抗體編碼序列的非人來源的抗體的氨基酸序列。人抗體的此定義明確排除了包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。

術(shù)語“嵌合”抗體指這樣的抗體，其中部分重鏈和/或輕鏈源自特定來源或物種，而重鏈和/或輕鏈的其余部分源自不同來源或物種?！叭嗽椿笨贵w指包含來自非人HVR的氨基酸殘基和來自人構(gòu)架(FR)的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體將包含至少一個且通常為兩個可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR(例如CDR)對應(yīng)于非人抗體的HVR，而全部或基本上全部FR對應(yīng)于人抗體的FR。人源化抗體可以可選地包含源自人抗體的抗體恒定區(qū)的至少一部分?？贵w(例如非人抗體)的“人源化形式”指已進(jìn)行了人源化的抗體。

IgG抗體是在重鏈恒定區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域中的Asn297處包含保守的Fc糖基化位點(diǎn)的糖蛋白。術(shù)語“糖基化位點(diǎn)”指抗體氨基酸序列內(nèi)共價連接聚糖的氨基酸。N連接聚糖通常連接至作為Asn-X-Ser或Asn-X-Thr共有序列的部分存在的天冬酰胺(Asn)側(cè)鏈的氮原子，其中X是除脯氨酸外的氨基酸，Ser是絲氨酸，Thr是蘇氨酸。雖然Fc區(qū)中的保守糖基化位點(diǎn)存在于所有野生型IgG抗體中，但其他糖基化位點(diǎn)可以存在于抗體Fab區(qū)內(nèi)。

本文所用的“Asn297”指定為在IgG1分子Fc區(qū)中的約297位的氨基酸天冬氨酸。根據(jù)抗體小的序列變異，Asn297也可以定位于297位上游或下游的一些氨基酸(通常不超過+3氨基酸)，即在294位和300位之間。

術(shù)語“N連接聚糖”指共價連接至抗體天冬酰胺殘基的氮原子的寡糖。一般而言，已知三類主要的N連接聚糖，包括高甘露糖結(jié)構(gòu)(圖1A)、復(fù)雜雙觸角結(jié)構(gòu)(圖1C)和具有甘露糖殘基分支和復(fù)雜分支的雜合結(jié)構(gòu)(圖1B)。CH2結(jié)構(gòu)域Asn297的N連接聚糖是復(fù)雜雙觸角寡糖，其埋藏在CH2結(jié)構(gòu)域之間，與多糖主鏈形成廣泛接觸。它們的存在對抗體介導(dǎo)效應(yīng)子功能(依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC))非常重要(Lifely,M.,R.等,Glycobiology 5(1995)813-822；Jefferis,R.等,Immunol.Rev.163(1998)59-76；Wright,A.和Morrison,S.L.,Trends Biotechnol.15(1997)26-32)。

“糖基化變體”指其中附著于Fc區(qū)的糖類改變的抗體。因此，本發(fā)明的抗體群體包含通過宿主細(xì)胞重組表達(dá)的抗體的糖基化變體。

圖1D中顯示N連接聚糖的不同復(fù)雜雙觸角結(jié)構(gòu)。本文所用的術(shù)語“糖基化”抗體指這樣的抗體，其中抗體的N連接聚糖(在一個實(shí)施方案中，與抗體Asn297偶聯(lián)的N連接聚糖)包含至少一個半乳糖殘基(包括G1F、G1、G2F、G2、G1S1F、G1S1、G2S1F、G2S1、G2S2F和G2S2結(jié)構(gòu))。本文所用的術(shù)語“雙半乳糖基化”抗體指這樣的抗體，其中抗體的N連接聚糖(在一個實(shí)施方案中，與抗體Asn297偶聯(lián)的N連接聚糖)是包含正好兩個半乳糖殘基的復(fù)雜雙觸角結(jié)構(gòu)(包括G2F、G2、G2S1F、G2S1、G2S2F和G2S2結(jié)構(gòu))。本文所用的術(shù)語“單半乳糖基化”抗體指這樣的抗體，其中抗體的N連接聚糖(在一個實(shí)施方案中，與抗體Asn297偶聯(lián)的N連接聚糖)是包含一個半乳糖殘基的復(fù)雜雙觸角結(jié)構(gòu)(包括G1F、G1、G1S1F和G1S1結(jié)構(gòu))。本文所用的術(shù)語“無半乳糖基化”抗體指這樣的抗體，其中抗體的N連接聚糖(在一個實(shí)施方案中，與抗體Asn297偶聯(lián)的N連接聚糖)不含半乳糖殘基(包括G0、G0F及其他不含半乳糖殘基的結(jié)構(gòu))。

本文所用的術(shù)語“唾液酸化”抗體指這樣的抗體，其中抗體的N連接聚糖(在一個實(shí)施方案中，與抗體Asn297偶聯(lián)的N連接聚糖)包含至少一個唾液酸殘基(包括G1S1F、G1S1、G2S1F、G2S1、G2S2F和G2S2結(jié)構(gòu))。本文所用的術(shù)語“唾液酸”指神經(jīng)氨酸的N取代衍生物，尤其包括5-N-乙酰神經(jīng)氨酸(NANA)或5-N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NGNA)。雖然人IgG分子僅包含以NANA作為唾液酸唾液酸化N連接聚糖，但重組表達(dá)的IgG分子(即在除人細(xì)胞外的宿主細(xì)胞中)包含以NANA或NGNA二者作為唾液酸的唾液酸化N連接聚糖。本文所用的術(shù)語“雙唾液酸化”抗體指這樣的抗體，其中抗體的N連接聚糖(在一個實(shí)施方案中，與抗體Asn297偶聯(lián)的N連接聚糖)是包含正好兩個唾液酸殘基的復(fù)雜雙觸角結(jié)構(gòu)(包括G2S2F和G2S2結(jié)構(gòu))。本文所用的術(shù)語“單唾液酸化”抗體指這樣的抗體，其中抗體的N連接聚糖(在一個實(shí)施方案中，與抗體Asn297偶聯(lián)的N連接聚糖)是包含正好一個唾液酸殘基的復(fù)雜雙觸角結(jié)構(gòu)(包括G1S1F、G1S1、G2S1F和G2S1結(jié)構(gòu))。本文所用的術(shù)語“無唾液酸化”抗體指這樣的抗體，其中抗體的N連接聚糖(在一個實(shí)施方案中，與抗體Asn297偶聯(lián)的N連接聚糖)不含唾液酸殘基(包括G0、G0F及其他不含唾液酸殘基的結(jié)構(gòu))。

本文所用的術(shù)語“巖藻糖基化”抗體指這樣的抗體，其中抗體的N連接聚糖(在一個實(shí)施方案中，與抗體Asn297偶聯(lián)的N連接聚糖)包含巖藻糖殘基(包括G1F、G2F、G1S1F、G2S1F、G2S2F及其他包含巖藻糖殘基的結(jié)構(gòu))。本文所用的術(shù)語“無巖藻糖基化”抗體指這樣的抗體，其中抗體的N連接聚糖(在一個實(shí)施方案中，與抗體Asn297偶聯(lián)的N連接聚糖)不含巖藻糖殘基(包括G1、G2、G1S1、G2S1、G2S2及其他不含巖藻糖殘基的結(jié)構(gòu))。術(shù)語“無巖藻糖基化的”在本文中也縮寫為“afu”。

本文所用的術(shù)語“不含”不同糖殘基指抗體CH2結(jié)構(gòu)域中沒有一個的聚糖模式包含該不同糖殘基。因此，“不含半乳糖”指抗體CH2結(jié)構(gòu)域中沒有一個的聚糖模式包含半乳糖殘基。因此，“不含巖藻糖”指抗體CH2結(jié)構(gòu)域中沒有一個的聚糖模式包含巖藻糖殘基。

在提到本文所用的“基本不含”不同糖殘基(例如半乳糖、巖藻糖或唾液酸)的抗體時，它是指抗體群體僅包含低相對頻率的含有該不同糖殘基的抗體，使得本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)為含有該不同糖殘基的抗體部分在抗體生物學(xué)特征(例如，抗體介導(dǎo)的ADCC、FcR結(jié)合)的背景內(nèi)幾乎沒有或沒有生物學(xué)意義。因此，“基本不含F(xiàn)c半乳糖殘基”的抗體指這樣的抗體群體，其僅包含低相對頻率的含有半乳糖殘基的抗體，使得本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)為含有該不同糖殘基的抗體部分在抗體生物學(xué)特征(例如，抗體介導(dǎo)的ADCC、FcR結(jié)合)的背景內(nèi)幾乎沒有或沒有生物學(xué)意義?！盎静缓辈煌菤埢?例如半乳糖、巖藻糖或唾液酸)的抗體可以以2％或更低、優(yōu)選1％或更低、優(yōu)選0.5％或更低的相對頻率存在于抗體群體中。因此，基本不含不同糖殘基的抗體群體包含相對頻率為至少98％、優(yōu)選至少99％、優(yōu)選至少99.5％的不含該不同糖殘基的抗體。

術(shù)語“抗體群體”指可以包含異質(zhì)聚糖模式的(優(yōu)選單克隆)抗體的混合物。具體而言，就其Fc區(qū)的N連接聚糖模式而言，抗體可以顯示異質(zhì)性。在重組表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的IgG抗體(例如通過在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá))包含可在單個抗體分子之間和在所產(chǎn)生的不同批次抗體之間不同的異質(zhì)N連接聚糖結(jié)構(gòu)。在抗體群體內(nèi)，除可能的變體抗體(例如包含天然存在的突變或在產(chǎn)生單克隆抗體制備物期間出現(xiàn)的突變，這類變體通常小量存在)外，單個抗體在其氨基酸序列上基本相同。

本文提到的抗體群體的“相對頻率”指抗體群體內(nèi)的不同聚糖模式相對于抗體群體內(nèi)的所有糖結(jié)構(gòu)的百分比。具體而言，抗體群體的相對頻率指抗體群體內(nèi)的不同聚糖模式相對于在抗體群體的PNGase F處理樣品中通過NP-UHPLC分析鑒定出的所有糖結(jié)構(gòu)的百分比。例如，包含相對頻率70％的雙半乳糖基化抗體的抗體群體在本文中指抗體群體內(nèi)70％的糖結(jié)構(gòu)是含有正好兩個半乳糖殘基的復(fù)雜雙觸角結(jié)構(gòu)(包括G2F、G2、G2S1F、G2S1、G2S2F和G2S2結(jié)構(gòu))，其中抗體群體內(nèi)所有糖結(jié)構(gòu)的其余30％是i)具有包含正好一個半乳糖殘基的復(fù)雜雙觸角結(jié)構(gòu)的糖結(jié)構(gòu)(包括G1F、G1、G1S1F和G1S1結(jié)構(gòu))，和/或ii)具有復(fù)雜雙觸角結(jié)構(gòu)但不含半乳糖殘基的糖結(jié)構(gòu)(包括G0、G0F及其他不含半乳糖殘基的結(jié)構(gòu))。

本文提到的術(shù)語“體外糖改造”指在重組表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并優(yōu)選純化抗體后在體外進(jìn)行的抗體N連接聚糖結(jié)構(gòu)的改變。本發(fā)明術(shù)語內(nèi)的體外糖改造總是涵蓋向包含在進(jìn)行體外糖改造的抗體群體內(nèi)的至少一部分抗體的N連接聚糖結(jié)構(gòu)加入至少一個糖殘基?？蛇x地，體外糖改造可以涵蓋從包含在進(jìn)行體外糖改造的抗體群體內(nèi)的至少一部分抗體的N連接聚糖結(jié)構(gòu)切割至少一個糖殘基。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語“體外糖改造”不涵蓋(即明確排除)向抗體的N連接聚糖結(jié)構(gòu)加入或從抗體的N連接聚糖結(jié)構(gòu)切割巖藻糖殘基。

本發(fā)明術(shù)語內(nèi)的體外糖改造包括在重組表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并優(yōu)選純化的抗體的至少一個酶處理步驟。在一個實(shí)施方案中，該酶處理包括用糖基轉(zhuǎn)移酶優(yōu)選能夠向蛋白質(zhì)的N連接寡糖結(jié)構(gòu)加入末端糖殘基的糖基轉(zhuǎn)移酶處理抗體。在一個實(shí)施方案中，該酶處理包括用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶優(yōu)選β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶處理抗體。本發(fā)明術(shù)語內(nèi)的體外糖改造還可以包括至少一個用能夠從蛋白質(zhì)的N連接寡糖結(jié)構(gòu)切割末端糖殘基的酶進(jìn)行酶處理的步驟。在一個實(shí)施方案中，該酶選自半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶。此外，本發(fā)明術(shù)語內(nèi)的體外糖改造還可以包括至少一個用唾液酸轉(zhuǎn)移酶優(yōu)選唾液酸轉(zhuǎn)移酶6(ST6，催化形成α-2,6-糖苷鍵)或唾液酸轉(zhuǎn)移酶3(ST3，催化形成α-2,3-糖苷鍵)進(jìn)行酶處理的步驟。

還可以例如通過在細(xì)胞系中過量表達(dá)能夠向蛋白質(zhì)的N連接寡糖結(jié)構(gòu)加入末端糖殘基或從蛋白質(zhì)的N連接寡糖結(jié)構(gòu)切割末端糖殘基的酶來在體內(nèi)進(jìn)行糖改造。此外，還可以例如通過降低細(xì)胞系中酶的表達(dá)或敲除細(xì)胞系中的酶來在體內(nèi)進(jìn)行糖改造，該酶能夠向蛋白質(zhì)的N連接寡糖結(jié)構(gòu)加入末端糖殘基或從蛋白質(zhì)的N連接寡糖結(jié)構(gòu)切割末端糖殘基。

本文提到的術(shù)語“半乳糖改造”指僅改變與半乳糖殘基相關(guān)的抗體的N連接聚糖結(jié)構(gòu)，即改變抗體N連接聚糖結(jié)構(gòu)內(nèi)半乳糖殘基的數(shù)目。本發(fā)明術(shù)語內(nèi)的半乳糖改造總是涵蓋向包含在進(jìn)行半乳糖改造的抗體群體內(nèi)的至少一部分抗體的N連接聚糖結(jié)構(gòu)加入至少一個半乳糖殘基?？蛇x地，半乳糖改造可以涵蓋從包含在進(jìn)行半乳糖改造的抗體群體內(nèi)的至少一部分抗體的N連接聚糖結(jié)構(gòu)切割至少一個半乳糖殘基。半乳糖改造可以在體內(nèi)進(jìn)行。還可以例如通過以下來進(jìn)行半乳糖改造：i)在細(xì)胞系中過量表達(dá)能夠向蛋白質(zhì)的N連接寡糖結(jié)構(gòu)加入末端半乳糖殘基或從蛋白質(zhì)的N連接寡糖結(jié)構(gòu)切割末端半乳糖殘基的酶；或ii)降低細(xì)胞系中酶的表達(dá)或敲除細(xì)胞系中的酶，該酶能夠向蛋白質(zhì)的N連接寡糖結(jié)構(gòu)加入末端半乳糖殘基或從蛋白質(zhì)的N連接寡糖結(jié)構(gòu)切割末端半乳糖殘基。本文所用的“半乳糖改造”是“糖改造”的具體形式，“半乳糖改造的”是“糖改造的”的具體形式。

本發(fā)明術(shù)語內(nèi)的術(shù)語“體外半乳糖改造”包括在重組表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并優(yōu)選純化的抗體的至少一個酶處理步驟。在一個實(shí)施方案中，該酶處理包括用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶優(yōu)選能夠向蛋白質(zhì)的N連接寡糖結(jié)構(gòu)加入末端半乳糖殘基的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶處理抗體。在一個實(shí)施方案中，該酶處理包括用β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶處理抗體。本發(fā)明術(shù)語內(nèi)的體外半乳糖改造還可以包括至少一個用能夠從蛋白質(zhì)的N連接寡糖結(jié)構(gòu)切割末端半乳糖殘基的酶進(jìn)行酶處理的步驟。在一個實(shí)施方案中，該酶是半乳糖苷酶。

本發(fā)明的抗體通過重組手段產(chǎn)生。用于重組產(chǎn)生抗體的方法在現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知，包括在原核和真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)，隨后分離抗體，且通常純化至可藥用純度。為了在宿主細(xì)胞中表達(dá)前述抗體，通過標(biāo)準(zhǔn)方法將編碼該抗體輕鏈和重鏈的核酸插入表達(dá)載體。在適當(dāng)?shù)脑嘶蛘婧怂拗骷?xì)胞(如CHO細(xì)胞、NS0細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、COS細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞、酵母或大腸桿菌細(xì)胞)中進(jìn)行表達(dá)，并從細(xì)胞(上清或裂解后的細(xì)胞)回收抗體。用于重組產(chǎn)生抗體的一般方法為現(xiàn)有技術(shù)中公知，并描述于例如綜述文章Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.等,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880中。

本文中可互換使用的“多核苷酸”或“核酸”指任意長度的核苷酸聚合物，且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或堿基、和/或其類似物，或可以通過DNA或RNA聚合酶或通過合成反應(yīng)摻入聚合物的任意底物。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸，如甲基化的核苷酸及其類似物。核苷酸的序列可以由非核苷酸成分中斷。多核苷酸可以包含合成后進(jìn)行的修飾，如與標(biāo)記綴合。其他類型的修飾包括例如“帽”，用類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸，核苷酸間修飾，例如具有不帶電荷的連接(例如磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)和具有帶電荷的連接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，包含懸垂部分(例如蛋白質(zhì)(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-賴氨酸等))的那些，具有嵌入劑(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的那些，包含螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的那些，包含烷化劑的那些，具有修飾的連接的那些(例如α異頭核酸等)，以及未修飾形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖中的任意羥基可以例如通過膦酸基團(tuán)、磷酸基團(tuán)取代，通過標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，或活化以制備與附加核苷酸的附加連接，或可以綴合至固體或半固體支持物。5’和3’端OH可以磷酸化或用1至20個碳原子的胺或有機(jī)帽化基團(tuán)部分取代。其他羥基也可以衍生至標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)。多核苷酸還可以包含本領(lǐng)域公知的核糖或脫氧核糖的類似物形式，包括例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基、2’-氟-或2’-疊氮基-核糖，碳環(huán)糖類似物，α-異頭糖，差向異構(gòu)糖如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，無環(huán)類似物和堿性核苷類似物如甲基核苷?？梢杂脗溥x的連接基團(tuán)取代一個或多個磷酸二酯鍵。這些備選的連接基團(tuán)包括但不限于其中用P(O)S(“硫代”)、P(S)S(“二硫代”)、(O)NR₂(“酰胺”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH₂(“formacetal”)取代磷酸的實(shí)施方案，其中每個R或R’獨(dú)立地是H或可選地包含醚(-O-)鍵的取代或未取代的烷基(1-20C)、芳基、鏈烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或araldyl。多核苷酸中的所有鍵無需相同。前面的描述適用于本文提到的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

“分離的”核酸指已從其天然環(huán)境的成分分開的核酸分子。分離的核酸包括包含這樣的核酸分子，其包含在通常含有該核酸分子的細(xì)胞內(nèi)，但該核酸分子存在于染色體外或不同于其天然染色體位置的染色體位置上。

“分離的編碼抗體的核酸”指編碼抗體重鏈和輕鏈(或其片段)的一個或多個核酸分子，包括單個載體或分開的載體中的這種(類)核酸分子，及存在于宿主細(xì)胞中的一個或多個位置的這種(類)核酸分子。

本文所用的術(shù)語“載體”指能夠繁殖與之連接的另一核酸的核酸分子。該術(shù)語包括作為自我復(fù)制核酸結(jié)構(gòu)的載體，以及摻入它所引入的宿主細(xì)胞的基因組中的載體。該術(shù)語包括功能主要是將DNA或RNA插入細(xì)胞(例如染色體整合)的載體，功能主要是復(fù)制DNA或RNA的復(fù)制載體，及功能是轉(zhuǎn)錄和/或翻譯DNA或RNA的表達(dá)載體。還包括提供一種以上所述功能的載體。

“表達(dá)載體”是能夠指導(dǎo)與之有效連接的核酸的表達(dá)的載體。在將表達(dá)載體引入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中時，它可以轉(zhuǎn)錄并翻譯為多肽。在本發(fā)明的方法中轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞時，使用“表達(dá)載體”；因此與本文所述轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞關(guān)聯(lián)的術(shù)語“載體”指“表達(dá)載體”?！氨磉_(dá)系統(tǒng)”通常指包含表達(dá)載體的適宜宿主細(xì)胞，其可以發(fā)揮功能來產(chǎn)生希望得到的表達(dá)產(chǎn)物。

本文所用的“表達(dá)”指核酸轉(zhuǎn)錄為mRNA的過程和/或所轉(zhuǎn)錄的mRNA(也稱為轉(zhuǎn)錄物)隨后翻譯為肽、多肽或蛋白質(zhì)的過程。轉(zhuǎn)錄物和所編碼的多肽單獨(dú)稱為或統(tǒng)稱為基因產(chǎn)物。如果核酸源自基因組DNA，則在真核細(xì)胞中的表達(dá)可以包括相應(yīng)mRNA的剪接。

本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指將載體/核酸轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的過程。如果用沒有難以對付的細(xì)胞壁屏障的細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，則例如通過Graham and Van der Eh,Virology 52(1978)546ff所述的磷酸鈣沉淀法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。但是，也可以使用其他用于將DNA引入細(xì)胞的方法，如通過核注射或通過原生質(zhì)體融合。如果使用包含實(shí)質(zhì)性細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的原核細(xì)胞，則例如轉(zhuǎn)染的一種方法Cohen,F.N等,PNAS 69(1972)7110et seq所述的使用氯化鈣的鈣處理。

本申請中所用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”指可以改造來產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的任何種類的細(xì)胞系統(tǒng)。

本文所用的表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，且所有這類命名都包括后代。因此，詞語“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括最初的主題細(xì)胞及從其衍生的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移的數(shù)目。還應(yīng)理解，由于有意或無意的突變，所有后代的DNA含量可以并非精確相同。包括具有與在最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選的功能或生物學(xué)活性相同的功能或生物學(xué)活性的突變體后代。在旨在不同命名時，它將從文中顯而易見。

NS0細(xì)胞中的表達(dá)由例如Barnes,L.M.等,Cytotechnology 32(2000)109-123；Barnes,L.M.等,Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述。瞬時表達(dá)由例如Durocher,Y.等,Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的克隆由Orlandi,R.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter,P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；Norderhaug,L.等,J.Immunol.Methods 204(1997)77-87描述。優(yōu)選的瞬時表達(dá)系統(tǒng)(HEK293)由Schlaeger,E.-J.和Christensen,K.在Cytotechnology 30(1999)71-83中及Schlaeger,E.-J.,J.Immunol.Methods 194(1996)191-199描述。

本文所用的術(shù)語“純化的”指這樣的多肽，其從其天然環(huán)境或從重組產(chǎn)生的來源移出，或以其他方式分離或分開，且至少60％(例如至少80％)游離于與之天然相關(guān)的其他成分(例如膜和微粒體)。通過包括堿/SDS處理、CsCl分帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和本領(lǐng)域公知的其他方法的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行抗體的純化(從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物回收抗體)，以去除細(xì)胞成分或其他污染物，例如其他細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)。參見Ausubel,F.等,編輯Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。良好地建立了不同的方法并廣泛用于蛋白質(zhì)純化，如使用微生物蛋白質(zhì)的親和層析(例如蛋白A、蛋白G親和層析)、離子交換層析(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨乙基樹脂)和混合模式交換)、親硫吸附(例如具有β-巰基乙醇和其他SH配體)、疏水相互作用或芳族吸附層析(例如具有苯基-瓊脂糖、aza-arenophilic樹脂或間-氨基苯基硼酸)、金屬螯合親和層析(例如具有Ni(II)-和Cu(II)親和材料)、大小排阻層析和電泳方法(如凝膠電泳、毛細(xì)管電泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。

術(shù)語“藥物組合物”指這樣的制備物，其以這樣的形式存在，使得允許包含在其中的活性成分的生物活性有效，且不包含對將要施用該組合物的個體具有不可接受的毒性的附加成分。本發(fā)明的藥物組合物可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法施用。如熟練的技術(shù)人員將理解，施用的途徑和/或方式將取決于希望得到的結(jié)果而不同。為了通過某些給藥途徑施用本發(fā)明的抗體，可以有必要用防止其失活的材料包被抗體，或者與防止其失活的材料共同施用抗體。例如，抗體可以在適當(dāng)?shù)妮d體(例如脂質(zhì)體)或稀釋劑中對個體施用?？伤幱孟♂寗┌}水和水性緩沖溶液。

藥物組合物包含有效量的本發(fā)明的抗體。藥物(agent)(例如抗體)的“有效量”指對在劑量下和必要的時間內(nèi)達(dá)到希望得到的治療或預(yù)防結(jié)果有效的量。具體而言，“有效量”指本發(fā)明的抗體的量，在對個體施用時，其(i)治療或預(yù)防具體疾病、病癥或障礙，(ii)減輕、改善或消除具體疾病、病癥或障礙的一種或多種癥狀，或(iii)預(yù)防或延遲本文所述具體疾病、病癥或障礙的一種或多種癥狀的起始。治療有效量將取決于所使用的抗體分子、所治療的疾病狀態(tài)、所治療的疾病嚴(yán)重度、個體的年齡和相對健康、施用的途徑和方式、主治醫(yī)生或獸醫(yī)的判斷及其他因素而變。

“可藥用載體”指藥物制劑中除活性成分之外的成分，其對個體無毒性?？伤幱幂d體包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。在一個實(shí)施方案中，該載體適合用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、胃腸外、脊髓或表皮施用(例如通過注射或輸注)。

本發(fā)明的藥物組合物還可以包含佐劑，如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^上文的滅菌流程及通過包含多種抗細(xì)菌和抗真菌劑(例如對羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等)二者來確保防止微生物的存在。還可以希望在組合物中包含等滲劑，例如糖、氯化鈉等。此外，可以通過包含延遲吸收的材料如單硬脂酸鋁和明膠來產(chǎn)生可注射藥物形式的延長吸收。

本文所用的短語“腸胃外施用”指腸內(nèi)和局部施用之外的施用方式，通常通過注射，且非限制性地包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。

無論選擇何種給藥途徑，都通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，將本發(fā)明的化合物(其可以以適宜的水合形式使用)和/或本發(fā)明的藥物組合物配制為可藥用劑型。

本發(fā)明的藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可以不同，以獲得對就具體患者、組合物和施用方式達(dá)到希望得到的治療反應(yīng)有效而對患者沒有毒性的活性成分量。所選擇的劑量水平將取決于多種藥代動力學(xué)因素，其包括所利用的本發(fā)明的具體組合物的活性；給藥途徑；施用時間；所利用的具體化合物的排泄速率；處理持續(xù)時間；與所利用的具體組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料；所治療的患者的年齡、性別、體重、狀態(tài)、一般健康和過往病史；和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域公知的類似因素。

組合物必須無菌，且為流體，至可通過注射器遞送組合物的程度。除水外，在一個實(shí)施方案中載體是等滲緩沖鹽溶液。

可以例如通過使用諸如卵磷脂的包衣、在分散體的情況下通過維持所需的顆粒大小及通過使用表面活性劑來維持恰當(dāng)?shù)牧鲃有浴Ｔ谠S多情況下，優(yōu)選在組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇(如甘露醇或山梨醇)和氯化鈉。

本文所用的“處理”(及其語法變形)指改變所處理的個體的自然過程的嘗試中的臨床干預(yù)，且可以為了預(yù)防而進(jìn)行或在臨床病理的過程中進(jìn)行。希望得到的處理作用包括但不限于防止疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、減輕癥狀、減少疾病的任何直接或間接的病理結(jié)果、防止轉(zhuǎn)移、降低疾病進(jìn)展的速率、改善或緩和疾病狀態(tài)及消退或改善的預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，用本發(fā)明的抗體來延遲疾病的發(fā)展或減慢疾病的進(jìn)展。

“個體(individual)”或“個體(subject)”是哺乳動物。哺乳動物包括但不限于飼養(yǎng)的動物(例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類(例如人類和非人靈長類，如猴)、兔和嚙齒類(例如小鼠和大鼠)。在某些實(shí)施方案中，該個體是人。

HER2是人表皮生長因子受體家族的成員，在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中具有蛋白激酶活性。HER2在腫瘤細(xì)胞中過量表達(dá)，與弱的預(yù)后和存活相關(guān)。HER2因此是有價值的乳腺癌治療靶標(biāo)?？笻ER2的抗體從Takai,N.等,Cancer 104(2005)2701-2708；Yeon,C.H.等,Invest.New Drugs 23(2005)391-409；Wong,W.M.等,Cancer Pract.7(1999)48-50；Albanell,J.等,Drugs Today(Barc).35(1999)931-46已知。

CD20抗原是見于超過90％的來自外周血或淋巴器官的B細(xì)胞表面上的～35kDa的非糖基化磷蛋白。CD20在早期前B細(xì)胞發(fā)育期間表達(dá)，并保持至漿細(xì)胞分化。CD20在正常B細(xì)胞以及惡性B細(xì)胞上都存在。CD20在文獻(xiàn)中的其他名稱包括“B淋巴細(xì)胞限制抗原”和“Bp35”。CD20抗原描述于例如Clark等PNAS(USA)82:1766(1985)中。

曲妥珠單抗(INN)(在本文中也稱為mAb1)是用于治療HER2過量表達(dá)/HER2基因擴(kuò)增的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的重組人源化抗HER2單克隆抗體。臨床研究表明，該抗體在體內(nèi)和體外具有抗腫瘤活性。此外，在小鼠模型中與多種抗腫瘤劑組合觀察到了曲妥珠單抗抗腫瘤活性的累加或協(xié)同增強(qiáng)。在臨床研究中，在HER2過量表達(dá)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中觀察到了存活期延長。曲妥珠單抗報(bào)道于WO 92/022653、WO 99/057134、WO 97/04801、US 5,677,171和US 5,821,337(在此引入作為參考)中。

利妥昔單抗(INN)(在本文中也稱為mAb2)是抗CD20抗原的遺傳改造嵌合鼠/人單克隆抗體，在美國專利號5,736,137(在此明確引入作為參考)中命名為“C2B8”。該抗體是包含鼠輕鏈和重鏈可變區(qū)序列及人恒定區(qū)序列的IgG1κ免疫球蛋白。

帕妥珠單抗(INN)(在本文中也稱為mAb3)是基于人IgG1(κ)構(gòu)架產(chǎn)生的重組人源化單克隆抗體。帕妥珠單抗作為人源化抗體開發(fā)，其抑制HER2與其他HER受體二聚化，從而抑制配體驅(qū)動的磷酸化和激活，及RAS和AKT途徑的下游激活。

Obinutuzumab(INN，之前稱為afutuzumab)(在本文中也稱為mAb5)是抗CD20抗原的人源化IgG1抗體。

術(shù)語“癌癥”和“癌性的”指或描述哺乳動物中通常表征為細(xì)胞生長/增殖失調(diào)的生理病癥。癌癥的實(shí)例包括但不限于癌、淋巴瘤(例如霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。這類癌癥更具體的實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、涎腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、白血病和其他淋巴增生性障礙、及多種類型的頭頸癌，

術(shù)語“炎性疾病”和“炎性障礙”可互換使用，指其中哺乳動物免疫系統(tǒng)的成分引起、介導(dǎo)或以其他方式有助于促成哺乳動物中的病態(tài)的炎癥反應(yīng)的疾病或障礙。還包括其中炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)對疾病的進(jìn)展具有改善作用的疾病。此定義內(nèi)包括免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，包括自身免疫病。

本文中的“自身免疫障礙”是由個體自身組織或器官引起且針對個體自身組織或器官的疾病或障礙，或其共分離或表現(xiàn)形式或從其產(chǎn)生的病癥。在許多這些自身免疫和炎性障礙中，可以存在許多臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)記，包括但不限于高γ球蛋白血癥、高水平自身抗體、組織中的抗原-抗體復(fù)合物沉積物、從糖皮質(zhì)激素或免疫抑制治療受益、及受影響組織中的淋巴細(xì)胞聚集體。不受限于任何理論，關(guān)于B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫障礙，認(rèn)為B細(xì)胞通過許多機(jī)制途徑在人自身免疫病中顯示致病作用，包括自身抗體產(chǎn)生、免疫復(fù)合物形成、樹突細(xì)胞和T細(xì)胞激活、細(xì)胞因子合成、直接趨化因子釋放和提供用于異位新淋巴發(fā)生的胞窩。這些途徑中的每一條可以不同程度地參與自身免疫病的病理。

“自身免疫病”可以是器官特異性疾病(即免疫反應(yīng)特異性針對器官系統(tǒng)，如內(nèi)分泌系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、皮膚、心肺系統(tǒng)、胃腸和肝系統(tǒng)、腎系統(tǒng)、甲狀腺、耳、神經(jīng)肌肉系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等)或可以影響多個器官系統(tǒng)的全身性疾病(例如全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多肌炎等)。優(yōu)選的這類疾病包括自身免疫性風(fēng)濕性障礙(例如RA、綜合征、硬皮病、狼瘡如SLE和狼瘡腎炎、多肌炎-皮肌炎、冷球蛋白血癥、抗磷脂抗體綜合征和銀屑病關(guān)節(jié)炎)、自身免疫性胃腸和肝障礙(例如炎性腸病(例如潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病)、自身免疫性胃炎和惡性貧血、自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎和乳糜瀉)、脈管炎(例如ANCA陰性脈管炎和ANCA相關(guān)脈管炎，包括Churg-Strauss脈管炎、Wegener肉芽腫和微小性多脈管炎)、自身免疫性神經(jīng)障礙(例如多發(fā)性硬化、視性眼陣攣-肌陣攣綜合征、重癥肌無力、視神經(jīng)脊髓炎、帕金森病、阿爾茨海默病和自身免疫性多神經(jīng)病)、腎障礙(例如腎小球腎炎、Goodpasture綜合征和Berger病)、自身免疫性皮膚障礙(例如銀屑病、風(fēng)疹、蕁麻疹、尋常性天皰瘡、大皰性類天皰瘡和皮膚紅斑狼瘡)、血液障礙(例如血小板減少性紫癜、血栓性血小板減少性紫癜、輸血后紫癜和自身免疫性溶血性貧血)、動脈粥樣硬化、葡萄膜炎、自身免疫性聽力病(例如內(nèi)耳病和耳聾)、Behcet病、Raynaud綜合征、器官移植和自身免疫性內(nèi)分泌障礙(例如糖尿病相關(guān)自身免疫病如胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、Addison病和自身免疫性甲狀腺病(例如Graves病和甲狀腺炎))。更優(yōu)選的這類疾病包括例如RA、潰瘍性結(jié)腸炎、ANCA相關(guān)脈管炎、狼瘡、多發(fā)性硬化、綜合征、Graves病IDDM、惡性貧血、甲狀腺炎和腎小球腎炎。

2.本發(fā)明的實(shí)施方案詳述

本發(fā)明提供具有改變的N連接聚糖譜的重組IgG1抗體，其通過酶處理糖改造為包含高量末端半乳糖殘基和可選的唾液酸殘基，從而顯示改善的介導(dǎo)ADCC的能力。此外，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生該抗體的糖改造方法。借助糖改造，可以產(chǎn)生具有基本同質(zhì)的聚糖模式的群體，其可以針對在單個類型宿主細(xì)胞的不同表達(dá)批次中產(chǎn)生的抗體可重現(xiàn)地產(chǎn)生。本發(fā)明證明，顯示N連接半乳糖基化和巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)間不同平衡的IgG1抗體顯示改善的ADCC特性。該抗體的ADCC特性可以通過借助半乳糖改造加入(末端)半乳糖殘基來調(diào)整。通過糖改造加入末端唾液酸殘基保留了ADCC特性，但此外可以改善抗體的生物學(xué)特性(例如增加血清半衰期)。

a)抗體

在一方面，本發(fā)明涉及半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體，其包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體。

在一方面，本發(fā)明涉及半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體，其包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及體外糖改造的重組IgG1同種型抗體，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率至多100％的Fc半乳糖基化抗體(包括單半乳糖基化和雙半乳糖基化聚糖結(jié)構(gòu))。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率至多99.5％的Fc半乳糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率至多95％的Fc半乳糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率至多90％的Fc半乳糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率80％至99.5％的Fc半乳糖基化抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率至多98％的Fc雙半乳糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率至多95％的Fc雙半乳糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率至多90％的Fc雙半乳糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率70％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體。在本一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體。在本一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率80％至90％的Fc雙半乳糖基化抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率至多16％的Fc無巖藻糖基化抗體。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率至少2％的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率至少5％的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率至少7％的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率2-20％的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率5-20％的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率8-12％的Fc無巖藻糖基化抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體群體未進(jìn)行糖改造來改善無巖藻糖基化。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率對應(yīng)于在相同宿主細(xì)胞中表達(dá)的抗體中Fc無巖藻糖基化的相對頻率的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率對應(yīng)于在CHO細(xì)胞中表達(dá)的抗體的Fc無巖藻糖基化的相對頻率的Fc無巖藻糖基化抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率至多98％的Fc唾液酸化抗體(包括單唾液酸化和雙唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu))。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率至多97％的Fc唾液酸化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率至多95％的Fc唾液酸化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率至多90％的Fc唾液酸化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率50％至80％的Fc唾液酸化抗體。

在一個實(shí)施方案中，該唾液酸化抗體包含NANA或NGNA作為唾液酸。在一個實(shí)施方案中，該唾液酸化抗體包含NANA作為唾液酸。在一個實(shí)施方案中，該唾液酸化抗體包含NANA作為唾液酸，且不包含NGNA。

在一個實(shí)施方案中，該抗體群體基本不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。在一個實(shí)施方案中，基本不含不同糖殘基的抗體群體以2％或更低的相對頻率包含含有該不同糖殘基的抗體。在一個實(shí)施方案中，基本不含不同糖殘基的抗體群體以1％或更低的相對頻率包含含有該不同糖殘基的抗體。在一個實(shí)施方案中，基本不含不同糖殘基的抗體群體以0.5％或更低的相對頻率包含含有該不同糖殘基的抗體。

在一個實(shí)施方案中，該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體(包括單半乳糖基化和雙半乳糖基化聚糖結(jié)構(gòu))，相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體，及可選的相對頻率20-98％的Fc唾液酸化抗體(包括單唾液酸化和雙唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu))。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體，相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體，及可選的相對頻率至多20-98％的Fc唾液酸化抗體，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體(包括單半乳糖基化和雙半乳糖基化聚糖結(jié)構(gòu))，相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體，及可選的相對頻率20-90％的Fc唾液酸化抗體(包括單唾液酸化和雙唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu))。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體，相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體，及可選的相對頻率20-90％的Fc唾液酸化抗體，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體，相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體，及可選的相對頻率20-98％的Fc唾液酸化抗體(包括單唾液酸化和雙唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu))。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體，相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體，及可選的相對頻率20-98％的Fc唾液酸化抗體(包括單唾液酸化和雙唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu))，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率80％至90％的Fc雙半乳糖基化抗體，相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率80％至90％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體，其中該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在一個實(shí)施方案中，該抗體在定位于重鏈CH2結(jié)構(gòu)域中294和300位(按照Kabat的EU指數(shù)的編號)之間的天冬酰胺殘基處包含糖基化位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，該抗體在定位于重鏈CH2結(jié)構(gòu)域中的294和300位(按照Kabat的EU指數(shù)的編號)之間的天冬酰胺殘基處包含糖基化位點(diǎn)，且不包含其他糖基化位點(diǎn)。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該重組抗體在Fab區(qū)中不包含糖基化位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在Fab區(qū)中不包含N連接聚糖的糖基化位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的Fab區(qū)不包含以下氨基酸序列：Asn-X-Ser和Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸外的氨基酸，Ser是絲氨酸，Thr是蘇氨酸。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體屬于人IgG1同種型。在一個實(shí)施方案中，該抗體是人抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體是人源化抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體是嵌合鼠/人抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體是全長IgG1抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體是單克隆抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體是單克隆全長人IgG1同種型抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體屬于含有突變L234A和L235A(按照Kabat的EU指數(shù)的編號)的人IgG1同種型。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體屬于含有突變L234A、L235A和P329G(按照Kabat的EU指數(shù)的編號)的人IgG1同種型。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該重組IgG1抗體的作用方式是誘導(dǎo)ADCC。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體是單特異性抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體是多特異性抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體是二價或三價抗體。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體是二價抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體曲妥珠單抗、利妥昔單抗、帕妥珠單抗和obinutuzumab。

在一個實(shí)施方案中，該抗體特異性結(jié)合HER2。在一個實(shí)施方案中，該抗體特異性結(jié)合HER2，且包含SEQ ID NO:1的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:2的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，該抗體是曲妥珠單抗。

在一個實(shí)施方案中，該抗體特異性結(jié)合CD20。在一個實(shí)施方案中，該抗體特異性結(jié)合CD20，且包含SEQ ID NO:3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:4的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，該抗體是利妥昔單抗。

在一個實(shí)施方案中，該抗體特異性結(jié)合HER2。在一個實(shí)施方案中，該抗體特異性結(jié)合HER2，且包含SEQ ID NO:5的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:6的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，該抗體是pertuzumab。

在一個實(shí)施方案中，該抗體特異性結(jié)合CD20。在一個實(shí)施方案中，該抗體特異性結(jié)合CD20，且包含SEQ ID NO:7的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:8的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，該抗體是obinutuzumab。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體是體外半乳糖改造的抗體。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該抗體是體內(nèi)半乳糖改造的抗體。

b)方法

本發(fā)明的另一方面是用于產(chǎn)生半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)遺傳改造該宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化，使得獲得該半乳糖改造的重組抗體群體，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體。

本發(fā)明的另一方面是用于產(chǎn)生半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)遺傳改造該宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化，使得獲得該半乳糖改造的重組抗體群體，其包含相對頻率至少80％的Fc雙半乳糖基化抗體(包括單半乳糖基化和雙半乳糖基化聚糖結(jié)構(gòu))。

本發(fā)明的另一方面是用于產(chǎn)生半乳糖改造的抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)分離該重組抗體群體；

c)用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶酶處理該抗體群體，以獲得該半乳糖改造的重組抗體群體，其包含相對頻率至少80％的Fc雙半乳糖基化抗體(包括單半乳糖基化和雙半乳糖基化聚糖結(jié)構(gòu))，隨后從該酶分離該半乳糖改造的重組抗體群體。

本發(fā)明的另一方面是用于產(chǎn)生半乳糖改造的抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)分離該重組抗體群體；

c)用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶酶處理該抗體群體，以獲得該半乳糖改造的重組抗體群體，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體，隨后從該酶分離該半乳糖改造的重組抗體群體。

在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，該抗體群體包含相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生上述半乳糖改造的重組抗體群體的方法，該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生上述半乳糖改造的重組抗體群體的方法，該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

以上方法適合用于產(chǎn)生包含高量的半乳糖基化尤其是雙半乳糖基化的N連接聚糖結(jié)構(gòu)的抗體群體。通過本發(fā)明的方法，包含IgG1分子的抗體群體介導(dǎo)ADCC的能力得到改善。在一個實(shí)施方案中，該IgG1分子與至少一種激活FcγR的結(jié)合得到改善。在一個實(shí)施方案中，該IgG1分子與FcγRIIIa的結(jié)合得到改善。在一個實(shí)施方案中，該IgG1分子與FcγRIIa的結(jié)合得到改善。

在一個實(shí)施方案中，該方法用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率低于25％的Fc無半乳糖基化抗體。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該半乳糖改造的重組抗體群體包含至多100％的Fc半乳糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率至多99.5％的Fc半乳糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率至多95％的Fc半乳糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率至多90％的Fc半乳糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80％至99.5％的Fc半乳糖基化抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率至多98％的Fc雙半乳糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率至多95％的Fc雙半乳糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率至多90％的Fc雙半乳糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率70％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80％至90％的Fc雙半乳糖基化抗體。

在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，步驟a)中獲得的重組抗體群體包含相對頻率至多16％的Fc無巖藻糖基化抗體。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，步驟a)中獲得的重組抗體群體包含相對頻率至少2％的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，步驟a)中獲得的重組抗體群體包含相對頻率至少5％的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，步驟a)中獲得的重組抗體群體包含相對頻率至少7％的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，步驟a)中獲得的重組抗體群體包含相對頻率至少8％的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，步驟a)中獲得的重組抗體群體包含相對頻率低于16％的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，步驟a)中獲得的重組抗體群體包含相對頻率2％至20％的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，步驟a)中獲得的重組抗體群體包含相對頻率5％至15％的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，步驟a)中獲得的重組抗體群體包含相對頻率7％至16％的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，步驟a)中獲得的重組抗體群體包含相對頻率8％至12％的Fc無巖藻糖基化抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該重組抗體在Fab區(qū)中不包含糖基化位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在Fab區(qū)中不包含N連接聚糖的糖基化位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的Fab區(qū)不包含以下氨基酸序列：Asn-X-Ser和Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸外的氨基酸，Ser是絲氨酸，Thr是蘇氨酸。

在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，關(guān)于遺傳改造宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化的步驟是通過在該宿主細(xì)胞中過量表達(dá)能夠提高Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率的酶來進(jìn)行。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，該能夠提高Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率的酶是半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，該能夠提高Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率的酶是β-(1-4)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，關(guān)于遺傳改造宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化的步驟是通過在該宿主細(xì)胞中過量表達(dá)能夠提高Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率的酶來進(jìn)行。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，該能夠提高Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率的酶是半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，該能夠提高Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率的酶是β-(1-4)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。

在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，關(guān)于遺傳改造宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化的步驟是通過降低該宿主細(xì)胞中能夠降低Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率的酶的表達(dá)或通過敲除該宿主細(xì)胞中能夠降低Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率的酶來進(jìn)行。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，該能夠降低Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率的酶是半乳糖苷酶。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，該能夠降低Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率的酶是β(1-4)-半乳糖苷酶。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，關(guān)于遺傳改造宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化的步驟是通過降低該宿主細(xì)胞中能夠降低Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率的酶的表達(dá)或通過敲除該宿主細(xì)胞中能夠降低Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率的酶來進(jìn)行。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，該能夠降低Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率的酶是半乳糖苷酶。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，該能夠降低Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率的酶是β(1-4)-半乳糖苷酶。

在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，關(guān)于遺傳改造宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化的步驟是通過在該宿主細(xì)胞中過量表達(dá)能夠提高Fc半乳糖基化抗體的相對頻率的酶來進(jìn)行。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，該能夠提高Fc半乳糖基化抗體的相對頻率的酶是半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，該能夠提高Fc半乳糖基化抗體的相對頻率的酶是β-(1-4)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，關(guān)于遺傳改造宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化的步驟是通過在該宿主細(xì)胞中過量表達(dá)能夠提高Fc半乳糖基化抗體的相對頻率的酶來進(jìn)行。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，該能夠提高Fc半乳糖基化抗體的相對頻率的酶是半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，該能夠提高Fc半乳糖基化抗體的相對頻率的酶是β-(1-4)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。

在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，關(guān)于遺傳改造宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化的步驟是通過降低該宿主細(xì)胞中能夠降低Fc半乳糖基化抗體的相對頻率的酶的表達(dá)或通過敲除該宿主細(xì)胞中能夠降低Fc半乳糖基化抗體的相對頻率的酶來進(jìn)行。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，該能夠降低Fc半乳糖基化抗體的相對頻率的酶是半乳糖苷酶。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，該能夠降低Fc半乳糖基化抗體的相對頻率的酶是β(1-4)-半乳糖苷酶。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，關(guān)于遺傳改造宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化的步驟是通過降低該宿主細(xì)胞中能夠降低Fc半乳糖基化抗體的相對頻率的酶的表達(dá)或通過敲除該宿主細(xì)胞中能夠降低Fc半乳糖基化抗體的相對頻率的酶來進(jìn)行。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，該能夠降低Fc半乳糖基化抗體的相對頻率的酶是半乳糖苷酶。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，該能夠降低Fc半乳糖基化抗體的相對頻率的酶是β(1-4)-半乳糖苷酶。

在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，遺傳改造宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化是通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，可以通過選自同源重組、使用鋅指核酸酶、RNA干擾(RNAi)和micro RNA(miRNA)的方法，來降低宿主細(xì)胞中能夠降低Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率的酶的表達(dá)，或敲除宿主細(xì)胞中能夠降低Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率的酶。在一個實(shí)施方案中，提高Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率可以通過生產(chǎn)工藝開發(fā)來進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，提高Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率可以通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中補(bǔ)充半乳糖來進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，提高Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率可以通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中補(bǔ)充谷氨酸來進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，提高Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率可以通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中用谷氨酸替代谷氨酰胺來進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，提高Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率可以通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中補(bǔ)充錳來進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，在宿主細(xì)胞中過量表達(dá)能夠提高Fc雙半乳糖基化抗體的相對頻率的酶可以通過用氨甲蝶呤選擇壓力產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)該酶的細(xì)胞系來進(jìn)行。

在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，遺傳改造宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化是通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，可以通過選自同源重組、使用鋅指核酸酶、RNA干擾(RNAi)和micro RNA(miRNA)的方法，來降低宿主細(xì)胞中能夠降低Fc半乳糖基化抗體的相對頻率的酶的表達(dá)，或敲除宿主細(xì)胞中能夠降低Fc半乳糖基化抗體的相對頻率的酶。在一個實(shí)施方案中，提高Fc半乳糖基化抗體的相對頻率可以通過生產(chǎn)工藝開發(fā)來進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，提高Fc半乳糖基化抗體的相對頻率可以通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中補(bǔ)充半乳糖來進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，提高Fc半乳糖基化抗體的相對頻率可以通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中補(bǔ)充谷氨酸來進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，提高Fc半乳糖基化抗體的相對頻率可以通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中用谷氨酸替代谷氨酰胺來進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，提高Fc半乳糖基化抗體的相對頻率可以通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中補(bǔ)充錳來進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，在宿主細(xì)胞中過量表達(dá)能夠提高Fc半乳糖基化抗體的相對頻率的酶可以通過用氨甲蝶呤選擇壓力產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)該酶的細(xì)胞系來進(jìn)行。

在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，步驟c)的酶處理在30-38℃進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，步驟c)的酶處理在31-38℃進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，步驟c)的酶處理在31-35℃進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，步驟c)的酶處理在約32℃進(jìn)行。

在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，步驟c)的酶處理在pH 6-7的溶液中進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，步驟c)的酶處理在pH 6.3-6.8的溶液中進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，步驟c)的酶處理在約pH 6.5的溶液中進(jìn)行。

在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，步驟c)的酶處理進(jìn)行至少150分鐘。在一個實(shí)施方案中，步驟c)的酶處理進(jìn)行至少2小時。在一個實(shí)施方案中，步驟c)的酶處理進(jìn)行至多150小時。在一個實(shí)施方案中，步驟c)的酶處理進(jìn)行至少150分鐘。

在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6-7的溶液中，30-35℃下酶處理該抗體群體至少150分鐘。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6.3-6.8的溶液中，31-34℃下酶處理該抗體群體至少150分鐘。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6.3-6.8的溶液中，31-34℃下酶處理該抗體群體2-150小時。在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在約pH 6.5的溶液中，約32℃下酶處理該抗體群體2-150小時。

在一個實(shí)施方案中，步驟c)在半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和UDP-半乳糖(尿苷二磷酸半乳糖)的存在下進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，步驟c)在半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、UDP-半乳糖和MnCl₂的存在下進(jìn)行。

在一個實(shí)施方案中，該半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是能夠?qū)肴樘菑腢DP-半乳糖轉(zhuǎn)移至寡糖的N乙酰葡糖胺殘基的β(1-4)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。

在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，在宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，其中未遺傳改造宿主細(xì)胞來改善或削弱蛋白質(zhì)巖藻糖基化。在一個實(shí)施方案中，在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生抗體，其中宿主細(xì)胞不顯示由宿主細(xì)胞的遺傳改變引起的巖藻糖轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)改變(例如減少)，且其中宿主細(xì)胞能夠表達(dá)至少一部分巖藻糖基化蛋白質(zhì)。

在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞或小鼠骨髓瘤細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞未遺傳改造來改善或削弱蛋白質(zhì)巖藻糖基化的CHO細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞是不顯示由CHO細(xì)胞的遺傳改變引起的巖藻糖轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)改變(例如減少)的CHO細(xì)胞，且其中該CHO細(xì)胞能夠表達(dá)至少一部分巖藻糖基化蛋白質(zhì)。

在一個實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞能夠表達(dá)含有相對頻率至多20％的Fc無巖藻糖基化抗體的抗體群體。在一個實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞能夠表達(dá)含有相對頻率至多16％的Fc無巖藻糖基化抗體的抗體群體。在一個實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞能夠表達(dá)含有相對頻率至少2％的Fc無巖藻糖基化抗體的抗體群體。在一個實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞能夠表達(dá)含有相對頻率至少5％的Fc無巖藻糖基化抗體的抗體群體。在一個實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞能夠表達(dá)含有相對頻率至少7％的Fc無巖藻糖基化抗體的抗體群體。在一個實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞能夠表達(dá)含有相對頻率至少8％的Fc無巖藻糖基化抗體的抗體群體。在一個實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞能夠表達(dá)含有相對頻率5％至20％的Fc無巖藻糖基化抗體的抗體群體。在一個實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞能夠表達(dá)含有相對頻率7％至16％的Fc無巖藻糖基化抗體的抗體群體。在一個實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞能夠表達(dá)含有相對頻率8％至12％的Fc無巖藻糖基化抗體的抗體群體。

在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法不包括從抗體的N連接聚糖結(jié)構(gòu)體外加入或體外切割巖藻糖殘基。在一個實(shí)施方案中，遺傳改造宿主細(xì)胞以改善或削弱蛋白質(zhì)巖藻糖基化，且本發(fā)明的方法不包括從抗體的N連接聚糖結(jié)構(gòu)體外加入或體外切割巖藻糖殘基。在一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是未遺傳改造以改善或削弱蛋白質(zhì)巖藻糖基化的CHO細(xì)胞，且本發(fā)明的方法不包括從抗體的N連接聚糖結(jié)構(gòu)體外加入或體外切割巖藻糖殘基。

因此，在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體(包括單半乳糖基化和雙半乳糖基化聚糖結(jié)構(gòu))和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率至多80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在一個實(shí)施方案中，半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80％至90％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體(包括單半乳糖基化和雙半乳糖基化聚糖結(jié)構(gòu))和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率至多80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6-7的溶液中，30-38℃下酶處理該抗體群體至少150分鐘，由此使步驟c)中獲得的抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6-7的溶液中，30-38℃下酶處理該抗體群體至少150分鐘，由此使步驟c)中獲得的抗體群體包含相對頻率至多80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6.3-6.8的溶液中，31-35℃下酶處理該抗體群體至少150分鐘，由此使步驟c)中獲得的抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6.3-6.8的溶液中，31-35℃下酶處理該抗體群體至少150分鐘，由此使步驟c)中獲得的抗體群體包含相對頻率至多80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的方法之一的一個實(shí)施方案中，對步驟c)中獲得的抗體群體(其N連接聚糖結(jié)構(gòu)為高半乳糖基化的)進(jìn)行步驟d)用唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行酶處理，以獲得包含相對頻率至多98％的Fc唾液酸化抗體(包括單唾液酸化和雙唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu))的抗體群體，隨后從該唾液酸轉(zhuǎn)移酶分離唾液酸化抗體群體。

步驟d)有利于產(chǎn)生包含高相對頻率的唾液酸化IgG1分子的抗體群體。通過用CMP-NANA(胞苷-5’-單磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸)作為活化糖，可以有利地產(chǎn)生僅包含NANA殘基的同質(zhì)群體。

在一個實(shí)施方案中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理在35-40℃進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理在36-38℃進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理在約37℃進(jìn)行。

在一個實(shí)施方案中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理在pH 6-9的溶液中進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理在pH 6.5-8.5的溶液中進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理在約pH 7至約pH 8的溶液中進(jìn)行。

在一個實(shí)施方案中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理進(jìn)行至少150分鐘。在一個實(shí)施方案中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理進(jìn)行至少2小時。在一個實(shí)施方案中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理進(jìn)行至2-120小時。

在一個實(shí)施方案中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理按以下條件進(jìn)行：

i)在第一步中，使唾液酸轉(zhuǎn)移酶和在本發(fā)明的方法之一的步驟c)中獲得的抗體群體在上文所示溫度下在pH 6-8(在一個實(shí)施方案中為pH 6.5-7.5)的溶液中接觸至少150分鐘(在一個實(shí)施方案中為2-80小時)；和

ii)可選地，在第二步中，使唾液酸轉(zhuǎn)移酶和步驟i)中獲得的抗體群體在上文所示溫度下在溶液中接觸至少150分鐘(在一個實(shí)施方案中為2至10小時)。

通過包括步驟i)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理，可以獲得具有高相對頻率的單唾液酸化N連接聚糖結(jié)構(gòu)的抗體群體。因此，在一個實(shí)施方案中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理包括步驟(i)(或由步驟i)組成)。包括上文所示步驟ii)的另一處理導(dǎo)致產(chǎn)生具有高相對頻率的雙唾液酸化N連接聚糖結(jié)構(gòu)的抗體群體。因此，在一個實(shí)施方案中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理包括步驟i)和ii)。

在一個實(shí)施方案中，步驟i)或可選地步驟i)和ii)中所示的唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理進(jìn)行總計(jì)至多120小時的時間。

在一個實(shí)施方案中，步驟d)在唾液酸轉(zhuǎn)移酶和CMP-NANA的存在下進(jìn)行。

在一個實(shí)施方案中，該唾液酸轉(zhuǎn)移酶是能夠?qū)⑼僖核?NANA)從CMP-NANA轉(zhuǎn)移至寡糖的末端半乳糖殘基的α(2-6)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶。在一個實(shí)施方案中，該唾液酸轉(zhuǎn)移酶是能夠?qū)⑼僖核?NANA)從CMP-NANA轉(zhuǎn)移至寡糖的末端半乳糖殘基的α(2-3)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶。

在一個實(shí)施方案中，步驟i)用包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的α(2-6)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，步驟ii)用包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的α(2-6)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，該方法包括步驟i)和ii)，且步驟i)用包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的α(2-6)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行，步驟ii)用包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的α(2-6)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，步驟d)中獲得的抗體群體包含相對頻率至多97％的Fc唾液酸化抗體。在一個實(shí)施方案中，步驟d)中獲得的抗體群體包含相對頻率至多95％的Fc唾液酸化抗體。在一個實(shí)施方案中，步驟d)中獲得的抗體群體包含相對頻率至多90％的Fc唾液酸化抗體。在一個實(shí)施方案中，步驟d)中獲得的抗體群體包含相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。在一個實(shí)施方案中，步驟d)中獲得的抗體群體包含相對頻率50％至80％的Fc唾液酸化抗體。

在一個實(shí)施方案中，該唾液酸是5-N-乙酰神經(jīng)氨酸(NANA)或5-N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NGNA)。在一個實(shí)施方案中，該唾液酸是NANA。在一個實(shí)施方案中，該唾液酸是NGNA。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，步驟d)中獲得的抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率70％至90％的Fc唾液酸化抗體。在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且步驟d)中獲得的抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體，其中該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，步驟d)中獲得的抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率7-16％的的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且步驟d)中獲得的抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率7-16％的的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體，其中該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，步驟d)中獲得的抗體群體包含相對頻率80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，步驟d)中獲得的抗體群體包含相對頻率80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體，其中該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，步驟d)中獲得的抗體群體包含相對頻率80％至90％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，步驟d)中獲得的抗體群體包含相對頻率80％至90％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體，其中該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體(包括單半乳糖基化和雙半乳糖基化聚糖結(jié)構(gòu))、相對頻率低于20％的的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6-7的溶液中，30-38℃下酶處理該抗體群體至少150分鐘，由此使步驟c)中獲得的抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6-7的溶液中，30-38℃下酶處理該抗體群體至少150分鐘，由此使步驟c)中獲得的抗體群體包含相對頻率至多80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6.3-6.8的溶液中，31-35℃下酶處理該抗體群體至少150分鐘，由此使步驟c)中獲得的抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6.3-6.8的溶液中，31-35℃下酶處理該抗體群體至少150分鐘，由此使步驟c)中獲得的抗體群體包含相對頻率至多80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體，且該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6-7的溶液中，30-38℃下酶處理該抗體群體至少150分鐘，且按以下條件進(jìn)行唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理：

i)使唾液酸轉(zhuǎn)移酶和步驟c)中獲得的抗體群體在上文所示溫度下在pH 6-8(在一個實(shí)施方案中為pH 6.5-7.5)的溶液中接觸至少150分鐘(在一個實(shí)施方案中為2-120小時)。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體，且步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6.3-6.8的溶液中，31-35℃下酶處理該抗體群體至少150分鐘，且按以下條件進(jìn)行唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理：

i)在第一步中，使唾液酸轉(zhuǎn)移酶和步驟c)中獲得的抗體群體在上文所示溫度下在pH 6-8(在一個實(shí)施方案中為pH 6.5-7.5)的溶液中接觸至少150分鐘(在一個實(shí)施方案中為2-120小時)；和

ii)在第二步中，使唾液酸轉(zhuǎn)移酶和步驟i)中獲得的抗體群體在上文所示溫度下在pH 6-8的溶液中再接觸至少150分鐘(在一個實(shí)施方案中為2至10小時)。

在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涵蓋向包含在進(jìn)行半乳糖改造的抗體群體內(nèi)的至少一部分抗體加入至少一個半乳糖殘基。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涵蓋向包含在進(jìn)行半乳糖改造的抗體群體內(nèi)的至少一部分抗體加入至少一個半乳糖殘基，以達(dá)到相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涵蓋向包含在進(jìn)行半乳糖改造的抗體群體內(nèi)的至少一部分抗體加入至少一個半乳糖殘基，以達(dá)到相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體。

在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，該抗體選自曲妥珠單抗、利妥昔單抗、帕妥珠單抗和obinutuzumab。本發(fā)明的另一方面是通過本發(fā)明的方法獲得的半乳糖改造的重組IgG1抗體群體。

c)藥物組合物、治療

本發(fā)明的另一方面是包含本發(fā)明的半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體群體的藥物組合物。本發(fā)明的一方面是與至少一種可藥用載體組合包含本發(fā)明的半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體群體的藥物組合物。

本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的藥物組合物用作藥物。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的藥物組合物用于治療癌癥。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的藥物組合物用于治療炎性障礙。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的藥物組合物用于治療自身免疫障礙。

本發(fā)明的另一方面是通過對需要這種治療的患者施用本發(fā)明的半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體來治療患有疾病的患者的方法。本發(fā)明的另一方面是通過對需要這種治療的患者施用本發(fā)明的半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體來治療患有癌癥疾病的患者的方法。本發(fā)明的另一方面是通過對需要這種治療的患者施用本發(fā)明的半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體來治療患有炎性障礙的患者的方法。本發(fā)明的另一方面是通過對需要這種治療的患者施用本發(fā)明的半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體來治療患有自身免疫障礙的患者的方法。

本發(fā)明的另一方面是通過對需要這種治療的患者施用本發(fā)明的藥物組合物來治療患有疾病的患者的方法。本發(fā)明的另一方面是通過對需要這種治療的患者施用本發(fā)明的藥物組合物來治療患有癌癥的患者的方法。本發(fā)明的另一方面是通過對需要這種治療的患者施用本發(fā)明的藥物組合物來治療患有炎性障礙的患者的方法。本發(fā)明的另一方面是通過對需要這種治療的患者施用本發(fā)明的藥物組合物來治療患有自身免疫障礙的患者的方法。

d)本發(fā)明的抗體的用途和方法

本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的方法在改善由該重組IgG1同種型抗體群體介導(dǎo)的ADCC中的用途。

本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的方法在改善重組抗體與FcγRIIa和FcγRIIIa的結(jié)合親和力中的用途。

本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的半乳糖改造的重組抗體群體在介導(dǎo)ADCC中的用途。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的半乳糖改造的重組抗體群體在招募和/或激活天然殺傷細(xì)胞中的用途。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的半乳糖改造的重組抗體群體在激活包含F(xiàn)cγR的效應(yīng)細(xì)胞中的用途。

本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的半乳糖改造的重組抗體群體用作藥物。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的半乳糖改造的重組抗體群體用于治療癌癥。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的半乳糖改造的重組抗體群體用于治療炎性障礙。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的半乳糖改造的重組抗體群體用于治療自身免疫障礙。

3.本發(fā)明的具體實(shí)施方案

以下項(xiàng)目進(jìn)一步提供本公開的具體方面和實(shí)施本文提供的教導(dǎo)的具體實(shí)施方案。

1.半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體群體，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

2.實(shí)施方案1的抗體群體，其包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

3.實(shí)施方案1的抗體群體，其包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體。

4.實(shí)施方案1的抗體群體，其包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

5.實(shí)施方案1的抗體群體，其包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

6.實(shí)施方案1至5中任一個的抗體群體，其中抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

7.實(shí)施方案1至6中任一個的抗體群體，其中抗體的Fab區(qū)不包含以下氨基酸序列：Asn-X-Ser和Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸外的氨基酸，Ser是絲氨酸，Thr是蘇氨酸。

8.實(shí)施方案1至7中任一個的抗體群體，其中抗體是單克隆全長人IgG1同種型抗體。

9.實(shí)施方案1至7中任一個的抗體群體，其中抗體是人源化抗體。

10.實(shí)施方案1至7中任一個的抗體群體，其中抗體選自曲妥珠單抗、利妥昔單抗、帕妥珠單抗和obinutuzumab。

11.實(shí)施方案1至10中任一個的抗體群體，其中抗體是體外半乳糖改造的重組抗體。

12.實(shí)施方案1至10中任一個的抗體群體，其中抗體是體內(nèi)半乳糖改造的重組抗體。

13.半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體群體，其包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

14.實(shí)施方案13的抗體群體，其包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

15.實(shí)施方案13的抗體群體，其包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體。

16.實(shí)施方案13的抗體群體，其包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

17.實(shí)施方案13的抗體群體，其包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率低于7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

18.實(shí)施方案13至17中任一個的抗體群體，其中抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

19.實(shí)施方案13至18中任一個的抗體群體，其中抗體的Fab區(qū)不包含以下氨基酸序列：Asn-X-Ser和Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸外的氨基酸，Ser是絲氨酸，Thr是蘇氨酸。

20.實(shí)施方案13至19中任一個的抗體群體，其中抗體是單克隆全長人IgG1同種型抗體。

21.實(shí)施方案13至20中任一個的抗體群體，其中抗體是人源化抗體。

22.實(shí)施方案13至21中任一個的抗體群體，其中抗體選自曲妥珠單抗、利妥昔單抗、帕妥珠單抗和obinutuzumab。

23.實(shí)施方案13至21中任一個的抗體群體，其中抗體是體外半乳糖改造的重組抗體。

24.實(shí)施方案13至21中任一個的抗體群體，其中抗體是體內(nèi)半乳糖改造的重組抗體。

25.半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體群體，其中抗體特異性結(jié)合HER2且包含SEQ ID NO:1的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:2的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

26.半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體群體，其中抗體特異性結(jié)合CD20且包含SEQ ID NO:3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:4的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

27.半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體群體，其中抗體特異性結(jié)合HER2且包含SEQ ID NO:5的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:6的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

28.半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體群體，其中抗體特異性結(jié)合CD20且包含SEQ ID NO:7的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:8的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

29.實(shí)施方案25至28中任一個的抗體群體，其包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

30.實(shí)施方案25至28中任一個的抗體群體，其包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體。

31.實(shí)施方案25至28中任一個的抗體群體，其包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

32.實(shí)施方案25至28中任一個的抗體群體，其包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

33.實(shí)施方案25至32中任一個的抗體群體，其中抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

34.實(shí)施方案25至33中任一個的抗體群體，其中抗體的Fab區(qū)不包含以下氨基酸序列：Asn-X-Ser和Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸外的氨基酸，Ser是絲氨酸，Thr是蘇氨酸。

35.實(shí)施方案25至34中任一個的抗體群體，其中抗體是單克隆全長人IgG1同種型抗體。

36.實(shí)施方案25至35中任一個的抗體群體，其中抗體是人源化抗體。

37.實(shí)施方案25至36中任一個的抗體群體，其中抗體是體外半乳糖改造的重組抗體。

38.實(shí)施方案25至36中任一個的抗體群體，其中抗體是體內(nèi)半乳糖改造的重組抗體。

39.半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體群體，其中抗體特異性結(jié)合HER2且包含SEQ ID NO:1的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:2的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

40.半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體群體，其中抗體特異性結(jié)合CD20且包含SEQ ID NO:3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:4的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

41.半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體群體，其中抗體特異性結(jié)合HER2且包含SEQ ID NO:5的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:6的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

42.半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體群體，其中抗體特異性結(jié)合CD20且包含SEQ ID NO:7的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:8的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

43.實(shí)施方案39至42中任一個的抗體群體，其包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

44.實(shí)施方案39至42中任一個的抗體群體，其包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體。

45.實(shí)施方案39至42中任一個的抗體群體，其包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

46.實(shí)施方案39至42中任一個的抗體群體，其包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

47.實(shí)施方案39至46中任一個的抗體群體，其中抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

48.實(shí)施方案39至47中任一個的抗體群體，其中抗體的Fab區(qū)不包含以下氨基酸序列：Asn-X-Ser和Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸外的氨基酸，Ser是絲氨酸，Thr是蘇氨酸。

49.實(shí)施方案39至48中任一個的抗體群體，其中抗體是單克隆全長人IgG1同種型抗體。

50.實(shí)施方案39至49中任一個的抗體群體，其中抗體是人源化抗體。

51.實(shí)施方案39至50中任一個的抗體群體，其中抗體是體外半乳糖改造的重組抗體。

52.實(shí)施方案39至50中任一個的抗體群體，其中抗體是體內(nèi)半乳糖改造的重組抗體。

53.半乳糖改造的曲妥珠單抗群體，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

54.半乳糖改造的利妥昔單抗群體，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

55.半乳糖改造的帕妥珠單抗群體，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

56.半乳糖改造的obinutuzumab群體，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

57.實(shí)施方案53至56中任一個的抗體群體，其包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

58.實(shí)施方案53至56中任一個的抗體群體，其包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體。

59.實(shí)施方案53至56中任一個的抗體群體，其包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

60.實(shí)施方案53至56中任一個的抗體群體，其包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

61.實(shí)施方案53至60中任一個的抗體群體，其中抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

62.半乳糖改造的曲妥珠單抗群體，其包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

63.半乳糖改造的利妥昔單抗群體，其包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

64.半乳糖改造的帕妥珠單抗群體，其包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

65.半乳糖改造的obinutuzumab群體，其包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

66.實(shí)施方案62至65中任一個的抗體群體，其包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

67.實(shí)施方案62至65中任一個的抗體群體，其包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體。

68.實(shí)施方案62至65中任一個的抗體群體，其包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

69.實(shí)施方案62至65中任一個的抗體群體，其包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

70.實(shí)施方案62至69中任一個的抗體群體，其中抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

71.用于產(chǎn)生半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)遺傳改造該宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化，使得獲得該半乳糖改造的重組抗體群體，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

72.實(shí)施方案71的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

73.實(shí)施方案71的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體。

74.實(shí)施方案71的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

75.實(shí)施方案71的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

76.實(shí)施方案71至75中任一個的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

77.實(shí)施方案71至76中任一個的方法，其中抗體的Fab區(qū)不包含以下氨基酸序列：Asn-X-Ser和Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸外的氨基酸，Ser是絲氨酸，Thr是蘇氨酸。

78.實(shí)施方案71至77中任一個的方法，其中抗體是單克隆全長人IgG1同種型抗體。

79.實(shí)施方案71至78中任一個的方法，其中抗體是人源化抗體。

80.實(shí)施方案71至79中任一個的方法，其中抗體是體內(nèi)半乳糖改造的抗體。

81.實(shí)施方案71至80中任一個的方法，其中抗體選自曲妥珠單抗、利妥昔單抗、帕妥珠單抗和obinutuzumab。

82.實(shí)施方案71至81中任一個的方法，其中宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。

83.實(shí)施方案71至81中任一個的方法，其中宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。

84.實(shí)施方案71至83中任一個的方法，其中未遺傳改造宿主細(xì)胞以改善或削弱蛋白質(zhì)巖藻糖基化，且該方法不包括從抗體的N連接聚糖結(jié)構(gòu)體內(nèi)加入或體內(nèi)切割巖藻糖殘基。

85.用于產(chǎn)生半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)遺傳改造該宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化，使得獲得該半乳糖改造的重組抗體群體，其包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

86.實(shí)施方案85的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

87.實(shí)施方案85的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體。

88.實(shí)施方案85的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

89.實(shí)施方案85的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

90.實(shí)施方案85至89中任一個的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

91.實(shí)施方案85至90中任一個的方法，其中抗體的Fab區(qū)不包含以下氨基酸序列：Asn-X-Ser和Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸外的氨基酸，Ser是絲氨酸，Thr是蘇氨酸。

92.實(shí)施方案85至91中任一個的方法，其中抗體是單克隆全長人IgG1同種型抗體。

93.實(shí)施方案85至92中任一個的方法，其中抗體是人源化抗體。

94.實(shí)施方案85至93中任一個的方法，其中抗體是體內(nèi)半乳糖改造的抗體。

95.實(shí)施方案85至94中任一個的方法，其中抗體選自曲妥珠單抗、利妥昔單抗、帕妥珠單抗和obinutuzumab。

96.實(shí)施方案85至95中任一個的方法，其中宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。

97.實(shí)施方案85至96中任一個的方法，其中宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。

98.實(shí)施方案85至97中任一個的方法，其中未遺傳改造宿主細(xì)胞以改善或削弱蛋白質(zhì)巖藻糖基化，且該方法不包括從抗體的N連接聚糖結(jié)構(gòu)體內(nèi)加入或體內(nèi)切割巖藻糖殘基。

99.用于產(chǎn)生半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)分離該重組抗體群體；

c)用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶酶處理該重組抗體群體，以獲得包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體的半乳糖改造的重組抗體群體，隨后從該酶分離該半乳糖改造的重組抗體群體。

100.實(shí)施方案99的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

101.實(shí)施方案99的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體。

102.實(shí)施方案99的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

103.實(shí)施方案99的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

104.實(shí)施方案99至103中任一個的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

105.實(shí)施方案99至104中任一個的方法，其中抗體的Fab區(qū)不包含以下氨基酸序列：Asn-X-Ser和Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸外的氨基酸，Ser是絲氨酸，Thr是蘇氨酸。

106.實(shí)施方案99至105中任一個的方法，其中重組抗體是單克隆全長人IgG1同種型抗體。

107.實(shí)施方案99至106中任一個的方法，其中重組抗體是人源化抗體。

108.實(shí)施方案99至107中任一個的方法，其中重組抗體是體外半乳糖改造的抗體。

109.實(shí)施方案99至108中任一個的方法，其中抗體選自曲妥珠單抗、利妥昔單抗、帕妥珠單抗和obinutuzumab。

110.實(shí)施方案99至109中任一個的方法，其中宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。

111.實(shí)施方案99至110中任一個的方法，其中宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。

112.實(shí)施方案99至111中任一個的方法，其中未遺傳改造宿主細(xì)胞以改善或削弱蛋白質(zhì)巖藻糖基化，且該方法不包括從抗體的N連接聚糖結(jié)構(gòu)體外加入或體外切割巖藻糖殘基。

113.實(shí)施方案99至112中任一個的方法，其中步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6-7的溶液中，30-35℃下酶處理該重組抗體群體至少150分鐘。

114.實(shí)施方案99至113中任一個的方法，其中步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6.3-6.8的溶液中，31-34℃下酶處理該重組抗體群體至少150分鐘。

115.實(shí)施方案99至114中任一個的方法，其中步驟c)在半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和UDP-半乳糖(尿苷二磷酸半乳糖)的存在下進(jìn)行。

116.實(shí)施方案99至115中任一個的方法，其中對步驟c)中獲得的重組抗體群體進(jìn)行：

d)唾液酸轉(zhuǎn)移酶酶處理，以獲得包含相對頻率至多98％的Fc唾液酸化抗體(包括單唾液酸化和雙唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu))的半乳糖改造的重組抗體群體，隨后從該唾液酸轉(zhuǎn)移酶分離唾液酸化抗體群體。

117.實(shí)施方案116的方法，其中按以下條件進(jìn)行唾液酸轉(zhuǎn)移酶酶處理：

i)使唾液酸轉(zhuǎn)移酶和步驟c)中獲得的該半乳糖改造的重組抗體群體在pH 6-8(在一個實(shí)施方案中為pH 6.5-7.5)的溶液中接觸至少150分鐘(在一個實(shí)施方案中為2-120小時)。

118.實(shí)施方案116的方法，其中按以下條件進(jìn)行唾液酸轉(zhuǎn)移酶酶處理：

i)在第一步中，使唾液酸轉(zhuǎn)移酶和步驟c)中獲得的該半乳糖改造的抗體群體在pH 6-8(在一個實(shí)施方案中為pH 6.5-7.5)的溶液中接觸至少150分鐘(在一個實(shí)施方案中為2-120小時)；和

ii)在第二步中，使唾液酸轉(zhuǎn)移酶和步驟i)中獲得的抗體群體在pH 6-8(在一個實(shí)施方案中為pH 6.5-7.5)的溶液中再接觸至少150分鐘(在一個實(shí)施方案中為2至10小時)。

119.實(shí)施方案116至118中任一個的方法，其中步驟i)或可選地步驟i)-ii)中所示的唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理進(jìn)行總計(jì)至多120小時的時間。

120.實(shí)施方案116至119中任一個的方法，其中步驟d)中獲得的抗體群體包含相對頻率80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體，其中該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

121.用于產(chǎn)生半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)分離該重組抗體群體；

c)用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶酶處理該重組抗體群體，以獲得包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體的半乳糖改造的重組抗體群體，隨后從該酶分離該半乳糖改造的重組抗體群體。實(shí)施方案85的方法，其中步驟c)中獲得的該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

122.實(shí)施方案121的方法，其中步驟c)中獲得的該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體。

123.實(shí)施方案121的方法，其中步驟c)中獲得的該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

124.實(shí)施方案121的方法，其中步驟c)中獲得的該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

125.實(shí)施方案121至124中任一個的方法，其中步驟c)中獲得的該半乳糖改造的重組抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

126.實(shí)施方案121至125中任一個的方法，其中抗體的Fab區(qū)不包含以下氨基酸序列：Asn-X-Ser和Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸外的氨基酸，Ser是絲氨酸，Thr是蘇氨酸。

127.實(shí)施方案121至126中任一個的方法，其中抗體是單克隆全長人IgG1同種型抗體。

128.實(shí)施方案121至127中任一個的方法，其中抗體是人源化抗體。

129.實(shí)施方案121至128中任一個的方法，其中抗體是體外半乳糖改造的抗體。

130.實(shí)施方案121至129中任一個的方法，其中抗體選自曲妥珠單抗、利妥昔單抗、帕妥珠單抗和obinutuzumab。

131.實(shí)施方案121至130中任一個的方法，其中宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。

132.實(shí)施方案121至131中任一個的方法，其中宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。

133.實(shí)施方案121至132中任一個的方法，其中未遺傳改造宿主細(xì)胞以改善或削弱蛋白質(zhì)巖藻糖基化，且該方法不包括從抗體的N連接聚糖結(jié)構(gòu)體外加入或體外切割巖藻糖殘基。

134.實(shí)施方案121至133中任一個的方法，其中步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6-7的溶液中，30-35℃下酶處理該抗體群體至少150分鐘。

135.實(shí)施方案121至134中任一個的方法，其中步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6.3-6.8的溶液中，31-34℃下酶處理該抗體群體至少150分鐘。

136.實(shí)施方案121至135中任一個的方法，其中步驟c)在半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和UDP-半乳糖(尿苷二磷酸半乳糖)的存在下進(jìn)行。

137.實(shí)施方案121至136中任一個的方法，其中對步驟c)中獲得的抗體群體進(jìn)行：

d)唾液酸轉(zhuǎn)移酶酶處理，以獲得包含相對頻率至多98％的Fc唾液酸化抗體(包括單唾液酸化和雙唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu))的抗體群體，隨后從該唾液酸轉(zhuǎn)移酶分離唾液酸化抗體群體。

138.實(shí)施方案137的方法，其中按以下條件進(jìn)行唾液酸轉(zhuǎn)移酶酶處理：

i)使唾液酸轉(zhuǎn)移酶和步驟c)中獲得的抗體群體在pH 6-8(在一個實(shí)施方案中為pH 6.5-7.5)的溶液中接觸至少150分鐘(在一個實(shí)施方案中為2-120小時)。

139.實(shí)施方案137的方法，按以下條件進(jìn)行唾液酸轉(zhuǎn)移酶酶處理：

i)在第一步中，使唾液酸轉(zhuǎn)移酶和步驟c)中獲得的抗體群體在pH 6-8(在一個實(shí)施方案中為pH 6.5-7.5)的溶液中接觸至少150分鐘(在一個實(shí)施方案中為2-120小時)；和

ii)在第二步中，使唾液酸轉(zhuǎn)移酶和步驟i)中獲得的抗體群體在pH 6-8(在一個實(shí)施方案中為pH 6.5-7.5)的溶液中再接觸至少150分鐘(在一個實(shí)施方案中為2至10小時)。

140.實(shí)施方案137至139中任一個的方法，其中步驟i)或可選地步驟i)-ii)中所示的唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理進(jìn)行總計(jì)至多120小時的時間。

141.實(shí)施方案137至140中任一個的方法，其中步驟d)中獲得的抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體，其中該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

142.用于產(chǎn)生特異性結(jié)合HER2且包含SEQ ID NO:1的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:2的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)遺傳改造該宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化，使得獲得該半乳糖改造的重組抗體群體，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

143.用于產(chǎn)生特異性結(jié)合CD20且包含SEQ ID NO:3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:4的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)遺傳改造該宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化，使得獲得該半乳糖改造的重組抗體群體，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

144.用于產(chǎn)生特異性結(jié)合HER2且包含SEQ ID NO:5的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:6的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)遺傳改造該宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化，使得獲得該半乳糖改造的重組抗體群體，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

145.用于產(chǎn)生特異性結(jié)合CD20且包含SEQ ID NO:7的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:8的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)遺傳改造該宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化，使得獲得該半乳糖改造的重組抗體群體，其包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

146.用于產(chǎn)生特異性結(jié)合HER2且包含SEQ ID NO:1的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:2的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)分離該重組抗體群體；

c)用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶酶處理該重組抗體群體，以獲得包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體的半乳糖改造的重組抗體群體，隨后從該酶分離該半乳糖改造的重組抗體群體。

147.用于產(chǎn)生特異性結(jié)合CD20且包含SEQ ID NO:3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:4的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)分離該重組抗體群體；

c)用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶酶處理該重組抗體群體，以獲得包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體的半乳糖改造的重組抗體群體，隨后從該酶分離該半乳糖改造的重組抗體群體。

148.用于產(chǎn)生特異性結(jié)合HER2且包含SEQ ID NO:5的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:6的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)分離該重組抗體群體；

c)用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶酶處理該重組抗體群體，以獲得包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體的半乳糖改造的重組抗體群體，隨后從該酶分離該半乳糖改造的重組抗體群體。

149.用于產(chǎn)生特異性結(jié)合CD20且包含SEQ ID NO:7的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:8的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)分離該重組抗體群體；

c)用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶酶處理該重組抗體群體，以獲得包含相對頻率至少70％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體的半乳糖改造的重組抗體群體，隨后從該酶分離該半乳糖改造的重組抗體群體。

150.實(shí)施方案142至149中任一個的方法，其中步驟c)中獲得的該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

151.實(shí)施方案142至149中任一個的方法，其中步驟c)中獲得的該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體和相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體。

152.實(shí)施方案142至149中任一個的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

153.實(shí)施方案142至149中任一個的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

154.實(shí)施方案142至153中任一個的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

155.實(shí)施方案142至154中任一個的方法，其中抗體的Fab區(qū)不包含以下氨基酸序列：Asn-X-Ser和Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸外的氨基酸，Ser是絲氨酸，Thr是蘇氨酸。

156.實(shí)施方案142至155中任一個的方法，其中抗體是單克隆全長人IgG1同種型抗體。

157.實(shí)施方案142至156中任一個的方法，其中抗體是人源化抗體。

158.實(shí)施方案146至157中任一個的方法，其中抗體是體外半乳糖改造的抗體。

159.實(shí)施方案142至145和150至158中任一個的方法，其中抗體是體內(nèi)半乳糖改造的抗體。

160.實(shí)施方案142至159中任一個的方法，其中宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。

161.實(shí)施方案142至159中任一個的方法，其中宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。

162.實(shí)施方案142至161中任一個的方法，其中未遺傳改造宿主細(xì)胞以改善或削弱蛋白質(zhì)巖藻糖基化，且該方法不包括從抗體的N連接聚糖結(jié)構(gòu)體外加入或體外切割巖藻糖殘基。

163.實(shí)施方案146至162中任一個的方法，其中步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6-7的溶液中，30-35℃下酶處理該重組抗體群體至少150分鐘。

164.實(shí)施方案146至163中任一個的方法，其中步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6.3-6.8的溶液中，31-34℃下酶處理該重組抗體群體至少150分鐘。

165.實(shí)施方案146至164中任一個的方法，其中步驟c)在半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和UDP-半乳糖(尿苷二磷酸半乳糖)的存在下進(jìn)行。

166.實(shí)施方案146至165中任一個的方法，其中對步驟c)中獲得的半乳糖改造的重組抗體群體進(jìn)行：

d)唾液酸轉(zhuǎn)移酶酶處理，以獲得包含相對頻率至多98％的Fc唾液酸化抗體(包括單唾液酸化和雙唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu))的抗體群體，隨后從該唾液酸轉(zhuǎn)移酶分離唾液酸化抗體群體。

167.實(shí)施方案166的方法，其中按以下條件進(jìn)行唾液酸轉(zhuǎn)移酶酶處理：

i)使唾液酸轉(zhuǎn)移酶和步驟c)中獲得的該半乳糖改造的重組抗體群體在pH 6-8(在一個實(shí)施方案中為pH 6.5-7.5)的溶液中接觸至少150分鐘(在一個實(shí)施方案中為2-120小時)。

168.實(shí)施方案166的方法，其中按以下條件進(jìn)行唾液酸轉(zhuǎn)移酶酶處理：

i)在第一步中，使唾液酸轉(zhuǎn)移酶和步驟c)中獲得的該半乳糖改造的抗體群體在pH 6-8(在一個實(shí)施方案中為pH 6.5-7.5)的溶液中接觸至少150分鐘(在一個實(shí)施方案中為2-120小時)；和

ii)在第二步中，使唾液酸轉(zhuǎn)移酶和步驟i)中獲得的抗體群體在pH 6-8(在一個實(shí)施方案中為pH 6.5-7.5)的溶液中再接觸至少150分鐘(在一個實(shí)施方案中為2至10小時)。

169.實(shí)施方案166至168中任一個的方法，其中步驟i)或可選地步驟i)-ii)中所示的唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理進(jìn)行總計(jì)至多120小時的時間。

170.實(shí)施方案166至169中任一個的方法，其中步驟d)中獲得的抗體群體包含相對頻率80％至95％的Fc雙半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體，其中該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

171.用于產(chǎn)生特異性結(jié)合HER2且包含SEQ ID NO:1的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:2的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)遺傳改造該宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化，使得獲得該半乳糖改造的重組抗體群體，其包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

172.用于產(chǎn)生特異性結(jié)合CD20且包含SEQ ID NO:3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:4的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)遺傳改造該宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化，使得獲得該半乳糖改造的重組抗體群體，其包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

173.用于產(chǎn)生特異性結(jié)合HER2且包含SEQ ID NO:5的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:6的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)遺傳改造該宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化，使得獲得該半乳糖改造的重組抗體群體，其包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

174.用于產(chǎn)生特異性結(jié)合CD20且包含SEQ ID NO:7的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:8的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)遺傳改造該宿主細(xì)胞以改善蛋白質(zhì)半乳糖基化，使得獲得該半乳糖改造的重組抗體群體，其包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

175.用于產(chǎn)生特異性結(jié)合HER2且包含SEQ ID NO:1的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:2的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)分離該重組抗體群體；

c)用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶酶處理該重組抗體群體，以獲得包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體的半乳糖改造的重組抗體群體，隨后從該酶分離該半乳糖改造的重組抗體群體。

176.用于產(chǎn)生特異性結(jié)合CD20且包含SEQ ID NO:3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:4的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)分離該重組抗體群體；

c)用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶酶處理該重組抗體群體，以獲得包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體的半乳糖改造的重組抗體群體，隨后從該酶分離該半乳糖改造的重組抗體群體。

177.用于產(chǎn)生特異性結(jié)合HER2且包含SEQ ID NO:5的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:6的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)分離該重組抗體群體；

c)用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶酶處理該重組抗體群體，以獲得包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體的半乳糖改造的重組抗體群體，隨后從該酶分離該半乳糖改造的重組抗體群體。

178.用于產(chǎn)生特異性結(jié)合CD20且包含SEQ ID NO:7的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:8的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的半乳糖改造的重組抗體群體的方法，其包括步驟：

a)在包含編碼抗體的核酸分子的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生IgG1同種型抗體，以獲得重組抗體群體；

b)分離該重組抗體群體；

c)用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶酶處理該重組抗體群體，以獲得包含相對頻率至少80％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體的半乳糖改造的重組抗體群體，隨后從該酶分離該半乳糖改造的重組抗體群體。

179.實(shí)施方案171至178中任一個的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體。

180.實(shí)施方案171至179中任一個的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體和相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體。

181.實(shí)施方案171至180中任一個的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

182.實(shí)施方案171至181中任一個的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率7-16％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體。

183.實(shí)施方案171至182中任一個的方法，其中該半乳糖改造的重組抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

184.實(shí)施方案171至183中任一個的方法，其中抗體的Fab區(qū)不包含以下氨基酸序列：Asn-X-Ser和Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸外的氨基酸，Ser是絲氨酸，Thr是蘇氨酸。

185.實(shí)施方案171至184中任一個的方法，其中抗體是單克隆全長人IgG1同種型抗體。

186.實(shí)施方案171至185中任一個的方法，其中重組抗體是人源化抗體。

187.實(shí)施方案175至186中任一個的方法，其中重組抗體是體外半乳糖改造的抗體。

188.實(shí)施方案171至174和179至186中任一個的方法，其中重組抗體是體內(nèi)半乳糖改造的抗體。

189.實(shí)施方案171至188中任一個的方法，其中宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。

190.實(shí)施方案171至189中任一個的方法，其中宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。

191.實(shí)施方案171至190中任一個的方法，其中未遺傳改造宿主細(xì)胞以改善或削弱蛋白質(zhì)巖藻糖基化，且該方法不包括從抗體的N連接聚糖結(jié)構(gòu)體外加入或體外切割巖藻糖殘基。

192.實(shí)施方案175至191中任一個的方法，其中步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6-7的溶液中，30-35℃下酶處理該重組抗體群體至少150分鐘。

193.實(shí)施方案175至192中任一個的方法，其中步驟c)涉及用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 6.3-6.8的溶液中，31-34℃下酶處理該重組抗體群體至少150分鐘。

194.實(shí)施方案175至193中任一個的方法，其中步驟c)在半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和UDP-半乳糖(尿苷二磷酸半乳糖)的存在下進(jìn)行。

195.實(shí)施方案175至194中任一個的方法，其中對步驟c)中獲得的半乳糖改造的重組抗體群體進(jìn)行：

d)唾液酸轉(zhuǎn)移酶酶處理，以獲得包含相對頻率至多98％的Fc唾液酸化抗體(包括單唾液酸化和雙唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu))的抗體群體，隨后從該唾液酸轉(zhuǎn)移酶分離唾液酸化抗體群體。

196.實(shí)施方案195的方法，其中按以下條件進(jìn)行唾液酸轉(zhuǎn)移酶酶處理：

i)使唾液酸轉(zhuǎn)移酶和步驟c)中獲得的該半乳糖改造的重組抗體群體在pH 6-8(在一個實(shí)施方案中為pH 6.5-7.5)的溶液中接觸至少150分鐘(在一個實(shí)施方案中為2-120小時)。

197.實(shí)施方案195的方法，按以下條件進(jìn)行唾液酸轉(zhuǎn)移酶酶處理：

i)在第一步中，使唾液酸轉(zhuǎn)移酶和步驟c)中獲得的該半乳糖改造的重組抗體群體在pH 6-8(在一個實(shí)施方案中為pH 6.5-7.5)的溶液中接觸至少150分鐘(在一個實(shí)施方案中為2-120小時)；和

ii)在第二步中，使唾液酸轉(zhuǎn)移酶和步驟i)中獲得的抗體群體在pH 6-8(在一個實(shí)施方案中為pH 6.5-7.5)的溶液中再接觸至少150分鐘(在一個實(shí)施方案中為2至10小時)。

198.實(shí)施方案195至197中任一個的方法，其中步驟i)或可選地步驟i)-ii)中所示的唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理進(jìn)行總計(jì)至多120小時的時間。

199.實(shí)施方案195至198中任一個的方法，其中步驟d)中獲得的抗體群體包含相對頻率80-99.5％的Fc半乳糖基化抗體、相對頻率低于20％的Fc無巖藻糖基化抗體和相對頻率50％至90％的Fc唾液酸化抗體，其中該抗體群體不包含含有二等分N乙酰葡糖胺分支的抗體。

200.藥物組合物，其包含實(shí)施方案1至70中任一個的半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體群體。

201.藥物組合物，其包含通過實(shí)施方案71至199中任一個的方法獲得的半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體群體。

202.實(shí)施方案200或201的藥物組合物，其中半乳糖改造的抗體與至少一種可藥用載體組合配制。

203.治療患有疾病的患者的方法，其通過對需要這種治療的患者施用實(shí)施方案1至70中任一個的半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體群體來治療。

204.治療患有疾病的患者的方法，其通過對需要這種治療的患者施用通過實(shí)施方案71至199中任一個的方法獲得的半乳糖改造的重組IgG1同種型抗體群體來治療。

205.實(shí)施方案203或204中任一個的方法，其中疾病選自癌癥、炎性障礙和自身免疫障礙。

206.實(shí)施方案71至199中任一個的方法，其用于改善該重組IgG1同種型抗體群體介導(dǎo)的ADCC。

207.實(shí)施方案65至218中任一個的方法的用途，用于改善重組抗體與FcγRIIa和FcγRIIIa的結(jié)合親和力。

208.實(shí)施方案1至70中任一個的或通過實(shí)施方案71至199中任一個的方法獲得的半乳糖改造的重組抗體群體的用途，用于介導(dǎo)ADCC。

209.實(shí)施方案1至70中任一個的或通過實(shí)施方案71至199中任一個的方法獲得的半乳糖改造的重組抗體群體的用途，用于招募和/或激活天然殺傷細(xì)胞。

210.實(shí)施方案1至70中任一個的或通過實(shí)施方案71至199中任一個的方法獲得的半乳糖改造的重組抗體群體的用途，用于激活包含F(xiàn)cγR的效應(yīng)細(xì)胞。

211.實(shí)施方案1至70中任一個的或通過實(shí)施方案71至199中任一個的方法獲得的半乳糖改造的重組抗體群體，其用作藥物。

212.實(shí)施方案1至70中任一個的或通過實(shí)施方案71至199中任一個的方法獲得的半乳糖改造的重組抗體群體，其用于治療選自癌癥、炎性障礙和自身免疫障礙的疾病。

213.半乳糖改造的重組抗體群體，其通過實(shí)施方案71至199中任一個的方法獲得。

氨基酸序列描述

實(shí)施例

提供以下實(shí)施例來輔助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真實(shí)范圍在所附權(quán)利要求書中顯示。應(yīng)理解，可以在所示方法中進(jìn)行修改而不背離本發(fā)明的精神。

實(shí)施例1：

通過體外糖改造制備高度半乳糖基化的IgG1抗體(曲妥珠單抗)并鑒定糖結(jié)構(gòu)

在第一實(shí)驗(yàn)中，通過酶對獲自四個不同生產(chǎn)批次的曲妥珠單抗(mAb1)進(jìn)行高半乳糖基化。

為了產(chǎn)生這種高度半乳糖基化(高半乳糖基化)的mAb曲妥珠單抗，向抗體中加入牛β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(Roche)。加入反應(yīng)緩沖液(20mM MnCl、10mM UDP-Gal、100mM MES緩沖液、pH 6.5)和H₂O以達(dá)到3至15mg mAb/ml的濃度。在32至37℃范圍內(nèi)的溫度下孵育樣品。孵育24小時(22mU)或孵育48小時(44mU)后加入其他量的酶。使用MabSelect Sure protein A柱，通過更換緩沖液為25mM檸檬酸鈉并調(diào)節(jié)pH至pH 5.5來終止反應(yīng)。最終mAb濃度在2至15mg/ml范圍內(nèi)。

為了分析糖結(jié)構(gòu)，對150μg mAb進(jìn)行緩沖液更換至磷酸鹽緩沖液(10mM、pH7.2)。然后用2μl PNGase F(500000U/ml,BioLabs)在45℃孵育1小時，2-AB 65℃標(biāo)記2小時(Signal 2-AB標(biāo)記試劑盒,Glyko,GKK404)。在HILIC柱(Waters,BEH Glycan 1.7μm,2.1 x 150mm；45分鐘梯度)上通過NP-UHPLC進(jìn)行分析。

未處理的原材料和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶處理的群體的糖結(jié)構(gòu)比較顯示在表1中。

表1：未處理和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶處理的曲妥珠單抗的糖結(jié)構(gòu)(相對頻率以％顯示)

實(shí)施例2：

評估高度半乳糖基化的IgG1抗體介導(dǎo)的ADCC

在基于NK細(xì)胞系的體外ADCC測定中分析了抗體介導(dǎo)的ADCC。

為了此分析，按之前所述(Schnueriger,A.等Mol Immunol 48,1512-1517(2011)，在此引入作為參考)產(chǎn)生和培養(yǎng)表達(dá)人FcγRIIIa的重組效應(yīng)細(xì)胞。靶細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。按照供應(yīng)商提供的建議用BATDA配體(Perkin Elmer)標(biāo)記多種靶細(xì)胞系。效應(yīng)細(xì)胞和標(biāo)記的靶細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中混合，并接種在96孔微量滴定板上。將抗體樣品稀釋在生長培養(yǎng)基中，并加至效應(yīng)細(xì)胞-靶細(xì)胞混合物。在37℃/5％CO₂的濕潤培養(yǎng)箱中孵育測定平板。孵育后，離心平板，并將來自各孔的上清轉(zhuǎn)移至白色96孔板。向每個孔加入200μl銪溶液(Perkin Elmer)，然后在平板震蕩器上短時間孵育。按BATDA配體供應(yīng)商(Perkin Elmer)提供的說明書制備自發(fā)釋放和最大釋放的對照。用345nm激發(fā)、615nm發(fā)射以RFU(相對熒光單位)測量時間分辨熒光。在Spectramax M5酶標(biāo)儀(Molecular Devices)上進(jìn)行讀數(shù)。特異性毒性值按以下計(jì)算：100％x(特異性釋放–自發(fā)釋放)/(最大釋放–自發(fā)釋放)。對于相對ADCC計(jì)算，將％特異性毒性對抗體濃度作圖，并通過全曲線平行線分析測定相對ADCC(Gottschalk,P.G.&Dunn,J.R.J Biopharm Stat 15,437-463(2005))。

修飾樣品與參考材料、起始材料和偽處理對照一起分析。每個樣品在五次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中分析。與起始材料相比，在缺乏修飾酶的情況下與修飾樣品平行制備的偽處理對照(稱為對照)顯示ADCC無變化(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖2A顯示高半乳糖基化曲妥珠單抗(mAb1)樣品(虛線，白色方形)和未處理的對照mAb樣品(實(shí)線，黑色圓)介導(dǎo)的代表性劑量依賴性ADCC。無論何種樣品處理，飽和抗體濃度(約1000ng/ml)下的最大靶細(xì)胞裂解達(dá)到可比的水平。就EC50值觀察到對照和高半乳糖基化材料間的差異，高半乳糖基化材料的EC50值更低。因此，相對于其偽處理對照，高半乳糖基化曲妥珠單抗樣品一致地引出提高的ADCC。

為了確定半乳糖對ADCC活性的影響是否是更普遍的現(xiàn)象，用一組抗不同靶標(biāo)的抗體產(chǎn)生了高半乳糖基化樣品。使基于NK細(xì)胞的體外測定系統(tǒng)適應(yīng)這些不同抗體，在三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中相對于每種抗體各自的參考標(biāo)準(zhǔn)品比較了糖修飾樣品及其相關(guān)對照的ADCC活性。類似于用曲妥珠單抗觀察到的劑量-反應(yīng)曲線，與各自的對照材料相比，高半乳糖基化樣品顯示更低的EC50值，而飽和濃度下的最大ADCC在所有情況下保持不變(數(shù)據(jù)未顯示)。圖2B中顯示相對于參考材料以ADCC表示的定量結(jié)果。高半乳糖基化時，利妥昔單抗(mAb2)批次#1、2和3的相對ADCC從對照的55％、96％和111％(圖2B，灰色條)提高至高半乳糖基化樣品的85％、113％和123％(圖2B，白色條)。在帕妥珠單抗(mAb3)的情況下，批次#1和2的相對ADCC從對照樣品的64％和53％(圖2B，灰色條)提高至高半乳糖基化樣品的75％和71％(圖2B，白色條)。mAb4批次#1、2和3顯示ADCC從對照的48％、97％和90％(圖2B，灰色條)提高至高半乳糖基化樣品的58％、112％和98％(圖2B，白色條)。一般而言，用所測試的mAb1-4的全部12個抗體批次都觀察到了高半乳糖基化增強(qiáng)ADCC活性的趨勢。

鑒于無巖藻糖對ADCC的顯著影響，產(chǎn)生了更高的半乳糖水平是否可以調(diào)節(jié)含有高水平無巖藻糖基化的mAb的ADCC的問題。為了研究這一點(diǎn)，通過酶半乳糖基化無巖藻糖基化的mAb4(mAb4 afu)和無巖藻糖基化的obinutuzumab(mAb5 afu)，并與其相關(guān)對照相比較(圖2B)。對照材料和高半乳糖基化材料的劑量反應(yīng)曲線大致重疊(數(shù)據(jù)未顯示)。在定量上，無巖藻糖基化的mAb4(100％)和無巖藻糖基化的obinutuzumab(107％)對照材料(圖2B，灰色條)介導(dǎo)的相對ADCC與高半乳糖基化材料介導(dǎo)的ADCC(無巖藻糖基化的mAb4和無巖藻糖基化的obinutuzumab分別為101％和108％。參見圖2B，白色條)可比。因此，高半乳糖基化時，高度無巖藻糖基化的抗體的ADCC保持不變。

無巖藻糖基化的mAb4變體用FUT-8-/-CHO表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生(mAb4 afu)，而無巖藻糖基化的曲妥珠單抗變體(mAb1 afu)和無巖藻糖基化的obinutuzumab變體(mAb5 afu)產(chǎn)生自過量表達(dá)GnT-III(β-1,4-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III)的細(xì)胞。

實(shí)施例3：

通過體外糖改造制備具有不同N連接聚糖結(jié)構(gòu)的IgG1抗體(曲妥珠單抗)群體

在第二實(shí)驗(yàn)中，對獲自標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)批次的曲妥珠單抗進(jìn)行體外糖改造，以產(chǎn)生具有不同聚糖譜的不同曲妥珠單抗群體。體外糖改造方法的示意性流程顯示在圖3中。

無半乳糖基化聚糖種類(“aGal”)：

通過用半乳糖苷酶處理mAb來制備包含高相對頻率的無半乳糖基化聚糖結(jié)構(gòu)(例如G0、G0F)的曲妥珠單抗mAb群體。簡言之，為了制備無半乳糖基化抗體，向1mg曲妥珠單抗加入5μlβ(1-4)-半乳糖苷酶(Prozyme,GKX-5014)(10mU酶/mg抗體)，并在37℃孵育24小時。隨后通過蛋白A層析從游離酶純化酶處理的mAb群體。

雙半乳糖基化聚糖種類(“biGal”)：

通過按照實(shí)施例1中所述的方法用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶處理mAb來制備包含高相對頻率的雙半乳糖基化聚糖結(jié)構(gòu)(例如G2、G2、G2S1和G2S2及相應(yīng)的巖藻糖基化種類)的曲妥珠單抗mAb群體。簡言之，將1g曲妥珠單抗(濃度＝25mg/ml)與157ml反應(yīng)緩沖液(10mM UDP-Gal、20mM MnCl₂、100mM MES pH 6.5)混合。用dH₂O將來自Sigma的β-(1-4)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(G5507-25U)稀釋至10U/ml的濃度。開始孵育時向樣品中加入4.6ml半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，并在2和3天后再加入2.3ml?？偡跤龝r間為32℃下4天。隨后通過蛋白A層析純化酶處理的樣品。

雙半乳糖基化、單唾液酸化聚糖種類(“biGal/monoSia”)：

為了制備包含高相對頻率的雙半乳糖基化和單唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu)(例如G2S1和G2S1F)的曲妥珠單抗mAb群體，用唾液酸轉(zhuǎn)移酶對所獲得的雙半乳糖基化聚糖種類的群體(其按上文所述制備)進(jìn)行酶處理。簡言之，為了達(dá)到500mg上文所述雙半乳糖基化曲妥珠單抗樣品(濃度＝8.1mg/ml)的單唾液酸化，加入50mg ST6和25ml濃度為10mg/ml的CMP-NANA水溶液。樣品在37℃孵育24小時，然后通過蛋白A純化來純化。

雙半乳糖基化、雙唾液酸化聚糖種類(“biGal/biSia”)：

為了制備包含高相對頻率的雙半乳糖基化和雙唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu)(例如G2S2和G2S2F)的曲妥珠單抗mAb群體，使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST6(Roche，氨基酸序列SEQ ID NO:9)，用唾液酸轉(zhuǎn)移酶對所獲得的雙半乳糖基化和單唾液酸化聚糖種類的群體(其按上文所述制備)進(jìn)行另一酶處理。簡言之，為了進(jìn)一步提高唾液酸化程度，將100mg雙半乳糖基化和單唾液酸化曲妥珠單抗樣品與3ml CMP-NANA水溶液和10mg ST6(Roche,產(chǎn)品號07012250103)混合。樣品在37℃孵育7小時，然后通過蛋白A純化來純化。

實(shí)施例4：

具有不同N連接聚糖結(jié)構(gòu)的IgG1抗體(曲妥珠單抗)群體的聚糖分析

為了分析實(shí)施例3的單種(individual)糖改造的曲妥珠單抗樣品的聚糖結(jié)構(gòu)(通過與實(shí)施例1中所述相同的方法)，對150μg各mAb進(jìn)行緩沖液更換至磷酸鹽緩沖液(10mM、pH7.2)，然后用2μl PNGase F(500000U/ml,BioLabs)在45℃孵育1小時，2-AB 65℃標(biāo)記2小時后純化(Signal 2-AB標(biāo)記試劑盒,Glyko,GKK404)。標(biāo)記的聚糖通過親水相互作用(BEH聚糖柱,1.7μm,2.1 x 150mm,Waters)液相層析(45分鐘梯度)分離，并在420nm(激發(fā)波長330nm)檢測熒光信號。

表2：未處理和體外糖改造的曲妥珠單抗群體的糖結(jié)構(gòu)(相對頻率以％顯示)

n.d.–低于檢測限

如從表2可見，與未處理的樣品相比，該體外糖改造導(dǎo)致希望得到的聚糖種類的比例提高。在通過半乳糖苷酶處理衍生的無半乳糖基化樣品中，超過85％的聚糖種類為無半乳糖基化的。在所提供的包含高頻率的雙半乳糖基化曲妥珠單抗抗體的樣品中，超過80％的聚糖種類是雙半乳糖基化的。在制備為包含提高量的單唾液酸化曲妥珠單抗抗體的樣品中，超過45％的聚糖種類是單唾液酸化的，另有約5％的部分是雙唾液酸化IgG1。在制備為包含提高量的雙唾液酸化曲妥珠單抗抗體的最后一個樣品中，雙唾液酸化IgG1的比例進(jìn)一步提高至約30％，樣品中存在約相同比例的單唾液酸化抗體。

由于可認(rèn)為不同樣品包含非常同質(zhì)的聚糖譜，就其對FcγR結(jié)合和ADCC介導(dǎo)的影響分析了每個樣品。

實(shí)施例5：

評估IgG1抗體(曲妥珠單抗)的不同聚糖種類介導(dǎo)的Fc-γR結(jié)合-表面等離振子共振

為了通過表面等離振子共振(SPR)分析FcγR結(jié)合，使用了T100系統(tǒng)(GE Healthcare)。對于FcγR和IgG1糖變體的相互作用分析，注入抗His捕獲抗體(GE Healthcare)以達(dá)到12,000個共振單位(RU)的水平。在pH 4.5用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)試劑盒(GE Healthcare)在CM5芯片上進(jìn)行捕獲抗體的固定。按10μl/分鐘流速以60秒脈沖按200nM濃度捕獲Fc-γRIa、Fc-γRIIa和Fc-γRIIIa。隨后按300nM濃度和30μl/分鐘流速應(yīng)用曲妥珠單抗糖變體60秒。監(jiān)測解離期180秒。通過按30μl/分鐘流速用10mM甘氨酸pH 1.5進(jìn)行的洗滌步驟來再生表面。所有實(shí)驗(yàn)均在HBS-N緩沖液(10mM HEPES、pH 7.4、150mM NaCl)中進(jìn)行。用Biacore T100評價軟件2.0.3進(jìn)行數(shù)據(jù)評價。

結(jié)果顯示在圖4中。所顯示(y軸)的是相對于未處理的對照樣品(其因此歸一化為與各受體100％結(jié)合)的結(jié)合強(qiáng)度。數(shù)據(jù)顯示，曲妥珠單抗的無半乳糖基化導(dǎo)致Fc-γRIa、IIa和IIIa結(jié)合減少(Fc-γRIIa和IIIa為顯著減少)。具有高頻率的雙半乳糖基化聚糖種類的曲妥珠單抗樣品顯示與Fc-γRIIa和Fc-γRIIIa的結(jié)合改善。

實(shí)施例6：

評估IgG1抗體(曲妥珠單抗)的不同聚糖種類介導(dǎo)的Fc-γR結(jié)合-親和層析

為了通過親和層析分析Fc-γR結(jié)合，分別將生物素化的人Fc-γRIIa或Fc-γRIIIa_V158與鏈霉抗生物素蛋白瓊脂糖輕輕振蕩孵育2小時。將各Fc-γ受體衍生的瓊脂糖裝填在Tricorn 5/50柱(內(nèi)徑5mm x長度50mm,GE Healthcare)中，并用explorer或Dionex Summit系統(tǒng)按0.5ml/分鐘流速用20mM Tris、150mM NaCl pH 8.0(Fc-γRIIa)或20mM檸檬酸鈉、150mM NaCl pH 6.0(Fc-γRIIIa)平衡親和柱。將含有50至100μg抗體樣品的平衡緩沖液加至各柱。隨后，用5個柱體積的平衡緩沖液洗滌柱。分別用20mM檸檬酸鈉、150mM NaCl pH 4.0(Fc-γRIIa)或pH 3.0(Fc-γRIIIa)以15個柱體積的線性pH梯度洗脫樣品。實(shí)驗(yàn)在室溫進(jìn)行。通過連續(xù)測量280nm吸光大度來獲得洗脫圖。

結(jié)果顯示在圖5中。所顯示的是各樣品的保留時間。對于Fc-γRIIIa結(jié)合，顯示巖藻糖基化聚糖種類(親和層析中的早期洗脫峰)和(部分)無巖藻糖基化聚糖種類(親和層析中的晚期洗脫峰)的保留時間。與SPR數(shù)據(jù)一致，這些數(shù)據(jù)證明，無半乳糖基化減少Fc-γRIIa和IIIa結(jié)合，而雙半乳糖基化改善曲妥珠單抗與該受體的結(jié)合。可針對巖藻糖基化以及無巖藻糖基化的聚糖種類觀察到該效應(yīng)(參見Fc-γRIIIa結(jié)合數(shù)據(jù))。

實(shí)施例7：

評估IgG1抗體(曲妥珠單抗)的不同聚糖種類介導(dǎo)的ADCC-親和層析

在按實(shí)施例2中所述進(jìn)行的基于NK細(xì)胞系的體外ADCC測定中分析了實(shí)施例3中產(chǎn)生的抗體群體介導(dǎo)的ADCC。

結(jié)果顯示在圖6中。所顯示的是與未處理的曲妥珠單抗樣品相比的相對ADCC。數(shù)據(jù)證明，無半乳糖基化的曲妥珠單抗種類降低抗體介導(dǎo)的ADCC，而IgG1的雙半乳糖基化(針對唾液酸化聚糖種類以及無唾液酸化聚糖種類觀察到)改善ADCC介導(dǎo)。

實(shí)施例8：

評估不同IgG1抗體的高半乳糖基化種類介導(dǎo)的Fc-γR結(jié)合

在使用基于球珠的非放射性發(fā)光同質(zhì)接近測定形式的競爭結(jié)合測定中評估了單克隆抗體樣品與人Fc-γRIIIa的結(jié)合。在此測定中，將人谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)記的Fc-γ受體及抗體參考標(biāo)準(zhǔn)品、對照和樣品加至96孔板，然后加入生物素化的抗體鏈霉抗生物素蛋白供體球珠和谷胱甘肽受體球珠。在缺乏競爭抗體樣品的情況下，供體球珠結(jié)合的抗體和受體球珠結(jié)合的Fc-γ受體相互作用產(chǎn)生發(fā)光信號。樣品破壞了供體球珠結(jié)合的抗體/Fcγ受體相互作用，減少發(fā)光信號。發(fā)光的變化與競爭抗體的量成比例。將表示為發(fā)光計(jì)數(shù)的結(jié)果對抗體濃度作圖，用四參數(shù)曲線擬合程序來測定樣品相對于適當(dāng)?shù)膮⒖紭?biāo)準(zhǔn)品的活性。

為了確認(rèn)高半乳糖基化對ADCC的影響源自修飾的mAb Fc和表達(dá)在NK細(xì)胞上的Fc-γRIIIa之間的相互作用增加，在Fc-γRIIIa結(jié)合實(shí)驗(yàn)中分析了利妥昔單抗(mAb2)和帕妥珠單抗(mAb3)批次的亞組。結(jié)果(圖7)證明，抗體的高半乳糖基化顯著增加Fc-γRIIIa結(jié)合。對照和高半乳糖基化mAb樣品的Fc-γRIIIa結(jié)合活性分別是，對于利妥昔單抗(mAb2)從62％提高至103％，對于帕妥珠單抗(mAb3)從73％提高至138％，對于mAb4從77％提高至160％，對于無巖藻糖基化的mAb4(mAb4 afu)從100％提高至165％。與對Fc-γRIIIa結(jié)合的影響相比，高半乳糖基化對ADCC活性的影響程度較低。如圖7中所示，對照和高半乳糖基化mAb樣品的相應(yīng)批次的ADCC分別為，對于利妥昔單抗(mAb2)從55％提高至85％，對于帕妥珠單抗(mAb3)從64％提高至75％，對于mAb4從90％提高至98％。mAb4的無巖藻糖基化變體(mAb4 afu)的ADCC保持不變(對照和高半乳糖基化材料分別為100％和101％)。