技術(shù)領(lǐng)域

本實(shí)用新型涉及可用于細(xì)胞培養(yǎng)的器件。具體涉及一種具有聚多巴胺層-羧甲基殼聚糖層-多肽層結(jié)構(gòu)的器件。

背景技術(shù)：

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Hμman pluripotent stem cells,hiPSCs)具有和人胚胎干細(xì)胞(Hμman embryonic stem cells,hESCs)幾乎同樣的形態(tài)、擴(kuò)增能力、表面抗原、基因表達(dá)譜和甲基化位點(diǎn)等特征。hiPSCs克服了hESCs存在的倫理道德困惑，增加了干細(xì)胞自體移植治療的可行性，并解決了細(xì)胞數(shù)量有限的問(wèn)題。

通常人多能干細(xì)胞的體外培養(yǎng)需借助于鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse embryonic fibroblasts,mEFs)滋養(yǎng)層或Matrigel。mEFs培養(yǎng)體系因其操作過(guò)程繁瑣，現(xiàn)逐漸被其它培養(yǎng)體系取代。Matrigel是從EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠肉瘤中得到的可溶性基底膜提取物，其能夠在培養(yǎng)基底表面形成一層充當(dāng)細(xì)胞外基質(zhì)的薄膜，使人多能干細(xì)胞能夠在其構(gòu)建的體外微環(huán)境中獲得理想的貼壁和自我更新效果(Xu，C.，et al.、Feeder-free growth of undifferentiated hμman embryonicstem cells、Nat Biotechnol、2001、19、10、971-4。)。但是Matrigel培養(yǎng)體系為異種來(lái)源且無(wú)法保證不同批次產(chǎn)品間的一致性，加之其成分的不明確性，使其不適于人多能干細(xì)胞的大規(guī)模體外擴(kuò)增，限制其在臨床治療中的應(yīng)用。所以許多科學(xué)家致力于構(gòu)建可替代Matrigel的、成分明確的人多能干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。

首先，研究者相繼發(fā)現(xiàn)纖連蛋白，玻連蛋白和層粘連蛋白等蛋白及層粘連蛋白的某些特定部分，均可實(shí)現(xiàn)人多能干細(xì)胞的體外自我更新。但是，受限于昂貴的費(fèi)用和物理吸附導(dǎo)致的批次不一致，蛋白等生物制品難以廣泛應(yīng)用于人多能干細(xì)胞科研和臨床中。因此，近些年研究者成功開發(fā)出了，少數(shù)幾種支持人多能干細(xì)胞體外培養(yǎng)和定向分化的人工合成表面，其在成本和批次穩(wěn)定性等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。Villa-Diaz等在聚苯乙烯表 面形成PMEDSAH甲基丙烯酸酯類衍生物涂層，外加條件培養(yǎng)基或化學(xué)成分明確的“StemPro”培養(yǎng)基可以實(shí)現(xiàn)H9hESCs干性維持Villa-Diaz LG et al.Synthetic polymer coatings for long-term growth of hμman embryonic stem cells.Nature biotechnology.2010；28:581-3。

Melkoμmian等通過(guò)在培養(yǎng)板表面形成聚丙烯酸層，并在其表面接枝能夠促進(jìn)hESCs貼壁和增殖的多肽，實(shí)驗(yàn)證實(shí)hESCs在來(lái)源于骨涎蛋白(Bone Sialoprotein,BSP)的Ac-KGGNGEPRGDTYRAY或來(lái)源于玻連蛋白(Vitronectin,VN)的Ac-KGGPQVTRGDVFTMP多肽功能化修飾表面均能夠?qū)崿F(xiàn)10代左右的干性維持(Melkoμmian Z et al.Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of hμman embryonic stem cells.Nature biotechnology.2010；28:606-10.)

但是，這些人工合成表面制備過(guò)程復(fù)雜，含生物惰性成分，不利于人多能干細(xì)胞的自我更新和大量擴(kuò)增。因此，希望利用體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境成分來(lái)構(gòu)建一種簡(jiǎn)單，穩(wěn)定，有效的成分明確人多能干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人針對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有聚多巴胺層-羧甲基殼聚糖層-VN多肽層的器件能夠調(diào)控人多能干細(xì)胞的行為，從而完成了本實(shí)用新型。

即，本實(shí)用新型如下。

1.一種器件，其包括：

基底，

連接于所述基底上的聚多巴胺層，

連接于所述聚多巴胺層上的羧甲基殼聚糖層，以及

連接于所述羧甲基殼聚糖層上的多肽層；

其中，所述多肽層包含玻連蛋白(Vitronectin，簡(jiǎn)稱VN)多肽。

2.根據(jù)項(xiàng)1所述的器件，其中，所述多肽層還包含具有促進(jìn)人多能干細(xì)胞定向分化的功能的化合物。

3.根據(jù)項(xiàng)2所述的器件，其中，所述具有促進(jìn)人多能干細(xì)胞定向分化的功能的化合物是BFP-1多肽。

實(shí)用新型的效果

1.構(gòu)成所述器件的材料均具有優(yōu)良的生物相容性，構(gòu)建了一種化學(xué)成分明確、無(wú)外源物質(zhì)、安全的調(diào)控人多能干細(xì)胞命運(yùn)的體系。

2.接枝不同的功能多肽可以賦予體系不同的生物學(xué)功能。

3.聚多巴胺層-羧甲基殼聚糖層-多肽層的結(jié)構(gòu)可以設(shè)置在多種基底材料表面(細(xì)胞培養(yǎng)板，種植體等)。這種設(shè)置可以在常規(guī)條件下進(jìn)行，步驟相對(duì)簡(jiǎn)單易行，不需要特殊設(shè)備和高溫高壓等條件，更符合GMP的要求。而且，制備過(guò)程避免了使用對(duì)生物體有毒性的化學(xué)物質(zhì)，工藝過(guò)程更為環(huán)保。

4.該體系制備過(guò)程均為化學(xué)反應(yīng)，相較于Matrigel和蛋白質(zhì)的物理吸附，具有更優(yōu)越的批次穩(wěn)定性。

5.采用不同的定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基，即可促使人多能干細(xì)胞向不同類型的細(xì)胞定向分化。

附圖說(shuō)明

圖1是顯示本實(shí)用新型的器件的制備流程和結(jié)構(gòu)的圖。

發(fā)明的具體實(shí)施方式

本說(shuō)明書中提及的科技術(shù)語(yǔ)具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義，如有沖突以本說(shuō)明書中的定義為準(zhǔn)。

器件

本實(shí)用新型的一個(gè)方面提供一種器件(以下也稱作本實(shí)用新型的器件)，其包括：

基底，

連接于所述基底上的聚多巴胺層，

連接于所述聚多巴胺層上的羧甲基殼聚糖層，以及

連接于所述羧甲基殼聚糖層上的多肽層；

其中，所述多肽層包含下述多肽A；

多肽A：由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成的多肽。

本實(shí)用新型的器件可用于細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞培養(yǎng)。在本說(shuō)明書中，細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)是指：(1)誘導(dǎo)人體細(xì)胞重編程為人多能干細(xì)胞，(2)使人多能干細(xì)胞貼壁，和/或(3)使人多能干細(xì)胞長(zhǎng)期自我更新。

1.基底

對(duì)于用作本實(shí)用新型的器件的基底的材料沒有特殊限制，可以使用通常用作細(xì)胞培養(yǎng)表面的基底的那些材料，例如聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷、玻璃等。作為基底，例如可以使用細(xì)胞培養(yǎng)板，也可以使用種植體(鈦或聚醚醚酮制)。

2.聚多巴胺層

多巴胺(Dopamine,DA)在體內(nèi)是一種生物神經(jīng)遞質(zhì)，將基底材料浸沒在含多巴胺的緩沖液中，多巴胺會(huì)通過(guò)氧化聚合沉積到基底材料表面，從而在基底材料表面形成聚多巴胺層。

對(duì)于構(gòu)成所述聚多巴胺層的聚多巴胺(Polydopamine，PDA)的分子量沒有特殊限制。聚多巴胺的分子量可以采用常規(guī)方法進(jìn)行控制，例如0.01～100g/L多巴胺溶液5～90℃反應(yīng)1分鐘～72小時(shí)。

3.羧甲基殼聚糖層

羧甲基殼聚糖(Carboxymethyl chitosan,CMC)是殼聚糖最重要的衍生物之一，與細(xì)胞外基質(zhì)成分糖胺聚糖(GAG)有相似之處，具有良好的生物相容性。

本發(fā)明人通過(guò)多肽熒光素標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)，PDA層上能夠接枝VN多肽，但所得器件不能促使細(xì)胞貼壁。

令人驚奇的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在設(shè)置CMC層作為PDA層與VN多肽層的橋梁的情況下，所得器件被賦予了調(diào)控人多能干細(xì)胞行為的功能。本實(shí)用新型中使用的羧甲基殼聚糖，通過(guò)凝膠滲透色譜儀和參照《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》方法，測(cè)得的重均分子量可以為1000～20萬(wàn)g/mol，優(yōu)選1萬(wàn)～10萬(wàn)g/mol，更優(yōu)選6～8萬(wàn)g/mol。例如實(shí)施例中制備的PDA-CMC-VN器件的CMC層中的羧甲基殼聚糖的重均分子量為83550g/mol。

羧甲基殼聚糖含有氨基和羧基，其中的氨基可與聚多巴胺形成化學(xué)結(jié)合。羧甲基殼聚糖與聚多巴胺的化學(xué)結(jié)合可利用本技術(shù)領(lǐng)域已知的化學(xué)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如邁克爾加成和席夫堿反應(yīng)。例如，可以將一定量的0.1重量％～30重量％的CMC溶液加至聚多巴胺層基底上，5～60℃反應(yīng)1h～72h，即可得到聚多巴胺-CMC基底層。

4.多肽層

所述多肽層應(yīng)包含下述多肽A，視需要也可以包含其他成分(多肽、蛋白質(zhì)、核酸、小分子化合物等)，只要本實(shí)用新型的器件能夠發(fā)揮調(diào)控人多能干細(xì)胞行為的功能即可。

所述多肽A是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成的多肽，稱作玻連蛋白(VN)多肽，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1:KGGPQVTRGDVFTMP。VN多肽來(lái)自于玻連蛋白 (Vitronectin,VN)，有報(bào)道稱，通過(guò)在培養(yǎng)板表面形成聚丙烯酸層，并在其表面接枝來(lái)源于骨涎蛋白(Bone Sialoprotein,BSP)的Ac-KGGNGEPRGDTYRAY和N端乙?；脑揤N多肽，能夠?qū)崿F(xiàn)hESCs的10代左右的干性維持(Melkoμmian Z et al.Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of hμman embryonic stem cells.Nature biotechnology.2010；28:606-10.)。

本實(shí)用新型的研究表明，在PDA層直接接枝該VN多肽，所得器件不能促使細(xì)胞貼壁，但在設(shè)置CMC層作為PDA層與VN多肽層的橋梁的情況下，所得器件被賦予了調(diào)控人多能干細(xì)胞行為的功能。

對(duì)于實(shí)現(xiàn)本實(shí)用新型的器件的功能而言，所述多肽A的分布密度應(yīng)為一定值以上，例如為1μg/cm²以上，優(yōu)選為10μg/cm²以上，更優(yōu)選為20μg/cm²以上，更優(yōu)選為30μg/cm²以上，更優(yōu)選為40μg/cm²以上。此外，對(duì)于所述多肽A的分布密度的上限沒有特殊限制，從可操作性的角度考慮，可以是例如200μg/cm²以下或150μg/cm²以下或100μg/cm²以下或80μg/cm²以下或60μg/cm²以下。

羧甲基殼聚糖含有氨基和羧基，其中的羧基可與多肽進(jìn)行接枝。羧甲基殼聚糖與多肽的接枝可利用本技術(shù)領(lǐng)域已知的化學(xué)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如聚多巴胺-羧甲基殼聚糖表面浸入活化劑溶液(例如，20mg/ml N-羥基琥珀酰亞胺和20mg/ml 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，pH＝5.6嗎啉乙磺酸緩沖液)中室溫反應(yīng)10～1000min后，與0.1～100mM VN多肽溶液4℃過(guò)夜反應(yīng)，即可通過(guò)邁克爾加成和席夫堿反應(yīng)得到聚多巴胺-羧甲基殼聚糖-VN多肽修飾的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)表面。

此外，作為使多肽A的分布密度達(dá)到1μg/cm²以上的方法，多肽A的反應(yīng)溶液濃度需在0.25mM以上，優(yōu)選為1mM以上。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽層還可包含具有促進(jìn)人多能干細(xì)胞定向分化的功能的化合物B，結(jié)合特定的培養(yǎng)基，可在成分明確條件下實(shí)現(xiàn)人多能干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化。所述化合物B可以是多肽、蛋白質(zhì)、核酸或小分子化合物。對(duì)于所述化合物B和特定培養(yǎng)基沒有特殊限制，只要其具有促進(jìn)人多能干細(xì)胞定向分化的功能即可。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)定向分化的需要，選擇適宜的化合物B和定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基。例如：多肽層接枝BFP-1多肽，結(jié)合含有β-巰基乙醇，地塞米松和維生素C的αMEM培養(yǎng)基，可定向誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞成骨向分化。

對(duì)于所述化合物B的分布密度沒有特殊限制，只要能夠發(fā)揮促進(jìn)人多能干細(xì)胞定向分化的功能即可，優(yōu)選至少為1μg/cm²以上，優(yōu)選為10μg/cm²以上，更優(yōu)選為20μg/cm²以上，更優(yōu)選為30μg/cm²以上，更優(yōu)選為40μg/cm²以上。

作為在羧甲基殼聚糖上接枝化合物B的方法，可以采用與接枝多肽A的方法相同的方法。

所述多肽可以適宜采用(1)化學(xué)合成方法、或(2)酶反應(yīng)合成方法等公知方法來(lái)獲得，其中化學(xué)合成更為簡(jiǎn)便。在化學(xué)合成本實(shí)用新型的多肽情況下，通過(guò)使用肽合成儀合成或者半合成該多肽來(lái)進(jìn)行。作為化學(xué)合成方法，可以列舉出例如肽固相合成法等。這樣合成的肽可以采用常規(guī)手段例如離子交換色譜、反相高效液體色譜、親和色譜等進(jìn)行純化。這樣的肽固相合成方法以及其后的肽純化都是本技術(shù)領(lǐng)域公知的。

此外，在通過(guò)酶反應(yīng)生產(chǎn)本實(shí)用新型的多肽的情況下，可以采用例如國(guó)際公開小冊(cè)子WO2004/011653號(hào)所述的方法。即，可以這樣來(lái)生產(chǎn)：將一方的氨基酸或二肽的羧基末端被酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、與氨基酸處于游離狀態(tài)的氨基酸(例如羧基保護(hù)的氨基酸)在肽合成酶的存在下進(jìn)行反應(yīng)，生成的二肽或三肽。作為肽合成酶，可以列舉出：具有生成肽的能力的微生物的培養(yǎng)物、由該培養(yǎng)物分離的微生物菌體、或該微生物的菌體處理物、或該微生物來(lái)源的肽合成酶。

特別是，多肽的化學(xué)合成已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，可以容易地委托專業(yè)的多肽合成公司來(lái)合成所述多肽。

實(shí)施例

以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)行更具體的說(shuō)明，但本實(shí)用新型不受這些實(shí)施例的限制。

實(shí)施例1PDA-CMC-VN器件的制備及表征

以下制備的PDA-CMC-VN器件依次具備基底(細(xì)胞培養(yǎng)板表面)、聚多巴胺層、羧甲基殼聚糖層和VN多肽層。

將24克羧甲基殼聚糖加入含800ml純水的藍(lán)口瓶中，利用恒溫?cái)嚢杵髟?0℃和150轉(zhuǎn)/分鐘條件下過(guò)夜攪拌，獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的CMC溶液。在經(jīng)中速濾紙粗濾后，于超凈工作臺(tái)內(nèi)先后經(jīng)0.45μm和0.22μm濾膜過(guò)濾后獲得無(wú)菌CMC溶液。將0.2424克三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽置入含200ml純水的燒杯中，用滴管攪拌均勻，然后用1mol/L 鹽酸將溶液PH調(diào)為8.5。將0.4克多巴胺粉末加入該緩沖液中，用滴管攪拌均勻。在超凈工作臺(tái)內(nèi)經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后，以每孔5ml體積加入康寧6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，封口膜封閉后置于37℃恒溫?fù)u床(70轉(zhuǎn)/分鐘)反應(yīng)16h。在超凈工作臺(tái)內(nèi)經(jīng)無(wú)菌純水沖洗3次后每孔加入5ml純水，Parafilm封口膜封閉后超聲5min，再于超凈間內(nèi)用純水沖洗一次后每孔加入CMC溶液5ml，封口膜封閉后置于37℃恒溫?fù)u床反應(yīng)70轉(zhuǎn)/分鐘)反應(yīng)24h。然后，超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌純水沖洗3次，干燥后紫外照射1h。

在超凈工作臺(tái)將5mg VN多肽溶于3.1ml DPBS緩沖液中，獲得1mM VN多肽溶液。將19.52克嗎啉乙磺酸溶于1000ml純水中，用玻璃棒攪拌均勻，然后用飽和氫氧化鈉溶液將pH調(diào)至5.6.將0.8g N-羥基琥珀酰亞胺和0.8克1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽分別溶于20ml嗎啉乙磺酸緩沖液后混勻，在超凈工作臺(tái)內(nèi)經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后，以每孔3ml體積加入康寧6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中室溫反應(yīng)40min，無(wú)菌純水沖洗3次后每孔加入1ml VN多肽溶液，封口膜封閉后4℃過(guò)夜，再用無(wú)菌純水沖洗3次，得到聚多巴胺-羧甲基殼聚糖-VN多肽修飾的細(xì)胞培養(yǎng)板。利用X射線光電子能譜(XPS),接觸角和原子力顯微鏡(AFM)研究，細(xì)胞培養(yǎng)板表面經(jīng)PDA-CMC-VN涂層修飾后的化學(xué)和形貌變化。

另外，我們利用FITC熒光蛋白標(biāo)記的VN多肽(FITC-KGGPQVTRGDVFTMP)，對(duì)表面接枝的VN多肽進(jìn)行定量研究。首先，避光條件下用乙腈與純水的1：1混合液配置0.2mM和2mM濃度的FITC-VN溶液，然后在康寧96孔板中分別加入2ul 0.2mM，5ul0.2mM，1ul 2mM，2ul 2mM，4ul 2mM，8ul 2mM，16ul 2mM(每組4孔)后，在避光條件下自然干燥后，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀以激發(fā)光488nm，吸收光538nm測(cè)量熒光值，建立熒光-密度標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，配置1mM FITC-VN溶液,利用上述方法接枝至活化后的PS-PDA-CMC表面，純水清洗3次后在相同條件下測(cè)量熒光值。

測(cè)定結(jié)果表明，修飾之前，PS呈現(xiàn)典型的水接觸角值(86.36±1.67°),經(jīng)PDA/CMC/VN修飾后表面接觸角分別降低至61.54±1.70°，41.48±7.16°和30.88±3.52°。我們利用原子力顯微鏡測(cè)量了PS表面分別經(jīng)PDA/CMC/VN多肽修飾后的表面形貌變化。我們選擇了1μm×1μm和5μm×5μm兩個(gè)掃面范圍進(jìn)行AFM測(cè)量。1μm×1μm結(jié)果顯示，PS未修飾前的表面比較平滑(Ra＝4.83nm),聚多巴胺修飾后，我們能夠在這些基體的表面見到典型的聚多巴胺顆粒,Ra值也分別增加至5.01nm,進(jìn)一步修飾CMC和VN多肽，我們發(fā)現(xiàn)表面的Ra值均呈下降趨勢(shì)，并最終獲得非常平滑的表面(Ra＝2.20nm)。當(dāng)AFM掃面范圍擴(kuò)大至5μm×5μm時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了類似的AFM測(cè)量結(jié)果。該修飾過(guò)程 進(jìn)一步利用XPS進(jìn)行表征,新出現(xiàn)的N元素峰證實(shí)PDA層的形成，Na元素峰和“C-N”鍵的出現(xiàn)說(shuō)明CMC成功與PDA層共價(jià)結(jié)合。最后，接枝VN多肽后，其所含肽鍵使得“C-N”含量增高。上述表征結(jié)果說(shuō)明我們開發(fā)的PDA-CMC-VN表面能夠共價(jià)結(jié)合至PS培養(yǎng)板表面。

另外，我們測(cè)得PS-PDA-CMC-FITCVN修飾12孔板表面的熒光強(qiáng)度為399.695±73.65291，根據(jù)96孔板標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果可知，表面VN多肽的接枝密度51.75±9.53ug/cm²。

實(shí)施例2PDA-CMC-VN器件使人多能干細(xì)胞貼壁

細(xì)胞培養(yǎng)

H1和H9人胚胎干細(xì)胞由中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院購(gòu)買自WiCell研究所后贈(zèng)送。人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系(人皮膚細(xì)胞來(lái)源的hNF-C1，以及人間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的UMC-C1)均由中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院以慢病毒重編程方法獲得后贈(zèng)送。這些人多能干細(xì)胞系培養(yǎng)在鋪有Matrigel(BD Biosciences,Canada)的培養(yǎng)板中，培養(yǎng)基使用的是成分明確的mTeSR^TM1(StemCell Technologies,Canada)。細(xì)胞培養(yǎng)在條件為37℃,100％濕度and 5％CO₂的培養(yǎng)箱中。Matrigel用DMEM/F12在冰上以1：80稀釋后，以1ml每孔體積加入6孔板37℃孵育1h以上。細(xì)胞每天換液，并每隔3-4天經(jīng)0.5mMEDTA37℃消化4-5min以1:3比例傳代。

PDA-CMC-VN修飾支持人多能干細(xì)胞在不同基體表面生長(zhǎng)

如上所述，制備接枝1mM VN多肽的PDA/VN和PDA-CMC/VN修飾6孔培養(yǎng)板，同時(shí)利用FITC標(biāo)記的熒光多肽進(jìn)行定量研究。用0.25％胰酶/EDTA(Stem Cell Technologies,Canada)將hNF-C1hiPSCs消化為單細(xì)胞，然后以23500細(xì)胞/cm^-2密度接種至PDA/VN和PDA-CMC-VN修飾6孔板中，并以預(yù)鋪有Matrigel的培養(yǎng)板作為對(duì)照。每天更換新鮮培養(yǎng)基至第四天，利用CCK8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Dojindo,Japan)測(cè)量每孔細(xì)胞數(shù)。每組含三個(gè)平行孔，每孔吸光度值測(cè)量三次。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：

1.實(shí)驗(yàn)在避光條件下進(jìn)行。將CCK8試劑以1:10比例加入至mTeSR1培養(yǎng)基中，均勻混合后每孔加入1ml。

2.置于培養(yǎng)箱中反應(yīng)2小時(shí)后，每孔吸取200ul轉(zhuǎn)至96孔板中,然后用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Model 680,Bio-Rad,Hercules,CA)測(cè)量吸光度值。

另外，Matrigel上培養(yǎng)的hNF-C1人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞經(jīng)EDTA消化后，以1:3比例傳至PDA-CMC-VN修飾的不同基體(PS,玻璃,PDMS和Ti)表面。培養(yǎng)4天后，用倒置顯 微鏡(OlympusCKX31SF,Japan)和正置金相顯微鏡(OlympusBX51M,Japan)觀察材料表面細(xì)胞形貌。同時(shí)，收集細(xì)胞后，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量Oct-4表達(dá)情況。

細(xì)胞貼壁研究

選擇H1人胚胎干細(xì)胞和hNF-C1hiPSC，研究多肽濃度，消化方法和ROCK抑制劑Y-27632對(duì)人多能干細(xì)胞貼壁的影響。首先，PDA/CMC修飾6孔板經(jīng)NHS/EDC活化后，每孔加入1ml不同濃度的VN多肽(0.25mM,0.5mM,0.75mM and 1mM)后4℃過(guò)夜反應(yīng)。第二天，接枝多肽后的培養(yǎng)板用DMEM/F12培養(yǎng)基清洗三次，然后Matrigel上培養(yǎng)的H1hESC和hNF-C1人誘導(dǎo)多功能細(xì)胞經(jīng)0.25％Trypsin/EDTA消化為單細(xì)胞，再以23500個(gè)細(xì)胞每平方厘米密度接種。同時(shí)，以相同密度傳至Matrigel上作為對(duì)照。每天更換新鮮的培養(yǎng)基至第四天，然后用CCK8試劑盒測(cè)量各孔細(xì)胞數(shù)。

如前所述，以每孔1ml體積將1mM VN加入活化后的PDA/CMC修飾培養(yǎng)板，制備PDA-CMC-VN表面用于后續(xù)人多能干細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)。H1人胚胎干細(xì)胞和hNF-C1人誘導(dǎo)多功能細(xì)胞分別以單細(xì)胞或者克隆的形式(23500個(gè)細(xì)胞每平方厘米)接種至PDA-CMC-VN和Matrigel表面，研究傳代方式對(duì)人多能干細(xì)胞貼壁和增殖的影響。同時(shí)，ROCK抑制劑Y-27632的作用也進(jìn)行了研究，即一組添加5mM Y-27632，另一組不添加。每天更換新鮮的培養(yǎng)基至第四天，然后用CCK8試劑盒測(cè)量各孔細(xì)胞數(shù)。

上述實(shí)驗(yàn)每組包含3個(gè)平行孔，每孔CCK8試劑吸光度值測(cè)量3次。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

雖然熒光多肽實(shí)驗(yàn)證實(shí)有大量的VN多肽成功接枝到聚多巴胺表面，但是沒有發(fā)現(xiàn)貼壁的H1人胚胎干細(xì)胞和hNF-C1hiPSC，說(shuō)明這種直接接枝的方式不可行。于是，我們引入同時(shí)含有氨基和羧基的羧甲基殼聚糖，先共價(jià)接枝至聚多巴胺表面，然后通過(guò)經(jīng)典的NHS/EDC反應(yīng)活化表面暴露的羧基，從而接枝VN多肽。有趣的是，雖然CMC的參入減少了VN多肽的接枝量，但實(shí)驗(yàn)證實(shí)H1人胚胎干細(xì)胞和hNF-C1hiPSC均能夠很好地貼壁和生長(zhǎng)在PDA-CMC-VN修飾的培養(yǎng)板表面。

選擇H1hESCs和hNF-C1hiPSCs，研究多肽濃度、消化方式和ROCK抑制劑Y-27632對(duì)PDA-CMC-VN修飾培養(yǎng)板表面人多能干細(xì)胞貼壁和增殖的影響。隨著VN多肽濃度的增加，PDA-CMC-VN表面含有更多的VN多肽，hNF-C1hiPSCs的細(xì)胞數(shù)也隨著逐漸增加，但H1hESCs的細(xì)胞數(shù)沒有顯著變化，且兩者均顯著低于Matrigel對(duì)照組(p<0.01)。該結(jié)果說(shuō)明，要想實(shí)現(xiàn)hPSCs在PDA-CMC-VN表面的長(zhǎng)期培養(yǎng)和擴(kuò)增，多肽的分布密度應(yīng)為一定以上。我們進(jìn)一步研究了EDTA消化方式和ROCK抑制劑Y-27632 對(duì)hPSCs貼壁和生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。無(wú)論是以單細(xì)胞或者克隆方式消化，Y-27632的加入均能夠顯著增加在PDA-CMC-VN表面培養(yǎng)4天的H1hESCs和hNF-C1hiPSCs的細(xì)胞數(shù)量(p<0.05)。然而，在Matrigel表面,單細(xì)胞或者克隆，Y-27632的促進(jìn)作用對(duì)于H1hESCs比較顯著，而對(duì)于hNF-C1hiPSCs則不明顯。此外，無(wú)論是否增加Y-27632，在PDA-CMC-VN表面生長(zhǎng)四天后，我們發(fā)現(xiàn)以克隆形式接種的H1hESCs和hNF-C1hiPSCs的細(xì)胞數(shù)，明顯多于以單細(xì)胞接種者(p<0.05)。我們驚喜的發(fā)現(xiàn)，結(jié)合EDTA消化方式和Y-27632，hNF-C1hiPSCs在PDA-CMC-VN表面生長(zhǎng)四天后的細(xì)胞數(shù)與Matrigel相近。

實(shí)施例3PDA-CMC-VN器件誘導(dǎo)人體細(xì)胞重編程為人多能干細(xì)胞

人尿液細(xì)胞重編程為人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院進(jìn)行。首先，我們成功從一名男性帕金森患者尿液中，純化獲得尿液細(xì)胞。然后利用電穿孔儀(AmaxaNucleofector II,Lonza,Switzerland)按照操作手冊(cè)，將同時(shí)編碼Oct-4(POU5F1),Sox-2,SV40LT,Klf-4的非整合型附著體載體和MicroRNA MIR302–367轉(zhuǎn)進(jìn)150萬(wàn)尿液上皮細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞轉(zhuǎn)至3孔PDA-CMC-VN修飾6孔板中，用添加有丁酸鈉的E7培養(yǎng)基(Stem Cell)培養(yǎng)，隔天換液。在轉(zhuǎn)染后的第14天，將培養(yǎng)基換成mTeSR1(Stem Cell)，繼續(xù)培養(yǎng)至第18天后挑取克隆。在PDA-CMC-VN表面培養(yǎng)至第16代后，利用核型、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光、體外擬胚體和畸胎瘤實(shí)驗(yàn)對(duì)所獲得的PDUE0304hiPSCs的多能性進(jìn)行鑒定。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：重編程至第8天即有少量胚胎干細(xì)胞樣人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞克隆，出現(xiàn)在PDA-CMC-VN表面。繼續(xù)誘導(dǎo)至第18天，表面有許多典型的胚胎干細(xì)胞樣人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞克隆，我們挑取一個(gè)克隆至Matrigel表面。在PDA-CMC-VN表面培養(yǎng)至P16的PDUE0304hiPSCs呈現(xiàn)典型的未分化克隆形貌，且核型完整。定量RT-PCR證實(shí)細(xì)胞表達(dá)干性基因Oct-4,Nanog和Sox-2，而不表達(dá)分化基因Rex-1。流式和免疫熒光結(jié)果顯示細(xì)胞高表達(dá)Oct-4,SSEA-3and Tra-1 60等全能型標(biāo)志物。此外，體外擬胚體和畸胎瘤實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)證實(shí)PDUE0304hiPSCs具備三胚層分化能力。這些結(jié)果證實(shí)，我們開發(fā)的PDA-CMC-VN器件能夠支持人體細(xì)胞重編程。據(jù)我們所知，該實(shí)驗(yàn)是首次報(bào)道多肽修飾表面能夠在成分明確條件下，將人體細(xì)胞重編程為人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，勢(shì)必將促進(jìn)人工合成表面在人多能干細(xì)胞中的應(yīng)用。

實(shí)施例4PDA-CMC-VN器件使人多能干細(xì)胞長(zhǎng)期自我更新

人多能干細(xì)胞系長(zhǎng)期自我更新

培養(yǎng)在Matrigel上的人胚胎干細(xì)胞(H1，H9)和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系(hNF-C1,GZC2F6和UMC-C1)，經(jīng)0.5mM EDTA 37℃條件下消化4分鐘后，用含有5μm Y-27632的mTeSR^TM1培養(yǎng)基將克隆吹打下來(lái)，并以1:3傳至PDA-CMC-VN修飾的6孔板中。第二天，更換為不含Y-27632的培養(yǎng)基并每天換液。同時(shí)，每天用倒置顯微鏡(OlympusCKX41,Japan)觀察細(xì)胞的形態(tài)，如發(fā)現(xiàn)有分化或異常的克隆，標(biāo)記后在生物安全柜內(nèi)用負(fù)壓吸引器(YX932D，China)吸除。根據(jù)克隆的大小和密度，細(xì)胞每隔3-5天經(jīng)EDTA消化后傳代至新的PDA-CMC-VN修飾6孔板中。

定量RT-PCR檢測(cè)

細(xì)胞用TRiZol提取RNA，繼而進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA，最后定量檢測(cè)Oct-4,Nanog,Sox-2和Rex-1的表達(dá)量，以ACTB作為對(duì)照基因，各基因引物見序列見表1。

表1.干性檢測(cè)基因引物序列

免疫熒光檢測(cè)

人胚胎干細(xì)胞(H1，H9)和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系(hNF-C1和UMC-C1)在PDA-CMC-VN表面連續(xù)傳至P20時(shí)，利用免疫熒光檢測(cè)多能性標(biāo)記物Oct-4和SSEA-3表達(dá)情況。免疫熒光實(shí)驗(yàn)在12孔板中進(jìn)行，具體檢測(cè)步驟介紹如下：

1)吸盡人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)基，用DPBS洗一次,加入1ml 4％多聚甲酵室溫

固定30分鐘。

2)吸去固定液,DPBS洗3次，每次在搖床上輕搖2min；

3)加入1ml 0.2％Triton-X100(Sigma,Missouri,USA)室溫通透30min，然后DPBS洗三次，每次在搖床上輕搖2min；

4)再利用1ml 3％BSA(Aladdin,Shanghai,China)溶液室溫封閉2小時(shí)；

5)用3％BSA與0.2％Triton-X100的等比例混合液，以1:50配制一抗(Mouse Anti-Oct-3/4IgG to Hμman(sc-5279)；Mouse Anti-SSEA-3IgM to Hμman(ab16286))，每孔 加200ul，然后再覆蓋上比孔略小的封口膜，把培養(yǎng)板放到有水的針盒(濕盒)里4℃過(guò)夜；

6)第二天用彎的針尖挑走封口膜，吸走一抗，PBS洗三次，每次在搖床上輕搖5min；

7)以下避光操作。用DPBS以1:500比例稀釋二抗(Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488IgG(Molecular Probes,Invitrogen,USA和Goat Anti-mouse Alexa Fluor 488IgM(Molecular Probes,Invitrogen,USA))，然后每孔加入400ul反應(yīng)1h；

8)DPBS洗三次，每次在搖床上輕搖5min。用DPBS以1:5000比例稀釋DAPI后，每孔加入500ul室溫染色5min；

9)DPBS洗一次后加入新DPBS,利用尼康Eclipse E800顯微鏡或者蔡司Axiovert200M倒置共聚焦顯微鏡觀察和拍照。DAPI和綠色熒光標(biāo)記抗體的激發(fā)波長(zhǎng)分別是405nm和488nm。

流式細(xì)胞術(shù)分析

2個(gè)人胚胎干細(xì)胞系(H1，H9)和2個(gè)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系(hNF-C1和UMC-C1))在PDA-CMC-VN表面連續(xù)傳至P20時(shí)，利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其多能性標(biāo)記物Oct-4，SSEA-3和Tra-1 60陽(yáng)性表達(dá)率。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：

1)待處理細(xì)胞通過(guò)0.25％胰酶/EDTA(Stem Cell Technologies,Canada)培養(yǎng)箱內(nèi)消化4分鐘，加入含血清培養(yǎng)基終止并吹打成單細(xì)胞；2)200g離心5分鐘，用1ml流式緩沖液(含2％FBS的DPBS)重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管中，加入200ul1％多聚甲醛37℃固定5分鐘后200g離心5分鐘。

3)用流式緩沖液重懸細(xì)胞,200g離心后加入200ul冰上預(yù)冷的90％甲醇,置冰上通透30分鐘。200g離心5分鐘后,流式緩沖液洗2次。

4)用流式緩沖液按1:100比例稀釋Oct-3/4一抗(01550,StemCell Technologies,Canada)。以100ul一抗溶液重懸細(xì)胞，并在培養(yǎng)箱中孵育30min。200g離心5分鐘,用流式緩沖液洗1次。步驟3-4適于細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物Oct-4檢測(cè),細(xì)胞表面標(biāo)記物SSEA-3和Tra-1 60無(wú)需此操作；

5)以下避光操作。用流式緩沖液按1:500比例稀釋Oct-4二抗，以200ul體積重懸并在培養(yǎng)箱中孵育30min。同時(shí)，用流式緩沖液按1:100比例稀釋SSEA-3(60061PE,StemCell Technologies,Canada)和Tra-1 60(60064PE,StemCell Technologies,Canada)直標(biāo)抗體，以100ul溶液重懸細(xì)胞，并在培養(yǎng)箱中孵育30min。孵育結(jié)束后,200g離心5分鐘。

6)流式緩沖液洗1次后,用600ul流式緩沖液洗重懸細(xì)胞。過(guò)濾后，用BD FACS Calibur System(LSRFortessa,USA)檢測(cè)并通過(guò)Flowjo軟件分析干性因子表達(dá)情況。

4.4核型

5個(gè)人多能干細(xì)胞系在PDA-CMC-VN修飾6孔板上傳過(guò)20代后，回傳至預(yù)鋪有Matrigel的10cm培養(yǎng)皿進(jìn)行核型檢測(cè)。待細(xì)胞生長(zhǎng)到75％-85％密度,按50μg·ml^-1濃度加入秋水仙素(Dahui Biotech,China)并在培養(yǎng)箱內(nèi)處理1h。DPBS潤(rùn)洗2遍后,用0.25％Trypsin/EDTA消化為單細(xì)胞。200g離心5分鐘后棄上清,用8ml 37℃預(yù)熱的0.075mol/LKC1溶液重懸細(xì)胞,然后置于37℃水浴中反應(yīng)20分鐘。然后，加入2ml新鮮配制的卡諾固定液(甲醇:冰醋酸3:1)并繼續(xù)處理10分鐘。細(xì)胞固定完成后,200g離心5分鐘，用冰浴過(guò)的固定液重懸細(xì)胞并制片。最后用BX51顯微鏡(Olympus,Japan)觀察染色體的排列。

擬胚體形成實(shí)驗(yàn)

在PDA-CMC-VN上傳過(guò)20代的H1hESCs和hNF-C1hiPSCs，當(dāng)生長(zhǎng)至培養(yǎng)板約70％面積時(shí)，用1mg·mL^-1Dispase消化7分鐘。DMEM/F12培養(yǎng)基清洗3次后，加入EB培養(yǎng)基(DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基含20％牛血清白蛋白,2mM L-glutaMax,1％(wt/vol)NEAA,0.1mMβ-巰基乙醇)并將細(xì)胞克隆機(jī)械刮脫，然后轉(zhuǎn)至低黏附6孔培養(yǎng)板中懸浮培養(yǎng)8天。根據(jù)細(xì)胞情況添加培養(yǎng)基或2-3天換液。然后將擬胚體轉(zhuǎn)至PDA-CMC-VN貼壁培養(yǎng)8天，并隔天換液。最后用Trizol裂解細(xì)胞,提取總RNA后,熒光定量PCR檢測(cè)三胚層標(biāo)志性基因的表達(dá)情況(引物見表2),與未分化的人多能干細(xì)胞進(jìn)行比較。

表2.擬胚體三胚層鑒定引物序列

畸胎瘤生成檢測(cè)

在PDA-CMC-VN上傳過(guò)20代的H1hESC和hNF-C1hiPSC回傳至Matrigel上培養(yǎng)，以用于畸胎瘤生成實(shí)驗(yàn)。將待注射細(xì)胞經(jīng)Dispase消化后,用1:80稀釋的Matrigel重懸，然后以一百萬(wàn)細(xì)胞量立即對(duì)NOD-SCID小鼠進(jìn)行皮下注射,并做好標(biāo)記。當(dāng)有畸胎瘤形成并成長(zhǎng)至直徑1cm時(shí)，處死小鼠，約6-8周后,一般即會(huì)有畸胎瘤長(zhǎng)出。取出畸胎瘤,切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。顯微鏡觀察尋找三個(gè)胚層典型的細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

選擇2個(gè)人胚胎干細(xì)胞系H1和H9，以及2個(gè)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系hNF-C1和UMC-C1，在PDA-CMC-VN表面連續(xù)傳代超過(guò)20代，以判斷該表面是否能夠支持人多能干細(xì)胞的長(zhǎng)期自我更新。在PDA-CMC-VN表面培養(yǎng)的4個(gè)人多能干細(xì)胞系，在傳至P20時(shí)均保持完整的核型。流式結(jié)果顯示，對(duì)于這4個(gè)人多能干細(xì)胞系，細(xì)胞多能性標(biāo)志物Oct-4,SSEA-3和Tra-160的陽(yáng)性表達(dá)率均分別超過(guò)99.4％,82.6％和96.4％。免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)這些細(xì)胞克隆均高表達(dá)多能性標(biāo)志物Oct-4和SSEA-3。

我們通過(guò)擬胚體形成和畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證H1hESCs和hNF-C1hiPSCs在PDA-CMC-VN表面培養(yǎng)超過(guò)20代后仍保持多能性。PDA-CMC-VN表面培養(yǎng)的H1hESCs和hNF-C1hiPSCs，經(jīng)懸浮和貼壁培養(yǎng)各8天后提取細(xì)胞總RNA，q-PCR結(jié)果證實(shí)H1hESCs和hNF-C1hiPSCs在PDA-CMC-VN表面形成的擬胚體均表達(dá)三胚層基因。此外，這些細(xì)胞在注射入裸鼠皮下6-8周后形成了畸胎瘤，且包含來(lái)源與三胚層的組織。這些結(jié)果證實(shí)長(zhǎng)期培養(yǎng)在PDA-CMC-VN表面的H1hESCs和hNF-C1hiPSCs仍保持多向分化能力。

實(shí)施例5PDA-CMC-VN器件支持人多能干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞和心肌樣細(xì)胞定向分化

H9hESCs在PDA-CMC-VN表面連續(xù)傳代至第15時(shí)，利用STEMdiff neural system(Stem Cell Technologies,Canada)，并按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行神經(jīng)向誘導(dǎo)分化；另外，我們參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法(Yang,L.etal.Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+embryonic-stem-cell-derived population.Nature、2008、453、524-528.)進(jìn)行了H9hESCs向心肌細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)，除第0，1和4天所用培養(yǎng)基如下所示之外，所有實(shí)驗(yàn)方法與文獻(xiàn)報(bào)道相同:第0天培養(yǎng)基：Stempro-34SFM10640medium,Glutamin(100X), transferrin(0.15mg/ml),1-thioglycerol(6.5ul/ml in 500ml medium,3ul/ml of backbone),ascorbic acid(50ug/ml),BMP4(0.05ng/ml),Y27632(10ug/ml)。第1天培養(yǎng)基：Stempro-34SFM 10640medium,Glutamin(100X),bFGF(6ng/ml),Activin A(2.5ng/ml),ascorbic acid(50ug/ml),BMP4(10ng/ml)。第4天培養(yǎng)基：Stempro-34SFM 10640medium,Glutamin(100X),transferrin(0.15mg/ml),1-thioglycerol(6.5ul/ml in 500ml medium,3ul/ml of backbone),ascorbic acid(50ug/ml),Y27632(10ug/ml),SB431542(10nM)。

定向分化形成的神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞用4％多聚甲醛固定后，通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)是否表達(dá)相關(guān)標(biāo)記物進(jìn)行鑒定。所選用的神經(jīng)特異性抗體為SOX-1(R&D AF3369,USA),Nestin(R&D MAB1259,USA),MAP-2(Millpore AB5622,USA)和Anti-β-Tubulin III(TUJ-1,Sigma-Aldrich T3952,USA)；心肌細(xì)胞特異性抗體為α-actinin(Abcam AB9465,United Kingdom)和β-myosin(R&D MAB4470,USA)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在PDA-CMC-VN表面培養(yǎng)的第15代H9hESCs,利用AggreWell^TM800板形成均一的擬胚體，并在成分明確條件下分別分化為神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞。H9hESCs在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)至第14天后形成神經(jīng)玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu),且陽(yáng)性表達(dá)神經(jīng)標(biāo)記物Sox-1和Nestin,說(shuō)明成功誘導(dǎo)成為神經(jīng)前體細(xì)胞。與此同時(shí)，我們挑取神經(jīng)玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)在神經(jīng)玫瑰花環(huán)選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天出現(xiàn)典型的神經(jīng)元形貌，免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)陽(yáng)性表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物MAP-2和TUJ-1，說(shuō)明成功分化為神經(jīng)元細(xì)胞。此外，H9hESCs形成的擬胚體在PDA-CMC-VN表面誘導(dǎo)16后形成跳動(dòng)的心肌細(xì)胞,且這些細(xì)胞表達(dá)心肌標(biāo)記物α-actinin和β-myosin。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明PDA-CMC-VN表面支持hESCs在成分明確條件下定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞。

實(shí)施例6實(shí)施例6PDA-CMC-VN·BFP-1器件促進(jìn)人多能干細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化

PDA-CMC-VN·BFP-1器件的制備和表征

PDA-CMC修飾細(xì)胞培養(yǎng)板的制備如前所述，在超凈工作臺(tái)將5mg VN多肽溶于3.1ml PBS緩沖液中，獲得1mM。將5mg BFP-1多肽溶于3.0ml PBS緩沖液中，獲得1mM BFP-1多肽溶液。將已制備的VN和BFP-1多肽溶液按照體積比10:0，7:3和5:5混合，得到VN₁₀/BFP-1₀(簡(jiǎn)稱VN)、VN₇/BFP-1₃(簡(jiǎn)稱7:3)和VN₅/BFP-1₅(簡(jiǎn)稱5:5)三組多肽混合液。然后利用如前所述NHS/EDC活化方法得到PDA-CMC-VN/BFP-1多肽混合修飾的細(xì)胞培養(yǎng)板。

我們利用FITC熒光蛋白標(biāo)記的VN多肽以及用羅丹明標(biāo)記的BFP-1多肽(Rho-KGGQGFSYPYKAVFSTQ)對(duì)表面接枝的VN和BFP-1多肽進(jìn)行多肽接枝情況的定量研究。首先，避光條件下用無(wú)菌的PBS溶液分別配置0.2mM，0.4mM，0.6mM，0.8mM，1.0mM以及1.2mM濃度梯度的FITC-VN和Rho-BFP-1多肽溶液，然后在康寧24孔板中分別加入200ul的多肽梯度液(每組3個(gè)副孔)。用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀以激發(fā)光488nm，吸收光525nm測(cè)量VN多肽熒光值，以激發(fā)光532nm，吸收光582nm測(cè)定BFP-1多肽熒光值，建立熒光-密度標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，配置VN₁₀/BFP-1₀(簡(jiǎn)稱VN)、VN₇/BFP-1₃(簡(jiǎn)稱7:3)和VN₅/BFP-1₅(簡(jiǎn)稱5:5)三組熒光多肽混合液。利用上述方法接枝至活化后的PS-PDA-CMC表面，純水清洗3次后在相同條件下測(cè)量熒光值。

人多能干細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化

在Matrigel表面培養(yǎng)的H9hESCs(代數(shù)為30-50代)及UMC-C1hiPSCs(代數(shù)為30-45代)，用Acutase酶消化成單細(xì)胞，然后接種至材料表面(VN組，7:3組及5:5組)。在mTESR1中加入ROCK抑制劑(Y-27632)促進(jìn)單細(xì)胞貼壁。12h后大部分的細(xì)胞已完全貼壁，此時(shí)更換為不含ROCK抑制劑(Y-27632)的mTESR1培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)1天后，更換mTESR1培養(yǎng)基為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(α-MEM培養(yǎng)基含10％的FBS，5μg/ml的維生素C(AA)，10mM的β-甘油磷酸鈉(β-GP)及10^-8M的地塞米松)，每2天更換培養(yǎng)基至28天。在培養(yǎng)到第28天的細(xì)胞培養(yǎng)板中，冰PBS沖洗三遍后加入4％的多聚甲醛固定30min。每孔加入1ml 2％質(zhì)量分?jǐn)?shù)茜素紅水溶液(pH＝4.2)反應(yīng)20min，蒸餾水多次沖洗后通過(guò)倒置光相差顯微鏡下拍攝鈣結(jié)節(jié)的染色情況。然后，在每孔中加入500ul的1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)十六烷基吡啶溶液，反應(yīng)完全后每孔吸取100ul的上清液轉(zhuǎn)移至新的96孔板中，每組做3個(gè)副孔，在全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀中用490nm的波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，從而定量鈣結(jié)節(jié)的形成量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同多肽混合接枝的表面，熒光強(qiáng)度都較為均勻，證實(shí)我們構(gòu)建了一個(gè)相對(duì)較為均一的材料表面。定量測(cè)量結(jié)果顯示，從VN組，到7:3組及5:5組，綠色熒光強(qiáng)度逐漸降低(代表VN多肽的接枝量逐漸降低)，紅色熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)(代表BFP-1多肽的接枝量逐漸增加)，說(shuō)明多肽按照預(yù)設(shè)的比例接枝在材料表面，熒光定量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)多肽的混合接枝比例。

成骨誘導(dǎo)28天后，各組的茜素紅定性染色和定量測(cè)定結(jié)果。通過(guò)28天的成骨誘導(dǎo)，VN組，7:3組和5:5組表面培養(yǎng)的H9hESCs及UMC-C1hiPSCs均有鈣結(jié)節(jié)形成，且隨著BFP-1成骨多肽的含量增加，鈣結(jié)節(jié)的形成量逐漸增加。定量結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，成骨多肽的確對(duì)干細(xì)胞的成骨起到促進(jìn)的作用，但是不同的細(xì)胞系表現(xiàn)有一定的差異，H9hESCs較UMC-C1hiPSCs成骨效果更好。

還需要說(shuō)明的是，在可實(shí)施且不明顯違背本實(shí)用新型的主旨的前提下，在本說(shuō)明書中作為某一技術(shù)方案的構(gòu)成部分所描述的任一技術(shù)特征或技術(shù)特征的組合同樣也可以適用于其它技術(shù)方案；并且，在可實(shí)施且不明顯違背本實(shí)用新型的主旨的前提下，作為不同技術(shù)方案的構(gòu)成部分所描述的技術(shù)特征之間也可以以任意方式進(jìn)行組合，來(lái)構(gòu)成其它技術(shù)方案。本實(shí)用新型也包含在上述情況下通過(guò)組合而得到的技術(shù)方案，并且這些技術(shù)方案相當(dāng)于記載在本說(shuō)明書中。

以上通過(guò)具體實(shí)施方式和實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)行了說(shuō)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，這些并非意圖對(duì)本實(shí)用新型的范圍進(jìn)行限定，本實(shí)用新型的范圍應(yīng)由權(quán)利要求書確定。

工業(yè)實(shí)用性

根據(jù)本實(shí)用新型，能夠提供一種可用于細(xì)胞培養(yǎng)或細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)的器件。