本實(shí)用新型屬于微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及一種用于細(xì)胞學(xué)分析的簡(jiǎn)易微流控芯片。

背景技術(shù)：

細(xì)胞是生命體結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)單元，細(xì)胞增殖、分化、遷移和代謝等行為與胚胎發(fā)育、血管新生、組織修復(fù)、免疫防御、以及腫瘤發(fā)生等重要生理病理過(guò)程都密切相關(guān)，因此，對(duì)細(xì)胞的研究是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)。

近年來(lái)，有報(bào)道將微流控芯片技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞研究，給細(xì)胞研究提供了新的方法和平臺(tái)。微流控芯片為細(xì)胞研究提供新的技術(shù)平臺(tái)，其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)包括：與細(xì)胞相似的微流體通道尺寸；有效細(xì)胞微環(huán)境控制及細(xì)胞體內(nèi)微環(huán)境模擬；減低分析試劑消耗；具備高通量和高內(nèi)涵分析潛力；系統(tǒng)化集成等。基于上述優(yōu)勢(shì)，微流控芯片分析技術(shù)已在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移和細(xì)胞藥物篩選等領(lǐng)域展開(kāi)。

然而，微流控芯片研究中涉及的相關(guān)技術(shù)對(duì)于無(wú)相關(guān)經(jīng)驗(yàn)的普通生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室仍是挑戰(zhàn)。如現(xiàn)有微流控芯片大多是利用軟光刻法加工制作微流控芯片，其制作過(guò)程較為繁復(fù)且需要借助一些昂貴、高精度的儀器來(lái)完成。例如：其掩膜的制作需借助高精度膠片打印機(jī)來(lái)完成；利用SU-8負(fù)性光刻膠光刻制作陽(yáng)模的過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜、繁瑣；大多數(shù)的芯片必須借助等離子表面處理器鍵合來(lái)完成封裝；芯片灌膠必須借助精密儀器來(lái)完成等。而且此類芯片清洗困難，往往只能一次性使用，在一定程度上增加了實(shí)驗(yàn)成本。這些都使微流控芯片在大多數(shù)生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用受到了很大范圍的限制。又如微流控芯片上成功的細(xì)胞培養(yǎng)是進(jìn)行細(xì)胞分析的基礎(chǔ)，其技術(shù)關(guān)鍵為細(xì)胞在空間受限的微通道內(nèi)培養(yǎng)時(shí) 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供。微通道內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)主要采用灌注式培養(yǎng)，即通過(guò)外圍流體灌注設(shè)備使細(xì)胞培養(yǎng)液持續(xù)在微通道內(nèi)流動(dòng)，從而為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并將細(xì)胞代謝廢物移除。然而，培養(yǎng)液流動(dòng)產(chǎn)生流體剪切力將對(duì)細(xì)胞造成一定的損傷，同時(shí)微流控芯片與外圍液路的接口問(wèn)題使細(xì)胞培養(yǎng)操作變得復(fù)雜。微通道內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)另一種方式是采用靜態(tài)培養(yǎng)，靜態(tài)培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)最常使用的方式，該方法雖不對(duì)細(xì)胞造成損傷，但將靜態(tài)培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用在空間受限的微通道內(nèi)，僅通過(guò)擴(kuò)散作用細(xì)胞常常不能獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

為此，基于上述微流控芯片加工、細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞響應(yīng)分析的三大技術(shù)難點(diǎn)，本實(shí)用新型發(fā)展一種簡(jiǎn)易且易于在普通生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展的微流控芯片及細(xì)胞分析方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本實(shí)用新型提供了一種簡(jiǎn)易微流控芯片，該芯片相對(duì)于現(xiàn)有微流控芯片更易被普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室采用加工和進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞分析的操作。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型的技術(shù)方案為：

一種簡(jiǎn)易微流控芯片，其特征在于，包括基底層和位于所述基底層上的細(xì)胞培養(yǎng)層，所述細(xì)胞培養(yǎng)層上設(shè)置有位于同一平面的儲(chǔ)液池，所述細(xì)胞培養(yǎng)層上還設(shè)置有微通道，至少兩個(gè)儲(chǔ)液池的底部由微通道連通。

進(jìn)一步，所述的一種簡(jiǎn)易微流控芯片，所述微通道為直微通道。

進(jìn)一步，所述的一種簡(jiǎn)易微流控芯片，由微通道連通的儲(chǔ)液池大小相同。

進(jìn)一步，所述的一種簡(jiǎn)易微流控芯片，所述微通道的寬度最低為30μm，深度為30μm-200μm。

進(jìn)一步，所述的一種簡(jiǎn)易微流控芯片，所述基底層為玻璃，所述細(xì)胞培養(yǎng)層為PDMS材質(zhì)。聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)是一種廣泛應(yīng)用于微流控等領(lǐng)域的聚合物材料。其是一種高分子有機(jī)硅化合物，具有無(wú)毒性、高透氣性、透光性良好、生物相容性佳、易與多種材質(zhì)室溫接合等特點(diǎn)。此外，其成本低，使用簡(jiǎn)單，且有極佳的可塑性、熱穩(wěn)定性和化學(xué)惰性。由于以上顯著優(yōu)點(diǎn)，使其成為目前微流控芯片制作使用最多的聚合物材料，也常用于芯片封裝、微流道、微混合器、微泵浦、微閥門等元件制作等領(lǐng)域。

進(jìn)一步，所述的一種簡(jiǎn)易微流控芯片，所述儲(chǔ)液池與基底層連通。

微流控芯片的快速加工是開(kāi)展微流控芯片分析的基礎(chǔ)，因此，本實(shí)用新型還提供了一種快速加工微流控芯片的方法，該方法采用感光干膜代替了液態(tài)的光刻膠作為芯片陽(yáng)模。

芯片陽(yáng)模是微流控芯片加工的關(guān)鍵，傳統(tǒng)軟光刻工藝中主要采用液態(tài)SU-8光刻膠為基礎(chǔ)，在潔凈空間通過(guò)光刻技術(shù)加工而成。該技術(shù)主要缺點(diǎn)在于需要昂貴的儀器設(shè)備、及嚴(yán)格操作流程，在一定程度上限制了大多數(shù)生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn) 室對(duì)該技術(shù)的應(yīng)用。因此，本實(shí)用新型提供一種采用低成本的感光干膜替代液態(tài)光刻膠的制備方法，不但降低了微流控芯片加工成本和難度，同時(shí)不需要額外解決空間和大型設(shè)備，更易被普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室采用加工。

感光干膜作為一種光聚合物材料主要應(yīng)用于印刷板電路板工藝。相對(duì)于液體光刻膠，感光干膜具有諸多優(yōu)勢(shì)，如良好的適應(yīng)性，基材粘附性、平整性、感光材料均勻分布性、低曝光功耗及低成本。更為重要的是，感光干膜光刻不需要超潔凈空間和昂貴的光刻設(shè)備，作為液態(tài)光刻膠的替代物還可應(yīng)用在微流體通道加工、電鑄模具等。利用感光干膜制備微流控芯片可參考任何現(xiàn)有文獻(xiàn)。而在本實(shí)用新型的一個(gè)具體實(shí)施例中，加工流程示意圖如圖5(A)所示，具體方法為：首先將三層感光干膜通過(guò)覆膜機(jī)依次層壓在玻璃板上使感光層厚度約為100μm，將微通道圖案通過(guò)愛(ài)普生噴墨打印機(jī)打印在透明膠片上制成光掩膜，紫外線透過(guò)光掩膜對(duì)感光干膜照射70s，1％碳酸鈉顯影制成微通道陽(yáng)模；將PDMS基質(zhì)和固化劑按重量10：1混合而成的預(yù)聚物澆鑄在微通道陽(yáng)模上，抽真空除氣泡，60℃下固化3h。將固化后的PDMS基片從感光干膜陽(yáng)模上剝離，利用平頭打孔器(直徑5mm)在微通道兩側(cè)打孔形成儲(chǔ)液池，氧等離子表面處理(30w，1min)與載玻片進(jìn)行不可逆鍵合，形成玻璃-PDMS復(fù)合微流控芯片。

與傳統(tǒng)加工工藝比較而言，本實(shí)用新型采用一種低成本的感光干膜作為液態(tài)光刻膠的替代，不但降低了微流控芯片加工成本和難度，同時(shí)不需要額外解決空間和大型設(shè)備，更易被普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室采用加工。同時(shí)，在沒(méi)有配置專業(yè)設(shè)備的基礎(chǔ)上，利用該方法能夠加工的微通道寬度最低為50μm，深度范圍為30μm-200μm。同時(shí)，為簡(jiǎn)化芯片結(jié)構(gòu)復(fù)雜度，避免引入外圍的灌流設(shè)備，本實(shí)用新型設(shè)計(jì)的微流控芯片由儲(chǔ)液池和微通道組成，儲(chǔ)液池內(nèi)的液體樣品在靜水壓作用下進(jìn)入微通道。

利用上述設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)易微流控芯片進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及分析的方法，該方法是一種間歇性細(xì)胞動(dòng)態(tài)培養(yǎng)分析方法，通過(guò)該方法，不但能夠?yàn)榧?xì)胞提供足夠營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，避免損傷生長(zhǎng)中的細(xì)胞，而且僅僅通過(guò)對(duì)儲(chǔ)液池的液體更換就能夠完成微流體操作和細(xì)胞培養(yǎng)，降低實(shí)驗(yàn)難度。

基于上述的一種簡(jiǎn)易微流控芯片進(jìn)行間歇性細(xì)胞動(dòng)態(tài)培養(yǎng)分析方法，包括如下進(jìn)行的步驟：

(1)將簡(jiǎn)易微流控芯片進(jìn)行消毒，然后采用人層粘連蛋白溶液對(duì)微通道進(jìn)行修飾；

(2)將細(xì)胞懸液滴加至微通道的入口處，在毛細(xì)管作用力下細(xì)胞進(jìn)入微通道內(nèi)，然后在微通道一側(cè)的儲(chǔ)液池中注滿細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)液在重力作用下持續(xù)進(jìn)入微通道并流向另一側(cè)的儲(chǔ)液池中，每隔一定時(shí)間將微通道兩側(cè)的儲(chǔ)液池中的細(xì)胞培養(yǎng)液更換一次，即實(shí)現(xiàn)間歇性細(xì)胞動(dòng)態(tài)培養(yǎng)；然后對(duì)微通道內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分析。

進(jìn)一步，所述的間歇性細(xì)胞動(dòng)態(tài)培養(yǎng)分析方法，所述消毒為：紫外燈(UV)近距離照射，然后70％乙醇沖洗微通道，最后PBS溶液沖洗微通道。

本實(shí)用新型的目的還在于提供所述的一種簡(jiǎn)易微流控芯片在細(xì)胞學(xué)分析中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述的應(yīng)用，所述細(xì)胞學(xué)分析包括細(xì)胞形態(tài)分析、細(xì)胞存活分析、細(xì)胞毒性分析、細(xì)胞藥物篩選。

本實(shí)用新型的有益效果：(1)本實(shí)用新型的簡(jiǎn)易微流控芯片簡(jiǎn)化了芯片結(jié)構(gòu)復(fù)雜度，避免引入外圍的灌流設(shè)備，本實(shí)用新型設(shè)計(jì)的微流控芯片由儲(chǔ)液池和微通道組成，儲(chǔ)液池內(nèi)的液體樣品在靜水壓作用下進(jìn)入微通道，相對(duì)于現(xiàn)有微流控芯片更易被普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室采用加工和進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞分析的操作。(2)本實(shí)用新型的簡(jiǎn)易微流控芯片的制備可采用一種低成本的感光干膜作為液態(tài)光刻膠的替代，不但降低了微流控芯片加工成本和難度，同時(shí)不需要額外解決空間和大型設(shè)備，更易被普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室采用加工。同時(shí)，在沒(méi)有配置專業(yè)設(shè)備的基礎(chǔ)上，利用該方法能夠加工的微通道寬度最低為30μm，深度范圍為30μm-200μm。(3)基于本實(shí)用新型的簡(jiǎn)易微流控芯片，可采用間歇性細(xì)胞動(dòng)態(tài)培養(yǎng)方法，該方法是利用微通道兩側(cè)儲(chǔ)液池間建立的液體靜水壓驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)液流過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)微通道，從而為細(xì)胞生長(zhǎng)提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。通過(guò)該方法，不但能夠?yàn)榧?xì)胞提供足夠營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，避免損傷生長(zhǎng)中的細(xì)胞，而且僅僅通過(guò)對(duì) 儲(chǔ)液池的液體更換就能夠完成微流體操作和細(xì)胞培養(yǎng)，降低實(shí)驗(yàn)難度。

附圖說(shuō)明

圖1簡(jiǎn)易微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2簡(jiǎn)易微流控芯片的側(cè)面剖視圖。

圖3實(shí)施例1的微流控芯片的俯視圖(圖3a)和側(cè)視圖(圖3b)。

圖4微流控芯片流體動(dòng)力學(xué)行為有限元分析結(jié)果，其中(a)為微流控芯片上液體樣品體積分?jǐn)?shù)分布云圖，(b)為微通道內(nèi)流體流動(dòng)速度-時(shí)間曲線，(c)為微通道內(nèi)流體流動(dòng)矢量圖。

圖5微通道內(nèi)A549細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞存活熒光分析。

圖6不同類型細(xì)胞在微通道內(nèi)培養(yǎng)48h后的顯微形態(tài)學(xué)圖像。

圖7不同濃度的重樓皂苷I作用微通道內(nèi)A549細(xì)胞8h后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變分析圖。

圖8不同濃度重樓皂苷I作用后微通道內(nèi)A549細(xì)胞熒光顯微圖。

圖9重樓皂苷I濃度與微通道內(nèi)A549細(xì)胞存活率間關(guān)系曲線圖。

圖10微流控芯片與傳統(tǒng)96孔平臺(tái)測(cè)量的重樓皂苷I濃度與A549細(xì)胞毒性關(guān)系曲線圖。

具體實(shí)施方式

以下將參照附圖，對(duì)本實(shí)用新型的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。

如圖1所示，本實(shí)用新型的一種簡(jiǎn)易微流控芯片，包括基底層1和位于所 述基底層1上的細(xì)胞培養(yǎng)層2，所述細(xì)胞培養(yǎng)層2上設(shè)置有位于同一平面的儲(chǔ)液池3，所述細(xì)胞培養(yǎng)層2上還設(shè)置有微通道4，至少兩個(gè)儲(chǔ)液池3的底部由微通道4連通。

作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的一種簡(jiǎn)易微流控芯片，所述微通道4為直微通道。

作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的一種簡(jiǎn)易微流控芯片，由微通道4連通的儲(chǔ)液池3大小相同。

作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的一種簡(jiǎn)易微流控芯片，所述微通道4的寬度最低為30μm，深度為30μm-200μm。

作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的一種簡(jiǎn)易微流控芯片，所述基底層1為玻璃，所述細(xì)胞培養(yǎng)層2為PDMS材質(zhì)。

作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的一種簡(jiǎn)易微流控芯片，所述儲(chǔ)液池3與基底層1連通。

實(shí)施例1微流控芯片

本實(shí)施例的一種簡(jiǎn)易微流控芯片，包括基底層1和位于所述基底層1上的細(xì)胞培養(yǎng)層2，所述基底層1為玻璃，所述細(xì)胞培養(yǎng)層2為PDMS材質(zhì)；所述細(xì)胞培養(yǎng)層2上設(shè)置有位于同一平面的儲(chǔ)液池3，所述儲(chǔ)液池3與基底層1連通，所述細(xì)胞培養(yǎng)層2上還設(shè)置有微通道4，至少兩個(gè)儲(chǔ)液池3的底部由微通道4連通；所述微通道4為直微通道，由微通道4連通的儲(chǔ)液池3大小相同，所述微通道4的長(zhǎng)度為5mm，寬度為30μm，深度為80μm，儲(chǔ)液池直徑為3mm，深3mm。

實(shí)施例2微流控芯片

本實(shí)施例的具體的微流控芯片所述基底層1為玻璃，所述細(xì)胞培養(yǎng)層2為PDMS材質(zhì)，含六條獨(dú)立的平行直微通道，每條微通道的長(zhǎng)、寬、深分別為5mm，500μm和100μm，儲(chǔ)液池直徑為5mm，深5mm。因此，這樣一片芯片上可獨(dú)立實(shí)施6次實(shí)驗(yàn)，一個(gè)微通道內(nèi)單次分析試劑耗量約為50μl。

為了方便觀察，在儲(chǔ)液池和微通道內(nèi)注入顏料，微流控芯片俯視圖和側(cè)視圖如圖3所示。

本實(shí)施例微流控芯片的制備方法：

首先將三層感光干膜通過(guò)覆膜機(jī)依次層壓在玻璃板上使感光層厚度約為100μm，將微通道圖案通過(guò)愛(ài)普生噴墨打印機(jī)打印在透明膠片上制成光掩膜，紫外線透過(guò)光掩膜對(duì)感光干膜照射70s，1％碳酸鈉顯影制成微通道陽(yáng)模；將PDMS基質(zhì)和固化劑按重量10:1混合而成的預(yù)聚物澆鑄在微通道陽(yáng)模上，抽真空除氣泡，60℃下固化3h。將固化后的PDMS基片從感光干膜陽(yáng)模上剝離，利用平頭打孔器(直徑5mm)在微通道兩側(cè)打孔形成儲(chǔ)液池，氧等離子表面處理(30w,1min)與載玻片進(jìn)行不可逆鍵合，形成玻璃-PDMS復(fù)合微流控芯片。

為簡(jiǎn)化芯片結(jié)構(gòu)復(fù)雜度，避免引入外圍的灌流設(shè)備，本實(shí)用新型的微流控芯片由儲(chǔ)液池和微通道組成，儲(chǔ)液池內(nèi)的液體樣品在靜水壓作用下進(jìn)入微通道。本實(shí)用新型采用一種低成本的感光干膜作為液態(tài)光刻膠的替代，不但降低了微流控芯片加工成本和難度，同時(shí)不需要額外解決空間和大型設(shè)備，更易被普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室采用加工。同時(shí)，在沒(méi)有配置專業(yè)設(shè)備的基礎(chǔ)上，利用該方法能夠加工的微通道寬度最低為30μm，深度范圍為30μm-200μm。為分析微流控芯片性能，通過(guò)有限元分析軟件ANSYS 14.0(美國(guó)ANSYS公司)對(duì)微通道內(nèi)流體動(dòng)力學(xué)行為進(jìn)行分析，儲(chǔ)液池式微流控芯片流體動(dòng)力學(xué)行為的數(shù)值有限元分析結(jié)果如圖4所示。圖4(a)為將液體樣品加入微通道一側(cè)的儲(chǔ)液池(直徑為5mm)后10s和700s時(shí)樣品體積分?jǐn)?shù)云圖。該圖可見(jiàn)液體樣品將通過(guò)微通道流入另一側(cè)儲(chǔ)液池，當(dāng)兩側(cè)儲(chǔ)液池液面高度相同時(shí)，液體流動(dòng)停止。圖4(b)為微通道內(nèi)流體流動(dòng)速度與時(shí)間的關(guān)系曲線。由圖4(b)結(jié)果可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，微通道內(nèi)流體流動(dòng)速度逐漸降低，其原因?yàn)閮蓚?cè)儲(chǔ)液池液面高度差隨時(shí)間延長(zhǎng)降低，從而導(dǎo)致推動(dòng)微通道內(nèi)液體流動(dòng)的靜水壓差降低。微通道內(nèi)典型的液體流場(chǎng)矢量圖如圖4(c)所示，顯示微通道內(nèi)流體沿微通道平行方向流動(dòng)，呈典型的層流模式。此外，圖4(b)還顯示儲(chǔ)液池直徑大小影響微通道內(nèi)流體流動(dòng)行為。即儲(chǔ)液池直徑越大，微通道內(nèi)流體流動(dòng)持續(xù)時(shí)間速度越長(zhǎng)，速度降 低越慢，其原因與微通道兩側(cè)儲(chǔ)液池間靜水壓差改變模式有關(guān)。因此，通過(guò)改變儲(chǔ)液池直徑能夠提供一種調(diào)控微通道內(nèi)流體流動(dòng)行為的一種策略。相比現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的通過(guò)改變儲(chǔ)液池高度調(diào)節(jié)模式，本實(shí)用新型的微流控芯片可避免額外的儲(chǔ)液池加工和計(jì)量?jī)?chǔ)液池液面高度的步驟。

實(shí)施例3微流控芯片細(xì)胞分析方法：以天然抗癌藥物重樓皂苷I促人肺癌細(xì)胞A549凋亡作用分析為例

以實(shí)施例2制備的微流控芯片進(jìn)行操作。

重樓皂苷I是一種被證實(shí)具有抗癌作用的天然藥物分子。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)施例以重樓皂苷I促人肺腺癌A549凋亡作用分析為例，對(duì)實(shí)用新型的微流控芯片細(xì)胞分析技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

以下實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備：

材料包括：重樓皂苷I(含量為98.36％)購(gòu)于上海純優(yōu)生物科技有限公司，DMSO溶解，4℃保存；人層粘連蛋白(美國(guó)PROSPEC公司)；葡聚糖(70kDa)(上海生工)；LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity試劑盒(美國(guó)Molecular probes公司)；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、鏈青霉素、胰酶(碧云天)，RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清(Gibco)；Sylgard 184型聚二甲基硅氧烷(美國(guó)Dow Corning公司)；HQ-6100感光干膜(長(zhǎng)興化工)；常規(guī)化學(xué)試劑(長(zhǎng)江化工)。

設(shè)備包括：紫外曝光燈(實(shí)驗(yàn)室自制)；FM-360覆膜機(jī)(杭州新彩)；Harrick等離子清洗機(jī)(PDG-32G-2)；HF90二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(力康)；1390噴墨打印機(jī)(愛(ài)普生)；IX71導(dǎo)致熒光顯微鏡(奧林巴斯)；CCD(QICAM fast 1394,QImanging)。

人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞懸液制備：

人肺癌細(xì)胞株A549由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)。A549細(xì)胞用含10％胎牛血清、100U/毫升青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中在37℃、5％二氧化碳條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化細(xì)胞，1500rmp離心4min，用含4％ 的葡聚糖的RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，制成濃度約為5×10⁶cells/ml細(xì)胞懸液。

(1)微流控芯片上A549細(xì)胞培養(yǎng)

微流控芯片上細(xì)胞培養(yǎng)包括三個(gè)步驟：芯片消毒，微通道修飾及細(xì)胞加載培養(yǎng)。芯片消毒：紫外燈(UV)近距離照射30min，70％乙醇沖洗微通道5min，PBS沖洗微通道2次；微通道修飾：在微通道內(nèi)注入濃度為0.1mg/ml的人層粘連蛋白溶液，37℃下孵育1h，PBS沖洗微通道2次；細(xì)胞加載培養(yǎng)：將5μl A549細(xì)胞懸液滴加進(jìn)微通道入口，在毛細(xì)管作用力下細(xì)胞進(jìn)入微通道內(nèi)，芯片放置進(jìn)37℃、5％二氧化碳濃度培養(yǎng)箱中靜止1h，在微通道一側(cè)儲(chǔ)液池中注滿含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)液在重力作用下持續(xù)進(jìn)入微通道并流向另一側(cè)儲(chǔ)液池中，儲(chǔ)液池中培養(yǎng)液8-12h更換一次。微通道內(nèi)培養(yǎng)不同時(shí)間的A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)通過(guò)倒置光學(xué)顯微鏡明場(chǎng)觀察，培養(yǎng)的細(xì)胞活性通過(guò)細(xì)胞存活/死亡檢測(cè)試劑盒Calcein-AM熒光染色分析。

對(duì)微通道內(nèi)A549細(xì)胞采用間歇式動(dòng)態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不同階段的A549細(xì)胞相差顯微形態(tài)圖如圖5，該結(jié)果顯示A549細(xì)胞能夠在微通道內(nèi)粘附、鋪展和增殖，培養(yǎng)48h細(xì)胞就能夠鋪滿微通道，進(jìn)一步Calcein AM熒光染色顯示細(xì)胞處于存活狀態(tài)。

另外，為驗(yàn)證儲(chǔ)液池式微流控上通過(guò)間歇性細(xì)胞動(dòng)態(tài)培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的通用性，本實(shí)用新型中還按照上述方法進(jìn)行了人腎上皮細(xì)胞株293、血管內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926、人原代嗅粘膜細(xì)胞及人膀胱癌細(xì)胞T24微流控芯片培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后微通道內(nèi)細(xì)胞形態(tài)學(xué)如圖6所示。結(jié)果顯示上述四種細(xì)胞均能夠在微通道進(jìn)行增殖，也進(jìn)一步說(shuō)明微流控芯片細(xì)胞培養(yǎng)方式具有優(yōu)良的通用性。

微流控芯片上成功的細(xì)胞培養(yǎng)是進(jìn)行細(xì)胞分析的基礎(chǔ)，其技術(shù)關(guān)鍵為細(xì)胞在空間受限的微通道內(nèi)培養(yǎng)時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供。微通道內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)主要采用灌注式培養(yǎng)，即通過(guò)外圍流體灌注設(shè)備使細(xì)胞培養(yǎng)液持續(xù)在微通道內(nèi)流動(dòng)，從而為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并將細(xì)胞代謝廢物移除。然而，培養(yǎng)液流動(dòng)產(chǎn)生流體剪切力將對(duì)細(xì)胞造成一定的損傷，同時(shí)微流控芯片與外圍液路的接口問(wèn)題使細(xì)胞培養(yǎng)操作變得復(fù)雜。靜態(tài)培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)最常使用的方式，該方法雖不對(duì)細(xì)胞造成 損傷，但將靜態(tài)培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用在空間受限的微通道內(nèi)，僅通過(guò)擴(kuò)散作用細(xì)胞常常不能獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本實(shí)用新型中采用了間歇性細(xì)胞動(dòng)態(tài)培養(yǎng)技術(shù)，該技術(shù)是利用微通道兩側(cè)儲(chǔ)液池間建立的液體靜水壓驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)液流過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)微通道，從而為細(xì)胞生長(zhǎng)提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中每間隔一段時(shí)間(如8-12h)移除微通道兩端儲(chǔ)液池中的舊培養(yǎng)液，同時(shí)在微通道一側(cè)儲(chǔ)液池中加入新鮮培養(yǎng)液。通過(guò)該方法，不但能夠?yàn)榧?xì)胞提供足夠營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，避免損傷生長(zhǎng)中的細(xì)胞，而且僅僅通過(guò)對(duì)儲(chǔ)液池的液體更換就能夠完成微流體操作和細(xì)胞培養(yǎng)，降低了實(shí)驗(yàn)難度。

(2)不同濃度重樓皂苷I對(duì)微通道內(nèi)A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變分析

微通道內(nèi)培養(yǎng)不同時(shí)間的A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)通過(guò)倒置光學(xué)顯微鏡明場(chǎng)觀察，培養(yǎng)的細(xì)胞活性通過(guò)Calcein-AM熒光染色分析。待微通道內(nèi)A549細(xì)胞融合度達(dá)到90％以上(48h)，吸出兩端儲(chǔ)液池中的細(xì)胞培養(yǎng)液，將50μl含不同重樓皂苷I濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液(濃度分別是0、2、4、6、8、10mg/ml)加入不同微通道一側(cè)的儲(chǔ)液池，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育8h后，倒置顯微鏡觀察分析A549細(xì)胞在不同濃度重樓皂苷I作用后形態(tài)學(xué)改變。

對(duì)微通道內(nèi)A549細(xì)胞進(jìn)行藥物作用采用上述的依賴靜水壓力驅(qū)動(dòng)的方法，即在微通道一側(cè)儲(chǔ)液池加入含不同濃度的重樓皂苷I細(xì)胞培養(yǎng)液，在靜水壓力作用下流過(guò)微通道內(nèi)A549細(xì)胞并對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行刺激。圖7為不同濃度重樓皂苷I作用微通道內(nèi)A549細(xì)胞8h后細(xì)胞的形態(tài)圖。從圖7可見(jiàn)，A549細(xì)胞在重樓皂苷I作用后，細(xì)胞質(zhì)收縮變園，細(xì)胞從基底脫離，呈凋亡的形態(tài)學(xué)。隨著重樓皂苷I濃度的上升，細(xì)胞收縮變圓數(shù)量比例增加，重樓皂苷I濃度達(dá)到10μg/ml時(shí)，變圓細(xì)胞比例接近100％。在未經(jīng)重樓皂苷I作用的微通道內(nèi)，A549細(xì)胞呈梭形，量化鋪展，呈正常生長(zhǎng)狀態(tài)。因此，通過(guò)對(duì)微通道內(nèi)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的分析能夠初步驗(yàn)證重樓皂苷I體外促A549細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。

(3)微通道內(nèi)A549細(xì)胞存活/死亡熒光染色分析

為進(jìn)一步量化重樓皂苷I濃度與A549細(xì)胞凋亡強(qiáng)度的關(guān)系，對(duì)微通道內(nèi)A549細(xì)胞進(jìn)行熒光染色分析。分析時(shí)，將含2μM Calcein AM和4μM ethidium homodier-1(EthD-1)的熒光染料混合液注入儲(chǔ)液池中。其中，Calcein AM能夠?qū)罴?xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，呈綠色熒光；EthD-1能夠特異標(biāo)記死亡細(xì)胞，呈紅色熒光。

具體操作為：微通道內(nèi)A549細(xì)胞經(jīng)過(guò)步驟(2)不同濃度重樓皂苷I處理后，吸出微通道兩端儲(chǔ)液池中細(xì)胞培養(yǎng)液，在一端儲(chǔ)液池中加入PBS沖洗2次，吸除PBS。在微通道一側(cè)儲(chǔ)液池加入50μl含2μM Calcein AM和4μM ethidium homodier-1(EthD-1)的細(xì)胞存活/死亡熒光染料，室溫下孵育30min，吸除熒光染料，PBS沖洗2次。通過(guò)倒置熒光顯微鏡下對(duì)微通道內(nèi)細(xì)胞熒光圖像進(jìn)行觀察，拍照，用圖像分析軟件Image ProPlus 6.0(media cybernetic)對(duì)圖像進(jìn)行分析。

不同濃度重樓皂苷I作用微通道內(nèi)A549細(xì)胞8h后細(xì)胞熒光染色結(jié)果如圖8所示。結(jié)果顯示隨著重樓皂苷I濃度增加，微通道內(nèi)存活細(xì)胞(綠色)數(shù)量降低，該結(jié)果與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果相似。以未經(jīng)重樓皂苷I處理的微通道活細(xì)胞數(shù)量為對(duì)照，重樓皂苷I濃度與微通道內(nèi)活細(xì)胞殘留率間的關(guān)系如圖9所示。值得注意的是，在對(duì)重樓皂苷I處理組的微通道內(nèi)A549細(xì)胞進(jìn)行熒光觀察時(shí)，實(shí)驗(yàn)未見(jiàn)微通道內(nèi)紅色熒光標(biāo)記的死細(xì)胞，其原因在于熒光染色分析過(guò)程中死細(xì)胞從微通道內(nèi)被沖洗掉。

(4)微通道內(nèi)A549細(xì)胞毒性分析

微通道內(nèi)A549細(xì)胞毒性分析采用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。LDH釋放是細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，當(dāng)細(xì)胞凋亡或壞死造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致細(xì)胞漿中的LDH釋放到培養(yǎng)液中，通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH的活性從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒性的定量分析。

分析流程如下：實(shí)驗(yàn)分為無(wú)細(xì)胞的空白對(duì)照微通道，未經(jīng)重樓皂苷I作用的樣品對(duì)照微通道和最大酶活性微通道，不同濃度重樓皂苷I作用的樣品處理微通道。重樓皂苷I作用7h時(shí)，在最大酶活性微通道儲(chǔ)液池中加入5μl LDH釋放試劑，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1h。隨后從所有微通道儲(chǔ)液池中吸出培養(yǎng)液，離心后將50μl上清液加入96孔板中，隨著在每孔中加入25μl LDH檢測(cè)工作液， 室溫避光孵育30min，多功能酶標(biāo)儀測(cè)量490nm處吸光度，測(cè)量采用620nm波長(zhǎng)作為參考波長(zhǎng)。每孔的吸光度減去空白對(duì)照的吸光度后，細(xì)胞毒性(％)＝(樣品處理吸光度-樣品對(duì)照組吸光度)/(細(xì)胞最大酶活性吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)×100。

不同濃度重樓皂苷I與A549細(xì)胞毒性的關(guān)系曲線如圖10所示。結(jié)果顯示，隨著重樓皂苷I濃度增殖，A549細(xì)胞LDH釋放率增強(qiáng)，細(xì)胞毒性越大，該結(jié)果與細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞存活率分析結(jié)果相似。

為進(jìn)一步驗(yàn)證微流控芯片進(jìn)行細(xì)胞毒性分析方法的可靠性，本實(shí)用新型還通過(guò)與傳統(tǒng)96孔板平臺(tái)上進(jìn)行的LDH釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果如圖10所示，結(jié)果顯示兩種不同平臺(tái)獲得的不同濃度重樓皂苷I對(duì)A549細(xì)胞毒性具有相同的趨勢(shì)。此外，相比96孔板實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，微流控芯片上測(cè)量的重樓皂苷I的細(xì)胞毒性值更高，特別在2μg/ml和4μg/ml低濃度情況下。推測(cè)其原因與微流控芯片上的流動(dòng)環(huán)境和空間受限條件下細(xì)胞與藥物作用更充分有關(guān)。

綜上，本實(shí)用新型的微流控芯片簡(jiǎn)單，該微流控芯片易于在普通生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展微流控芯片細(xì)胞分析。本實(shí)用新型通過(guò)重樓皂苷I促人肺癌細(xì)胞A549凋亡的分析為例對(duì)本實(shí)用新型的微流控芯片進(jìn)行了驗(yàn)證。微流控芯片上細(xì)胞培養(yǎng)采用一種間歇式細(xì)胞動(dòng)態(tài)培養(yǎng)技術(shù)，該技術(shù)能為空間受限微通道內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)提供足夠營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且易于操作；微流控芯片上細(xì)胞對(duì)重樓皂苷I的響應(yīng)分析采用了形態(tài)學(xué)、細(xì)胞存活/死亡熒光染色分析及基于LDH釋放的細(xì)胞毒性分析三種策略，能夠從定性到定量的不同層次獲得細(xì)胞響應(yīng)信息。因此，本實(shí)用新型的微流控芯片及細(xì)胞分析方法操作簡(jiǎn)單，未來(lái)可在普通生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室中推廣并應(yīng)用于各類體外細(xì)胞藥物篩選分析。

最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本實(shí)用新型的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本實(shí)用新型的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本實(shí)用新型技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本實(shí)用新型的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。