本發(fā)明屬于茄尼醇提取
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種提高廢次煙草中茄尼醇溶浸的金屬-酶制劑共催化方法。
背景技術(shù)：
：茄尼醇是三倍半萜醇，天然存于煙葉（總重的0.3％～3％）、馬鈴薯葉（約為1.5%左右）、桑葉（約0.1%）等中，具有較強的抗癌生物活性，常作為藥物合成的重要原料，應(yīng)用于：①合成泛醌類化合物如輔酶q10；②合成治療腫瘤藥物；③合成抗?jié)兯幬?；④合成治療心腦血管病藥物；⑤合成抗艾滋病毒藥物，具有廣闊的應(yīng)用前景?，F(xiàn)有茄尼醇提取技術(shù)主要有溶劑萃取法、超臨界萃取法、聚合態(tài)共沉淀法、鮮法勻漿萃取法以及分子蒸餾技術(shù)等，或多或少能有效降解木質(zhì)纖維素促進天然茄尼醇的溶出，但強酸（堿）、高溫（壓）等工藝條件不僅導(dǎo)致高能耗、高污染，而且易使茄尼醇發(fā)生加成、氧化、脫氫及分子重排反應(yīng)等，降低資源利用率。因此，研究提高茄尼醇的提取方法，具有非常重要的意義?，F(xiàn)有提取茄尼醇的方法，如2014年10月1日公開的公開號為cn104072336a的“一種提取茄尼醇的工藝”，公開的方法是以廢次煙葉為原料，采用超臨界層析法，利用超臨界二氧化碳的良好選擇性和樹脂的選擇性，經(jīng)原料預(yù)處理、一級萃取、二級萃取、三級萃取、洗脫后重結(jié)晶、過濾和干燥，獲得茄尼醇。其中，一級萃取為粗提，利用超臨界二氧化碳溶浸廢次煙葉中所有組分，原料填充率為80%，萃取溫度為65-75℃；二級萃取利用萃取釜中吸附劑（分子篩、三氧化二鋁或活性炭）完成脫蠟、脫脂和除雜，溫度為60-70℃；三級萃取利用具有選擇性的色譜硅膠或樹脂完成茄尼醇的吸附，并采用乙酸乙酯或石油醚洗脫，獲純度為95%的茄尼醇。該方法的主要缺點是：（1）該方法利用利用超臨界二氧化碳溶浸煙葉中茄尼醇，但同時也增強了煙葉中其他組分的溶出，因溶出組分的多樣性加大了雜質(zhì)去除難度，故采取三級萃取工序，進而增加生產(chǎn)設(shè)備，加大生產(chǎn)成本；（2）該方法三級萃取各階段采取不同功能的吸附劑，增加生產(chǎn)原料，增加生產(chǎn)成本；（3）該方法二級萃取中采用具有吸附功能的分子篩、三氧化二鋁或活性炭為吸附劑，雖完成脫蠟、脫脂和除雜，但也會吸附茄尼醇，減少三級萃取中茄尼醇的提取率，減低生產(chǎn)產(chǎn)量；（4）該方法生產(chǎn)需使用超臨界技術(shù)，且過程中萃取溫度高于60℃，不僅需要特殊的生產(chǎn)設(shè)備，還需外加熱源設(shè)備，進一步增加生產(chǎn)成本。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是，針對現(xiàn)有提取茄尼醇方法的不足，提供一種提高廢次煙草中茄尼醇溶浸的金屬-酶制劑共催化方法，具有反應(yīng)條件溫和、操作步驟少且簡單、茄尼醇溶浸充分且雜質(zhì)少、生產(chǎn)能耗和成本低等特點。本發(fā)明的機理是：本發(fā)明以廢次煙草為原料，選用工程酶（木聚糖酶：纖維素酶：漆酶）作為催化活化木質(zhì)纖維素的酶制劑、錳系催化劑為酶制劑的激活劑，通過木聚糖酶和漆酶降解煙草中桎梏纖維素的木質(zhì)素，增加纖維素酶對纖維素的水解作用，通過金屬催化劑提高酶制劑的催化活性，增強阻礙茄尼醇溶出的煙草植物纖維組織的水解程度，提高植物組織通透性，減小茄尼醇傳質(zhì)阻力，增大茄尼醇提取率。二者協(xié)同催化水解煙草植物纖維組織，因酶的專一性，減少煙葉中其他活性成分的溶出，同時避免化學(xué)活化劑酸、堿的使用量，減少了茄尼醇生產(chǎn)安全隱患，避免酸堿使用加大對環(huán)境造成的二次污染，有利于環(huán)境保護，實現(xiàn)廢次煙草資源化再利用。實現(xiàn)發(fā)明目的的技術(shù)方案是：一種提高廢次煙草中茄尼醇溶浸的金屬-酶制劑共催化方法，以廢次煙草為原料，經(jīng)原料預(yù)處理、金屬-酶制劑共催化反應(yīng)、超聲波協(xié)同處理、茄尼醇產(chǎn)品制備得到產(chǎn)品。所述方法的具體步驟如下：（1）原料預(yù)處理以煙草固體廢棄物（包括廢次煙葉、煙梗、煙草加工過程中的下腳料及提取煙草總天然產(chǎn)物的煙渣等）為原料。先將原料用水清洗干凈后，放置于烘箱中，先在85～110℃的烘箱中烘30～90min，再經(jīng)粉碎機粉碎后、并過20～120目篩，未過篩的原料返回粉碎機中再粉碎，收集過篩原料（即為預(yù)處理后的原料）。（2）金屬-酶制劑共催化反應(yīng)第（1）步驟完成后，先按照第（1）步處理后的原料質(zhì)量(g)∶催化劑質(zhì)量(g)∶水的體積(ml)之比為1∶0.0125～0.075∶5～15的比例，在第（1）步預(yù)處理后的原料中，加入催化劑及水，攪拌均勻后，再用硫酸或氫氧化鈉稀溶液調(diào)節(jié)體系的ph值為4～8，然后將調(diào)節(jié)ph值后的混合液放置于搖床中，在水浴溫度為20～45℃下進行酶解活化4～8h，用抽濾泵進行抽濾，分別收集濾液和濾渣。收集的濾液為含有茄尼醇的水相提取液；收集的濾渣為經(jīng)催化劑催化活化后的煙草基料。所述的催化劑為金屬和復(fù)配酶的金屬-酶制劑，其投加量之比為金屬催化劑（g）∶酶制劑（g）=1:1.6～10；所述的金屬為錳鋅鐵氧體（mn0.3zn0.2fe0.5ox）或mn2+或fe3+；所述酶制劑為酶活比為木聚糖酶：纖維素酶：漆酶=2～14∶23～47∶51～64的復(fù)配酶。（3）超聲波協(xié)同處理第（2）步驟完成后，先將第（2）步收集的濾渣，即煙草基料轉(zhuǎn)入到浸提容器中，再按照第（1）步驟預(yù)處理后原料的質(zhì)量(g)∶復(fù)合萃取劑溶液的體積(ml)之比為1∶8～12的比例，在浸提容器中加入復(fù)合萃取劑溶液，攪拌混合均勻，并在超聲波功率100～200w、溫度30～55℃條件下進行超聲波處理5～40min后，用抽濾機進行抽濾，分別收集濾液和濾渣。對收集的濾渣作為制備吸附材料的原料；將收集的濾液轉(zhuǎn)入離心機中，在離心轉(zhuǎn)速為3000～4000r/min條件下，進行離心分離10～40min后，分別收集離心清液（即為含茄尼醇的提取液）和離心渣。對收集的離心渣轉(zhuǎn)入第（2）步中濾渣，作為制備吸附材料的原料；對收集的離心清液通過高效液相色譜法測定茄尼醇的濃度，即按高效液相色譜法的流動相乙醇∶甲醇的體積比為1∶4～9的比例，在流速為0.6～1.2ml/min，柱溫20～30℃條件下，測定收集的離心清液中的茄尼醇質(zhì)量濃度及溶出率。茄尼醇溶出率為92.00～98.70%，溶出率提高15.00～24.90%。所述的復(fù)合萃取劑溶液為乙醇∶甲醇的質(zhì)量濃度比為1∶1～9的乙醇和甲醇的混合液。（4）茄尼醇產(chǎn)品制備第（3）步驟完成后，先將第（3）步收集的離心清液放置于在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在真空壓強為0.1～0.6mpa、溫度為30～60℃下，進行減壓濃縮至粘稠狀得茄尼醇粗制品。然后，按照茄尼醇粗制品的質(zhì)量(g)∶復(fù)合提取劑溶液的體積(ml)之比為1∶3～6的比例，在浸提容器中加入茄尼醇粗品和復(fù)合萃取劑溶液，混合溶解均勻。最后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，在真空壓強為0.1～0.6mpa、溫度為30～60℃下，進行減壓濃縮重復(fù)2～4次，制得茄尼醇產(chǎn)品。茄尼醇提取率達90.0～97.5%，純度高達91.0～94.0%%。本發(fā)明采用上述技術(shù)方案后，主要有以下效果：（1）本發(fā)明選用金屬催化劑和復(fù)配酶作為催化活化木質(zhì)纖維素的協(xié)同活化劑，提高茄尼醇的提取率。再經(jīng)金屬-酶制劑協(xié)同催化降解煙草木質(zhì)纖維素，能提高酶制劑的生物活性，進而提高煙草內(nèi)部通透性，減少茄尼醇溶出傳質(zhì)阻力，促使茄尼醇溶浸充分，因此，本發(fā)明方法所得茄尼醇溶出率為98.64%，比超聲醇提法提高24.90%，其提取率可達97.3%。（2）本發(fā)明用金屬-酶制劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學(xué)活化劑酸堿浸提茄尼醇和煙堿，減少酸堿等化學(xué)試劑對茄尼醇生物活性的破壞，其浸提液中干擾組分較少，生物活性保留完備，能確保產(chǎn)品質(zhì)量。用酶代替活化劑酸堿，同時避免了生產(chǎn)過程中酸堿對生產(chǎn)設(shè)備的腐蝕而縮短生產(chǎn)設(shè)備使用壽命，有利于環(huán)境保護，又降低生產(chǎn)成本。（3）本發(fā)明采用的煙草固體廢棄物經(jīng)酶（纖維素酶或木質(zhì)素或纖維素酶和木質(zhì)素酶復(fù)配酶）催化活化條件在20～40℃最佳，酶解時間僅為7.5小時，反應(yīng)條件溫和，操作簡單，且提取茄尼醇使用的有機溶劑為甲醇和乙醇，減少高溫或大量有毒有機溶劑提取茄尼醇的生產(chǎn)安全隱患，減少生產(chǎn)過程中環(huán)境治理成本的同時，提高生產(chǎn)安全性能，又降低能耗。（4）本發(fā)明方法的原料來源廣，廢物利用充分，生產(chǎn)成本低，操作簡單，方法綠色環(huán)保。本發(fā)明方法可廣泛應(yīng)用于固體煙草廢棄物為原料提制茄尼醇，也可廣泛應(yīng)用于從固體煙草廢棄物中煙堿、果膠、纖維素的提取。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進一步說明。實施例1一種提高廢次煙草中茄尼醇溶浸的金屬-酶制劑共催化方法的具體步驟如下：（1）原料預(yù)處理將40g廢棄的煙葉洗凈，晾干后，放置于烘箱中，在100℃的烘箱中烘30min后取出，經(jīng)粉碎機粉碎后過60目的分子篩篩分，得到粒徑小于60目的煙葉，用塑料袋分裝，備用。（2）金屬-酶制劑共催化反應(yīng)第（1）步驟完成后，先按照第（1）步處理后的原料質(zhì)量(g)∶催化劑質(zhì)量(g)∶水的體積(ml)之比為1∶0.035∶10的比例，在第（1）步預(yù)處理后的原料中，加入催化劑及水，攪拌均勻后，再用硫酸或氫氧化鈉稀溶液調(diào)節(jié)體系的ph值為7，然后將調(diào)節(jié)ph值后的混合液放置于搖床中，在水浴溫度為45℃下進行酶解活化7.5h，用抽濾泵進行抽濾，分別收集濾液和濾渣。收集的濾液為含有茄尼醇的水相提取液；收集的濾渣為經(jīng)催化劑催化活化后的煙草基料。所述的催化劑為金屬和復(fù)配酶的金屬-酶制劑，其投加量之比為金屬催化劑（g）∶酶制劑（g）=1:5；所述的金屬為錳鋅鐵氧體mn0.3zn0.2fe0.5ox；所述酶制劑為酶活比為木聚糖酶：纖維素酶：漆酶=14∶23∶63的復(fù)配酶。（3）超聲波協(xié)同處理第（2）步驟完成后，先將第（2）步收集的濾渣，即煙草基料轉(zhuǎn)入到浸提容器中，再按照第（1）步驟預(yù)處理后原料的質(zhì)量(g)∶復(fù)合萃取劑溶液的體積(ml)之比為1∶10的比例，在浸提容器中加入復(fù)合萃取劑溶液，攪拌混合均勻，并在超聲波功率200w、溫度50℃條件下進行超聲波處理25min后，用抽濾機進行抽濾，分別收集濾液和濾渣。對收集的濾渣作為制備吸附材料的原料；將收集的濾液轉(zhuǎn)入離心機中，在離心轉(zhuǎn)速為4000r/min條件下，進行離心分離15min后，分別收集離心清液（即為含茄尼醇的提取液）和離心渣。對收集的離心渣轉(zhuǎn)入第（2）步中濾渣，作為制備吸附材料的原料；對收集的離心清液通過高效液相色譜法測定茄尼醇的濃度，即按高效液相色譜法的流動相乙醇∶甲醇的體積比為1∶6的比例，在流速為0.8ml/min，柱溫25℃條件下，測定收集的離心清液中的茄尼醇質(zhì)量濃度及溶出率。茄尼醇溶出率為98.64%，溶出率提高24.9%。所述的復(fù)合萃取劑溶液為乙醇∶甲醇的質(zhì)量濃度比為1∶5.5的乙醇和甲醇的混合液。（4）茄尼醇產(chǎn)品制備第（3）步驟完成后，先將第（3）步收集的離心清液放置于在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在真空壓強為0.2mpa、溫度為45℃下，進行減壓濃縮至粘稠狀得茄尼醇粗制品。然后，按照茄尼醇粗制品的質(zhì)量(g)∶復(fù)合提取劑溶液的體積(ml)之比為1∶5的比例，在浸提容器中加入茄尼醇粗品和復(fù)合萃取劑溶液，混合溶解均勻。最后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，在真空壓強為0.2mpa、溫度為45℃下，進行減壓濃縮重復(fù)3次，制得茄尼醇產(chǎn)品。茄尼醇提取率達97.3%，純度高達93.5%。實施例2一種提高廢次煙草中茄尼醇溶浸的金屬-酶制劑共催化方法的方法，同實施例1，其中：第（1）步中，選用煙草目數(shù)為20目，烘箱溫度為85℃，烘干時間為90min。第（2）步中，煙草固體廢棄物的質(zhì)量(g)∶催化劑質(zhì)量(g)∶水的體積(ml)之比為1∶0.0125∶5的比例。采用鹽酸溶液調(diào)節(jié)體系的ph值為4，酶解水浴溫度為25℃。酶解活化煙草基料8h。所述的金屬-酶制劑投加量之比為金屬催化劑（g）∶酶制劑（g）=1:1.6；所述酶制劑為酶活比為木聚糖酶：纖維素酶：漆酶=2∶47∶51的復(fù)配酶。第（3）步中，預(yù)處理后的煙草固體廢棄物的質(zhì)量∶復(fù)合萃取劑溶液體積比為1:8，復(fù)合萃取劑乙醇∶甲醇的體積比例為1∶1。超聲波功率為200w、超聲溫度為30℃，超聲時間為5min；濾液離心轉(zhuǎn)數(shù)為4000r/min，離心時間為25min。高效液相色譜法流動相乙醇和甲醇的體積比例為1∶9，流速為1.2ml/min，柱溫為30℃。茄尼醇溶出率為92.03%，溶出率提高16.56%。第（4）步中，抽濾真空壓強為0.6mpa、濃縮溫度為60℃。茄尼醇粗制品的質(zhì)量(g)∶復(fù)合提取劑溶液的體積(ml)之比為1∶3。茄尼醇提取率達95.9%，純度達91.5%。實施例3一種提高廢次煙草中茄尼醇溶浸的金屬-酶制劑共催化方法的方法，同實施例1，其中：第（1）步中，選用煙草目數(shù)為120目，烘箱溫度為110℃，烘干時間為30min。第（2）步中，煙草固體廢棄物的質(zhì)量(g)∶催化劑質(zhì)量(g)∶水的體積(ml)之比為1∶0.075∶15的比例。采用鹽酸溶液調(diào)節(jié)體系的ph值為6，水浴溫度為45℃。酶解活化煙草基料4h。所述的金屬-酶制劑投加量之比為金屬催化劑（g）∶酶制劑（g）=1:10；所述酶制劑為酶活比為木聚糖酶：纖維素酶：漆酶=2∶34∶64的復(fù)配酶。第（3）步中，預(yù)處理后的煙草固體廢棄物的質(zhì)量∶復(fù)合萃取劑溶液體積比為1:12，復(fù)合萃取劑乙醇∶甲醇的體積比例為1∶9。超聲波功率為100w、超聲溫度為55℃，超聲時間為40min；濾液離心轉(zhuǎn)數(shù)為3000r/min，離心時間為10min。高效液相色譜法流動相乙醇和甲醇的體積比例為1∶4，流速為0.6ml/min，柱溫為20℃。茄尼醇溶出率為95.30%，溶出率提高20.7%。第（4）步中，抽濾真空壓強為0.1mpa、濃縮溫度為30℃。茄尼醇粗制品的質(zhì)量(g)∶復(fù)合提取劑溶液的體積(ml)之比為1∶6。茄尼醇提取率達93.2%，純度達92.0%。實驗結(jié)果1、采用實施例1的方法與其他方法溶浸茄尼醇的比較表1提制茄尼醇產(chǎn)品與復(fù)配酶催化水解以及超聲醇提方法的比較方法濃度（mg/ml）溶浸率（%）溶浸提高率（%）提取率（%）純度（%）有機溶劑使用量（ml）反應(yīng)溫度（℃）浸提時間（min）金屬-酶制劑解工藝0.179498.6424.9097.3093.50204530復(fù)配酶催化水解0.168792.7617.4992.8091.0204530超聲醇提0.143578.95__78.9575.605050、加熱50從上述實驗知：本發(fā)明采用金屬-酶共催化活化處理煙草固體廢棄物制備活性炭，當(dāng)投加與固體煙葉廢棄物質(zhì)量比為1：0.035的酶（木聚糖酶：纖維素酶：漆酶酶活比為14∶23∶63），加入水體積比為1：10，在水浴近室溫條件下45℃，酶解時間為7.5h，經(jīng)復(fù)合提取劑協(xié)同超聲處理可制得茄尼醇產(chǎn)品，同時可獲得附產(chǎn)物煙堿。其中煙草酶解活化基料質(zhì)量(g)∶復(fù)合提取劑溶液體積(ml)之比為1:10，復(fù)合提取劑乙醇：甲醇的體積比例為1∶5.5，超聲波功率為200w、超聲溫度為50℃，超聲浸提時間為25min。該方法茄尼醇溶出充分，其溶浸率為98.64%，比超聲醇提方法提高24.90%。該方法酶代替酸堿活化劑，制備條件溫和，不僅避免酸堿對生產(chǎn)設(shè)備的腐蝕，而且減少高溫制備產(chǎn)品的生產(chǎn)安全隱患，操作簡單，茄尼醇產(chǎn)品提取率和純度高，且生物活性完備，同時減少生產(chǎn)過程中酸堿及有害有機物對環(huán)境造成的二次污染，有利于環(huán)境保護，降低生產(chǎn)成本。當(dāng)前第1頁12