本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種青枯菌(Ralstonia solanacearum)的LAMP檢測(cè)引物組合及其LAMP檢測(cè)試劑盒和LAMP方法。

背景技術(shù)：

植物細(xì)菌性青枯病(Bacterial wilt of plants)，是由茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum Yabuuchi et al.，簡(jiǎn)稱青枯菌)引起的一種世界性重大病害。青枯病于上世紀(jì)30年代在我國(guó)首次被報(bào)道；上世紀(jì)50年代，該病僅分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域。但迄今為止，南起20°N的海南省、北至42°N的河北壩上地區(qū)均有其造成危害的報(bào)道(徐進(jìn)等，2013)。作為復(fù)合種，青枯菌寄主范圍廣泛，可侵染54個(gè)科的450余種植物(Wicker et al.，2007)。其中經(jīng)濟(jì)上重要的寄主包括馬鈴薯、西紅柿、辣椒、茄子、煙草、生姜、桑樹和香蕉等。

國(guó)內(nèi)最為常用的青枯菌檢測(cè)方法是平板劃線分離技術(shù)，該方法簡(jiǎn)單廉價(jià)。但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且操作人員需具備準(zhǔn)確識(shí)別青枯菌菌落形態(tài)的能力。血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)是基于抗原與抗體的專一性識(shí)別與結(jié)合，它利用抗體與抗原產(chǎn)生的凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)等對(duì)靶標(biāo)病原菌作出快速有效的診斷與鑒定。已報(bào)道用于青枯菌檢測(cè)的血清學(xué)方法，包括酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、免疫螢光(IF)、熒光原位雜交(FISH)以及免疫試紙條(Immuno-strip)等。美國(guó)阿格迪(Agdia)公司商品化生產(chǎn)的ELISA試劑盒和免疫試紙條在歐美一些國(guó)家已被用于室內(nèi)及田間青枯病疑似樣品的初步篩查。但此類方法的缺點(diǎn)在于價(jià)格昂貴，檢測(cè)靈敏度不高。如Agdia的檢測(cè)試紙條每個(gè)樣品的檢測(cè)成本約￥50，檢測(cè)靈敏度閾值一般在10⁶-10⁷cfu/ml H2O。

基于植物病原細(xì)菌核酸序列(Nucleic acid-based)的分子檢測(cè)和鑒定方法主要包括：PCR(Polymerase Chain Reaction，PCR)、DNA指紋、DNA芯片以及DNA條形碼技術(shù)等。上世紀(jì)90年代以來(lái)，隨著PCR技術(shù)日臻成熟，基于該技術(shù)的快速分子診斷方法，被廣泛應(yīng)用于包括青枯菌在內(nèi)的植物病原細(xì)菌研究領(lǐng)域。較常規(guī)平板劃線分離和血清學(xué)檢測(cè)方法，PCR檢測(cè)更為精準(zhǔn)、高效和靈敏。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究通過(guò)抑制性差減雜交(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)、比較基因組學(xué)(Comparative Genomics)和DNA指紋圖譜等研究手段，分別以青枯菌的16S和23S rRNA基因及其間隔區(qū)(Internal Transgenic Spacer，ITS)、flicC和lpxC等功能基因、未知功能片斷(Anonymous sequence)以及菌株特有基因(strain-specific gene)等作為PCR擴(kuò)增靶標(biāo)，設(shè)計(jì)出了近30套用于青枯菌種及種以下分類單元(演化型、生理小種和生化 變種)的特異性檢測(cè)引物或探針。

在種水平上，Opina等基于隨機(jī)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Random amplified polymorphism，RAPD)的分析結(jié)果，錨定了青枯菌lpxC基因及其上游部分序列，設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物Au759/760，因其在青枯菌種水平鑒定上具有高度的特異性和廣泛的通用性，因此被國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究者廣為采用；Seal和Pastrik分別基于16S rRNA基因建立的單一PCR和PCR/RFLP檢測(cè)方法也比較具有代表性，被歐洲和地中海植物保護(hù)組織推薦作為青枯菌的分子鑒定方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，因其操作簡(jiǎn)單快速、特異性、靈敏度高、成本低等特點(diǎn)，逐漸成為可以替代傳統(tǒng)PCR的新的核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)。它是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，利用Bst DNA聚合酶的鏈置換活性在同一反應(yīng)體系中恒溫高效擴(kuò)增，大量合成目的DNA的同時(shí)，產(chǎn)生副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀。由于擴(kuò)增反應(yīng)依賴于靶DNA的6個(gè)獨(dú)立的區(qū)域，因此特異性非常高，反應(yīng)在等溫條件下進(jìn)行，則不需要PCR儀等昂貴設(shè)備，僅用水浴鍋等能夠維持穩(wěn)定恒溫的設(shè)備即可完成，檢測(cè)成本大大降低，應(yīng)用范圍顯著擴(kuò)大，可以在田間進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對(duì)以上存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一組LAMP引物組合，能夠檢測(cè)植物病原青枯菌。本發(fā)明的另一目的是提供上述青枯菌的LAMP檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供上述青枯菌的LAMP檢測(cè)方法。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種用于青枯菌的LAMP引物組合，由正向外引物F3，反向外引物B3，正向內(nèi)引物FIP，反向內(nèi)引物BIP和反向環(huán)引物L(fēng)B組成，各引物序列如下：

FIP：5’-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT-3’；

BIP：5’-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3’；

F3：5’-CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3’；

B3：5’-ACCGCAACACGGGATCA-3’；

所述引物組合在檢測(cè)青枯菌中的應(yīng)用。

一種檢測(cè)青枯菌的LAMP試劑盒，包含以下成分：

(1)包含上述引物組合的引物混合液，濃度分別為：正向外引物F3 1μM、反向外引物B3 1μM、正向內(nèi)引物FIP 8μM、反向內(nèi)引物FIP 8μM；

(2)反應(yīng)液及染料，包含：7mM dNTPs、100mM Tris-HCl，50mM KCl，50mM(NH₄)₂SO₄，40mM MgSO₄、0.5％Triton X-100、5M Betain、40U Bst DNA聚合酶，SYBR Green I；

(3)陽(yáng)性對(duì)照為青枯菌GMI1000菌株的基因組DNA，陰性對(duì)照為不含目的基因的反應(yīng)混合 液。

所述的檢測(cè)青枯菌的LAMP試劑盒在檢測(cè)青枯菌中的應(yīng)用

一種檢測(cè)青枯菌的方法，包括以DNA為模板，利用LAMP引物組或LAMP試劑盒進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，觀察反應(yīng)溶液的顏色變化，顯示橙色表示檢測(cè)為陰性，不存在青枯菌，而顯示綠色的為陽(yáng)性，樣品中存在青枯菌。

所述的檢測(cè)青枯菌的方法，提取待測(cè)樣品的總DNA，取1μL DNA溶液，加入5μL反應(yīng)液、5μL引物液、14μL滅菌超純水進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?0～65℃，時(shí)間為30～50min，反應(yīng)結(jié)束后加入染料觀察顏色變化。

本發(fā)明檢測(cè)青枯菌的方法，包括待測(cè)樣品DNA的提取，以DNA為模板，利用所述引物組合進(jìn)行LAMP反應(yīng)。SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。因此，SYBR Green I的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)反應(yīng)體系的顏色變化判斷青枯菌的有無(wú)。顯示橙色表示檢測(cè)為陰性，不存在青枯菌，而顯示綠色的為陽(yáng)性，樣品中存在青枯菌。

本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)之一是青枯菌的高效特異擴(kuò)增引物序列及其擴(kuò)增方法。為了驗(yàn)證引物序列的特異性，本發(fā)明以24株青枯菌和4株非青枯菌菌株為供試材料(表1和表2)，當(dāng)發(fā)生LAMP反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂沉淀導(dǎo)致濁度上升。通過(guò)SYBR Green I顯色反應(yīng)結(jié)果所示，青枯菌樣品反應(yīng)管里均為綠色，其為陽(yáng)性結(jié)果；而非青枯菌樣品管均呈橙色，為陰性結(jié)果。證明設(shè)計(jì)的LAMP引物組合具有特異性。說(shuō)明該引物組合可被用于田間青枯菌快速可靠的檢測(cè)鑒定。

有益效果：現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在：

1)特異性強(qiáng)。本發(fā)明針對(duì)青枯菌的lpxC基因序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)了4條特異引物，對(duì)青枯菌進(jìn)行特異性識(shí)別，其特異性強(qiáng)、靈敏度高，使本發(fā)明能夠快速準(zhǔn)確完成青枯菌的檢測(cè)。

2)操作簡(jiǎn)便快捷。本發(fā)明提供的檢測(cè)青枯菌的LAMP方法，克服了現(xiàn)有生物與化學(xué)檢測(cè)方法樣品處理繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)費(fèi)力及需要PCR熱循環(huán)儀等問(wèn)題。該方法無(wú)需PCR反應(yīng)中的退火、復(fù)性等溫度的變化，30～50min內(nèi)即可完成檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)的效率。

3)成本低。本方法無(wú)需昂貴、精密的試驗(yàn)儀器設(shè)備，僅需要恒溫水浴鍋或保溫杯即可完成檢測(cè)，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用均為常規(guī)試劑，價(jià)格低廉。

因此本方法實(shí)用性強(qiáng)，可滿足田間青枯菌的快速檢測(cè)。

表1 用于檢測(cè)引物特異性的青枯菌菌株

表2 用于檢測(cè)引物特異性的非青枯菌菌株

(四)附圖說(shuō)明

圖1：LAMP引物組合的特異性驗(yàn)證結(jié)果

圖中菌株編號(hào)與表1和表2相同，圖中顯示1～24反應(yīng)管為青枯菌，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，25～28為非青枯菌，29為未加入任何DNA的反應(yīng)管，檢測(cè)結(jié)果均均顯示陰性。

圖2：LAMP引物組合的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

1～8反應(yīng)管中菌懸液濃度分別為3×10⁷CFU/mL、3×10⁶CFU/mL、3×10⁵CFU/mL、3×10⁴CFU/mL、3×10³CFU/mL、3×10²CFU/mL、3×10¹CFU/mL、3×10⁰CFU/mL。圖中顯示1～5反應(yīng)管均顯示陽(yáng)性，而6～8反應(yīng)管呈陰性，說(shuō)明LAMP反應(yīng)對(duì)青枯菌菌懸液的靈敏度為3×10³CFU/mL。

(五)具體實(shí)施方式

下面以具體實(shí)施例做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受以下實(shí)施例的限制。

實(shí)施實(shí)例1：青枯菌LAMP反應(yīng)的特異性實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證LAMP方法的特異性，以24個(gè)青枯菌株和4個(gè)對(duì)照菌株為參試對(duì)象(表1和表2)。

LAMP反應(yīng)：取1μL DNA溶液，加入5μL反應(yīng)液、5μL引物組混合液、14μL滅菌超純水進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?3℃，時(shí)間為45min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顏色變化的觀察。

LAMP檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，24株青枯菌菌株反應(yīng)管均顯示綠色的陽(yáng)性反應(yīng)，而其他4株菌株及不加入任何DNA模板的反應(yīng)管均呈橙色的陰性反應(yīng)。

實(shí)施實(shí)例2：青枯菌LAMP反應(yīng)的靈敏度實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證LAMP方法的靈敏度，比濁法制備3×10⁸CFU/mL濃度的青枯菌菌懸液，用超純水進(jìn)行10倍梯度稀釋。分別取稀釋后的各濃度菌懸液1μL做模板，加入5μL反應(yīng)液、5μL引物組混合液、14L滅菌超純水進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?3℃，時(shí)間為45min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顏色變化的觀察。結(jié)果表明(圖2)，加入1μL濃度為3×10⁷CFU/mL、3×10⁶ CFU/mL、3×10⁵CFU/mL、3×10⁴CFU/mL、3×10³CFU/mL菌懸液的反應(yīng)管呈明顯綠色，而加入1μL濃度為3×10²CFU/mL、3×10¹CFU/mL、3×10⁰CFU/mL菌懸液的反應(yīng)管呈橙色，表明LAMP反應(yīng)的靈敏度達(dá)到3×10³CFU/mL。

序列表：