本申請涉及菌種保藏領(lǐng)域，特別是涉及一種用于菌種保藏的保藏液，以及基于該保藏液的重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
重組大腸桿菌，是指以大腸桿菌為宿主，導(dǎo)入重組DNA后，能夠有效表達(dá)外源蛋白的一大類基因工程菌，由于所采用的宿主均為大腸桿菌，因此，統(tǒng)稱為重組大腸桿菌。
目前重組大腸桿菌主要應(yīng)用到生物制藥領(lǐng)域。在生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)重組大腸桿菌穩(wěn)定性不高，在生產(chǎn)過程中，易發(fā)生菌種衰退現(xiàn)象，主要原因是，①傳統(tǒng)菌種保藏方法，因?yàn)閮龃嬗?80℃冰箱中，無法長期保持菌體的活力，菌種的活力衰退易導(dǎo)致菌體自溶、菌體質(zhì)粒丟失等問題，從而導(dǎo)致目標(biāo)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量下降；②在發(fā)酵過程中，傳統(tǒng)發(fā)酵方法和補(bǔ)料方法無法達(dá)到高菌體密度，使得產(chǎn)品產(chǎn)量的提升受到制約。另外，傳統(tǒng)的菌種保藏都需要將菌種保藏在-80℃。
重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵是提高外源表達(dá)蛋白產(chǎn)量和質(zhì)量的一個非常有效的手段，也是目前發(fā)酵工程研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。現(xiàn)有研究顯示，影響重組大腸桿菌高密度發(fā)酵的因素主要包括，宿主菌本身的外源基因表達(dá)能力、環(huán)境耐受力等，以及培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、補(bǔ)料方法等。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本申請的目的是提供一種用于菌種保藏的保藏液及重組大腸桿菌高密度發(fā)酵方法，旨在有效的保持菌種活力，降低了發(fā)酵過程中由于菌種活力退化導(dǎo)致的生產(chǎn)異?，F(xiàn)象。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請采用了以下技術(shù)方案：
本申請的一方面公開了一種用于菌種保藏的保藏液，該保藏液由緩沖溶液和溶解于緩沖溶液中的溶質(zhì)組成，緩沖溶液為pH值6.2-7.0的磷酸鹽緩沖液或檸檬酸緩沖液，溶質(zhì)包括低聚糖、甘油、甘露醇、脫脂奶粉和瓊脂糖。
需要說明的是，采用本申請的保藏液對菌種進(jìn)行保藏時，可以不用-80℃保藏，直接在0-26℃保存，特別是，對于工作菌種庫，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，采用本申請的保藏液保存菌種也可以保存于-80℃。在本申請的一種優(yōu)選方案中，將工作菌種庫于4-10℃保藏，一方面降低了保藏成本，另一方面，在4-10℃下，能夠更長時間的保持菌體活力，從而為高密度發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)，本申請的 一種實(shí)現(xiàn)方式中，菌體538天的存活率在74.8％以上。
優(yōu)選的，低聚糖選自海藻糖、蔗糖和麥芽糖中的至少一種。
優(yōu)選的，溶質(zhì)中包括100重量份的低聚糖，30-40重量份的甘油，50-60重量份的甘露醇，180-200重量份的脫脂奶粉，0.5-0.8重量份的瓊脂糖。
優(yōu)選的，保藏液中，緩沖溶液和溶質(zhì)的重量比為1:8-15。
本申請的另一面公開了本申請的保藏液在重組大腸桿菌的菌種保藏中的應(yīng)用。
本申請的另一面還公開了本申請的保藏液在基因工程菌的高密度發(fā)酵中的應(yīng)用。
需要說明的是，本申請的保藏液是特別針對重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵而改良的，可以理解，本申請的保藏液并不僅限用于重組大腸桿菌；其它的基因工程菌，都可以采用本申請的保藏液。
本申請的再一面公開了一種重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵方法，包括采用三級菌種保藏方法建立原始菌種庫、主代菌種庫和工作菌種庫，工作菌種庫采用本申請的保藏液，保存于-80℃-26℃，優(yōu)選的保存于0-26℃；并且，采用工作菌種庫的菌種進(jìn)行高密度發(fā)酵，高密度發(fā)酵依序包括劃線培養(yǎng)、搖床活化培養(yǎng)、種子液培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)。
需要說明的是，本申請中，三級菌種保藏方法具體包括：①原始菌種庫的建立：將構(gòu)建好的重組大腸桿菌接種于50mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-8h，然后與滅過菌的等量的保藏液充分混勻，無菌條件下分裝至100μL安瓿管中，0℃以下低溫保存，或者真空冷凍干燥后封口，常溫下保存；②主代菌種庫的建立：原始菌種庫檢驗(yàn)合格后，取原始菌種于10mL培養(yǎng)液搖管活化6-8h，然后接種于50mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-8h，再與滅過菌的等量保藏液充分混勻，無菌條件下分裝至100μL安瓿管中，0℃以下低溫保存，或者真空冷凍干燥后封口，常溫下保存；③工作菌種庫的建立：主代菌種庫檢驗(yàn)合格后，取主代菌種于10mL培養(yǎng)液搖管活化6-8h，然后接種于50mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-8h，再與滅過菌的等量的保藏液充分混合，保存于-80℃-26℃。其中，原始菌種庫檢驗(yàn)和主代菌種庫檢驗(yàn)都可以參考現(xiàn)有的檢驗(yàn)和判斷方法，在此不累述；另外，從原始菌種庫中取菌液進(jìn)行活化，以及從主代菌種庫取菌液進(jìn)行活化，都參考現(xiàn)有技術(shù)，在此不累述。本申請中常溫是指0-26℃。工作菌種庫保存于-80℃至26℃，優(yōu)選的保存于0-26℃，更優(yōu)選的，保存于4℃-10℃?？梢岳斫猓捎帽旧暾埖谋２匾嚎梢詫⒐ぷ骶N庫保存于常溫，這樣可以方便取用，并且，在常溫下也能夠更有效的保持菌種活力，但是，采用本申請的保藏液同樣可以將菌種保藏于-80℃。
還需要說明的是，本申請中，原始菌種庫和主代菌種庫除了采用保藏液保存于常溫以外，也可以將液體培養(yǎng)產(chǎn)物與等量的質(zhì)量濃度為20％的脫脂奶混勻后，分裝、凍干，保存于-80℃；也可以與等量的本申請的保藏液混合，然后保存于-80℃。但是，本申請的優(yōu)選方案中，原始菌種庫、主代菌種庫和工作菌種庫都是采用本申請的保藏液保存于常溫的。
可以理解，由于采用本申請的保藏液，能夠避免工作菌種庫在-80℃的保藏溫度下，造成其活力衰退，從而有利于重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵，至于具體的劃線培養(yǎng)、搖床活化培養(yǎng)、種子液培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)，可以參考常規(guī)的方式進(jìn)行，在此不累述。只是，本申請的一種優(yōu)選實(shí)現(xiàn)方式中，對發(fā)酵罐培養(yǎng)進(jìn)行了特別優(yōu)化，以進(jìn)一步提高發(fā)酵密度，這將在以下的方案中詳細(xì)描述。
優(yōu)選的，工作菌種庫采用本申請的保藏液，保存于4℃-10℃。
需要說明的是，采用本申請的保藏液，可以使菌種保藏于0℃-26℃，但是，在為了達(dá)到更好的保藏效果，優(yōu)選的，保存于4℃-10℃?？梢岳斫?，菌種保藏的作用是，盡量降低或停止菌種的代謝活動，減慢或停止其生長繁殖；因此，溫度越低，越利于降低或停止代謝活動和生長繁殖，但是，溫度太低，如傳統(tǒng)的-80℃保藏，則會影響菌種的活力，特別是長期保存，會使菌種活力衰退；因此，本申請優(yōu)選的將工作菌種庫的菌種保存于4℃-10℃。
優(yōu)選的，發(fā)酵罐培養(yǎng)包括，將種子罐培養(yǎng)的菌液接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)，通氣攪拌培養(yǎng)的初始培養(yǎng)條件為，轉(zhuǎn)速100-150rpm，通氣量0.9-1.2vvm，溫度35-37℃，罐壓0.03-0.05MPa；當(dāng)溶氧低于20％時，提高轉(zhuǎn)速至200-800rpm，提高通氣量至1.5-2.5vvm；當(dāng)發(fā)酵OD600至30以上時，加入誘導(dǎo)劑，同時，將發(fā)酵罐溫度由35-37℃降為25-27℃，繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束；整個發(fā)酵過程中，調(diào)節(jié)補(bǔ)料速度，pH值保持7.0-7.1；誘導(dǎo)劑為異丙基硫代半乳糖苷。
由于采用以上技術(shù)方案，本申請的有益效果在于：
本申請的保藏液，能使菌種在0℃-26℃下長期保藏，并保持良好的活力，避免傳統(tǒng)的-80℃保藏對菌種活力造成影響，為高密度發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。本申請的重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵方法，采取三級菌種保藏方法，并使用本申請的保藏液，大大提高了菌種長期保藏過程中的菌體的穩(wěn)定性；由于菌種保藏于0℃-26℃的溫度條件下，更有效的保持了菌種活力，大大降低了發(fā)酵過程中由于菌種活力退化導(dǎo)致的生產(chǎn)異?，F(xiàn)象，同時，也大大降低了菌種活化等待的時間， 隨拿隨用。
具體實(shí)施方式
現(xiàn)有研究顯示，宿主菌、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、補(bǔ)料方法等都是影響重組大腸桿菌高密度發(fā)酵的重要因素，為此，也有很多研究報道，對宿主菌進(jìn)行篩選，對培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、補(bǔ)料方法等進(jìn)行優(yōu)化，以進(jìn)一步提高重組大腸桿菌的發(fā)酵密度。本申請的發(fā)明人，經(jīng)過大量的研究和實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，除以上因素以外，重組大腸桿菌的保藏方法也會直接或間接的影響高密度發(fā)酵；本申請的研究顯示，傳統(tǒng)的菌種保藏方法都是在-80℃保藏的，使得菌種無法長期保持活力，菌種活力衰退，容易導(dǎo)致菌體自溶、菌體質(zhì)粒丟失等問題，從而導(dǎo)致目標(biāo)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量下降，無法實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的效果。但是，-80℃保藏是公認(rèn)的菌種保藏溫度，這幾乎成了高密度發(fā)酵不可逾越的瓶頸。
正是基于以上研究和認(rèn)識，本申請創(chuàng)造性的提出了一種新的用于菌種保藏的保藏液，該保藏液由低聚糖、甘油、甘露醇、脫脂奶粉和瓊脂糖溶于pH值6.6的磷酸鹽緩沖液或檸檬酸緩沖液中而成。最重要的是，本申請的保藏液能夠使得菌種在0-26℃下長期保存，并且保持良好的活力，避免了活力衰退對發(fā)酵生產(chǎn)的影響。
基于本申請的保藏液，本申請進(jìn)一步提出了重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵方法。本申請的保藏液，其初衷雖然是針對重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵而提出，可以理解，為了保持活力，任何需要在0-26℃下長期保存的菌種都可以采用本申請的保藏液，本申請的保藏液并不僅限于重組大腸桿菌使用，甚至也不僅限于高密度發(fā)酵使用。
下面通過具體實(shí)施例對本申請作進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實(shí)施例僅對本申請進(jìn)行進(jìn)一步說明，不應(yīng)理解為對本申請的限制。
實(shí)施例
本例的用于菌種保藏的保藏液采用pH6.6的磷酸鹽緩沖液作為緩沖溶液，溶質(zhì)包括低聚糖、甘油、甘露醇、脫脂奶粉和瓊脂糖，其中，低聚糖具體為海藻糖，保藏液的制備方法如下：
稱取100g低聚糖、30g甘油、50g甘露醇、180g脫脂奶粉和0.5g瓊脂糖，將其全部溶于1000mL50mM的磷酸鹽緩沖液中。高溫高壓滅菌消毒后保存?zhèn)溆谩?/p>
采用本例制備的保藏液對重組大腸桿菌進(jìn)行保藏，然后進(jìn)行高密度發(fā)酵； 本例采用的重組大腸桿菌為BL21。本例的高密度發(fā)酵方法包括，采用三級菌種保藏方法建立原始菌種庫、主代菌種庫和工作菌種庫，并且，原始菌種庫、主代菌種庫和工作菌種庫的保藏都采用本例制備的保藏液，原始菌種庫、主代菌種庫保存于常溫，工作菌種庫保存于4℃；然后，采用工作菌種庫的菌種進(jìn)行高密度發(fā)酵，高密度發(fā)酵依序包括劃線培養(yǎng)、搖床活化培養(yǎng)、種子液培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)。具體如下：
三級菌種保藏方法：
①原始菌種庫的建立：將構(gòu)建好的重組大腸桿菌以2％的接種量接種于50mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h，然后與滅過菌的等量的保藏液充分混勻，無菌條件下分裝至100μL安瓿管中，真空冷凍干燥后封口，常溫下保存；
②主代菌種庫的建立：原始菌種庫檢驗(yàn)合格后，10mL搖管活化6h，然后以2％的接種量接種于50mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h，再與滅過菌的等量保藏液充分混勻，無菌條件下分裝至100μL安瓿管中，真空冷凍干燥后封口，常溫下保存；
③工作菌種庫的建立：主代菌種庫檢驗(yàn)合格后，10mL搖管活化6h，然后以2％接種量接種于50mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h，然后與滅過菌的等量的保藏液體充分混合，保存于4℃。
需要說明的是，本例中，液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)或搖管活化的培養(yǎng)時間為6-8h均可。至于工作菌種庫的保存溫度，在0-26℃均可，優(yōu)選的保存于4℃-10℃能夠更長時間的保持菌種活力。本例的常溫下保存，其溫度為0-26℃，優(yōu)選的保存于4℃-10℃。
本例的三級菌種保藏方法中，液體培養(yǎng)基的為LB培養(yǎng)基，搖管活化所采用的培養(yǎng)基也是LB培養(yǎng)基。
本例的三級菌種保藏方法中，原始菌種庫和主代菌種庫除了采用本例的保藏液保存于常溫以外，還可以將液體培養(yǎng)產(chǎn)物與等量的質(zhì)量濃度為20％的脫脂奶混勻后，分裝、凍干保存于-80℃；或者同樣采用本例的保藏液，將液體培養(yǎng)產(chǎn)物與等量的保藏液混勻后，保存于0℃以下的低溫條件下。
建立好三級菌種庫后，原始菌種庫和主代菌種庫繼續(xù)保存?zhèn)溆?，取工作菌種庫的菌種進(jìn)行高密度發(fā)酵，依序包括劃線培養(yǎng)、搖床活化培養(yǎng)、種子液培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)。具體如下：
劃線培養(yǎng)：將工作菌種庫中的菌種在斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線培養(yǎng)24h，斜面培養(yǎng)基的組分包括重量份數(shù)：蛋白胨1.5％、酵母抽提粉1％、NaCl 1％、瓊脂粉2.0％，余量為去離子水，培養(yǎng)基pH值為6.8-7.0均可，本例具體為pH 7.0；
搖床活化培養(yǎng)：挑取劃線培養(yǎng)的菌體，接種于50mL液體培養(yǎng)基中搖床活化 培養(yǎng)8h，本例采用的液體培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基；
種子液培養(yǎng)：將搖床活化培養(yǎng)后的菌種轉(zhuǎn)接于500mL，接種量1％，液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)8h，獲得種子液，種子液培養(yǎng)所采用的培養(yǎng)液包括重量份數(shù)：蛋白胨1.5％、酵母抽提粉1％、NaCl 1％，余量為去離子水，培養(yǎng)液pH值為6.8-7.0均可，本例具體為pH 7.0；
種子罐培養(yǎng)：將種子液培養(yǎng)的種子液以2％的比例接種于滅過菌的種子罐中，通氣攪拌培養(yǎng)6h，培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速300rpm，通氣量1vvm，溫度35-37℃均可，本例具體為37℃，罐壓0.05MPa；種子罐培養(yǎng)所采用的培養(yǎng)液包括重量份數(shù)：蛋白胨1.5％、酵母抽提粉2.0％、NaCl 1％、葡萄糖2％、KH2PO40.1％、K2HPO40.2％，余量為去離子水，培養(yǎng)液pH值為6.8-7.0均可，本例具體為pH 7.0；
發(fā)酵罐培養(yǎng)：將種子罐培養(yǎng)的菌液以2％的比例接種于滅過菌的發(fā)酵罐中進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)，通氣攪拌培養(yǎng)的初始培養(yǎng)條件為，轉(zhuǎn)速120rpm，通氣量1.0vvm，35-37℃培養(yǎng)均可，本例具體為37℃，罐壓0.05MPa；當(dāng)溶氧低于20％時，提高轉(zhuǎn)速至400rpm，提高通氣量至2.0vvm；當(dāng)發(fā)酵OD600至30以上時，加入誘導(dǎo)劑，同時，將發(fā)酵罐溫度由37℃降為25-27℃均可，本例具體的將為27℃，繼續(xù)培養(yǎng)10-16h，本例具體為16h，發(fā)酵結(jié)束。整個發(fā)酵過程中，調(diào)節(jié)補(bǔ)料速度，控制pH7.0-7.1，具體的控制pH為7.0，本例采用的誘導(dǎo)劑為異丙基硫代半乳糖苷。本例中，發(fā)酵罐培養(yǎng)采用的培養(yǎng)液包括重量份數(shù)：蛋白胨2％、酵母抽提粉2.0％、NaCl 1％、葡萄糖1％、KH2PO40.20％、K2HPO40.35％、MgSO40.05％，余量為去離子水，培養(yǎng)液pH值為6.8-7.0均可，本例具體為pH 7.0。補(bǔ)料所采用的培養(yǎng)液包括重量份數(shù)：蛋白胨3％、酵母抽提粉8％、甘油10％、ZnSO40.6％、CaCl20.5％、CoCl20.3％、MgSO43％，余量為去離子水，培養(yǎng)液pH值為6.8-7.5均可，本例具體為pH 7.0。
發(fā)酵結(jié)束后，測量本例發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵密度，結(jié)果顯示，本例重組大腸桿菌的發(fā)酵密度為OD140；經(jīng)測量細(xì)胞干重的發(fā)酵密度為50g/L。需要說明的是，細(xì)胞干重的發(fā)酵密度通常在30g/L以上就算高密度發(fā)酵菌，而本申請可以達(dá)到50g/L，遠(yuǎn)超過普通標(biāo)準(zhǔn)。
另外，對本例三級菌種保藏方法所建立的工作菌種庫的菌種的存活率進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，工作菌種庫在4至10℃條件下保藏332天，菌種存活率為81.2％以上，保藏538天的存活率在74.8％以上。在25℃下保藏10天的菌種存活率在70.9％以上，保藏20周的存活率在51.8％以上。
可見，本例的工作菌種庫在4至10℃條件下，可以長期保存，并且能夠較好的保持菌種活力，相比傳統(tǒng)的-80℃保藏，還需要進(jìn)行菌種的解凍、復(fù)蘇等一 些列工作，更加方便實(shí)用。
在以上試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本例進(jìn)一步對不同的緩沖溶液，不同的低聚糖，以及保藏液各組分的用量進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果顯示，緩沖溶液除了磷酸鹽緩沖液以外，還可以采用pH值6.6的檸檬酸緩沖液；低聚糖還可以采用蔗糖或麥芽糖，替換海藻糖；保藏液各組分的用量，按照低聚糖重量份100份算，甘油的重量份30-40，甘露醇的重量份50-60，脫脂奶粉的重量份180-200，瓊脂糖的重量份0.5-0.8，均可以制備出與本例效果相當(dāng)?shù)谋２匾骸?/p>
以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對本申請所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本申請的具體實(shí)施只局限于這些說明。對于本申請所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本申請構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本申請的保護(hù)范圍。