本發(fā)明涉及一株誘變湛江等鞭金藻及其在低溫培養(yǎng)的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

微藻為自養(yǎng)型微生物，因其細(xì)胞內(nèi)存在光合作用系統(tǒng)也稱為微藻植物。微藻具有高效吸收太陽能、固定二氧化碳產(chǎn)生生物質(zhì)的能力(即光合作用能力)；同時(shí)微藻作為微生物的一種，其增殖速度較快。作為單細(xì)胞生物，微藻的主要組成為蛋白、脂肪、碳水化合物和核酸等。目前，微藻已經(jīng)是重要的養(yǎng)殖餌料被養(yǎng)殖企業(yè)廣泛應(yīng)用，同時(shí)微藻也已經(jīng)成為類胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、多糖等保健食品的來源。隨著化石能源枯竭的預(yù)期加劇，微藻在能源制品和精細(xì)化學(xué)品的潛在應(yīng)用也得到了極大關(guān)注。如本專利申請(qǐng)所涉及的湛江等鞭金藻，屬于定鞭藻門，等鞭藻目，等鞭藻科，等鞭金藻屬，富含不飽和脂肪酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，是我國(guó)非常重要的經(jīng)濟(jì)藻類。

目前，實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的藻種多從自然界直接分離獲得，后代的性狀單一，容易出現(xiàn)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力差以及藻種退化等問題，如野生湛江等鞭金藻在水溫低于15℃或高于35℃時(shí)停止生長(zhǎng)甚至死亡，極大限制了其應(yīng)用，需要從藻種入手予以改良。

常壓室溫等離子體(ARTP)是近幾年來發(fā)展起來的一種新的等離子體源，能夠在常壓(1am)下產(chǎn)生溫度在25～40℃之間的、具有高活性粒子(如處于激發(fā)態(tài)的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)濃度的等離子體射流。科學(xué)研究表明，等離子體中適當(dāng)劑量的活性粒子作用于微生物(包括微藻)，能夠使微生物細(xì)胞壁/膜的結(jié)構(gòu)及通透性改變，并引起基因損傷，進(jìn)而使微生物基因序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)顯著變化，最終導(dǎo)致微生物產(chǎn)生致畸突變。該方法已被證明能夠有效的應(yīng)用于湛江等鞭金藻的誘變育種中【基于常壓室溫等離子體技術(shù)的金藻誘變篩選方法，中國(guó)生物工程雜志，2014,34(12)：84-90】。

湛江等鞭金藻IM130017正是利用上述技術(shù)所獲得的一株誘變?cè)逯辏哂械蜏啬褪芰?，且DHA含量更高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株湛江等鞭金藻誘變?cè)逯闕M130017，其具有可在8-14℃水溫條件下進(jìn)行培養(yǎng)的能力，并具有高于野生株的DHA生產(chǎn)能力。

本發(fā)明所提供的湛江等鞭金藻IM130017(Isochrysis zhangjiangensis IM130017)，是利用常壓室溫等離子體誘變技術(shù)獲得的一株具有較野生株更寬溫度耐受范圍的誘變?cè)逯?，已?015年11月09日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)大 屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCC No.11419。所述湛江等鞭金藻在標(biāo)準(zhǔn)F/2培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的形態(tài)特征：卵圓形或圓形，細(xì)胞長(zhǎng)6～7μm，寬5～6μm，厚4～5μm，具有兩條等長(zhǎng)從細(xì)胞頂端伸出的、長(zhǎng)度5～7μm的鞭毛；無細(xì)胞壁，由雙層膜構(gòu)成的質(zhì)膜包被，質(zhì)膜外是2～4層的鱗片層；具有單個(gè)細(xì)胞核。

野生金藻的最適培養(yǎng)溫度在15-35℃之間。野生湛江等鞭金藻經(jīng)過室溫常壓等離子誘變技術(shù)誘變后，以生長(zhǎng)速率、脂肪酸成分等指標(biāo)，以經(jīng)典的F/2培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)，在不同溫度下進(jìn)行培養(yǎng)測(cè)定，最終找到一株誘變株IM130017【基于常壓室溫等離子體技術(shù)的金藻誘變篩選方法，中國(guó)生物工程雜志，2014,34(12)：84-90】。其在正常培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)速度和總脂含量高于野生株，同時(shí)能夠在低至8-14℃的水溫條件下生長(zhǎng)，并且其二十二碳六烯酸(DHA)含量提升至細(xì)胞干重的4％，較野生株有近50％的提升。因此，以該株誘變金藻為出發(fā)，大大延長(zhǎng)了戶外規(guī)模培養(yǎng)金藻的可培養(yǎng)區(qū)間，提升了其高附加值代謝產(chǎn)物DHA的產(chǎn)量，具有高的實(shí)際應(yīng)用前景。

湛江等鞭金藻誘變株IM130017(Isochrysis zhangjiangensis IM130017)已于2015年11月09日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCC N0.11419。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1：湛江等鞭金藻誘變株IM130017(Isochrysis zhangjiangensis IM130017)的種子液培養(yǎng)。

挑取生長(zhǎng)于含有F/2營(yíng)養(yǎng)鹽的瓊脂平板上IM130017單克隆于20mL含有F/2營(yíng)養(yǎng)鹽的滅菌海水(培養(yǎng)基)中，在100mL三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度(25±1)℃，光暗時(shí)間比14h∶10h，日光燈作光源，光強(qiáng)為(50±5)μmol/m²/s，培養(yǎng)至指數(shù)期接種使用。所使用的F/2營(yíng)養(yǎng)鹽主要成分的終濃度為NaNO₃ 75mg/L，NaH₂PO₄·2H₂O 5mg/L，VitaminB₁₂ 0.5μg/L，Biotin 0.5μg/L，vitamin B₁ 0.1mg/L，F(xiàn)eCl₃·6H₂O 3.16mg/L,Na₂EDTA·2H₂O 4.36mg/L，CuSO₄·5H₂O 9.8μg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 6.3μg/L，ZnSO₄·7H₂O 22μg/L，CoCl₂·6H₂O 12μg/L，MnCl₂·4H₂O 0.18mg/L。

實(shí)施例2：湛江等鞭金藻誘變?cè)逯闕M130017與野生株在25℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)比其生長(zhǎng)和總脂含量。接種細(xì)胞濃度約300萬細(xì)胞/毫升，培養(yǎng)基同實(shí)施例1，培養(yǎng)七天，測(cè)定細(xì)胞數(shù)和總脂含量。其中總脂含量為氯仿甲醇提取后重量法測(cè)定。結(jié)果表明，二者在25℃條件下脂含量和脂肪酸構(gòu)成相近，但是無論是單位時(shí)間增量倍數(shù)還是最大比生長(zhǎng)速率，IM130017較野生株具有明顯優(yōu)勢(shì)。詳見表1和表2。

實(shí)施例3：湛江等鞭金藻誘變?cè)逯闕M130017與野生株在10℃條件下 進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)比其生長(zhǎng)和脂肪酸構(gòu)成。接種細(xì)胞濃度約300萬細(xì)胞/毫升，培養(yǎng)基同實(shí)施例1，培養(yǎng)七天，其中脂肪酸構(gòu)成使用氣相色譜外標(biāo)法測(cè)定。結(jié)果表明，二者在10℃條件下，IM130017生長(zhǎng)速度降低，七天周期內(nèi)平均生物量增加一倍，野生株基本處于生長(zhǎng)停滯狀態(tài)或死亡。GC結(jié)果表明此時(shí)IM130017脂肪酸中多不飽和脂肪酸比例上升，其中對(duì)于DHA，IM130017在10℃培養(yǎng)條件下，可達(dá)細(xì)胞干重的4％。詳見表2。

實(shí)施例4：湛江等鞭金藻誘變株IM130017的18s rDNA序列擴(kuò)增使用標(biāo)準(zhǔn)真核細(xì)胞通用18s rDNA擴(kuò)增引物，其中：

18s-F 5′-CCGAATTCGTCGACAACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′，

18s-R5′-CCCGGGATCCAAGCTTGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序獲得湛江等鞭金藻誘變株IM130017(Isochrysis zhangjiangensis IM130017)18s rDNA序列如下。

湛江等鞭金藻誘變株IM130017(Isochrysis zhangjiangensis IM130017)

18s rDNA序列表

AACTTGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAAATGATAAGGTTCGGACAGCTTCCCGCGACGCCAGCGCTGGAGAACCAGCGGCGGCGCCGCAGTCCGGGGGCCTCACCGGATCATTCAATCGGTAGGAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAACGTGCGCTGATGACACACGCTTACTAGGAATTCCTCGTTGAAGATTAATAGTTGCAATAATCTATCCCCATCACGATGCAAGTTCACAAGATTACCCGGACCTCTCGGTCAAGGGAGACGACTCGCTGAATGCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCGCGAACTTCCACTTGTTGAAGACAAGTTGTCCCTCTAAGAAGCGAGCCCCAACAGRGGGTTGGGGACACTATTTAGCAGGCTGCGGTCTCGTTCGTTAACGGAATTAACCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCATCGAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTCACAATGTCTGGACCTGGTAAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCGGAACCCAAAGACTTTAGTTTCCCGAAAGGTGCTGAAGGAGTCACAAACGGAACATCCTCCAATCCCTAGTCGGCATGGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCTTGATCAGTGAAAACATCCCTGGCAAATGCTTTCGCAGTCGTTCGTCTTCCGCTGGTCTGAGAATTTCACCTCTCTCGGCGGAATACGAGTGCCCCTGACTGTCCCTGTTAACCATTACTCCGGTGCTCGAAACCAACAAAATAGCACCAGAGTCCTATTTCATTATCCCATGCTAATCCATGCAAGAGCGACTGCCTGCTTGAAACACTCTGATTTTTTCAAAGTAAACATCCCGTCTCCGACCACCGCTCAGTTAAGAGTAGCGGCCGTCTCCGGGAGGAAGGACGCGCCCGCCAGTGCGTACCCATCGGCAGACCGGCGGGCCCGCCCCGAAATCCGACTACGAGCGTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGATCCTCGT GAAGAGATGTAAATTGTACTCATTCCAATTACAAGACTCGAAGAGCCCTGTATTGTTATTTCTTGTCACTACCTCCCTGTGTCAGGATTCGGGCAATTTACGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCATTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCTCCGTTACCCGTTAACGCCATGGTAGGCCTCTATCCTACCATCGAAAGCTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCAGCGTAAAGCCGTGCGATTCGAGCAGTTAGTATGACTCAGCACGCAACCGGAGACCGGTTTGGTTTCTTATCTAATAAATACATCCCTTCCGAAGTCGGGAACTCCTGCATGTATTAGCTCTAGAATTACTACGGTTATCCAAGTAGCAAGGTACCATCAAATAAACCATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACAGTATACTCGCTTATACTTAGACATGCATGGCTTAATCTTGAGACAAGC

表1、25℃條件下IM130017與野生株生長(zhǎng)和總脂含量對(duì)比

表2、10℃和25℃條件下IM130017與野生株脂肪酸含量對(duì)比

本發(fā)明的湛江等鞭金藻是通過室溫常壓等離子誘變技術(shù)誘變獲得的誘變?cè)逯?，相?duì)與野生株具有更寬的溫度耐受性，其在8-10℃的生長(zhǎng)速率和二十二碳六烯酸含量較野生株均有一倍的提升，適宜作為戶外培養(yǎng)的工程藻株。