本發(fā)明涉及一種微生物低溫保存保護(hù)劑，及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：冷凍干燥是一種常用的實現(xiàn)微生物長保質(zhì)期的方法(CarcobaR，2000)，被廣泛視為是最適合的細(xì)菌脫水過程之一，其目的在于獲得穩(wěn)定的最終試劑(CarvalhoAS，2004)，也是用于貯存微生物細(xì)胞培養(yǎng)物的最常見方法之一。冷凍干燥后的細(xì)胞存活率反映了細(xì)胞抵抗快速冷凍和干燥的影響(Miyamoto‐ShinoharaY，2008)。一般認(rèn)為，大多數(shù)無保護(hù)的細(xì)菌在冷凍干燥后都會被殺死，而存活的那些在進(jìn)行貯存時迅速死亡。要想獲得理想的冷凍及凍干效果，除工藝外，篩選和使用適宜的冷凍保護(hù)劑也是十分重要的。適宜的凍干保護(hù)劑能夠使微生物在凍干以及解凍的過程中降低死亡率，減輕冷凍干燥以及解凍時所引起的菌體損傷。因而，凍干保護(hù)劑的種類、濃度和配置方法對微生物的保存效果有明顯的影響。Harrison(1963)推薦凍干保護(hù)劑應(yīng)具有以下條件：1)保護(hù)劑應(yīng)含有能形成骨架的物質(zhì)；2)它應(yīng)含有限制剩余水分的緩沖物質(zhì)；3)電解質(zhì)的含量應(yīng)少等。已進(jìn)行了多種嘗試來增加凍干和貯存后存活的細(xì)菌的數(shù)量，但僅取得有限的成功。選擇適當(dāng)?shù)母稍锝橘|(zhì)/冷凍保護(hù)劑混合物是增加微生物尤其是細(xì)菌微生物在凍干和后續(xù)貯存過程中存活率的關(guān)鍵因素(CarvalhoAS，2004)?，F(xiàn)有技術(shù)中，CN101108164A報告了卡介菌多糖核酸在凍干中的幾項研究。Castro等人評估了5％的海藻糖對保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)在冷凍干燥后存活率的有益效果，相比起在單獨的水中的約1％的留存率，它們顯示25％的留存率。2003年，Carvalho等人證明了谷氨酸鈉對凍干和3‐6個月的后續(xù)貯存期間的存活的穩(wěn)定作用，但所報導(dǎo)的微生物存活率仍然很低?？ń榫?BacillusCalmette‐Guérin,BCG)源自具有致病性的牛型結(jié)核桿菌經(jīng)230代次連續(xù)傳代后形成的減毒菌株。我國目前涉及卡介菌的上市或臨床研究中生物制品主要有皮內(nèi)注射用卡介苗、卡介菌多糖核酸注射液(BCG‐PSN)、卡介菌純蛋白衍生物(BCG‐PPD)、治療用卡介苗、卡介菌CpG‐DNA等。這些產(chǎn)品均涉及卡介菌活菌的收獲與應(yīng)用，因此現(xiàn)行版藥典均對其種子批傳代代次有要求，目的是降低細(xì)菌變異的風(fēng)險。尤其對于活菌制品的菌種傳代代次要求基本為：自工作種子批啟開至菌體收集，傳代應(yīng)不超過12代。然而國內(nèi)卡介苗產(chǎn)品的代次多數(shù)為12代，國外卡介苗制品的代次則多為3‐5代，這種差別的主要原因是菌種首次復(fù)蘇后活菌量少，只能通過增加培養(yǎng)代次來滿足生產(chǎn)需要。解決該問題的首要關(guān)鍵之一是如何提高卡介菌菌種首次復(fù)蘇的活菌含量。正常情況下，接種的活菌含量越多，菌種復(fù)蘇所需的時間越短，形成的菌苔或菌膜的質(zhì)量越高，反之，活菌含量越低，所需要的復(fù)蘇時間就越長，進(jìn)一步影響后續(xù)的傳代與收獲?？ń槊缇N所含的活菌數(shù)量與菌種的保存形式有關(guān)。菌種的保存形式有兩種，一種為凍干保存，一種為液體冷凍保存。凍干菌種為卡介菌培養(yǎng)物加凍干保護(hù)劑后經(jīng)過低溫冷凍真空干燥制備而成，凍干后活菌較穩(wěn)定，可在2‐8℃保藏與運輸，在室溫下也能保持相對穩(wěn)定；但凍干后菌種活菌含量下降，平均僅為凍干前液體菌種的16％‐20％左右，且菌株經(jīng)干燥后復(fù)蘇時間也較長。菌種的另一種保存方式為液體冷凍保存菌種，即卡介菌新鮮培養(yǎng)物加低溫保存保護(hù)劑后，在‐20℃及以下溫度冷藏，該方式具有保持活菌含量高容易復(fù)蘇的特點。目前，現(xiàn)有技術(shù)中對卡介菌的研究中，多針對卡介菌多糖核酸的保存進(jìn)行研究，而對卡介菌活菌的菌種保存研究較少，同時，在菌種的保存中，基本都是采用凍干保存，存在凍干菌種復(fù)蘇慢、保存效率不高等問題。為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點，本發(fā)明人通過長期的研究，發(fā)明了一種微生物低溫保存保護(hù)劑，該保護(hù)劑可以有效的提高微生物的液體冷凍保存效率，尤其是能提高卡介菌活菌樣品低溫冷藏或冷凍后的活菌含量，進(jìn)而提高卡介菌生產(chǎn)用活菌菌種首次復(fù)蘇質(zhì)量，解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，彌補了滿足生產(chǎn)需要收獲物傳代代次多的缺陷。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種微生物低溫保存保護(hù)劑，可以用于但不限于卡介菌菌種、卡介菌活菌樣品等卡介菌活菌或其他細(xì)菌、微生物的低溫冷藏，用以提高微生物，例如卡介菌生產(chǎn)用菌種，首次復(fù)蘇質(zhì)量，解決凍干菌種復(fù)蘇慢等技術(shù)難題。為了最大限度地提高微生物，例如卡介菌生產(chǎn)用菌種，冷凍存活率，在低溫保存前將低溫保存保護(hù)劑添加到微生物培養(yǎng)物中。本發(fā)明涉及一種微生物低溫保存保護(hù)劑，由非還原性糖、甘油、非離子型表面活性劑、鉀鹽、谷氨酸鹽和水組成；其中，所述微生物低溫保存保護(hù)劑各組分含量為1單位濃度含量；并且，1單位濃度含量中非還原性糖的量為4％到16％(w/v)，優(yōu)選5％到15％(w/v)；甘油的量為0.9％到11％(v/v)，優(yōu)選1％到10％(v/v)；非離子型表面活性劑的量為0.4％到2.5％(v/v)，優(yōu)選0.5％到2％(v/v)；鉀鹽的量為0.5％到2％(w/v)；所述谷氨酸鹽的量為0.15％到1％(w/v)，優(yōu)選0.2％到0.8％(w/v)。在本發(fā)明的一個實施例中，1單位濃度含量中非還原性糖的量為5％到15％(w/v)；甘油的量為1％到10％(v/v)；非離子型表面活性劑的量為0.5％到2％(v/v)；鉀鹽的量為0.5％到1％(w/v)；所述谷氨酸鹽的量為0.2％到0.4％(w/v)。在本發(fā)明的另一個實施例中，1單位濃度含量中非還原性糖的量為5％到15％(w/v)；甘油的量為1％到10％(v/v)；非離子型表面活性劑的量為0.5％到2％(v/v)；鉀鹽的量為1％到2％(w/v)；所述谷氨酸鹽的量為0.4％到0.8％(w/v)。在本發(fā)明的一個實施例中，還涉及一種微生物低溫保存保護(hù)劑原液，其各組分含量為上述微生物低溫保存保護(hù)劑的1單位濃度含量的倍數(shù)。優(yōu)選的，微生物低溫保存保護(hù)劑原液的各組分含量為1單位濃度含量的1.5倍～10倍，進(jìn)一步優(yōu)選為2倍～5倍，例如1.5倍、2倍、2.5倍或3倍等。在微生物低溫保存保護(hù)劑原液的制備方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實際工作需要進(jìn)行調(diào)整，如保存劑原液可以為1單位濃度的(包括但不限于)1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍、5倍、5.1倍、5.2倍、5.3倍、5.4倍、5.5倍、5.6倍、5.7倍、5.8倍、5.9倍、6倍、6.1倍、6.2倍、6.3倍、6.4倍、6.5倍、6.6倍、6.7倍、6.8倍、6.9倍、7倍、7.1倍、7.2倍、7.3倍、7.4倍、7.5倍、7.6倍、7.7倍、7.8倍、7.9倍、8倍、8.1倍、8.2倍、8.3倍、8.4倍、8.5倍、8.6倍、8.7倍、8.8倍、8.9倍、9倍、9.1倍、9.2倍、9.3倍、9.4倍、9.5倍、9.6倍、9.7倍、9.8倍、9.9倍、10倍等。在使用時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實際工作的需要，將保存液原液進(jìn)行稀釋，例如稀釋10倍、9倍、8倍、7倍、5倍、4倍、3倍、2倍、1倍等，使最終保存液使用時的濃度為上述微生物低溫保存保護(hù)劑的1單位濃度含量。更優(yōu)選的，所述微生物低溫保存保護(hù)劑原液中，非還原性糖的量為10％到30％(w/v)；甘油的量為2％到20％(v/v)；非離子型表面活性劑的量為1％到4％(v/v)；鉀鹽的量為1％到4％(w/v)；并且谷氨酸鹽的量為0.4％到1.6％(w/v)。在本發(fā)明的一個實施例中，所述微生物低溫保存保護(hù)劑原液中，非還原性糖的量為10％到30％(w/v)；甘油的量為2％到20％(v/v)；非離子型表面活性劑的量為1％到4％(v/v)；鉀鹽的量為1％到2％(w/v)；并且谷氨酸鹽的量為0.4％到0.8％(w/v)。在本發(fā)明的另一個實施例中，所述微生物低溫保存保護(hù)劑原液中，非還原性糖的量為10％到30％(w/v)；甘油的量為2％到20％(v/v)；非離子型表面活性劑的量為1％到4％(v/v)；鉀鹽的量為2％到4％(w/v)；并且谷氨酸鹽的量為0.8％到1.6％(w/v)。本文中所使用的“非還原性糖”可以是海藻糖，棉籽糖，蔗糖等。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，非還原性糖是海藻糖。本文中所使用的“非離子型表面活性劑”可以是聚山梨酯20，聚山梨酯40，聚山梨酯60和聚山梨酯80中的一種或幾種的組合。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，非離子型表面活性劑是聚山梨酯80。本文中所使用的“鉀鹽”可以是硝酸鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鉀和氯化鉀中的一種或幾種的組合。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，鉀鹽是氯化鉀或磷酸氫二鉀。本文中所使用的“谷氨酸鹽”通常是指可食用的谷氨酸的水溶性鹽。這類“可食用的”鹽是被批準(zhǔn)用于人類食品中且是食品級的那些，如谷氨酸的鈉鹽、谷氨酸的鉀鹽。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，谷氨酸鹽是谷氨酸鈉。在本發(fā)明的另一個實施例中涉及一種微生物低溫保存保護(hù)劑或其原液，其中非還原性糖為海藻糖；所述非離子型表面活性劑為聚山梨酯80；所述鉀鹽為磷酸氫二鉀和氯化鉀中的至少一種；和/或谷氨酸鹽為谷氨酸鈉。優(yōu)選的微生物低溫保存保護(hù)劑，每一百毫升1單位濃度中含有：海藻糖：4‐16g，優(yōu)選5‐15g；甘油：0.9‐11mL，優(yōu)選1‐10mL；聚山梨酯80：0.4‐2.5mL，優(yōu)選0.5‐2.0mL；氯化鉀或磷酸氫二鉀：0.5‐2g；谷氨酸鈉：0.15‐1g，優(yōu)選0.2‐0.8g。更優(yōu)選的，每一百毫升1單位濃度中含有海藻糖5‐15g，甘油9‐11mL，優(yōu)選10mL、聚山梨酯800.4‐0.6mL，優(yōu)選0.5mL、氯化鉀或磷酸氫二鉀1‐2g、谷氨酸鈉0.4‐0.8g；或者，每一百毫升1單位濃度中含有海藻糖5‐10g，甘油0.9‐2mL，優(yōu)選1mL、聚山梨酯801.5‐2.5mL，優(yōu)選2mL、氯化鉀或磷酸氫二鉀1‐2g、谷氨酸鈉0.4‐0.8g；在本發(fā)明的另一個實施例中，每一百毫升1單位濃度中含有海藻糖5g，甘油10mL、聚山梨酯800.5mL、氯化鉀1g、谷氨酸鈉0.4g；在本發(fā)明的另一個實施例中，每一百毫升1單位濃度中含有海藻糖10g，甘油1mL、聚山梨酯802mL、氯化鉀1g、谷氨酸鈉0.4g；在本發(fā)明的另一個實施例中，每一百毫升1單位濃度中含有海藻糖5g，甘油1mL、聚山梨酯802mL、氯化鉀1g、谷氨酸鈉0.4g。在本發(fā)明的另一個實施例中，每一百毫升1單位濃度中含有海藻糖10g，甘油5mL、聚山梨酯801mL、氯化鉀1g、谷氨酸鈉0.4g。在本發(fā)明的另一個實施例中，每一百毫升1單位濃度中含有海藻糖10g，甘油1mL、聚山梨酯802mL、磷酸氫二鉀1g、谷氨酸鈉0.4g。在本發(fā)明的另一個實施例中，每一百毫升1單位濃度中含有海藻糖10g，甘油1mL、聚山梨酯802mL、氯化鉀2g、谷氨酸鈉0.4g。在本發(fā)明的另一個實施例中，每一百毫升1單位濃度中含有海藻糖10g，甘油1mL、聚山梨酯802mL、氯化鉀1g、谷氨酸鈉0.8g。在本發(fā)明的一個實施例中，還公開了一種低溫保存保護(hù)劑原液，每一百毫升所述保護(hù)劑原液中含有：海藻糖：8‐32g，優(yōu)選10‐30g；甘油：1.8‐22mL，優(yōu)選2‐20mL；聚山梨酯80：0.8‐5mL，優(yōu)選1‐4mL；氯化鉀或磷酸氫二鉀：1‐4g；和谷氨酸鈉：0.3‐2g，優(yōu)選0.4‐1.6g。進(jìn)一步優(yōu)選，每一百毫升保護(hù)劑原液中含有海藻糖10‐30g，甘油18‐22mL，優(yōu)選20mL、聚山梨酯800.8‐1.2mL，優(yōu)選1mL、氯化鉀或磷酸氫二鉀2‐4g、谷氨酸鈉0.8‐1.6g；或者，每一百毫升保護(hù)劑原液中含有海藻糖10‐20g，甘油1.8‐4mL，優(yōu)選2mL、聚山梨酯803‐5mL，優(yōu)選4mL、氯化鉀或磷酸氫二鉀2‐4g、谷氨酸鈉0.8‐1.6g。更優(yōu)選的，每一百毫升保護(hù)劑原液中含有海藻糖10g，甘油20mL、聚山梨酯801mL、氯化鉀2g、谷氨酸鈉0.8g；或者，每一百毫升保護(hù)劑原液中含有海藻糖20g，甘油2mL、聚山梨酯804mL、氯化鉀2g、谷氨酸鈉0.8g；或者，每一百毫升保護(hù)劑原液中含有海藻糖10g，甘油2mL、聚山梨酯804mL、氯化鉀2g、谷氨酸鈉0.8g；或者，每一百毫升保護(hù)劑原液中含有海藻糖20g，甘油10mL、聚山梨酯802mL、氯化鉀2g、谷氨酸鈉0.8g；或者，每一百毫升保護(hù)劑原液中含有海藻糖20g，甘油2mL、聚山梨酯804mL、磷酸氫二鉀2g、谷氨酸鈉0.8g；或者，每一百毫升保護(hù)劑原液中含有海藻糖20g，甘油2mL、聚山梨酯804mL、氯化鉀4g、谷氨酸鈉0.8g；或者，每一百毫升保護(hù)劑原液中含有海藻糖20g，甘油2mL、聚山梨酯804mL、氯化鉀2g、谷氨酸鈉1.6g。優(yōu)選的，本發(fā)明的保護(hù)劑或其原液的pH值為7‐8，例如7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.7，7.8，7.9，8.0。可采用本領(lǐng)域常規(guī)的pH調(diào)節(jié)手段調(diào)節(jié)保護(hù)劑的pH值到所需范圍，例如可以用鹽酸和/或氫氧化鈉、氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的一個實施例中，低溫保存保護(hù)劑或其原液的保存條件為2‐8℃。同時，本發(fā)明涉及一種低溫保存微生物的方法，包括使用上述微生物低溫保存保護(hù)劑或微生物低溫保存保護(hù)劑原液。優(yōu)選的，將待低溫保存的微生物懸浮液與低溫保存保護(hù)劑原液混合，或者將待低溫保存的微生物與低溫保存保護(hù)劑混合，得到待低溫保存的微生物混合液，所述混合液中微生物低溫保存保護(hù)劑的各組分含量為1單位濃度含量。所述低溫保存是指液體低溫冷藏或液體冷凍保存中的一種。如下文實施例詳細(xì)解釋的，在所述的低溫保存保護(hù)劑的存在下，低溫保存后獲得高存活細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)。令人驚訝的是，低溫保存后菌或細(xì)胞的存活率最高可以達(dá)到95％左右。特別是，與現(xiàn)有的冷凍保存劑相比，本發(fā)明的低溫保存保護(hù)劑尤其適用于長期冷凍保存以及需要反復(fù)凍融操作下的微生物的冷凍保存。在本發(fā)明中，所述微生物包括但不限于細(xì)菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、衣原體、螺旋體。在本發(fā)明的一個實施例中，所述微生物為細(xì)菌，優(yōu)選為分枝桿菌，包括但不限于：結(jié)核分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、瘰癘分枝桿菌、鳥‐胞內(nèi)分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌。更優(yōu)選為結(jié)核分枝桿菌。在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述微生物為卡介菌菌種或卡介菌活菌。本文中所使用的“卡介苗”或“卡介菌”通常是指一種減毒的活性牛型結(jié)核桿菌。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，卡介菌活菌包括但不限于牛型結(jié)核桿菌‐BCG‐Russia(Mycobaxteriumbovis‐BCG‐Russia)、牛型結(jié)核桿菌‐BCG‐Moreau(Mycobaxteriumbovis‐BCG‐Moreau)、牛型結(jié)核桿菌‐BCG‐Japan(Mycobaxteriumbovis‐BCG‐Japan)、牛型結(jié)核桿菌‐BCG‐Sweden(Mycobaxteriumbovis‐BCG‐Sweden)、牛型結(jié)核桿菌‐BCG‐Birkhaug(Mycobaxteriumbovis‐BCG‐Birkhaug)、牛型結(jié)核桿菌‐BCG‐Prague(Mycobaxteriumbovis‐BCG‐Prague)、牛型結(jié)核桿菌‐BCG‐Glaxo(Mycobaxteriumbovis‐BCG‐Glaxo)、牛型結(jié)核桿菌‐BCG‐Denmark(Mycobaxteriumbovis‐BCG‐Denmark)、牛型結(jié)核桿菌‐BCG‐Tice(Mycobaxteriumbovis‐BCG‐Tice)、牛型結(jié)核桿菌‐BCG‐Frappier(Mycobaxteriumbovis‐BCG‐Frappier)、牛型結(jié)核桿菌‐BCG‐Connaught(Mycobaxteriumbovis‐BCG‐Connaught)、牛型結(jié)核桿菌‐BCG‐Phipps(Mycobaxteriumbovis‐BCG‐Phipps)和/或牛型結(jié)核桿菌‐BCG‐Pasteur(Mycobaxteriumbovis‐BCG‐Pasteur)、卡介菌D2PB302(CMCC95050)卡介菌BCGNIFDC945SⅢ(CMCC94103)、卡介菌BCGNIFDC945SⅡ(CMCC94102)。在本發(fā)明的一個實施例中，所述低溫保存微生物方法的步驟包括將微生物低溫保存保護(hù)劑與待保存的微生物混合，然后將混合后的物料置于保存溫度下。在本發(fā)明的一個實施例中，低溫保存卡介菌活菌的方法為，將微生物低溫保存保護(hù)劑與卡介菌活菌混合，將混合后的物料在0℃至5℃之間的任意溫度下放置2‐24h，再將混合后的物料轉(zhuǎn)移置于零下25℃至零下15℃之間的任意溫度下放置2‐24h，最后將混合后的物料放置于零下50℃或以下溫度中保存。在本發(fā)明的一個具體實施例中，低溫保存卡介菌活菌的步驟為：收獲卡介菌菌體，研磨后測定濃度得細(xì)菌原液；用低溫保存保護(hù)劑將細(xì)菌原液稀釋至所需濃度，例如，每1ml含菌量0.1mg得半成品；分裝，例如，每支凍存管0.5ml，4℃預(yù)凍12小時以上，‐20℃預(yù)凍12小時以上，‐70℃冷藏保存。本發(fā)明提供的微生物低溫保存保護(hù)劑實現(xiàn)了冷凍保存的微生物，尤其是卡介菌活菌，在不同溫度下的長期保存的穩(wěn)定性。由此卡介菌活菌在儲存2個月、儲存4個月、儲存6個月、儲存9個月、儲存12個月、儲存1年半、儲存2年，儲存3年，儲存4年，儲存5年，儲存6年，儲存7年，儲存8年，儲存9年，儲存10年，儲存11年，儲存12年，儲存13年，儲存14年，儲存15年，儲存20年后保留的存活率超過10％、優(yōu)選超過20％、更優(yōu)選超過30％，更優(yōu)選超過40％，更優(yōu)選超過50％，更優(yōu)選超過60％，更優(yōu)選超過70％，更優(yōu)選超過80％，更優(yōu)選超過90％。在使用保存劑的比例方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實際工作需要進(jìn)行調(diào)整，如保存劑原液可以占低溫保存體系總體積的(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，90％等。在相關(guān)方面，本發(fā)明還提供了一種低溫保存保護(hù)劑的制備方法，包括稱取各組分并溶解于適量水中，定容并調(diào)節(jié)pH為7‐8，滅菌。在一個實施方案中，當(dāng)按照本發(fā)明制造的低溫保存保護(hù)劑和微生物的混合物表達(dá)抗原時，本發(fā)明也可提供疫苗?！耙呙纭边@一術(shù)語是指藥學(xué)上可接受的組合物，其當(dāng)以有效量施用給動物或人類受試者時，能在受試者中誘導(dǎo)針對疫苗內(nèi)包含的免疫原的抗體和/或激發(fā)保護(hù)性免疫。另一方面，本發(fā)明還涉及所述低溫保存保護(hù)劑在低溫保存微生物中的應(yīng)用。所述微生物包括但不限于細(xì)菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、衣原體、螺旋體。在本發(fā)明的一個實施例中，所述微生物為細(xì)菌，優(yōu)選為分枝桿菌，包括但不限于：結(jié)核分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、瘰癘分枝桿菌、鳥‐胞內(nèi)分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌。更優(yōu)選為結(jié)核分枝桿菌。在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述微生物為卡介菌菌種或卡介菌活菌。本發(fā)明的低溫保存保護(hù)劑提高了微生物低溫保存效率，尤其是卡介菌活菌低溫保存的存活率，采用微生物凍干保護(hù)中常用的蔗糖、明膠等制成液態(tài)冷凍保護(hù)劑，得到的樣品存活率僅為20％左右，而使用本發(fā)明的低溫保存保護(hù)劑樣品活菌存活率范圍在33％‐99％之間；并且，與其他冷凍保護(hù)劑相比，本發(fā)明的低溫保存保護(hù)劑非常適用于反復(fù)凍融情況下的細(xì)菌保存。因此，本發(fā)明的低溫保存保護(hù)劑賦予了卡介菌活菌在低溫冷藏條件下更好的存活率，提高了卡介苗活菌冷藏樣品首次復(fù)蘇后的活菌含量，有利于改善卡介苗活菌樣品的首次復(fù)蘇質(zhì)量，有利于后續(xù)的培養(yǎng)與收獲。本文中所使用的術(shù)語“含有”、“包含”和“包括”是同義詞，其是包容性或開放式的，不排除額外的、未被引述的成份、元素或方法步驟。用端點值表示的數(shù)值范圍包括該范圍內(nèi)所包含的所有數(shù)值及分?jǐn)?shù)，以及所引述的端點值。當(dāng)描述一個可測量的值，例如參數(shù)、量、時間期限等時，本文中所使用的術(shù)語“約”意欲涵蓋與指定值相差±20％或更少、優(yōu)選±10％或更少、更優(yōu)選±5％或更少、更優(yōu)選±1％或更少，更優(yōu)選±0.1％或更少的變化，此類變化適宜在所披露的發(fā)明中使用。本說明書中列舉的所有文件以其全文通過引用并入本文。具體來說，本文中特別提到的所有文件的教導(dǎo)通過引用并入本文。除非另有說明，用于披露本發(fā)明的所有術(shù)語(包括技術(shù)和科學(xué)術(shù)語)的意義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的相同。通過進(jìn)一步的指導(dǎo)，其后的定義用于更好地理解本發(fā)明的教導(dǎo)。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。在下述每一實施例中，所用卡介菌為D2PB302(CMCC95050)，其他試劑都從商購?fù)緩将@得。實施例1配置海藻糖、甘油、聚山梨酯‐80、氯化鉀和谷氨酸鈉含量不同的低溫保存保護(hù)劑原液按表1中的組分含量，取相應(yīng)物質(zhì)，溶解于適量超純水中，定容至100mL并用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4；115℃30min滅菌，制得不同配比的本發(fā)明的低溫保存保護(hù)劑原液。表1低溫保存保護(hù)劑原液配比表(每100ml)海藻糖(g)甘油(ml)聚山梨酯80(ml)氯化鉀(g)谷氨酸鈉(g)配方11020120.8配方21010220.8配方3102420.8配方42020120.8配方52010220.8配方6202420.8配方73020120.8配方83010220.8配方9302420.8對照1稱取以下物質(zhì)：明膠2g、蔗糖2g、氯化鉀2g,谷氨酸鈉0.8g；將上述物質(zhì)溶解于適量超純水，定容至100mL并用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4；115℃30min滅菌，即得。實施例2低溫保存保護(hù)劑的效果研究收獲生長于液體蘇通培養(yǎng)基表面的卡介菌菌膜，以無菌生理鹽水洗滌，壓干后稱重，根據(jù)濕菌重量加入生理鹽水，在含鋼珠球形瓶中研磨至菌液為均一菌液，取樣品進(jìn)行濃度測定。以生理鹽水稀釋菌液濃度為0.2mg/ml,分別取相同體積的菌液與實施例1中配方1‐9和對照1的低溫保存保護(hù)劑原液1：1混合均勻，得半成品，卡介菌濃度為0.1mg/ml，分裝，每支凍存管0.5ml，4℃預(yù)凍12小時以上，‐20℃預(yù)凍12小時以上，‐70℃冷凍，得成品。另外，設(shè)置一組無保護(hù)劑組，采用生理鹽水將卡介菌濃度調(diào)整為0.1mg/ml，同樣的方式冷凍。取對照保護(hù)劑卡介菌樣品，以10倍稀釋法進(jìn)行活菌數(shù)檢測，結(jié)果作為凍前活菌數(shù)對照?；罹鷶?shù)檢測法為：將樣品稀釋至10‐5mg/ml、10‐6mg/ml，分別取2個稀釋度樣品各0.1ml接種至培養(yǎng)基表面，每個稀釋度5復(fù)管，37±1℃培養(yǎng)四周后計數(shù)菌落形成單位(CFU)個數(shù)，計算后換算為每mg細(xì)菌含的CFU數(shù)。各樣品在‐70℃冷凍兩周、四周后復(fù)蘇，其中凍存四周后的一部分樣品復(fù)蘇后再反復(fù)凍融3次，分別進(jìn)行活菌數(shù)測定，與凍前活菌數(shù)結(jié)果比較，計算存活率，結(jié)果如下：表2卡介菌冷凍保存前后活菌數(shù)對比表注：存活率＝(冷凍后活菌數(shù)/冷凍前活菌數(shù))×100％活菌數(shù)單位：×104CFU/mg上述結(jié)果表明，利用實施例1中配方1‐9的低溫保存保護(hù)劑原液冷凍制備的卡介菌活菌樣品，冷凍后活菌存活率比對照保護(hù)劑(對照1)要高，配方1‐9尤其適合長時間的低溫保存，并且能夠降低反復(fù)凍融后細(xì)菌的死亡率。實施例3低溫保存保護(hù)劑的長期低溫保存和反復(fù)凍融的保存效果按照實施例1的制備方法，以表3的組成含量配制對照凍存液原液和本發(fā)明的低溫保存保護(hù)劑原液：表3低溫保存保護(hù)劑原液配比表(每100ml)按照實施例2的制備方法，分別取相同體積的卡介菌菌液與配方10‐15和對照2‐4的低溫保存保護(hù)劑原液1：1混合均勻，得半成品，卡介菌濃度為0.1mg/ml，分裝，每支凍存管0.5ml，4℃預(yù)凍12小時以上，‐20℃預(yù)凍12小時以上，‐70℃冷凍，得成品。取對照2保護(hù)劑卡介菌樣品，以10倍稀釋法進(jìn)行活菌數(shù)檢測，結(jié)果作為凍前活菌數(shù)對照。各樣品在‐70℃冷凍四周后復(fù)蘇，其中凍存四周后的一部分樣品復(fù)蘇后再反復(fù)凍融3次，分別進(jìn)行活菌數(shù)測定，與凍前活菌數(shù)結(jié)果比較，計算存活率，結(jié)果如下：表4卡介菌冷凍保存前后活菌數(shù)對比表注：存活率＝(冷凍后活菌數(shù)/冷凍前活菌數(shù))×100％活菌數(shù)單位：×104CFU/mg上述結(jié)果表明，利用配方10‐15的低溫保存保護(hù)劑冷凍制備的卡介菌活菌樣品長時間冷凍后存活率高，反復(fù)凍融后細(xì)菌的存活率更是明顯高于對照2‐4。本發(fā)明的低溫保存保護(hù)劑能明顯提高卡介菌活菌的存活率，從而在復(fù)蘇菌種與卡介菌活菌樣品時能從樣品本身的方面促進(jìn)復(fù)蘇質(zhì)量。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。當(dāng)前第1頁1 2 3