本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物多糖的分離提取領(lǐng)域，具體涉及一種提取銀杏白果多糖的方法及其產(chǎn)品。

背景技術(shù)：
銀杏屬裸子植物銀杏科銀杏屬植物，為亞熱帶、溫帶樹種，在我國廣泛栽培，是我國主要的經(jīng)濟(jì)樹種之一。銀杏白果是銀杏的主要經(jīng)濟(jì)器官，其資源量大、售價(jià)高、銷路暢，表現(xiàn)出明顯的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)銀杏制劑有對(duì)防治心腦血管疾病、老年癡呆癥和對(duì)抗血小板活化因子的作用，目前已經(jīng)研制開發(fā)了銀杏植物藥制劑、功能性食品、保健品和化妝品。有研究表明白果中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，主要有：碳水化合物類(60％)、蛋白質(zhì)類(13％)、脂類物質(zhì)(4％)、糖類(6％)，同時(shí)白果中還含有維生素、無機(jī)鹽以及人體需要但自身不能合成的9種氨基酸?，F(xiàn)研究表明，白果蛋白及脂肪具有抗氧化、抗衰老等作用。而銀杏白果多糖也是白果中一種重要的活性成分，它具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、抗炎等多種活性作用。目前，銀杏白果多糖的提取大都采用熱水浸提或水煎煮，其提取方法簡單，不會(huì)引起多糖降解，但一般只能提取胞壁外多糖，所得多糖生物活性較低。近年有文獻(xiàn)報(bào)道，利用超聲波或微波提取，但提取率及純度較低，對(duì)原料的利用率低。且粗多糖中蛋白的去除一般采用Sevag法，此法只能除去少量蛋白質(zhì)，效率不高，需反復(fù)多次，多糖損失較大，且在某種度上會(huì)影響銀杏白果多糖的生物活性。在多糖分離純化方面，多采用凝膠過濾法分離純化多糖，成本高，工作量大，技術(shù)操作繁雜，不宜應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種可以用于工業(yè)化生產(chǎn)高效率和操作簡單的，且可用于食品工業(yè)的白果多糖的提取方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種提取銀杏白果多糖的方法，包括以下步驟：(1)超聲協(xié)同酶處理提取銀杏白果多糖：脫脂銀杏白果粉加水后制備成反應(yīng)液，所述反應(yīng)液中添加復(fù)合酶進(jìn)行水解，復(fù)合酶水解的同時(shí)對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行超聲處理，所述復(fù)合酶為果膠酶和纖維素酶，超聲處理后滅活復(fù)合酶，調(diào)節(jié)體系pH值，加入蛋白酶進(jìn)行水解，水解后滅活蛋白酶，離心處理，得上清液為銀杏白果多糖溶液；(2)醇沉、除蛋白純化得銀杏白果粗多糖：步驟(1)所得的銀杏白果多糖溶液添加乙醇進(jìn)行沉淀，復(fù)溶沉淀加入Sevag試劑除蛋白，再次加入乙醇后沉淀、洗滌干燥沉淀得銀杏白果粗多糖；(3)溶解步驟(2)所得的銀杏白果粗多糖添加季銨鹽再次沉淀進(jìn)行分離純化；(4)脫鹽處理；(5)冷凍干燥得銀杏白果精多糖。進(jìn)一步的，步驟(1)中所述反應(yīng)液中脫脂銀杏白果粉的質(zhì)量濃度為4.0％-10％，果膠酶添加量為35-55U/g脫脂銀杏白果粉，纖維素酶添加量為30-60U/g脫脂銀杏白果粉，添加復(fù)合酶前調(diào)解反應(yīng)液pH值為5.0-6.0，復(fù)合酶水解溫度為45-65℃，超聲功率為250-450W，每次復(fù)合酶水解并結(jié)合超聲提取的時(shí)間為10-50min，超聲兩次。進(jìn)一步的，步驟(1)中滅活復(fù)合酶后加入蛋白酶前調(diào)解反應(yīng)液pH值至7.0，蛋白酶的種類為中性蛋白酶，蛋白酶添加量為150-350U/g脫脂銀杏白果粉，調(diào)節(jié)中性蛋白酶的水解溫度為50-60℃。進(jìn)一步的，步驟(1)中滅活復(fù)合酶后加入蛋白酶前調(diào)解反應(yīng)液pH值至7.0，蛋白酶的種類為中性蛋白酶，蛋白酶添加量為150-350U/g脫脂銀杏白果粉，調(diào)節(jié)中性蛋白酶的水解溫度為50-60℃，蛋白酶水解反應(yīng)時(shí)間為1-3h。進(jìn)一步的，步驟(4)的具體操作為：將步驟(3)所得的復(fù)溶溶液裝入分子量2-14kDa透析袋內(nèi)進(jìn)行脫鹽。一種使用所述的方法得到的銀杏白果精多糖。進(jìn)一步的，所述銀杏白果精多糖純度為65-80％。進(jìn)一步的，所述銀杏白果精多糖重均分子量為2.020×104g/mol。進(jìn)一步的，所述銀杏白果精多糖的單糖組成為甘露糖、鼠李糖和葡萄糖，其物質(zhì)的量的比為8.25:1.00:1.53。所述銀杏白果精多糖應(yīng)用于降血糖、抗氧化的保健品及藥物的制備。本發(fā)明的有益效果是：1)本發(fā)明采用超聲波協(xié)同酶法提取多糖具有條件溫和、雜質(zhì)易除、得率高、操作簡便、無副作用、無二次污染、在某種程度上可提高多糖的生物活性等優(yōu)點(diǎn)。2)通過本發(fā)明提取方法可以直接獲得得率及純度較高的銀杏白果多糖，可以直接制得具有天然抗氧化和降血糖活性的銀杏白果多糖，可以將其作為天然降血糖功能因子加入到食品或作為抗氧劑加入化妝品等日常用品中，還可以直接作為天然保健品食用。3)本發(fā)明先利用蛋白酶將蛋白水解，再用Sevag法去除蛋白，只需兩次處理就可以很好的去除蛋白，效率高。在多糖分離純化方面，多采用凝膠過濾法分離純化多糖，成本高，工作量大，技術(shù)操作繁雜，不宜應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，而本發(fā)明中用季銨鹽法分離純化多糖，操作方便、成本低，適合應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。4)本發(fā)明利用超聲波協(xié)同酶法，建立了快速、高效率、低成本的白果多糖的提取技術(shù)，能夠滿足工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的要求。附圖說明圖1為不同提取方式對(duì)銀杏白果多糖提取率的影響；圖2為不同提取方式提取的銀杏白果多糖DPPH自由基清除率的比較；圖3為不同提取方式提取的銀杏白果多糖羥自由基清除率的比較；圖4為不同提取方式提取的銀杏白果多糖還原力的比較；圖5為不同提取方式提取的銀杏白果多糖對(duì)葡萄糖苷酶抑制率影響的比較；圖6為不同提取方式提取的銀杏白果多糖的全波長掃描圖譜；圖7為掃描電鏡下的熱水提取的銀杏白果多糖形貌；圖8為掃描電鏡下的超聲提取的銀杏白果多糖形貌；圖9為掃描電鏡下的酶法提取的銀杏白果多糖形貌；圖10為掃描電鏡下的超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的銀杏白果多糖形貌；圖11為熱水提取的銀杏白果多糖的多角度激光散色光譜；圖12為超聲提取的銀杏白果多糖的多角度激光散色光譜；圖13為酶法提取的銀杏白果多糖的多角度激光散色光譜；圖14為超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的銀杏白果多糖的多角度激光散色光譜；圖15為單糖標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜分離圖譜；圖16為熱水提取的銀杏白果多糖水解物高效液相色譜分離圖；圖17為超聲提取的銀杏白果多糖水解物高效液相色譜分離圖；圖18為酶法提取的銀杏白果多糖水解物高效液相色譜分離圖；圖19為超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的銀杏白果多糖水解物高效液相色譜分離圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種提取銀杏白果多糖的方法，包括以下步驟：(1)超聲協(xié)同酶處理提取銀杏白果多糖：脫脂銀杏白果粉加水后添加復(fù)合酶制備成反應(yīng)液，同時(shí)對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行超聲處理，所述復(fù)合酶為果膠酶和纖維素酶，超聲處理后滅活復(fù)合酶，保持液料比和酶解溫度恒定，調(diào)節(jié)體系pH，加入蛋白酶水解蛋白，水解后滅酶，離心處理，得上清液為銀杏白果多糖溶液；(2)醇沉、除蛋白純化得銀杏白果粗多糖：步驟(1)所得的銀杏白果多糖溶液添加乙醇進(jìn)行沉淀，復(fù)溶沉淀加入Sevag試劑除蛋白，再次加入乙醇后沉淀、洗滌干燥沉淀得銀杏白果粗多糖；(3)溶解步驟(2)所得的銀杏白果粗多糖添加季銨鹽再次沉淀進(jìn)行分離純化；(4)脫鹽處理；(5)冷凍干燥得銀杏白果精多糖。步驟(1)中所述反應(yīng)液中脫脂銀杏白果粉的質(zhì)量濃度為4.0％-10％，果膠酶添加量為35-55U/g脫脂銀杏白果粉，纖維素酶添加量為30-60U/g脫脂銀杏白果粉，復(fù)合酶水解溫度為45-65℃，添加復(fù)合酶前調(diào)解反應(yīng)液pH值為5.0-6.0，超聲功率為250-450W，超聲時(shí)間為10-50min，超聲兩次。步驟(1)中滅活復(fù)合酶后加入蛋白酶前調(diào)解反應(yīng)液pH值至7.0，蛋白酶的種類為AS1.398中性蛋白酶，蛋白酶添加量為150-350U/g脫脂銀杏白果粉，調(diào)節(jié)中性蛋白酶的水解溫度為50-60℃，蛋白酶水解反應(yīng)時(shí)間為1-3h。步驟(3)的具體操作為：取銀杏白果粗多糖溶于蒸餾水中，加入等體積的3％十六烷基三甲基溴化銨，34～36℃下保溫靜置3～6h，產(chǎn)生沉淀，4℃離心收集沉淀，將沉淀用9.5％～10.5％NaCl溶液溶解后，加入無水乙醇，產(chǎn)生白色沉淀，離心，收集沉淀，并用去離子水溶解得復(fù)溶溶液。步驟(4)的具體操作為：將步驟(3)所得的復(fù)溶溶液裝入分子量2-14kDa透析袋內(nèi)進(jìn)行脫鹽。通過上述方法制備得到銀杏白果精多糖。銀杏白果精多糖純度為65-80％。銀杏白果精多糖重均分子量為2.020×104g/mol。銀杏白果精多糖的單糖組成為甘露糖、鼠李糖和葡萄糖，其物質(zhì)的量的比為8.25:1.00:1.53。該銀杏白果精多糖可應(yīng)用于降血糖、抗氧化的保健品及藥物的制備。實(shí)施例2在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化。一種超聲協(xié)同酶技術(shù)提取銀杏白果多糖的方法，其特征包含以下步驟：(1)超聲協(xié)同酶處理提取銀杏白果多糖：a：在室溫條件下，將白果剝殼、去紅皮，用高速粉碎機(jī)將其粉碎并真空干燥、脫脂，即得脫脂白果粉備用。b：稱取一定量的脫脂白果粉，用蒸餾水配置成質(zhì)量濃度為4.0％-10％的體系，然后使用HCl調(diào)節(jié)pH至5.0-6.0，調(diào)節(jié)酶解溫度為50-60℃，添加復(fù)合酶，即果膠酶添加量為35-55U/g(每克白果粉添加果膠酶35-55U)和纖維素酶添加量為40-60U/g(每克白果粉添加纖維素酶40-60U)后，同時(shí)對(duì)其反應(yīng)液進(jìn)行超聲處理，超聲功率為250-400W，每次超聲時(shí)間為10-50min，超聲兩次。在超聲結(jié)束后，在溫度為90℃條件下，加熱滅酶30秒。c：利用NaOH調(diào)節(jié)步驟b中滅酶后反應(yīng)液的pH至7.0，調(diào)節(jié)酶解溫度為50-60℃，添加AS1.398中性蛋白酶，其添加量為150-350U/g，水解反應(yīng)時(shí)間為1-3h，酶解反應(yīng)后，在溫度為90℃條件下，加熱滅酶30秒；在4000r/min條件下，離心10min后，獲得上清液，即為白果多糖溶液；(2)醇沉、除蛋白純化得銀杏白果粗多糖：將步驟(1)中所得多糖溶液50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/5，然后加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀，靜置過夜，離心得沉淀；將沉淀加水復(fù)溶后，在多糖溶液中，以體積比1:4加入Sevag試劑(氯仿：正丁醇＝5:1v/v)，混合物劇烈振搖30min，離心(4000r/min，10min)，除去水層和試劑層交界處的變性蛋白，重復(fù)操作幾次，直至不出現(xiàn)白色膠狀物；再在多糖溶液中加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀，離心得沉淀；將沉淀分別用無水乙醇、丙酮和乙醚相繼洗滌，再冷凍干燥得銀杏白果粗多糖；(3)溶解粗多糖添加季銨鹽再次沉淀分離純化：取一定量的粗多糖溶于蒸餾水中，加入等體積的3％十六烷基三甲基溴化銨，35℃下保溫靜置4h，產(chǎn)生沉淀，4℃，4000r/min離心20min，收集沉淀；將沉淀用10％NaCl溶液溶解后，加入3倍的無水乙醇，產(chǎn)生白色沉淀，離心，收集沉淀，并用去離子水溶解得復(fù)溶溶液；(4)脫鹽處理：將步驟(3)的復(fù)溶溶液裝入分子量2-14kDa透析袋內(nèi)進(jìn)行脫鹽；(5)冷凍干燥得銀杏白果精多糖：將脫鹽溶液冷凍干燥即制得銀杏白果多糖精制品。實(shí)施例3在實(shí)施例2的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化條件。一種超聲協(xié)同酶技術(shù)提取銀杏白果多糖的方法，其特征包含以下步驟：(1)超聲協(xié)同酶處理提取銀杏白果多糖：a：在室溫條件下，將白果剝殼、去紅皮，用高速粉碎機(jī)將其粉碎并真空干燥、脫脂，即得脫脂白果粉備用。b：稱取一定量的脫脂白果粉，用蒸餾水配置成質(zhì)量濃度為6.7％的體系，然后使用HCl調(diào)節(jié)pH至5.5，調(diào)節(jié)酶解溫度為55℃，添加復(fù)合酶，即果膠酶添加量為46U/g(每克白果粉添加果膠酶46U)和纖維素酶添加量為45U/g(每克白果粉添加纖維素酶45U)后，同時(shí)對(duì)其反應(yīng)液進(jìn)行超聲處理，超聲功率為350W，超聲兩次，每次為30min；在超聲結(jié)束后，在溫度為90℃條件下，加熱滅酶30秒。c：利用NaOH調(diào)節(jié)步驟b中滅酶后反應(yīng)液的pH至7.0，調(diào)節(jié)酶解溫度為55℃，添加AS1.398中性蛋白酶，其添加量為280U/g(每克白果粉添加蛋白酶280U)，水解反應(yīng)時(shí)間為2h，酶解反應(yīng)后，在溫度為90℃條件下，加熱滅酶30秒；在4000r/min條件下，離心10min后，獲得上清液，即為白果多糖溶液；(2)醇沉、除蛋白純化得銀杏白果粗多糖：將步驟(1)中所得多糖溶液50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/5，然后加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀，靜置過夜，離心得沉淀；將沉淀加水復(fù)溶后，在多糖溶液中，以體積比1:4加入Sevag試劑(氯仿：正丁醇＝5:1v/v)，混合物劇烈振搖30min，離心(4000r/min，10min)，除去水層和試劑層交界處的變性蛋白，重復(fù)操作幾次，直至不出現(xiàn)白色膠狀物；再在多糖溶液中加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀，離心得沉淀；將沉淀分別用無水乙醇、丙酮和乙醚相繼洗滌，再冷凍干燥得粗多糖；(3)溶解粗多糖添加季銨鹽再次沉淀分離純化：取一定量的粗多糖溶于蒸餾水中，加入等體積的3％十六烷基三甲基溴化銨，35℃下保溫靜置4h，產(chǎn)生沉淀，4℃，4000r/min離心20min，收集沉淀；將沉淀用10％NaCl溶液溶解后，加入3倍的無水乙醇，產(chǎn)生白色沉淀，離心，收集沉淀，并用去離子水溶解；(4)脫鹽：將步驟(3)的溶液裝入分子量2-14kDa透析袋內(nèi)進(jìn)行脫鹽；每隔3-4h更換一次去離子水，透析10-12h即可。(5)冷凍干燥得銀杏白果精多糖：將脫鹽溶液冷凍干燥即制得銀杏白果多糖精制品。提取產(chǎn)物分析：1、多糖提取率的計(jì)算多糖提取率(％)＝(c×V×D)÷m×100％式中c代表由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得銀杏白果多糖的質(zhì)量濃度，V為待測(cè)溶液體積，D為稀釋倍數(shù)，m為準(zhǔn)確稱取銀杏白果粉的質(zhì)量。2、采用本發(fā)明方法提取得到的銀杏白果多糖精產(chǎn)品為乳白色粉狀物，白果多糖的提取率和純度分別達(dá)到4.1％和75％。3、采用本發(fā)明方法提取得到的銀杏白果多糖，在濃度為30mg/mL條件下，其還原能力、DPPH自由基清除能力、·OH自由基清除能力以及α-葡萄糖苷酶抑制活性，分別為0.673，86.03％，73.73％，80.12％。且在一定范圍內(nèi)，隨著其濃度的增加，其抗氧化活性以及降血糖活性皆逐漸增強(qiáng)。3、不同提取方法的多糖生物活性分析：熱水提取、超聲提取、酶法提取和超聲波協(xié)同酶法提取多糖所得率及其生物活性分別見圖1～5。從圖1中的多重比較結(jié)果可知，在相同濃度(30mg/mL)下，四種提取方式提取的銀杏白果多糖的提取率差異顯著(P<0.05)。其中超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的銀杏白果多糖的提取率為4.1％，是熱水提取的4.7倍，而超聲提取的銀杏白果多糖的提取率為2.04％，酶法提取的銀杏白果多糖的提取率為3.78％。說明單一的生物酶或超聲輔助作用可在一定范圍的提高銀杏白果多糖的提取率，但效果并不理想，而超聲協(xié)同酶技術(shù)將超聲和生物酶有效地結(jié)合起來，可大大提高銀杏白果多糖的提取率，可能是超聲波的空化、機(jī)械粉碎、熱學(xué)等作用，再加上生物酶破壞細(xì)胞壁，從而提高速度，縮短時(shí)間，極大地提高多糖的提取效率。從圖2中的多重比較結(jié)果可知，在相同濃度(30mg/mL)下，四種提取方式提取的銀杏白果多糖都具有一定的DPPH自由基清除能力，但熱水提取、超聲提取、酶法提取和超聲協(xié)同酶法提取的四種銀杏白果多糖的DPPH自由基清除能力差異顯著(P<0.05)。熱水提取、超聲提取、酶法提取和超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的銀杏白果多糖對(duì)DPPH自由基清除率依次為12.12％、14.85％、62.12％、86.03％。可知超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的銀杏白果多糖對(duì)DPPH自由基清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于熱水提取的銀杏白果多糖。從圖3中的多重比較結(jié)果可知，在相同濃度(30mg/mL)下，熱水提取、超聲提取、酶法提取和超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的四種銀杏白果多糖對(duì)Fe3+還原能力差異顯著(P<0.05)。超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的銀杏白果多糖對(duì)Fe3+還原能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于熱水提取的銀杏白果多糖。從圖4中的多重比較結(jié)果可知，在相同濃度(30mg/mL)下，熱水提取、超聲提取、酶法提取和超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的四種銀杏白果多糖對(duì)·OH自由基清除能力差異顯著(P<0.05)。四種銀杏白果多糖對(duì)·OH自由基清除能力大小順序?yàn)椋撼晠f(xié)同酶技術(shù)提取>酶法提取>熱水提取>超聲提取。目前市面上某些藥物利用抑制α-葡萄糖苷酶(AGC)以減慢單糖和多糖轉(zhuǎn)化成人體可吸收的單糖，進(jìn)而將血糖平緩地控制在一定的范圍內(nèi)來達(dá)到降血糖的目的。從圖5中的多重比較結(jié)果可知，在相同濃度(30mg/mL)下，熱水提取、超聲提取、酶法提取和超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的四種銀杏白果多糖對(duì)AGC抑制率差異顯著(P<0.05)。超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的銀杏白果多糖對(duì)AGC抑制率達(dá)80.12％，是超聲提取的22.38倍。結(jié)果表明，超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的銀杏白果多糖對(duì)AGC的抑制率較好，是一種潛在的降血糖可應(yīng)用物質(zhì)。綜合圖1-5的研究結(jié)果可知，與熱水、超聲、酶法等三種方法提取的銀杏白果多糖比較，超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的銀杏白果多糖在提取率、還原能力、DPPH自由基清除能力、·OH自由基清除能力以及α-葡萄糖苷酶抑制活性等方面顯著提高(P<0.05)。本發(fā)明所得的銀杏白果多糖提取率為4.1％，在銀杏白果多糖濃度為30mg/mL條件下，其還原能力、DPPH自由基清除能力、·OH自由基清除能力以及α-葡萄糖苷酶抑制活性，分別為0.673，86.03％，73.73％，80.12％。且在一定范圍內(nèi)，隨著其濃度的增加，其抗氧化活性以及降血糖活性皆逐漸增強(qiáng)。這表明本發(fā)明的一種采用超聲協(xié)同酶技術(shù)提取銀杏白果多糖的方法是提取白果多糖的有效方法。4、不同提取方式的銀杏白果多糖的結(jié)構(gòu)的對(duì)比4.1全波長光譜掃描對(duì)四種銀杏白果多糖的水溶液在190-700nm處進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果如圖6，四種銀杏白果多糖在210nm附近都有多糖的特征吸收峰，四者均在260-280nm范圍內(nèi)無明顯吸收峰，證明四種銀杏白果多糖多糖中均不含有蛋白質(zhì)和核酸。4.2紅外光譜掃描四種銀杏白果多糖在40000-400cm-1的紅外光譜檢測(cè)，四種銀杏白果多糖樣品在3400cm-1附近出現(xiàn)寬的吸收峰，這是糖類的O-H伸縮振動(dòng)的強(qiáng)吸收，表明四種銀杏白果多糖皆存在分子間氫鍵。四種銀杏白果多糖樣品在2950-2830cm-1處有較弱雙吸收峰，可能樣品中含有氨基糖。熱水、超聲和酶法提取的銀杏白果多糖在2800cm-1附近出現(xiàn)較弱的吸收峰，表明該樣品中存在多糖-CH2的-CH伸縮振動(dòng)，但吸收峰較弱，超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的銀杏白果多糖在2800cm-1附近出現(xiàn)尖而強(qiáng)的吸收峰，表明其-CH伸縮振動(dòng)較強(qiáng)。超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的多糖在1740cm-1附近有一較弱的吸收峰，這是C＝O的伸縮振動(dòng)峰。四種銀杏白果多糖樣品在1680-1600cm-1附近都有吸收峰，熱水、超聲和酶法提取的銀杏白果多糖的吸收峰的強(qiáng)度高于超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的銀杏白果多糖，表明超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的銀杏白果多糖中C＝O所引起的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰較弱。四種銀杏白果多糖樣品在1400-1200cm-1之間存在C-H的變角振動(dòng)區(qū)。四種銀杏白果多糖樣品在1200-1000cm-1之間存在由C-O-H和吡喃環(huán)的C-O-C兩種C-O形成的伸縮振動(dòng)區(qū)，表明該樣品為吡喃糖。超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的多糖在870cm-1附近具有吸收峰，證明該多糖為β-葡萄吡喃糖。4.3電鏡觀察將四種銀杏白果多糖放大2000倍和4500倍的照片如圖7～10所示。從圖7中可以看出，熱水提取的銀杏白果多糖中出現(xiàn)大量的小球狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)緊密。從圖8中可以看出，超聲提取的銀杏白果多糖呈不規(guī)則的幾何外形，表面凹凸不平，帶有孔洞的褶皺結(jié)構(gòu)。這說明銀杏白果多糖分子見相互存在排斥力，分子間吸引力較為弱小。從圖9、10中可以看出，酶法和超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的銀杏白果多糖呈海綿狀，表面形貌光滑，分子聚集程度明顯減少，說明酶法和超聲協(xié)同酶技術(shù)使銀杏白果多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，使得分子間作用力減小，分子交聯(lián)程度減弱，進(jìn)而導(dǎo)致銀杏白果多糖聚集體的形態(tài)發(fā)生變化，使銀杏白果多糖的生物活性更好的發(fā)揮出來。4.4分子量測(cè)定從圖11中可以看出，熱水提取的銀杏白果多糖出峰時(shí)間是14.68-18.05min，且峰形為單一對(duì)稱峰，多角度激光信號(hào)顯示該多糖存在分子量較大的聚合物，經(jīng)軟件計(jì)算，可得Mw(重均分子量)為4.20×105，Mn(數(shù)均分子量)為3.65×105，分子量分布系數(shù)(Mw/Mn)為1.15，(小于1.5)，分子量分布較窄，相對(duì)純度為63.85％。從圖12中可以看出，超聲提取的銀杏白果多糖出峰時(shí)間是18.05-21.55mim，經(jīng)軟件計(jì)算，可得Mw為1.34×104，Mn為1.25×104，分子量分布(Mw/Mn)為1.08(小于1.5)，分子量分布較窄，相對(duì)純度為63.39％。從圖13中可以看出，酶法提取的銀杏白果多糖出峰時(shí)間是15.95-19.65mim，經(jīng)軟件計(jì)算，可得Mw為1.72×104，Mn為1.20×104，分子量分布(Mw/Mn)為1.44(小于1.5)，分子量分布較窄，相對(duì)純度為97.83％。從圖14中可以看出，超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的銀杏白果多糖出峰時(shí)間是16.05-21.55mim，經(jīng)軟件計(jì)算，可得Mw為2.02×104，Mn為1.37×104，分子量分布(Mw/Mn)為1.48(小于1.5)，分子量分布較窄，相對(duì)純度為96.18％。4.5單糖組成測(cè)定Man、Rha、Glc、Gal、Xyl、Ara6種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PMP衍生化，產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜分析，分離結(jié)果見圖15?？梢钥闯?種標(biāo)準(zhǔn)單糖在20min內(nèi)可以得到良好的分離，且峰形對(duì)稱。表1單糖標(biāo)準(zhǔn)品的分離檢測(cè)以單糖濃度對(duì)峰面積作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各單糖的線性回歸方程見表1。結(jié)果表明，各單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，R2≥0.99，線性范圍為100mg/L到1000mg/L。經(jīng)計(jì)算，甘露糖和鼠李糖間的校正因子為fM/R＝3.04，鼠李糖和葡萄糖間的校正因子為fR/G＝1.25，甘露糖和葡萄糖間的校正因子為fM/G＝3.80。圖16是熱水提取的銀杏白果多糖經(jīng)PMP衍生后的高效液相色譜分離圖。由圖可見，熱水提取的銀杏白果多糖是由甘露糖組成的單一的均單糖。圖17是超聲提取的銀杏白果多糖經(jīng)PMP衍生后的高效液相色譜分離圖。由圖可見，超聲提取的銀杏白果多糖是由甘露糖和鼠李糖組成，根據(jù)分析和計(jì)算方法，可求得該多糖中甘露糖和鼠李糖的摩爾比為16.87:1.00。圖18是酶法提取的銀杏白果多糖經(jīng)PMP衍生后的高效液相色譜分離圖。由圖可見，酶法提取的銀杏白果多糖是由甘露糖和葡萄糖組成，根據(jù)分析和計(jì)算方法，可求得該多糖中甘露糖和葡萄糖的摩爾比為6.41:1.00。圖19是超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的銀杏白果多糖經(jīng)PMP衍生后的高效液相色譜分離圖。由圖可見，超聲協(xié)同酶技術(shù)提取的銀杏白果多糖是由甘露糖、鼠李糖和葡萄糖組成，根據(jù)分析和計(jì)算方法，可求出該多糖中甘露糖、鼠李糖和葡萄糖的摩爾比為8.25:1.00:1.53。本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)條件的確定：1.確定酶的添加順序?yàn)榇_定酶的添加順序，將復(fù)合酶(纖維素酶和果膠酶)和中性蛋白酶進(jìn)行前后添加，控制反應(yīng)體系質(zhì)量濃度為5.0％，提取時(shí)間為2h，體系pH為6.0，提取溫度為60℃，其余步驟同實(shí)施例1，根據(jù)銀杏白果多糖的提取率，來研究酶的添加順序?qū)︺y杏白果多糖提取率的影響，具體試驗(yàn)結(jié)果見表2。表2酶的添加順序?qū)︺y杏白果多糖提取率的影響由表2可以看出，先添加復(fù)合酶再添加中性蛋白酶所得的多糖提取率為3.21％左右，高于先添加中性蛋白酶后加復(fù)合酶，因此，酶的添加順序選擇為先添加復(fù)合酶再加中性蛋白酶。2.確定復(fù)合酶的復(fù)合配比選取果膠酶用量(A)、纖維素酶用量(B)、中性蛋白酶用量(C)三因素，采用L9(33)正交表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以銀杏白果多糖提取率為指標(biāo)，確定復(fù)合酶的最佳配比。表3復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果從正交試驗(yàn)結(jié)果(表3)得出，三因素影響多糖提取率的大小分別為A>C>B，即果膠酶＞中性蛋白酶＞纖維素酶，最佳配比組合為：A2B1C3，即適宜的酶的比例為果膠酶46U/g，纖維素酶45U/g，中性蛋白酶280U/g。經(jīng)三次重復(fù)試驗(yàn)得出銀杏白果多糖提取率為3.5％。3.響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶法提取銀杏白果多糖利用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶法提取銀杏白果多糖，具體試驗(yàn)結(jié)果見表4、5。表4復(fù)合酶法提取銀杏白果多糖工藝優(yōu)化中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表5復(fù)合酶法提取銀杏白果多糖工藝優(yōu)化的回歸分析結(jié)果注：*.P<0.05，差異顯著；**.P<0.01，差異高度顯著；***.P<0.001，差異極度顯著。結(jié)果分析：由表4、5分析可知：該模型的F＝45.87，P<0.0001，表明實(shí)驗(yàn)所采用的二次模型是極顯著的，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是有意義的。失擬項(xiàng)用來表示所用模型與實(shí)驗(yàn)擬合的程度，即二者差異的程度。本試驗(yàn)P＝0.0992>0.05，對(duì)模型是有利的，無失擬因素存在，因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。因素A提取溫度的P＝0.0008<0.001，說明因素A提取溫度對(duì)提取率％的影響是極顯著的；因素B時(shí)間的P＝0.0319<0.05，因素CpH的P＝0.0268<0.05，因素D液料比的P＝0.0378<0.05，說明因素B、C、D對(duì)提取率％的影響是顯著的。而A的2次方，B的2次方，C的2次方，D的2次方的P值均小于0.01，說明A2、B2、C2、D2對(duì)提取率均有高度顯著影響。交互項(xiàng)AB、CD的P值分別為：0.0010，0.0005均小于0.001，所以交互項(xiàng)AB、CD對(duì)提取率有極度顯著性影響。交互項(xiàng)BC的P＝0.0048，小于0.01，所以交互項(xiàng)BC對(duì)提取率有高度顯著性影響。交互項(xiàng)AC的P＝0.0103，小于0.05，所以交互項(xiàng)AC對(duì)提取率有顯著性影響。而交互項(xiàng)AD、BD的P值分別為0.4491，0.3285，均大于0.05，所以交互項(xiàng)AD、BD對(duì)提取率沒有影響。利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化了超聲協(xié)同酶技術(shù)提取銀杏白果多糖提取率的最佳工藝條件，建立了銀杏白果多糖提取的數(shù)學(xué)模型，較適宜工藝條件為提取溫度為55℃、提取時(shí)間為2h、體系質(zhì)量濃度為6.7％、體系pH5.5，經(jīng)驗(yàn)證銀杏白果多糖提取率平均值為3.78％，與模型預(yù)測(cè)值基本一致，模型的可靠性得以驗(yàn)證。4.蛋白酶水解溫度的確定蛋白酶酶解過程中，酶解溫度為45℃時(shí)，銀杏白果多糖提取率為1.22％，蛋白去除率為54％，隨著酶解溫度的升高，銀杏白果多糖提取率逐漸增大，蛋白去除率也逐漸增大。當(dāng)酶解溫度為55℃時(shí)，銀杏白果多糖提取率達(dá)到最大(3.13％)，而蛋白去除率也接近最高，表明適當(dāng)?shù)靥岣邷囟瓤梢蕴岣呙傅幕钚?，促進(jìn)多糖中的蛋白分解，進(jìn)而提高蛋白去除率；但當(dāng)酶解溫度再升高時(shí)，銀杏白果多糖提取率和蛋白去除率皆逐漸下降，這可能是由于超過一定溫度時(shí)，酶解溫度的升高會(huì)導(dǎo)致酶活性的降低或酶部分失活，多糖損失量變大，因此選擇酶解溫度55℃。5.蛋白酶水解時(shí)間的確定在一定的酶解時(shí)間內(nèi)，銀杏白果多糖提取率和蛋白去除率逐漸升高，可能As.1398中性蛋白酶在這段時(shí)間內(nèi)充分作用使多糖中的蛋白分解或?qū)⒌鞍字邪亩嗵轻尫懦鰜恚瑥亩广y杏白果多糖充分浸出，當(dāng)酶解時(shí)間超過2.0h時(shí)，銀杏白果多糖提取率呈現(xiàn)平緩趨勢(shì)不再升高，而蛋白去除率緩緩下降，因此選擇酶解時(shí)間為2.0h。6.確定超聲協(xié)同酶技術(shù)提取多糖的最佳條件控制體系質(zhì)量濃度為6.7％，體系pH為5.5，提取溫度為55℃，酶的比例為果膠酶46U/g，纖維素酶45U/g，中性蛋白酶280U/g的條件下，研究超聲協(xié)同酶技術(shù)對(duì)銀杏白果多糖的提取率影響的最佳條件，具體試驗(yàn)結(jié)果見表6、7。表6超聲協(xié)同酶技術(shù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果表7正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)方差分析表注：*.P<0.05，差異顯著。通過極差分析可以看出，三個(gè)因素對(duì)銀杏白果多糖提取率的影響效果從大到小順序依次為功率>超聲次數(shù)>提取次數(shù)。最佳提取工藝為A2B2C2，即超聲功率為350W，時(shí)間為30min，超聲次數(shù)為2次，此時(shí)銀杏白果多糖提取率為4.02％。從方差分析表6可以看出，F(xiàn)A>FC>FB，而FA>F0.05(2,2)說明超聲功率對(duì)白果多糖提取率影響顯著；而FC、FB<F0.05(2,2)說明超聲時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)多糖提取率影響不顯著，從高效省時(shí)可考慮選用超聲時(shí)間為30min，提取次數(shù)為2次，故選用超聲功率為350W，時(shí)間為30min，超聲次數(shù)為2次，作為銀杏白果多糖提取率的最佳工藝。經(jīng)三次重復(fù)試驗(yàn)得出銀杏白果多糖提取率為4.1％。實(shí)施例4在實(shí)施例2的基礎(chǔ)上進(jìn)一步具體實(shí)驗(yàn)條件。一種超聲協(xié)同酶技術(shù)提取銀杏白果多糖的方法，其特征包含以下步驟：(1)超聲協(xié)同酶技術(shù)提取銀杏白果多糖：a：在室溫條件下，將白果剝殼、去紅皮，用高速粉碎機(jī)將其粉碎并真空干燥、脫脂，即得脫脂白果粉備用。b：稱取一定量的脫脂白果粉，用蒸餾水配置成質(zhì)量濃度為6.0％的體系，然后使用HCl調(diào)節(jié)pH至6.0，調(diào)節(jié)酶解溫度為60℃，添加復(fù)合酶，即果膠酶添加量為40U/g(每克白果粉添加果膠酶40U)和纖維素酶添加量為40U/g(每克白果粉添加纖維素酶40U)后，同時(shí)對(duì)其反應(yīng)液進(jìn)行超聲處理，超聲功率為300W，每次超聲時(shí)間為20min，超聲兩次；在超聲結(jié)束后，在溫度為90℃條件下，加熱滅酶30秒。c：利用NaOH調(diào)節(jié)步驟b中滅酶后反應(yīng)液的pH至7.0，調(diào)節(jié)酶解溫度為60℃，添加蛋白酶，其添加量為200U/g(每克白果粉添加蛋白酶200U)，水解反應(yīng)時(shí)間為1h，酶解反應(yīng)后，在溫度為90℃條件下，加熱滅酶30秒；在4000r/min條件下，離心10min后，獲得上清液，即為白果多糖溶液。(2)醇沉、除蛋白純化得銀杏白果粗多糖：將(1)中所得多糖溶液50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/5，然后加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀，靜置過夜，離心得沉淀；將沉淀加水復(fù)溶后，在多糖溶液中，以體積比1:4加入Sevag試劑(氯仿：正丁醇＝5:1v/v)，混合物劇烈振搖30min，離心(4000r/min，10min)，除去水層和試劑層交界處的變性蛋白，重復(fù)操作幾次，直至不出現(xiàn)白色膠狀物；再在多糖溶液中加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀，離心得沉淀；將沉淀分別用無水乙醇、丙酮和乙醚相繼洗滌，再冷凍干燥得粗多糖。(3)溶解粗多糖添加季銨鹽再次沉淀分離純化：取一定量的粗多糖溶于蒸餾水中，加入等體積的3％十六烷基三甲基溴化銨，35℃下保溫靜置4h，產(chǎn)生沉淀，4℃，4000r/min離心20min，收集沉淀；將沉淀用10％NaCl溶液溶解后，加入3倍的無水乙醇，產(chǎn)生白色沉淀，離心收集沉淀，并用去離子水溶解的復(fù)溶溶液；(4)脫鹽：將步驟(3)的復(fù)溶溶液裝入分子量2-14kDa透析袋內(nèi)進(jìn)行脫鹽；每隔3-4h更換一次去離子水，透析10-12h即可。(5)冷凍干燥得銀杏白果精多糖：將脫鹽溶液冷凍干燥即制得銀杏白果多糖精制品。結(jié)果驗(yàn)證：1、多糖提取率的計(jì)算如實(shí)施例1所述。2、采用本發(fā)明方法提取得到的白果多糖精產(chǎn)品為乳白色粉狀物，白果多糖的提取率和純度分別達(dá)到3.5％和65％。