本發(fā)明屬于生物技術(shù)及植物學領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)薯類葉片中淀粉含量的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

薯類植物指具有可供食用塊根或地下莖的一類的陸生作物。有塊根、塊莖類，如番薯(紅薯、甘薯)、木薯、馬鈴薯、薯蕷(山藥)、腳板薯等，多行無性繁殖，只留薯塊作種，并可以用藤本進行繁殖。這類植物一般耐寒力較弱，多在無霜季節(jié)栽培，低溫會抑制薯類作物的生長，造成塊根或塊莖的減產(chǎn)，因此種植薯類作物盡量避免長時間的低溫期；此外，疏松、肥沃、深厚的土壤和多量鉀肥有利于提高薯類作物產(chǎn)量及品質(zhì)。

絕大多數(shù)薯類植物的葉片和儲藏根中都會大量富集淀粉，目前薯類植物的儲藏根是生產(chǎn)淀粉的主要原料，但葉片作為進行光合作用固定二氧化碳的主要器官，也具有生產(chǎn)新型淀粉的潛能。通過調(diào)控葉片中淀粉的積累以及改良葉片中淀粉的性質(zhì)，充分發(fā)揮薯類葉片的優(yōu)勢生產(chǎn)新型淀粉，一直是本領(lǐng)域研究的重點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種調(diào)節(jié)薯類葉片中淀粉含量的方法及應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種調(diào)節(jié)薯類植物的葉片的淀粉性狀的方法，所述方法包括：調(diào)節(jié)薯類植物中SRD多肽的表達。

在一個優(yōu)選例中，所述的薯類植物包括：木薯，甘薯、馬鈴薯、山藥、芋頭、葛根、魔芋、洋姜、雪蓮果等。

在另一優(yōu)選例中，所述的SRD多肽選自下組：

(a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；

(b)將SEQ ID NO:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(如1-20個；較佳地1-10；更佳地1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(c)與(a)限定的多肽序列有70％以上(較佳地80％以上，85％以上，更佳地90％以上，如95％以上，98％以上，99％以上)同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在另一優(yōu)選例中，所述方法包括：降低植物中SRD多肽的表達，從而：

提高薯類植物葉片中的淀粉含量；

提高薯類植物葉片中淀粉顆粒的直徑；

降低薯類植物葉片中淀粉的磷酸化程度；

增加薯類植物葉片中直鏈淀粉的含量；和/或

增加淀粉中短鏈(較佳地為DP6-14)的含量，降低淀粉中長鏈部分(較佳地為DP20-37)的含量。

在另一優(yōu)選例中，所述降低植物中SRD多肽的表達包括：將干擾所述SRD多肽表達的干擾分子轉(zhuǎn)入植物(如植物的細胞、組織、器官或種子)，從而下調(diào)植物中SRD多肽的表達。

在另一優(yōu)選例中，干擾所述SRD多肽表達的干擾分子靶向SRD多肽的編碼基因或其轉(zhuǎn)錄本；較佳地，靶向該編碼基因的第741-1193位或其轉(zhuǎn)錄本。

在另一優(yōu)選例中，所述的干擾分子含有式(I)所示的結(jié)構(gòu)：

Seq_正向-X-Seq_反向 式(I)，

式(I)中，

Seq_正向為SRD多肽的編碼基因的片段，Seq_反向為與Seq_正向互補的多核苷酸；較佳地，Seq_正向為SRD多肽的編碼基因的第741-1193位；

X為位于Seq_正向和Seq_反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq_正向和Seq_反向不互補。

在另一優(yōu)選例中，式(I)所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入植物后，形成式(II)所示的二級結(jié)構(gòu)：

式(II)中，Seq_正向、Seq_反向和X的定義如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之間的基本上互補的關(guān)系。

在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括后續(xù)步驟：從調(diào)節(jié)SRD多肽的表達后的植物中選擇出相較調(diào)節(jié)前植物而言性狀獲得變化的植物。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種下調(diào)(如干擾)SRD多肽表達的物質(zhì)的用途，用于調(diào)節(jié)薯類植物的葉片的淀粉性狀。

在一個優(yōu)選例中，所述的下調(diào)SRD多肽表達的物質(zhì)用于：

提高薯類植物葉片中的淀粉含量；

提高薯類植物葉片中淀粉顆粒的直徑；

降低薯類植物葉片中淀粉的磷酸化程度；

增加薯類植物葉片臨時性淀粉中直鏈淀粉的含量；和/或

增加淀粉中短鏈的含量，降低淀粉中長鏈部分的含量。

在另一優(yōu)選例中，所述的薯類植物包括：木薯，甘薯、馬鈴薯、山藥、芋頭、葛根、魔芋、洋姜、雪蓮果等。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種下調(diào)SRD多肽表達從而調(diào)節(jié)薯類植物的葉片的淀粉性狀的干擾分子，其含有式(I)所示的結(jié)構(gòu)：

Seq_正向-X-Seq_反向 式(I)，

式(I)中，

Seq_正向為SRD多肽的編碼基因片段，Seq_反向為與Seq_正向互補的多核苷酸；較佳地，Seq_正向為SRD多肽的編碼基因的第741-1193位；

X為位于Seq_正向和Seq_反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq_正向和Seq_反向不互補。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種載體，所述的載體含有所述的干擾分子。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種SRD多肽或其編碼基因的用途，用于作為鑒定薯類植物的葉片的淀粉性狀的分子標記；所述的薯類植物的葉片的淀 粉性狀包括：

薯類植物葉片中的淀粉含量；

薯類植物葉片中淀粉顆粒的直徑；

薯類植物葉片中淀粉的磷酸化程度；

薯類植物葉片臨時性淀粉中直鏈淀粉的含量；和/或

增加淀粉中短鏈的含量，降低淀粉中長鏈部分的含量。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1、含有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNAi雙元表達載體示意圖。

圖2、轉(zhuǎn)基因植株Southern blot鑒定。

圖3、SRDRNAi轉(zhuǎn)基因植株中木薯SRD表達水平的變化。

圖4、轉(zhuǎn)基因植株中MeSRD蛋白表達的Western blot分析結(jié)果。

抗體：MeSRD兔源多克隆抗體；

內(nèi)參：以Rubisco為蛋白上樣量內(nèi)參；

對照：野生型木薯TMS60444；

蛋白提取材料為溫室木薯植株的成熟葉片。

圖5、野生型木薯TMS60444及轉(zhuǎn)基因木薯葉片中臨時性淀粉的含量。葉片取自上海五厙中試試驗田自然條件下生長的木薯植株，圖中所示數(shù)據(jù)為3次實驗重復(fù)。

圖6、暗周期末野生型木薯TMS60444及轉(zhuǎn)基因不同發(fā)育時期木薯葉片碘染結(jié)果。

圖7、野生型木薯TMS60444及轉(zhuǎn)基因木薯葉片中淀粉的掃描電鏡結(jié)果。

葉片中的淀粉粒經(jīng)提取后通過掃描電鏡觀察，A-D分別為WT、轉(zhuǎn)基因株系G1i-12、轉(zhuǎn)基因株系G1i-17、轉(zhuǎn)基因株系G1i-31葉片中的淀粉。

圖8、野生型木薯TMS60444及轉(zhuǎn)基因木薯葉片中淀粉的磷酸化水平圖譜。

A：葡萄糖-6-磷酸標準樣品；

B：葡萄糖-3-磷酸標準樣品；

C：野生型木薯TMS60444葉片中葡萄糖-6-磷酸及葡萄糖-3-磷酸含量；

D：SRDRNAi轉(zhuǎn)基因木薯葉片中葡萄糖-6-磷酸及葡萄糖-3-磷酸含量。

圖9、野生型木薯TMS60444及轉(zhuǎn)基因木薯葉片中淀粉的磷酸化程度。

縱坐標為每毫克淀粉中含有的葡萄糖-6-磷酸的量，淀粉提取材料用大田木薯植株的葉片。**代表t-test檢驗差異極顯著(p<0.01)。

圖10、野生型木薯TMS60444及轉(zhuǎn)基因木薯葉片中淀粉的直鏈淀粉含量。

圖中所示數(shù)據(jù)為三次重復(fù)結(jié)果。*代表t-test檢驗差異顯著(p<0.05)，**代表t-test檢驗差異極顯著(p<0.01)。

圖11、野生型木薯TMS60444及轉(zhuǎn)基因木薯葉片中淀粉的XRD衍射圖譜。

葉片臨時性淀粉的衍射圖譜；淀粉分別從大田木薯的葉片及塊根中提取。

圖12、野生型木薯TMS60444及轉(zhuǎn)基因木薯葉片中淀粉的鏈長分布。

A：野生型木薯TMS60444葉片支鏈淀粉的鏈長分布；

B-F：分別為野生型木薯TMS60444塊根儲存性淀粉、轉(zhuǎn)基因植株G1i-12、17、28、31葉片臨時性淀粉與野生型木薯TMS60444葉片臨時性淀粉鏈長分布之差。以上數(shù)據(jù)為三次實驗重復(fù)。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，發(fā)現(xiàn)通過改變SRD在薯類植物中的表達，可以顯著調(diào)節(jié)薯類植物的淀粉性狀，在植物品質(zhì)的遺傳改良上具有良好的應(yīng)用 前景。

如本文所用，本發(fā)明的“薯類植物”也稱為“薯類作物”，主要指具有可供食用塊根或地下莖的一類的陸生作物。包括但不限于：大戟科的塊根植物如木薯、旋花科的塊根植物如甘薯，茄科的塊莖植物如馬鈴薯，薯蕷科的塊根植物如山藥，天南星科的塊莖植物如芋頭、魔芋，豆科塊根植物如葛根，菊科塊莖植物如洋姜，雪蓮果等。

本發(fā)明還包括SRD多肽的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的SRD多肽相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。

任何一種SRD多肽的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，SRD多肽的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的SRD多肽的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50％的全長SRD多肽的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長SRD多肽的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本發(fā)明中，術(shù)語“SRD多肽”指具有SRD多肽活性的SEQ ID NO:2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與SRD多肽相同功能的、SEQ ID NO:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)：若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，還更佳如1-8個、1-5個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括SRD多肽的活性片段和活性衍生物。

多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與SRD多肽DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含SRD多肽或其片段的融合蛋白。

任何與所述的SRD多肽同源性高(比如與SEQ ID NO:2所示的序列的同源性為70％或更高；優(yōu)選的，同源性為80％或更高；更優(yōu)選的，同源性為90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有SRD多肽相同功能的蛋白也包括在本發(fā)明內(nèi)。

發(fā)明還提供SRD多肽或多肽的類似物。這些類似物與天然SRD多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。

應(yīng)理解，雖然本發(fā)明的SRD多肽優(yōu)選獲自木薯，但是獲自其它植物的與木薯SRD多肽高度同源(如具有70％以上，如80％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它多肽也在本發(fā)明考慮的范圍之內(nèi)。比對序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知的，例如BLAST。

本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明SRD多肽或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO:1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO:2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO:1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。

編碼SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。

術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼所述多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。

本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。

本發(fā)明的SRD基因的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。

本發(fā)明也涉及包含所述的多核苷酸的載體，以及用所述的載體或SRD基因序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞。

基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還提供了一種改良薯類植物的方法，該方法包括調(diào)節(jié)所述薯類植物中SRD多肽的表達。

更優(yōu)選地，所述的方法包括：降低所述植物中SRD多肽的表達(包括使SRD多肽不表達或低表達)，從而：提高薯類植物葉片中的淀粉含量；提高薯類植物葉片中淀粉顆粒的直徑；降低薯類植物葉片中淀粉的磷酸化程度；和/或增加薯類植物葉片臨時性淀粉中直鏈淀粉的含量；增加淀粉中短鏈的含量，降低淀粉中長鏈部分的含量。

可以采用本領(lǐng)域人員熟知的多種方法來降低SRD多肽的表達或使之缺失表達，比如將攜帶反義SRD基因的表達單位(比如表達載體或病毒等)遞送到靶點上，使得細胞或植物組織不表達或降低表達SRD多肽。

作為本發(fā)明的一種實施方式，提供了一種降低植物中SRD多肽的表達的方法，所述的方法包括：

(1)將干擾SRD基因表達的干擾分子轉(zhuǎn)入植物組織、器官或種子，獲得轉(zhuǎn)化入所述干擾分子的植物組織、器官或種子；和

(2)將步驟(1)獲得的轉(zhuǎn)入了所述干擾分子的植物組織、器官或種子再生成植物。

作為一種優(yōu)選的實例，所述的方法包括步驟：

(i)提供攜帶可干擾基因表達的載體的農(nóng)桿菌，所述的載體選自下組：

(a)含有反方向啟動的SRD多肽的編碼基因或基因片段(反義分子)的載 體；

(b)含有可在植物體內(nèi)形成特異性干擾SRD多肽的編碼基因表達(或轉(zhuǎn)錄)的成分的干擾分子的載體；

(ii)將植物的組織或器官與步驟(i)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所述載體轉(zhuǎn)入植物組織或器官。

較佳地，所述方法還包括：

(iii)選擇出轉(zhuǎn)入了所述載體的植物織或器官；和

(iv)將步驟(iii)中的植物組織或器官再生成植物。

基于SRD基因的核苷酸序列，可以設(shè)計出在導入植物體后可形成特異性干擾SRD基因表達的分子的多核苷酸。設(shè)計時要考慮到特異性以及干擾的效率。本發(fā)明對干擾分子的制備方法沒有特別的限制，包括但不限于：化學合成法，體外轉(zhuǎn)錄法等。應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員在得知了SRD基因與植物性狀的相關(guān)性以后，可以以各種途徑制備出所述的干擾分子，從而用于調(diào)節(jié)植物性狀。所述的干擾分子可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)被輸送到植物體內(nèi)，或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到植物體內(nèi)。

作為本發(fā)明的特別優(yōu)選的方式，提供了一種效果優(yōu)異的干擾分子，所述的干擾分子可特異性的干擾SRD基因的表達；并且經(jīng)驗證，其具有良好的干擾SRD基因表達的效果。所述的干擾分子是含有SEQ ID NO:1中第741-1193位所示的核苷酸序列的分子，構(gòu)成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明還提供了一種干擾分子，所述干擾分子含有以下結(jié)構(gòu)：Seq_正向為SRD基因片段(較佳地為SEQ ID NO:1中第741-1193位所示的核苷酸序列)，Seq_反向為與Seq_正向互補的多核苷酸；X為位于Seq_正向和Seq_反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq_正向和Seq_反向不互補。

所述的干擾分子在導入到植物體內(nèi)后，可折疊成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部兩側(cè)包含基本上互補的兩條序列。也即，形成如下所示的二級結(jié)構(gòu)：

其中，||表示在Seq_正向和Seq_反向之間的基本上互補的關(guān)系。所述的莖環(huán)結(jié)構(gòu)可被植物體內(nèi)的各種物質(zhì)進一步作用、加工或剪切，并且形成雙鏈RNA(dsRNA)。

通常，所述的干擾分子位于表達載體上。

本發(fā)明還包括利用前述任一種方法獲得的植物，所述的植物包括：轉(zhuǎn)入了SRD基因或其同源基因的轉(zhuǎn)基因植物；或者SRD多肽表達量(包括低表達或不表達)降低的植物等。

可采用任何適當?shù)某Ｒ?guī)手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來實施所述的方法。

此外，本發(fā)明還涉及利用SRD多肽或其編碼基因作為一種基因轉(zhuǎn)化植株后代的追蹤標記。本發(fā)明還涉及利用SRD多肽或其編碼基因作為一種分子標記，通過檢測植物中SRD多肽的表達情況，鑒定植物的性狀。還可利用SRD基因相關(guān)的植物特性作為雜交制種過程中真雜種的指示標記。

本發(fā)明的方法可以制備獲得葉片中的淀粉含量提高及淀粉顆粒增大的薯類植物，從而可實現(xiàn)從薯類植物的葉片中大量提取淀粉的工藝。

并且，本發(fā)明的方法可以提高薯類植物葉片中淀粉顆粒的直徑(3-10μm)，使得其中的淀粉顆粒與來源于豆類(如綠豆)或谷物類(如米)的淀粉顆粒較為接近，這種顆粒淀粉作為小顆粒淀粉(小于10μm)具有良好的應(yīng)用價值。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1、MeSRD的克隆及序列分析

本發(fā)明人通過Blastp及Blastn在RIKEN cassava cDNA數(shù)據(jù)庫(http://www.brc.riken.jp/inf/en/index.shtml)中搜索發(fā)現(xiàn)兩條EST序列，定義為木薯的MeSRD基因，其全長4230bp，編碼1410個氨基酸。

MeSRD核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：

ATGAGTAATAGCATAGGGCATAATTTATTCCAACAGAGTTTGATTCGTCCCGCGAGTTTTAAACATGGAAGCAATCTCAATTCTTCTGGCATTCCTGCAAGCTATTTATTCCAATCTGCCTCTGTGAGTCGAGGACTGCAGATAAGCAGGTCGCCAATATCCTCTAGTTTTTATGGAAAAAATTTGAGGGTGCGGAAATCAAAATTAGCCGTTGTAAATCCTCGTCCAGCTATAACAATTCC ACGGGCTATATTGGCGATGGATCCGGCATCCCAGCTCCTAGGAAAATTCAACCTTGATGGAAATGTTGAATTGCAGGTGTTTGTTAGCAGTCACACTTCTGCTTCTACTGTGCAAGTACACATTCAGATAACATGCACTAGTGATTCTTTGCTCCTACACTGGGGTGGGAAACATGATAGAAAGGAAAACTGGGTACTTCCTAGTCGTTATCCAGATGGAACCAAAAATTATAAGAGCAGAGCCCTTAGAAGTCCTTTTGTCAAGTCTGGTTCAAGTTCTTACCTGAAAATAGAGATTGATGATCCTGCAATACAAGCCTTAGAATTTCTTATACTTGATGAAGCGCATAATAAATGGTTTAAAAATAATGGTGACAACTTTCATGTTAAATTACCTGCACGAGAGAAGCTGATAATTCCAAATATCTCAGTTCCTGAAGAGCTTGTACAAGTTCAAGCATATCTGAGGTGGGAAAGAAATGGTAAACAAATGTATACCCCAGAACAAGAAAAGAAAGAATATGAAGCCGCTCGTATTGAACTATTGGAGGAAGTAGCTAAGGGTACTTCCATTGAGGGCCTCCGAGCAAGGCTGACAAACAAAAATGAAATTAAGGAGTCATCTGTCTCTAAAACACAAAGCAAGATACACGCTCAAGCTCATAGAAGATGGGAAAAATCTACTACTAGTAATGAAAGGTTTCAGCGCAATCAGAGGGACTTAGCACAGCTTGTTACCAAATCTGCTACTAAAAAATCTGCAGAGGAAGCTGTTTCAGTAGAACCAAAACCAAAAGCATTGAAGGCAGTTGAACTTTTTGCTAAAGAAAAGGAAGAACGGGTTGGGGGTGCTGTTCTGAACAAGAAGATCTTTAAGCTCCAAGATGCGGAACTTCTGGTGCTTGTGACCAAGCCTGCTGATAAGATGAAGGTTTATGTTGCCACTGATTTCAAAGAACCAGTCACTCTTCACTGGGCATTATCTAGGAAGGGTAAAGAGTGGTTGGCGCCACCACCAAGTGTGTTGCCTCCTGGTTCAGTTTCTTTGAACGAGGCTGCTGAAACACAACTTAAAAGCATTTCTTCAACTGAACTTTCTTATCAGGTCCAATACTTTGAAACGGAGATCGAAGAGAATTTTGTAGGGATGCCCTTTGTGCTTTTTTCTAATGAAAAATGGATAAAGAATAAGGGCTCTGACTTTTATGTTGAACTTAGTGGCGGACCTAGGCCAGTCCAAAAGGATGCTGGTGATGGAAGAGGTACAGCAAAAGTTTTATTGGACACAATTGCAGAGCTGGAGAGTGAAGCACAGAAATCCTTCATGCACCGATTTAATATTGCAGCTGATTTGATGGAGGATGCAAAGGATGCTGGTGAGTTGGGTTTTGCAGGGATCTTGGTGTGGATGAGATTTATGGCCACGAGGCAACTTATTTGGAACAAAAACTACAATGTGAAACCACGTGAGATCAGCAAGGCACAGGATAGGCTCACAGACTTGCTCCAGAATACTTATACAAGTCATCCTCAATATCGGGAGCTTTTGCGGATGATTATGTCTACTGTCGGTCGAGGTGGTGAAGGTGATGTGGGGCAGCGAATTCGGGATGAAATTTTAGTTATCCAGAGAAACAATGATTGCAAAGGTGGTATGATGGAGGAATGGCATCAGAAGCTGCATAATAACACAAGCCCTGATGATGTTGTTATCTGCCAGGCATTAATGGATTACATTAAAAGTGACCTTGACATCAGTGTGTACTGGAAAACTTTGAATGAAAATGGAATAACAAAAGAACGACTTTTAAGCTATGATCGTGCAATCCATTCTGAACCAAGCTTCAGGAGAGATCAAAAGGACGGTCTTTTGCGTGATCTCGGCAACTATATGAGAAGTTTGAAGGCAGTTCATTCTGGTGCAGATCTTGAGTCTGCTATTGCAAATTGTATGGGCTATAAAGATGAGGGTCAAGGTTTCATGGTTGGAGTGCAAATAAATCCCATTTCAGGCTTGCCATCTGGATTTCCAGAGTTGCTTCGATTTGTTCTCAAACATGTTGAAGATAGAAATGTAGAAGCACTTCTTGAGGGTTTGCTGGAGGCTCGTCAGGAGCTGAGGCCATTGCTGTTTAAGTCTAATAATCGTCTGAAAGATCTTCTATTTTTGGATATTGCCCTTGATTCTACTGTTAGGACAGCCATTGAGAGAGGATATGAGGAATTAAATGATGCTGGACCAGAGAAAATTATGTATTTCATCACCCTGGTTCTTGAAAATCTTGCGCTTTCATCAGATGATAATGAAGAGTTTGTCTATTGCTTGAAGGGATGGAATTATGCCCTAAGCATGTCCAAAAGTAAAAGCAATCACTGGGCATTATATGCAAAATCAGTCCTTGACAGAACTCGCCTTGCCCTGGCCAGCAAGGCTGAATGGTATCAGCAAGTTTTGCAACCATCAGCAGAGTATCTTGGATCACTGCTTGGAGTGGATCAGTGGGCTGTGAACATATTCACTGAAGAAATAGTTCGTGCTGGATCAGCTGCAGCTGTATCCTTGCTTCTTAATCGACTTGATCCAGTTCTTCGGAAGACTGCTCATCTTGGAAGTTGGCAGGTTATTAGCCCAGTTGAAGCTGCTGGGTATGTTGTTGTTGTGGATGAGTTGCTCACAGTACAGAATTTATCTTACGACCGCCCTACAATTTTAGTGGCAAGAAGAGTAAGTGGAGAAGAAGAAATTCCTGATGGTACAGTTGCTGTGCTGACATCTGACATGCCAGATGTCCTATCCCATGTTTCTGTACGAGCAAGAAATAGCAAGGTTTGCTTTGCCACATGTTTTGATCAC AACATTCTGGACAATCTCCGAGCAAATGAAGGGAAATTATTGAATTTGAAACCTACATCAGCAGATATAGTCTATAGCGTGATCGAGGGTGAATTAGCAGATTTAAGTTCAAATAAGCTGAAAGAAGTTGGTCCTTCACCTATAAAGTTGATAAGAAAGCAGTTCAGTGGTAGATATGCCATATCATCGGAGGAGTTCACCGGTGAAATGGTTGGTGCCAAATCACGCAATATCGCGCATCTAAAAGGAAAAGTACCATCCTGGATTGGGATTCCTACATCGGTTGCCTTACCATTTGGAGTTTTTGAGAAGGTTCTTTCAGATGGTTCAAATCAAGAAGTGGCTAAGAAGTTGGAAGTTTTGAAGAAACAGTTGGAAGGAGGAGAGTCTAGTGTCCTCAGGAGAATTCGTGAGACAGTTTTACAGCTGGCAGCACCACCACAGCTGGTGCAAGAGCTGAAGACAAAGATGAAAAGTTCTGGGATGCCTTGGCCTGGCGATGAAGGTGAACAGCGATGGGAGCAAGCATGGATGGCTATAAAGAAGGTCTGGGCTTCAAAATGGAATGAGAGAGCATACTTCAGCACAAGGAAAGTGAAGTTGGACCATGATTACCTCTGCATGGCTGTCCTGGTTCAGGAGATAATAAATGCCGATTATGCATTTGTTATCCACACGACCAATCCATCTTCTGGGGATTCATCAGAGATATATGCTGAGGTAGTGAAGGGACTTGGAGAAACTCTTGTTGGAGCCTATCCCGGCCGTGCTTTGAGTTTTATCTGCAAGAAAAAAGATCTGAATTCTCCTCAGGTGTTGGGTTACCCAAGCAAACCCATTGGCCTTTTTATAAGACGTTCTATAATCTTCAGATCTGACTCCAATGGTGAAGATCTGGAAGGTTATGCTGGTGCTGGTCTTTATGATAGTGTTCCAATGGATGAGGAAGAGAAAGTTGTGCTTGATTACTCATATGATCCATTGATCACCGATGAAAGCTTCCGAAAATCAATTCTCTCTAACATAGCTCGTGCTGGAAGTGCCATTGAAGAGCTCTATGGATCTCCACAAGACATTGAAGGAGTAATAAGGGACGGTAAACTCTATGTGGTTCAGACAAGGCCTCAGATGTAA

MeSRD氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：

MSNSIGHNLFQQSLIRPASFKHGSNLNSSGIPASYLFQSASVSRGLQISRSPISSSFYGKNLRVRKSKLAVVNPRPAITIPRAILAMDPASQLLGKFNLDGNVELQVFVSSHTSASTVQVHIQITCTSDSLLLHWGGKHDRKENWVLPSRYPDGTKNYKSRALRSPFVKSGSSSYLKIEIDDPAIQALEFLILDEAHNKWFKNNGDNFHVKLPAREKLIIPNISVPEELVQVQAYLRWERNGKQMYTPEQEKKEYEAARIELLEEVAKGTSIEGLRARLTNKNEIKESSVSKTQSKIHAQAHRRWEKSTTSNERFQRNQRDLAQLVTKSATKKSAEEAVSVEPKPKALKAVELFAKEKEERVGGAVLNKKIFKLQDAELLVLVTKPADKMKVYVATDFKEPVTLHWALSRKGKEWLAPPPSVLPPGSVSLNEAAETQLKSISSTELSYQVQYFETEIEENFVGMPFVLFSNEKWIKNKGSDFYVELSGGPRPVQKDAGDGRGTAKVLLDTIAELESEAQKSFMHRFNIAADLMEDAKDAGELGFAGILVWMRFMATRQLIWNKNYNVKPREISKAQDRLTDLLQNTYTSHPQYRELLRMIMSTVGRGGEGDVGQRIRDEILVIQRNNDCKGGMMEEWHQKLHNNTSPDDVVICQALMDYIKSDLDISVYWKTLNENGITKERLLSYDRAIHSEPSFRRDQKDGLLRDLGNYMRSLKAVHSGADLESAIANCMGYKDEGQGFMVGVQINPISGLPSGFPELLRFVLKHVEDRNVEALLEGLLEARQELRPLLFKSNNRLKDLLFLDIALDSTVRTAIERGYEELNDAGPEKIMYFITLVLENLALSSDDNEEFVYCLKGWNYALSMSKSKSNHWALYAKSVLDRTRLALASKAEWYQQVLQPSAEYLGSLLGVDQWAVNIFTEEIVRAGSAAAVSLLLNRLDPVLRKTAHLGSWQVISPVEAAGYVVVVDELLTVQNLSYDRPTILVARRVSGEEEIPDGTVAVLTSDMPDVLSHVSVRARNSKVCFATCFDHNILDNLRANEGKLLNLKPTSADIVYSVIEGELADLSSNKLKEVGPSPIKLIRKQFSGRYAISSEEFTGEMVGAKSRNIAHLKGKVPSWIGIPTSVALPFGVFEKVLSDGSNQEVAKKLEVLKKQLEGGESSVLRRIRETVLQLAAPPQLVQELKTKMKSSGMPWPGDEGEQRWEQAWMAIKKVWASKWNERAYFSTRKVKLDHDYLCMAVLVQEIINADYAFVIHTTNPSSGDSSEIYAEVVKGLGETLVGAYPGRALSFICKKKDLNSPQVLGYPSKPIGLFIRRSIIFRSDSNGEDLEGYAGAGLYDSVPMDEEEKVVLDYSYDPLITDESFRKSILSNIARAGSAIEELYGSPQDIEGVIRDGKLYVVQTRPQM*

實施例2、MeSRDRNAi載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因木薯的獲得

本發(fā)明人首先通過選擇MeSRD(pdm02348)基因特異性片段(741-1193bp)，構(gòu)建了特異性抑制MeSRD表達的RNA interference(RNAi)雙元載體：pPCaMV35S::SRDRNAi。

本發(fā)明人首先通過選擇MeSRD(pdm02348)基因特異性片段(741-1193bp)，構(gòu)建了特異性抑制MeSRD表達的RNA interference(RNAi)雙元載體：pPCaMV35S::SRDRNAi。

以木薯(manihot utilissima)基因組為模板，以5’-ATGGTACCCCCAGAACAAGAAAAGAAAGAA-3’(SEQ ID NO:3)和5’-CTATCGATAA ATCAGTGGCAACATAAACCT-3’(SEQ ID NO:4)擴增獲得MeSRD(pdm02348)基因特異性片段(741-1193bp)，將擴增的MeSRD(741-1193bp)正向片段插入到pRNAi-dsAC1雙元載體(參見Biotechnology and Bioengineering,Vol.108,No.8,August,2011，1925-1935)的KpnI/ClaI酶切位點中；以5’-ATGGATCCCCCAGAACAAGAAAAGAAAGAA-3’(SEQ ID NO:5)和5’-CTCTCGAGAAATCAGTGGCAACATAAACCT-3’(SEQ ID NO:6)為引物，擴增獲得MeSRD(pdm02348)基因特異性片段(741-1193bp)，將擴增的MeSRD(741-1193bp)反向重復(fù)片段插入到前述已經(jīng)插入了正向片段的pRNAi-dsAC1雙元載體的XhoI/BamHI酶切位點中，獲得包含有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNAi重組載體。

將構(gòu)建好的RNAi重組載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，再通過農(nóng)桿菌侵染木薯脆性懸浮愈傷，侵染后的愈傷組織通過再生、篩選等過程得到陽性植株，將pPCaMV35S::SRDRNAi轉(zhuǎn)基因木薯記作SRDRNAi，縮寫為G1i。

實施例3、MeSRDRNAi轉(zhuǎn)基因木薯的分子鑒定

通過農(nóng)桿菌介導的木薯懸浮愈傷轉(zhuǎn)化共獲得pPCaMV35S::SRDRNAi陽性轉(zhuǎn)基因木薯G1i-1、5、12、16、17等共20個株系，隨后通過Southern blot篩選最后獲得單拷貝轉(zhuǎn)基因植株為G1i-12、17、18、22、23等共十一個株系。

(1)基因表達水平鑒定

為了驗證RNA干擾的效果，本發(fā)明人以5’-ACCTCTGCATGGCTGTCCTGGTT-3’(SEQ ID NO:7)和5’-GCACGGCCGGGATAGGCTCC-3’(SEQ ID NO:8)為引物，通過Real-time RT-PCR對單拷貝植株中MeSRD的表達水平進行分析。

結(jié)果表明，在大多數(shù)pPCaMV35S::SRDRNAi單拷貝轉(zhuǎn)基因木薯中，MeSRD的表達量都被明顯下調(diào)，其中以G1i-2、12、18、28、31下調(diào)最為明顯，相對于野生型木薯TMS60444，在G1i-12轉(zhuǎn)基因株系中MeSRD的表達量減少了90％，如圖3。

(2)蛋白水平表達鑒定

雖然目標基因在表達水平上受到了強烈的抑制，但在蛋白水平上是否也受到抑制，需要進一步的證明。本發(fā)明人針對MeSRD特異性的蛋白片段設(shè)計抗原多肽并成功獲得了木薯MeSRD的兔源多克隆抗體。收獲野生型木薯及MeSRD基因表達明顯下調(diào)的三個單拷貝轉(zhuǎn)基因木薯(G1i-12、G1i-17、G1i-28)大小一致的葉片，提取總蛋白后，進一步通過Western blot檢測MeSRD的蛋白量。以Rubisco為蛋白上樣量內(nèi)參，以野生型木薯TMS60444為對照(WT)；蛋白提取材料為溫室木薯植株的成熟葉片。

結(jié)果表明，在野生型中有MeSRD的目的條帶，大小約在140kD，與預(yù)測的MeSRD大小一致；在轉(zhuǎn)基因植株G1i-12、17、18中并沒有MeSRD的目的條帶，說明本發(fā)明人通過RNAi的手段不僅降低了目的基因的表達水平，同時也成功降低了目的基因的蛋白量，如圖4。

上述結(jié)果表明，成功獲得了MeSRD的表達被有效干擾的MeSRDRNAi轉(zhuǎn)基因木薯。

實施例4、MeSRD在葉片臨時性淀粉含量的調(diào)節(jié)

分別在上海五厙中試試驗田自然條件下培養(yǎng)野生型木薯TMS60444和SRDRNAi轉(zhuǎn)基因木薯。分別取光周期中6:00、12:00、18:00、0:00的成熟葉片，先用甲醇除去可溶性的多糖，烘干后通過Total Starch(K-TSTA，Megazyme)試劑盒測定葉片中的淀粉含量。結(jié)果如圖5，野生型木薯的葉片在光周期開始時，淀粉含量逐漸上升，6:00到12:00之間淀粉迅速積累，12:00到18:00之 間，淀粉積累速率變得相對緩慢，到光周期結(jié)束時淀粉含量達到最高，約為2％；當暗周期開始時，淀粉開始降解，淀粉含量逐漸下降，在整個暗周期中淀粉的降解速率基本保持不變，到暗周期末(6:00)時淀粉基本被完全降。而在SRDRNAi轉(zhuǎn)基因木薯的葉片中，淀粉含量在光周期中一直保持在較高的水平，約為11％，其淀粉含量在光周期中的變化中的波動性也沒有規(guī)律。

取暗周期結(jié)束后不同發(fā)育時期的野生型及轉(zhuǎn)基因木薯葉片，經(jīng)過酒精脫色后，用0.2％的碘液染色，發(fā)現(xiàn)野生型葉片不能著色，而轉(zhuǎn)基因木薯不同時期的葉片都明顯變藍，說明野生型木薯葉片在暗周期末不再積累淀粉，而轉(zhuǎn)基因木薯葉片仍然含有大量的淀粉，如圖6。

實施例5、MeSRD對葉片臨時性淀粉形態(tài)的影響

分別在上海五厙中試試驗田自然條件下培養(yǎng)野生型木薯TMS60444和SRDRNAi轉(zhuǎn)基因木薯，培養(yǎng)至收獲期。分別提取野生型木薯TMS60444及SRDRNAi轉(zhuǎn)基因木薯葉片中淀粉，通過掃描電鏡(SEM)觀察葉片及塊根中的淀粉形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉片中的淀粉呈現(xiàn)圓餅狀，野生型木薯葉片中淀粉直徑約為2-3μm，而SRDRNAi轉(zhuǎn)基因植株中淀粉粒普遍變大，大部分淀粉直徑可達5μm以上，在部分MeSRD表達下調(diào)的轉(zhuǎn)基因植株G1i-12、17中淀粉的直徑最高可達10μm左右，如圖7。

淀粉粒的增大不但可降低淀粉提取工藝的成本，同時也更接近綠豆、谷物來源的小淀粉顆粒。

實施例6、MeSRD對葉片臨時性淀粉磷酸化程度的調(diào)節(jié)

分別在上海五厙中試試驗田自然條件下培養(yǎng)野生型木薯TMS60444和SRDRNAi轉(zhuǎn)基因木薯，培養(yǎng)至收獲期。收集光周期末成熟木薯葉片，提取葉片中淀粉，酸水解后通過HPAEC-PAD分析其水解液中的葡萄糖-6-磷酸的含量。

色譜圖顯示，G-6-P及G-3-P的標準品分別在22.7min及24.2min分鐘出現(xiàn)洗脫峰，在野生型木薯的葉片臨時性淀粉水解液中也檢測到明顯的G-6-P及G-3-P的洗脫峰。與其他物種中類似，G-3-P的含量明顯小于G-6-P的含量，而在RNAi轉(zhuǎn)基因植株的葉片臨時性淀粉中G-6-P洗脫峰變的非常微弱，約為 野生型木薯的0.5％，說明木薯中MeSRD也具有催化淀粉中葡萄糖殘基C-6位磷酸化的功能，如圖8。MeSRDRNAi轉(zhuǎn)基因木薯植株中以G1i-12、17、18中淀粉的磷酸化程度下調(diào)最為明顯，約為1ng/mg淀粉，G1i-28、31其次，分別為7ng/mg淀粉和15ng/mg淀粉，而野生型葉片中淀粉磷酸化水平為20ng/mg淀粉，其磷酸化水平基本與MeSRD基因的表達水平成正相關(guān)，如圖9所示。

實施例7、MeSRD對葉片臨時性淀粉中直鏈淀粉含量的調(diào)節(jié)

隨著葉片中淀粉形態(tài)的改變，其直鏈淀粉含量也發(fā)生了明顯的變化。

分別在上海五厙中試試驗田自然條件下培養(yǎng)野生型及SRDRNAi轉(zhuǎn)基因木薯，培養(yǎng)至收獲期。測定葉片臨時性淀粉中直鏈淀粉含量。

測定方法：木薯淀粉中直鏈淀粉含量的測定參考中華人民共和國國家標準GB/T 15683-2008/ISO 6647-1：2007。主要步驟為：稱取50mg±0.5mg木薯淀粉、直鏈淀粉標樣(Sigma，St.Louis，MO，USA)和支鏈淀粉標樣(Sigma，St.Louis，MO，USA)于試管中，加入500μL 95％乙醇將粘在試管內(nèi)壁上的樣品沖下，輕輕搖勻并加入4.5mL 1.0M氫氧化鈉溶液混勻后沸水浴10min以上直至淀粉樣完全分散，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中定容；同時按相同步驟制備不加任何淀粉樣的空白對照；利用定容的直鏈淀粉和支鏈淀粉標樣配制直鏈淀粉含量為0、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％的系列標準含量溶液各1mL備用；8mL 2％碘液稀釋后加4mL 1.0M HAC溶液并定容至200mL即為淀粉顯色液，現(xiàn)配現(xiàn)用，同一批樣品使用相同的顯色液；空白對照、木薯淀粉樣、標準含量溶液各取100μL加入1mL淀粉顯色液中混勻顯色，空白對照取4次，其它樣品取3次，顯色后在分光光度計Libra S22(Biochrom Ltd.，UK)上進行720nm波長OD值測量；利用標準含量溶液在720nm處的吸光度值進行一元線性回歸并求取相關(guān)系數(shù)，建立直鏈淀粉含量與吸光度的方程式，將待測木薯淀粉樣吸光度代入方程式求取其直鏈淀粉含量。

結(jié)果如圖10，相對于野生型木薯葉片臨時性淀粉，在轉(zhuǎn)基因植株葉片中直鏈淀粉的含量有非常明顯的上升，野生型木薯葉片中直鏈淀粉含量約有9％，SRDRNAi轉(zhuǎn)基因植株葉片臨時性淀粉中直鏈淀粉的含量上升到22-37％，與塊 根儲存性淀粉種直鏈淀粉的含量相近。

實施例8、MeSRD對葉片臨時性淀粉熱力學性質(zhì)的調(diào)節(jié)

差示熱值掃描(Differential Scanning Calorimetry，DSC)是測定在加熱過程中淀粉的吸熱能力的一種熱力學手段，淀粉的吸熱能力主要受到淀粉直鏈淀粉含量、淀粉結(jié)晶度、支鏈淀粉鏈長分布等方面的影響。在上海五厙中試試驗田自然條件下培養(yǎng)野生型及SRDRNAi轉(zhuǎn)基因木薯，培養(yǎng)至收獲期，進行熱力學性質(zhì)測定。

熱力學性質(zhì)測定方法為：使用Q2000差示掃描量熱儀(TA Instruments，Norwalk，CT，USA)作淀粉樣品糊化熱力學分析。將樣品(10mg淀粉加30μL水，以空盤作為空白對照)密封在氧化鋁坩堝內(nèi)，室溫平衡24h后，以10℃/min的速度，由30℃升溫至95℃，掃描熱量變化。數(shù)據(jù)使用Universal Analysis軟件進行分析。

結(jié)果如表1，SRDRNAi轉(zhuǎn)基因植株中，葉片臨時性淀粉To(起始糊化溫度)、Tp(峰值糊化溫度)與野生型葉片臨時性淀粉沒有明顯差異，但Tc(表示結(jié)束糊化溫度)、ΔH(糊化焓)明顯提高，其中ΔH要比野生型高四倍左右。

表1野生型及轉(zhuǎn)基因木薯葉片中淀粉的熱力學性質(zhì)參數(shù)

注：圖中所示數(shù)據(jù)均為3次實驗重復(fù)的平均值±標準差。每組數(shù)據(jù)中標有相同字母(a，b，c，d，e)的值表示在此條件下各測定值之間差異不顯著(p<0.05)。

實施例9、MeSRD對葉片臨時性淀粉結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)

在上海五厙中試試驗田自然條件下培養(yǎng)野生型及SRDRNAi轉(zhuǎn)基因木薯，培養(yǎng)至收獲期，收集木薯葉片，并從葉片中提取臨時性淀粉，利用X射線衍射儀測定葉片臨時性淀粉的衍射圖譜。

淀粉XRD衍射圖譜可以分為A、B、C、V型淀粉，一般認為淀粉的XRD衍射圖譜由結(jié)晶區(qū)的衍射峰及非結(jié)晶區(qū)的背景峰組成。野生型木薯葉片中的淀粉XRD圖譜顯示其衍射圖譜有多個結(jié)晶區(qū)特征峰，但非結(jié)晶區(qū)的背景峰比較弱，預(yù)示野生型葉片中的臨時性淀粉非結(jié)晶區(qū)比較少，結(jié)晶度比較高；而SRDRNAi轉(zhuǎn)基因植株葉片中的臨時性淀粉與普通淀粉一樣有結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)組成，其衍射峰主要表現(xiàn)為15°，17°，23°衍射峰，為標準的C型淀粉，與儲存性淀粉的衍射圖譜相近，如圖11。

此外，葉片臨時性淀粉通過異淀粉酶(Isoamylase)水解后，利用HPAEC-PAD分析其水解液中的葡聚糖成分。

如圖12，分析結(jié)果顯示，野生型木薯葉片臨時性淀粉中最短的葡聚糖鏈為DP6，在DP11-12及DP45處有兩個峰，DP18-20處有一個肩峰。不同于木薯葉片淀粉的鏈長分布，塊根儲存性淀粉中短鏈含量增加(2.2％)、中鏈含量降低(-0.8％)。轉(zhuǎn)基因植株葉片淀粉與野生型相比，其鏈長分布變化趨勢與塊根淀粉變化相似：其短鏈(DP6-14)有明顯的上升，最高可提高0.4％；中鏈部分(DP20-37)有明顯的下降，約-0.2％左右。

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