本發(fā)明涉及基因編輯領(lǐng)域，具體涉及一種谷氨酸棒狀桿菌的基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

基因編輯技術(shù)出現(xiàn)自20世紀(jì)90年代，指外源DNA與受體細(xì)胞基因組通過(guò)重組方式對(duì)受體細(xì)胞基因組目標(biāo)基因進(jìn)行突變，從而產(chǎn)生目的突變株。基因編輯需要依賴于包括同源重組、特異位點(diǎn)重組和轉(zhuǎn)座重組等DNA重組系統(tǒng)。

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/Cas系統(tǒng)作為細(xì)菌和古細(xì)菌的獲得性免疫系統(tǒng)，通過(guò)RNA介導(dǎo)，特異性的切割外源遺傳物質(zhì)，用以對(duì)抗入侵的病毒和質(zhì)粒。隨著近兩年的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為一套精確的打靶系統(tǒng)，通過(guò)CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的打靶系統(tǒng)可以試驗(yàn)快速高效的基因敲除、基因敲入、基因沉默。目前該技術(shù)已成功應(yīng)用到大腸桿菌、斑馬魚(yú)、擬南芥、釀酒酵母等物種中。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)發(fā)揮基因編輯的作用是建立在由CRISPR 轉(zhuǎn)錄來(lái)的trancrRNA 與crRNA 形成一個(gè)tracrRNA-crRNA 復(fù)合體，接著該復(fù)合體與Cas9 蛋白結(jié)合，并在crRNA 的引導(dǎo)下識(shí)別靶位點(diǎn)；而對(duì)目的片段的切割是由crRNA 上長(zhǎng)度為20 bp 的向?qū)蛄?Guiding sequence)與目的DNA上的特定序列互補(bǔ)來(lái)引導(dǎo)Cas9 蛋白對(duì)目的基因的切割；除此之外，在所識(shí)別的目的DNA 上還必須有一個(gè)3′堿基(NGG)組成的PAM (protospacer adjacent motif)區(qū)域，識(shí)別區(qū)域緊跟PAM 的5′端。

谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium. glutamicum）是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，其DNA含有大約56%的GC。該菌在過(guò)去的50多年里被廣泛用于氨基酸的生產(chǎn)，比如谷氨酸、賴氨酸等，還被用于食品工業(yè)、動(dòng)物飼料和醫(yī)藥產(chǎn)品的生產(chǎn)。普遍認(rèn)為C. glutamicum無(wú)致病性，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，因而是一種安全的醫(yī)藥蛋白表達(dá)宿主。

用于工業(yè)生產(chǎn)的谷氨酸棒狀桿菌菌株主要通過(guò)傳統(tǒng)誘變獲得。隨著，C. giutamicum ATCC 13032和C. giutamicum ATCC 14067全基因組的測(cè)序，通過(guò)基因工程手段定向改造谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)氨基酸越來(lái)越受到重視。

目前，只有pKl8mobsacB/pKl9mobsacB等少數(shù)幾個(gè)用于谷氨酸棒狀桿菌基因編輯的載體，但上述載體的基因編輯效率低下。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種谷氨酸棒狀桿菌的基因編輯系統(tǒng)，其具有較高的基因編輯效率。

一種谷氨酸棒狀桿菌的基因編輯系統(tǒng)，所述谷氨酸棒狀桿菌中待編輯的目的基因具有5′-（N₂₀）-NGG-3′結(jié)構(gòu)，N為A、T、C或G，其特征在于：

所述基因編輯系統(tǒng)包括cas9表達(dá)載體和sgRNA表達(dá)載體；

所述cas9表達(dá)載體包括cas9序列和SD序列，所述cas9序列如SEQ ID No.1所示，所述SD序列如SEQ ID No.2所示、并連接在cas9序列的始密碼子ATG前；

所述sgRNA表達(dá)載體的包含sgRNA序列和同源修復(fù)序列，所述sgRNA序列為crRNA與trancrRNA 連接形成的復(fù)合體序列，所述trancrRNA序列如SEQ ID No.3所示，所述crRNA序列為20bp的引導(dǎo)序列、與目的基因的N₂₀序列相同。

進(jìn)一步的，所述cas9表達(dá)載體的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

進(jìn)一步的，所述cas9表達(dá)載體由以下方法制備得到：a、合成由SD序列和cas9序列連接形成的復(fù)合體序列，并在復(fù)合體序列的兩端引入HindⅢ酶切識(shí)別序列、EcoRⅠ酶切識(shí)別序列；b、將帶有酶切識(shí)別序列的復(fù)合體序列以及pXMJ19載體分別酶切、純化后進(jìn)行連接，得到所述cas9表達(dá)載體。

進(jìn)一步的，所述同源修復(fù)序列由目的基因上游序列、目的基因編輯后形成的序列、目的基因下游序列依次連接形成，所述目的基因上游序列、目的基因下游序列長(zhǎng)度為300bp~1500bp。

更進(jìn)一步的，當(dāng)所述目的基因編輯為敲除時(shí)，所述同源修復(fù)序列由目的基因上游序列和目的基因下游序列連接形成。

進(jìn)一步的，所述sgRNA表達(dá)載體由以下方法制備得到：a、合成sgRNA序列，并在sgRNA兩端引入EcoRⅠ酶切識(shí)別序列、XbaⅠ酶切識(shí)別序列；b、將帶有酶切識(shí)別序列的sgRNA序列以及pECXK-99載體分別酶切、純化后進(jìn)行連接，得到pFST-1載體；c、合成同源修復(fù)序列，并在同源修復(fù)序列兩端引入BglⅡ酶切識(shí)別序列或者同源重組位點(diǎn)；d、將帶有酶切識(shí)別序列的同源修復(fù)序列以及pFST-1載體分別酶切、純化后進(jìn)行連接或者同源重組組裝，得到所述sgRNA表達(dá)載體。

上述基因編輯系統(tǒng)在谷氨酸棒狀桿菌中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括基因敲除和基因替換。

上述應(yīng)用的具體操作如下：

a、將cas9表達(dá)載體和sgRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌；

b、培養(yǎng)、篩選，獲得轉(zhuǎn)化子。

本發(fā)明構(gòu)建的基因編輯系統(tǒng)即利用crispr/cas9技術(shù)，利用人工設(shè)計(jì)的sgRNA結(jié)合cas9蛋白對(duì)基因組靶點(diǎn)位置切割，形成雙鏈斷裂缺口；同時(shí)提供同源修復(fù)序列，以達(dá)到基因敲除，基因插入和基因替換的目的；其中，SD序列的涉及使得cas9蛋白能夠在谷氨酸棒桿菌中順利表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明構(gòu)建的基因編輯系統(tǒng)對(duì)谷氨酸棒狀桿菌基因組進(jìn)行編輯，具有周期短，節(jié)省成本效率高等優(yōu)點(diǎn)；并且使用該系統(tǒng)對(duì)谷氨酸棒狀桿菌基因編輯效率能達(dá)到100%。

附圖說(shuō)明

圖1為pXMJ19的質(zhì)粒圖譜。

圖2為cas9表達(dá)載體的質(zhì)粒圖譜。

圖3為pECXK-99的質(zhì)粒圖譜。

圖4為sgRNA表達(dá)載體的質(zhì)粒圖譜。

圖5為同源修復(fù)序列的設(shè)計(jì)示意圖。

圖6為porb基因敲除后基因型驗(yàn)證結(jié)果，其中，泳道M: marker DL10,000；泳道1-6: 敲除菌株基因型驗(yàn)證結(jié)果；泳道7: 陽(yáng)性對(duì)照；泳道8: 陰性對(duì)照野生型菌株基因型。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例或應(yīng)用例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例或應(yīng)用例中所用的材料、試劑，基因合成等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。

下述實(shí)施例或應(yīng)用例中所用載體骨架pXMJ19及pECXK-99均購(gòu)自Addgene。

下述實(shí)施例或應(yīng)用例中所用大腸桿菌DH5α購(gòu)買(mǎi)自TAKARA。

下述實(shí)施例或應(yīng)用例中所用谷氨酸棒狀桿菌C. glutamicum ATCC13032購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。

下述實(shí)施例或應(yīng)用例中所用連接液solution Ⅰ購(gòu)買(mǎi)自TaKaRa公司，貨號(hào) D6020A。

下述實(shí)施例或應(yīng)用例中所用Gibson Assembly Master Mix溶液購(gòu)買(mǎi)自NEB( New England Biolabs)公司，貨號(hào)E2611S。

下述實(shí)施例或應(yīng)用例中大腸桿菌的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，去離子水1L。

下述實(shí)施例或應(yīng)用例中谷氨酸棒狀桿菌的培養(yǎng)使用LBB培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，腦心浸液10g、去離子水1L。

實(shí)施例1：一種谷氨酸棒狀桿菌的基因編輯系統(tǒng)

1、cas9表達(dá)載體

cas9表達(dá)載體，其制備過(guò)程如下：

a、合成由SD序列和cas9序列連接形成的復(fù)合體序列，并在復(fù)合體序列的兩端引入HindⅢ酶切識(shí)別序列、EcoRⅠ酶切識(shí)別序列，SD序列、cas9序列分別如SEQ ID No.2和SEQ ID No.1所示。

b、將帶有酶切識(shí)別序列的復(fù)合體序列以及pXMJ19載體分別酶切、純化后進(jìn)行連接，得到cas9表達(dá)載體。

酶切、純化連接體系如下：20μL反應(yīng)體系中含有限制性內(nèi)切酶HindⅢ、EcoRⅠ各1μL，含有待酶切的復(fù)合體及pXMJ19載體0.8ng，pXMJ19的質(zhì)粒圖譜如圖1所示，37℃反應(yīng)30min；0.7%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，膠回收試劑盒純化，即得到酶切純化后的復(fù)合體序列以及pXMJ19載體片段；純化后的復(fù)合體序列和pXMJ19載體片段摩爾比3:1，連接液Solution I 5μL，無(wú)菌水補(bǔ)齊到10μL ，16℃反應(yīng)1h，熱擊轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞；均勻涂布于含有30μg/mL氯霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)16h；挑選陽(yáng)性克隆子，提取質(zhì)粒即為cas9表達(dá)載體。

2、sgRNA表達(dá)載體

sgRNA表達(dá)載體，其制備過(guò)程如下：

a、合成由crRNA序列和trancrRNA序列連接形成sgRNA序列，并在sgRNA序列兩端引入EcoRⅠ、XbaⅠ酶切酶切識(shí)別序列，crRNA序列為20bp的引導(dǎo)序列、并與目的基因中5′-（N₂₀）-NGG-3′結(jié)構(gòu)的N₂₀序列相同，trancrRNA序列如SEQ ID No.3所示。

b、將帶有酶切識(shí)別序列的sgRNA序列以及pECXK-99載體分別酶切、純化后進(jìn)行連接，得到pFST-1載體。

酶切純化連接體系如下：20μL反應(yīng)體系中含有限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XbaⅠ各1μL，含有待酶切的sgRNA片段及pECXK-99載體0.8ng，37℃反應(yīng)30min；0.7%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，膠回收試劑盒純化，即得到酶切純化后的sgRNA片段及pECXK-99載體片段；純化后的sgRNA片段和pECXK-99載體片段摩爾比3:1，連接液Solution I 5μL，無(wú)菌水補(bǔ)齊到10μL ，16℃反應(yīng)1h，熱擊轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞；均勻涂布于含有30μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)16h；挑選陽(yáng)性克隆子，提取質(zhì)粒即為pFST-1載體。

c、根據(jù)目的不同設(shè)計(jì)不同的同源修復(fù)序列，設(shè)計(jì)方法依據(jù)圖5所示，若實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除，構(gòu)建由目的基因上游序列和目的基因下游序列融合連接形成的同源修復(fù)序列，目的基因上、下游序列長(zhǎng)度為300bp~1500bp，并在同源修復(fù)序列兩端引入BglⅡ酶切識(shí)別序列，其中，目的基因的原序列中具有5′-（N₂₀）-NGG-3′結(jié)構(gòu)；將帶有酶切識(shí)別序列的同源修復(fù)序列以及pFST-1載體分別酶切、純化后進(jìn)行連接，得到sgRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α。

構(gòu)建體系如下：根據(jù)目的基因基因組序列設(shè)計(jì)引物，分別擴(kuò)增目的基因上游序列和目的基因下游序列，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為300bp~1500bp，兩個(gè)片段的中間引物設(shè)計(jì)融合位點(diǎn)，可以通過(guò)融合pcr的方法融合兩個(gè)片段，并在兩端引物上引入BglⅡ酶切識(shí)別序列。20μL反應(yīng)體系中含有限制性內(nèi)切酶BglⅡ1μL，含有待酶切的同源修復(fù)序列片段及pFST-1載體0.8ng，37℃反應(yīng)30min；0.7%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，膠回收試劑盒純化，即得到酶切純化后的同源修復(fù)序列片段及pFST-1載體片段；純化后的同源修復(fù)序列片段與pFST-1載體片段摩爾比3:1，連接液Solution I 5μL，無(wú)菌水補(bǔ)齊到10μL ，16℃反應(yīng)1h，熱擊轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞；均勻涂布于含有30μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)16h；挑選陽(yáng)性克隆子，提取質(zhì)粒即為sgRNA表達(dá)載體。

d、若實(shí)現(xiàn)目的基因的替換，構(gòu)建目的基因上游、目的基因編輯后形成的序列和目的基因下游序列連接形成的同源修復(fù)序列，目的基因上、下游序列長(zhǎng)度為300bp~1500bp，并在同源修復(fù)序列兩端引入載體pFST-1 位于BglⅡ酶切位點(diǎn)兩端的同源序列，其中，目的基因的原序列中具有5′-（N₂₀）-NGG-3′結(jié)構(gòu)。將同源修復(fù)序列以及pFST-1載體利用Gibson Assembly Master Mix溶液進(jìn)行組裝，得到sgRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α。

構(gòu)建體系如下：根據(jù)目的基因基因組序列設(shè)計(jì)引物，分別擴(kuò)增目的基因上游片段、目的基因編輯后形成的序列、目的基因下游片段，目的基因上、下游片段長(zhǎng)度為300bp~1500bp，每?jī)蓚€(gè)片段中間設(shè)計(jì)同源位點(diǎn)，可以通過(guò)Gibson Assembly Master Mix溶液進(jìn)行組裝，其中組裝后片段兩端要包含pFST-1位于 BglⅡ酶切位點(diǎn)兩端的同源序列，以便于將片段組裝到載體pFST-1上。20μL反應(yīng)體系中含有限制性內(nèi)切酶BglⅡ1μL，含有待酶切的pFST-1載體0.8ng，37℃反應(yīng)30min；0.7%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，膠回收試劑盒純化，即得到酶切純化后pFST-1載體片段；純化后的pFST-1載體片段、目的基因上游片段、目的基因編輯后形成序列、目的基因下游片段摩爾比1:3:3:3:3， Gibson Assembly Master Mix溶液 10μL，無(wú)菌水補(bǔ)齊到20μL ，50℃反應(yīng)1h；熱擊轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞；均勻涂布于含有30μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)16h；挑選陽(yáng)性克隆子，提取質(zhì)粒即為sgRNA表達(dá)載體。

3、基因編輯

基因編輯過(guò)程如下：

a、提取cas9表達(dá)載體和sgRNA表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌；b、培養(yǎng)、篩選，獲得轉(zhuǎn)化子。

基因編輯具體包括基因敲除和基因替換，如圖5所示，其中B為待編輯的目的基因，A、C為待編輯的目的基因兩端的同源片段，D為替換后的基因。

應(yīng)用例1：porb基因的敲除

一種谷氨酸棒狀桿菌的porb基因敲除系統(tǒng)，包括cas9表達(dá)載體和sgRNA表達(dá)載體。

1、cas9表達(dá)載體

cas9表達(dá)載體的制備方法如實(shí)施例1中所示。

cas9表達(dá)載體的質(zhì)粒圖譜如圖2所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，其中9359-10678位的核苷酸序列為乳糖操作子，9359-10330位的核苷酸序列為乳糖操縱子中的lacIq基因，10514-10678位的核苷酸為乳糖操縱子中的tac啟動(dòng)子；11-25位核苷酸序列為促進(jìn)翻譯的SD序列； 26-4132位核苷酸序列cas9序列，即針對(duì)谷氨酸棒狀桿菌密碼子優(yōu)化過(guò)的cas9編碼基因；4144-4569位核苷酸序列為調(diào)控cas9基因轉(zhuǎn)錄的終止子rrnb ；8487-9306位核苷酸序列為氯霉素抗性基因；5044-5616位核苷酸序列為大腸桿菌復(fù)制子ori PUC；5801-8355位核苷酸序列為谷氨酸棒狀桿菌復(fù)制子PBL1。

2、sgRNA表達(dá)載體

sgRNA表達(dá)載體，其制備方法如下：

a、制備pFST-1

根據(jù)谷氨酸棒狀桿菌基因組序列（NCBI Reference Sequence: NC_003450.3），針對(duì)porb基因?qū)ふ?′-（N₂₀）-NGG-3′結(jié)構(gòu)， porb基因正義鏈的靶點(diǎn)序列、以及針對(duì)靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)的crRNA、sgRNA序列分別如下所示：

靶點(diǎn)序列為：

GGAGGATAGGTTTGCGAAGTCGG；

crRNA序列為：

GGAGGATAGGTTTGCGAAGT，對(duì)應(yīng)序列表中SEQ ID No.5；

sgRNA序列為：

GGAGGATAGGTTTGCGAAGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT，對(duì)應(yīng)序列表中SEQ ID No.6；

其中，sgRNA交由基因公司合成，同時(shí)在sgRNA序列兩端引入EcoRⅠ和XbaⅠ酶切識(shí)別序列，sgRNA片段和pECXK-99分別EcoRⅠ、XbaⅠ酶切，然后純化、連接，pECXK-99的質(zhì)粒圖譜如圖3所示，獲得pFST-1，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α。

b、制備帶有酶切識(shí)別序列的同源修復(fù)序列

根據(jù)porb基因序列設(shè)計(jì)帶有酶切識(shí)別序列的同源修復(fù)序列porb LR，同源修復(fù)序列porb LR由porb基因的上游同源片段porb-L、下游同源片段porb-R依次連接組成，其中porb-L、porb-R分別引入BglⅡ酶切識(shí)別序列。

上游同源片段porb-L的引物為：

porb L-F:5’GAGAGATCTGGAGTGGACAAGTCACGAT 3’；

porb L-R:5’TTGGAGGACATGCCACTGTGATGCCTGCGGTTGCT 3’。

下游同源片段porb-R的引物為：

porb R-F:5’ CACAGTGGCATGTCCTCCAACTTCTCTTCCTAAAA 3’ ；

porb R-R:5’GGCAGATCTGGGTGAACCTGTTTCTATC 3’。

分別擴(kuò)增porb-L和porb-R，然后采用融合pcr的方法融合形成porb LR， porb LR長(zhǎng)度為2068bp，融合后序列如SEQ ID No.7所示。

c、制備sgRNA表達(dá)載體

將帶有酶切識(shí)別序列的同源修復(fù)序列以及pFST-1載體分別BglⅡ酶切，然后純化、連接，得到sgRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α。

sgRNA表達(dá)載體的質(zhì)粒圖譜如圖4所示、其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，其中7777-9161位核苷酸序列為乳糖操縱子，7777-8859位核苷酸序列為乳糖操縱子中的lacIq基因，8916-9161位核苷酸序列為乳糖操縱子中的trc啟動(dòng)子；7-108位核苷酸序列為trancrRNA 與crRNA 形成一個(gè)tracrRNA-crRNA 復(fù)合體，即sgRNA序列；344-546位核苷酸序列為調(diào)控sgRNA轉(zhuǎn)錄終止的終止子T1和T2；3604-5671位核苷酸序列為同源修復(fù)模板；5705-6499位核苷酸序列為卡那霉素抗性基因；6664-7339位核苷酸序列為大腸桿菌復(fù)制子ori；1644-3107位核苷酸序列為谷氨酸棒狀桿菌復(fù)制子repA。

3、porb基因的敲除具體操作流程：

a、將cas9表達(dá)載體和sgRNA表達(dá)載體質(zhì)粒從E.coli中提出，各取1μg DNA共轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)，電擊轉(zhuǎn)化條件為1800v，50ms，恢復(fù)培養(yǎng)后涂布于含有氯霉素和卡那霉素的LBB固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)36h。

b、挑取平板上的單菌落，利用cas9基因引物；

cas9-F:5’ACAACTAATGGATAAAAAGTATTC 3’；

cas9-R:5’ TATGAATTCTTAGTCGCCACCCA 3’；

驗(yàn)證cas9表達(dá)載體是否正確轉(zhuǎn)入；

用同源片段引物porb L-F 和porb R-R驗(yàn)證sgRNA表達(dá)載體質(zhì)粒是否正確轉(zhuǎn)入。

c、挑選正確的轉(zhuǎn)化子，接種于LBB液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)到OD≈1，加入0.1mmIPTG誘導(dǎo)。

d、繼續(xù)培養(yǎng)12h，將培養(yǎng)物劃線與含有卡那霉素、氯霉素以及IPTG的固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h。

e、挑取平板上的單菌落用同源片段引物porb L-F 和porb R-R pcr驗(yàn)證獲得目的菌株，同時(shí)把擴(kuò)增出來(lái)的片段進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，最終根據(jù)基因型及測(cè)序結(jié)果挑選正確的菌株及porb基因敲除菌株，基因型驗(yàn)證結(jié)果如圖6所示。

實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明構(gòu)建的crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)對(duì)谷氨酸棒狀桿菌基因組進(jìn)行編輯，具有周期短，節(jié)省成本效率高等優(yōu)點(diǎn)，使用該系統(tǒng)對(duì)谷氨酸棒狀桿菌基因編輯效率能達(dá)到100%。

質(zhì)粒的除去，把挑選出的敲除菌株在不加抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，質(zhì)粒cas9表達(dá)載體和sgRNA表達(dá)載體即可除去。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種谷氨酸棒狀桿菌的基因編輯系統(tǒng)

<130> 2016

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4107

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggataaaa agtattccat tggcctggac atcggcacca attctgtggg ttgggcagtc 60

atcaccgacg aatacaaggt cccatccaag aagttcaagg tgctcggtaa taccgatcgc 120

cactctatca agaaaaacct gatcggcgcc ctgctcttcg actccggcga aaccgcagaa 180

gcaacccgtc tcaagcgtac cgcacgtcgc cgctacaccc gccgtaagaa tcgcatctgc 240

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catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 9960

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 10020

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 10080

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 10140

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 10200

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 10260

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 10320

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgca ccattcgatg gtgtcaacgt 10380

aaatgccgct tcgccttcgc gcgcgaattg caagctgatc cgggcttatc gactgcacgg 10440

tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg tggtatggct gtgcaggtcg 10500

taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc gttctggata atgttttttg 10560

cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc 10620

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<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggaggatagg tttgcgaagt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggaggatagg tttgcgaagt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tt 102

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggagtggaca agtcacgatc gttggaacac aacaggtttg cggcactcaa tgctgcgtca 60

tcaatttggt tggggtccgc taccccatca ccgtttgcat ccaatcccat aagtcgccac 120

gtttccggaa tgaactgcat gggacctacc gcgcgatcat attcagtatc gccatctaat 180

tccccaccat cagtgtcggg aatttccgca aaccccggtg aaccatcaag tggaacgccg 240

atgattggag gggttgcaac tccattttca tccagggaac tgcccccgaa cattttgccg 300

ttgtaggtac cgtgacgggt ttccacctgg ccgatacctg ccaaggtatt ccaccccaga 360

ttgcagccag accacgcagt actcgcaatg agctctgcgt ttccataagc cgcaatcgct 420

tgagcggaca caccagtatc ttgagcaatt ggttccgccc aaaaacgcaa atggtcggat 480

gtgcgtccat ctgcccctgt atcaatttgc ggaacttcta caccacgcgc cggcggaaca 540

tcttcaggga tttgctggag ttggcgaata ggtgccgttc catccatgaa gctaagcgcc 600

catccaacaa atgagatcac catgatgacg gccaaaaccg aaccgcatcc aaatcccatt 660

gcttttctaa cccctgaact catgagggtc gatgttaccg gctcgtttta gaactctcgc 720

attggctaga aaaacctgat tacttcacgc ctctttaagt aaaaaatcct gtgtctttct 780

aaccaaaaga cccaaaaaga cacgctaaat cagcctccta tgcaattagt agagcattca 840

catacaccgt gccaagacct aatttccacg actgaaactt caccaaatcc gcaggtagaa 900

actttgatga tctacatcac aaatttacaa tgtgtgatga gttgttcata taacccaagg 960

acttgaacct taaaaggagc cttagaatca tgaagctttc acaccgcatc gcagcaatgg 1020

cagcaaccgc aggcatcaca gtggcatgtc ctccaacttc tcttcctaaa aggttcgggg 1080

gtaaccccaa aaatcactta agccacaaca gtcacataaa tcacttcagt aacgtacgat 1140

tttggactgt tgtggctttt gccatattta tttcatttcc atctcagtga tctcttaagg 1200

aaacccatga agaaactacg tttcgccacc atcgcggccg ctaccgttgc cctgactgcg 1260

agcctttccc tctcagcttc cgcacaggac ttcaaccaaa tcatcgacaa ctttgattgt 1320

ggcatcctcc agaccgctat ctacaccacc ggtctggctc acgagaactc cactcgctca 1380

gagctcgctg ctaatctgcg caactccgca gctgtcggcc aactagactt cccattgaat 1440

atcgcggcta ccggctactc cgagcgcatc gctaaccgcg cactgacctg cggaatcgtg 1500

aaggaagatc cacaggactt cctctcccag ctgcagcttc tgtcctctaa cctatcttct 1560

tccttcttca ctgcttagtt tctcttgggc ttttccttga gcccacagcc gttgctgctc 1620

gacggtgtcc acaattccgg tggagccgtc gaacaggttc ggcgaacgag attgcatctt 1680

ggctacgaaa ctcgccgcca cgtcaaaaat gtcgaatcga ccctgacggg cggcgatttc 1740

tgcatgaaaa agcacctgca gcaaaacatc ccccagtgcg cttttcatgt gctcatcatc 1800

gccaccatga atcgcttcaa taaactcctg cgattcttct tccagatacg gaatcaaact 1860

ctcatgggtt tgcgtgcgtt cccactcgcc gcggcccacg gccgcccgca tgacgccgac 1920

ggcctcatgc aaagggttga ggggcgcgtc gataagcagc gtgctttgcg gttttgcggt 1980

gataaaccag gaggcgcttg tcgacgtctt gatcccccat ttttcaatat caaatggaaa 2040

atcgggatcg atagaaacag gttcaccc 2068

<210> 8

<211> 9167

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaattcggag gataggtttg cgaagtgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg 60

ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttc tagagtcgac 120

ctgcaggcat gcaagcttgg ctgttttggc ggatgagaga agattttcag cctgatacag 180

attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg cagtagcgcg 240

gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc cgatggtagt 300

gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat caaataaaac gaaaggctca 360

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gacaaatccg ccgggagcgg atttgaacgt tgcgaagcaa cggcccggag ggtggcgggc 480

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cctttttgcg tttctacaaa ctctttttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 600

ccgctcatga attaattccg ctagatgacg tgcggcttcg acctcctggg cgtggcgctt 660

gttggcgcgc tcgcggctgg ctgcggcacg acacgcgtct gagcagtatt ttgcgcgccg 720

tcctcgtggg tcaggccggg gtgggatcag gccaccgcag taggcgcagc tgatgcgatc 780

ctccactact gcgcgtcctc ctggcgctgc cgagcacgca gctcgtcggc cagctcttca 840

aggtcggcca caagcgtttc taggtcgctc gcggcacttg cccagtcgcg tgatgctggc 900

gcgtctgtcg tatcgagggc gcggaaaaat ccgatcaccg tttttaaatc gacggcggca 960

tcgagtgcgt cggactccag cgcgacatcg gagagatcca ccgctgatgc ttcaggccag 1020

ttttggtact tcgtcgtgaa ggtcatgaca ccattataac gaacgttcgt taaaaattct 1080

agccccaatt ctgataattt cttccggcac tcctgcgaaa acctgcgaga cttcttgccc 1140

agaaaaaacg ccaagcgcag cggttaccgc actttttttc caggtgattt caccctgacc 1200

agcgaagcgg cactttagtg catgaggtgt gcccctggtt tcccctcttt ggagggttca 1260

acccaaaaaa gcacacaagc aaaaatgaaa atcatcatga gcaagttggt gcgaagcagc 1320

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taaaaatcag gccggggagg aaccggggag ggatcagagc taggagcgag acaccctaaa 1500

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ggagggtgag ggcaagtgag agccagagca aggacgggac ccctaaaggg gggaaccgtt 1620

ttctgctgac ggtgtttcgt ttattagttt tcagcccgtg gacggccgcg tttagcttcc 1680

attccaagtg cctttctgac ttgttggatg cgcctttcac tgacacctag ttcgcctgca 1740

agctcacgag tcgagggatc agcaaccgat tgagaacggg catccaggat cgcagttttg 1800

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tgtcgcgtct cctgcgcata cttactttct gggtcagccc atctgcgtgc attcgatgta 1920

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aattccccac catcagtgtc gggaatttcc gcaaaccccg gtgaaccatc aagtggaacg 3840

ccgatgattg gaggggttgc aactccattt tcatccaggg aactgccccc gaacattttg 3900

ccgttgtagg taccgtgacg ggtttccacc tggccgatac ctgccaaggt attccacccc 3960

agattgcagc cagaccacgc agtactcgca atgagctctg cgtttccata agccgcaatc 4020

gcttgagcgg acacaccagt atcttgagca attggttccg cccaaaaacg caaatggtcg 4080

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cgcattggct agaaaaacct gattacttca cgcctcttta agtaaaaaat cctgtgtctt 4380

tctaaccaaa agacccaaaa agacacgcta aatcagcctc ctatgcaatt agtagagcat 4440

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tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gaccatg 9167