1.一種構建測序文庫的方法,其特征在于,包括:
(1)將mRNA打斷,以便獲得片段化mRNA;
(2)將所述片段化mRNA去磷酸化,以便獲得去磷酸化mRNA;
(3)將所述去磷酸化mRNA連接3’端接頭,以便獲得連接產物;
(4)將所述連接產物進行反轉錄,以便獲得cDNA;
(5)從所述cDNA分離單鏈DNA;以及
(6)將所述單鏈DNA進行環(huán)化,以便獲得環(huán)狀DNA,所述環(huán)狀DNA構成所述測序文庫。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法,其特征在于,其中,所述步驟(3)和所述步驟(4)是在同一容器中進行的。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法,其特征在于,所述步驟(1)的起始mRNA是采用去核糖體RNA方法從總RNA中分離純化獲得的,
任選地,所述去核糖體RNA方法包括:
將所述總RNA與oligo DNA進行退火處理,
將所述退火處理得到的產物進行RNaseH酶消化,
將所述RNaseH酶消化得到的產物進行DNase I酶消化,以及
將所述DNase I酶消化得到的產物進行磁珠純化,以便獲得所述mRNA,
其中,所述Oligo DNA是可與rRNA雜交的寡核苷酸單鏈片段,其長度為45-60bp,優(yōu)選為45-55bp。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法,其特征在于,所述步驟(5)是通過以下步驟進行的:
(a)向反轉錄產物中加入1M NaOH,在PCR儀上98℃反應20min,然后向得到的混合物中加入1M HCl;
(b)向步驟(a)中所得到的混合物中加入水,然后進行乙醇沉淀,并用1×TE重懸。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法,其特征在于,所述步驟(4)的反轉錄是采用攜帶生物素的引物進行的。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法,其特征在于,所述步驟(6)進一步包括:
將所述單鏈DNA進行單鏈環(huán)化反應,以便獲得單鏈環(huán)化反應產物;
利用鏈霉素磁珠對所述單鏈環(huán)化反應產物進行篩選,以便獲得所述環(huán)狀DNA。
7.一種測序方法,其特征在于,包括:
通過權利要求1-6中任一項所述的方法構建測序文庫;
對所述測序文庫進行測序。
8.一種構建測序文庫的設備,其特征在于,包括:
片段化裝置,所述片段化裝置用于將mRNA打斷,以便獲得片段化mRNA;
去磷酸化裝置,所述去磷酸化裝置用于將所述片段化mRNA去磷酸化,以便獲得去磷酸化mRNA;
接頭連接裝置,所述接頭連接裝置用于將所述去磷酸化mRNA連接3’端接頭,以便獲得連接產物;
反轉錄裝置,所述反轉錄裝置用于將所述連接產物進行反轉錄,以便獲得cDNA;
分離裝置,所述分離裝置用于從所述cDNA分離單鏈DNA;以及
環(huán)化裝置,所述環(huán)化裝置用于將所述單鏈DNA進行單鏈環(huán)化,以便獲得環(huán)狀DNA,所述環(huán)狀DNA構成所述測序文庫。
9.根據(jù)權利要求8所述的設備,其特征在于,進一步包括:
提取裝置,所述提取裝置用于利用去核糖體RNA方法從總RNA中分離純化所述mRNA,
任選地,所述分離裝置進一步包括:
熱解單元,所述熱解單元用于向反轉錄產物中加入1M NaOH,在PCR儀上反應98℃20min,然后向得到的混合物中加入1M HCl;
沉淀單元,所述沉淀單元用于向所述熱解單元中所得到的混合物中加入水,然后進行乙醇沉淀,并用1XTE重懸,
任選地,所述反轉錄裝置中設置有攜帶生物素的引物,
任選地,所述環(huán)化裝置進一步包括:
環(huán)化反應單元,所述環(huán)化反應單元用于將所述單鏈DNA進行單鏈環(huán)化反應,以便獲得單鏈環(huán)化反應產物;
篩選單元,所述篩選單元用于利用鏈霉素磁珠對所述單鏈環(huán)化產物進行篩選,以便獲得所述環(huán)狀DNA。
10.一種測序系統(tǒng),其特征在于,包括:
權利要求8-9中任一項所述的構建測序文庫的設備;以及
測序設備。