本發(fā)明涉及生物
技術領域：
，具體地，涉及構建測序文庫的方法及設備，以及測序的方法及系統(tǒng)。
背景技術：
：隨著高通量測序技術的應用和發(fā)展，第二代測序平臺日趨成熟、穩(wěn)定，存在的主要問題是文庫制備步驟繁瑣、成本居高不下，所以第二代基因測序還無法滿足市場的要求，走入千家萬戶。解決這個問題的關鍵在于減少起始樣本的投入量和簡化文庫制備步驟。傳統(tǒng)從總RNA中構建cDNA文庫需要依賴oligo(dT)，從而將信息RNA捕獲出來。這些信息再通過反轉錄合成一鏈和二鏈，加上接頭，再經過PCR擴增形成適用于高通量測序的cDNA文庫。目前存在的方法有一個局限在于開始投入的RNA產量需要達到數(shù)百ng到μg之間，以滿足在多種酶反應過程中和在PCR擴增前一系列純化回收步驟導致的丟失。因而，目前關于從總RNA中構建cDNA文庫的相關研究仍有待深入。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種從非常低的RNA投入量構建cDNA文庫適用于高通量測序的構建測序文庫的方法。在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種構建測序文庫的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括：(1)將mRNA打斷，以便獲得片段化mRNA；(2)將所述片段化mRNA去磷酸化，以便獲得去磷酸化mRNA；(3)將所述去磷酸化mRNA連接3’端接頭，以便獲得連接產物；(4)將所述連接產物進行反轉錄，以便獲得cDNA；(5)從所述cDNA分離單鏈DNA；以及(6)將所述單鏈DNA進行環(huán)化，以便獲得環(huán)狀DNA，所述環(huán)狀DNA構成所述測序文庫。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的該方法，能夠快速有效的構建測序文庫，且該方法能夠有效減少樣品提取的數(shù)量和切膠和膠純化回收步驟，可以利用非常微量的RNA用于構建文庫，RNA的起始量只需要pg級別就能滿足要求；在單管中利用連續(xù)反應無縫銜接接頭連接和反轉錄，不僅能夠簡化純化步驟，還可以縮短文庫構建的時間，提高效率； 另外，該方法無需進行PCR，能夠有效避免PCR帶來的偏差(bias)問題，而且步驟簡單，利于實現(xiàn)高通量、自動化應用。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述步驟(3)和所述步驟(4)是在同一容器中進行的。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述步驟(1)的起始mRNA是采用去核糖體RNA方法從總RNA中分離純化獲得的。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述去核糖體RNA方法包括：將所述總RNA與oligoDNA進行退火處理，將所述退火處理得到的產物進行RNaseH酶消化，將所述RNaseH酶消化得到的產物進行DNaseI酶消化，以及將所述DNaseI酶消化得到的產物進行磁珠純化，以便獲得所述mRNA，其中，所述OligoDNA是可與rRNA雜交的寡核苷酸單鏈片段，其長度為45-60bp，優(yōu)選為45-55bp。由此，能夠高效地分離獲得mRNA。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述步驟(5)是通過以下步驟進行的：(a)向反轉錄產物中加入1MNaOH，在PCR儀上反應98℃20min，然后向得到的混合物中加入1MHCl；(b)向步驟(a)中所得到的混合物中加入水，然后進行乙醇沉淀，并用1×TE重懸。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述步驟(4)的反轉錄是采用攜帶生物素的引物進行的。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述步驟(6)進一步包括：將所述單鏈DNA進行單鏈環(huán)化反應，以便獲得單鏈環(huán)化反應產物；利用鏈霉素磁珠對所述單鏈環(huán)化反應產物進行篩選，以便獲得所述環(huán)狀DNA。在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了一種測序方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括：通過前面所述的方法構建測序文庫；以及對所述測序文庫進行測序。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的該方法，能夠快速、有效的進行測序，且通過前面所述的方法構建測序文庫能夠有效減少樣品提取的數(shù)量和切膠和膠純化回收步驟，可以利用非常微量的RNA用于構建文庫，RNA的起始量只需要pg級別就能滿足要求；在單管中利用連續(xù)反應無縫銜接接頭連接和反轉錄，不僅能夠簡化純化步驟，還可以縮短文庫構建的時間，提高效率；另外，該方法無需進行PCR，能夠有效避免PCR帶來的偏差(bias)問題，而且步驟簡單，利于實現(xiàn)高通量、自動化應用。在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了一種構建測序文庫的設備。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該設備包括：片段化裝置，所述片段化裝置用于將mRNA打斷，以便獲得片段化mRNA；去磷酸化裝置，所述去磷酸化裝置用于將所述片段化mRNA去磷酸化，以便獲得去磷酸化mRNA；接頭連接裝置，所述接頭連接裝置用于將所述去磷酸化mRNA連接3’端接頭，以便獲得連接產物；反轉錄裝置，所述反轉錄裝置用于將所述連接產物進行反轉錄，以便獲得cDNA；分離裝置，所述分離裝置用于從所述cDNA分離單鏈DNA；以及環(huán)化裝置，所述環(huán)化裝置用于將所述單鏈DNA進行單鏈環(huán)化，以便獲得環(huán)狀DNA，所述環(huán)狀DNA構 成所述測序文庫。利用本發(fā)明的該設備，能夠有效實施前面所述的構建測序文庫的方法，可以利用非常微量的RNA用于構建文庫，RNA的起始量只需要pg級別就能滿足要求；不需要復雜的純化裝置，且不需進行PCR，不僅設備簡單，成本低廉，且能夠縮短文庫構建的時間，大大提高效率。根據(jù)本發(fā)明的實施例，進一步包括：提取裝置，所述提取裝置用于利用去核糖體RNA方法從總RNA中分離純化所述mRNA。在本發(fā)明的一些實施例中，提取裝置中設置有oligoDNA，所述OligoDNA是長度為45-60bp，優(yōu)選45-55bp的寡核苷酸單鏈片段，具有選自SEQIDNO.:1-195中至少之一所示的序列。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述分離裝置進一步包括：熱解單元，所述熱解單元用于向反轉錄產物中加入1MNaOH，在PCR儀上反應98℃20min，然后向得到的混合物中加入1MHCl；以及沉淀單元，所述沉淀單元用于向所述熱解單元中所得到的混合物中加入水，然后進行乙醇沉淀，并用1×TE重懸。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述反轉錄裝置中設置有攜帶生物素的引物，，用于進行反轉錄反應。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述環(huán)化裝置進一步包括：環(huán)化反應單元，所述環(huán)化反應單元用于將所述單鏈DNA進行單鏈環(huán)化反應，以便獲得單鏈環(huán)化反應產物；篩選單元，所述篩選單元用于利用鏈霉素磁珠對所述單鏈環(huán)化產物進行篩選，以便獲得所述環(huán)狀DNA。在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了一種測序系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該系統(tǒng)包括：前面所述的構建測序文庫的設備；以及測序設備。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的該系統(tǒng)能夠快速、有效的實施前面所述的測序方法，且通過前面所述的設備構建測序文庫能夠有效減少樣品提取的數(shù)量和切膠和膠純化回收步驟，可以利用非常微量的RNA用于構建文庫，RNA的起始量只需要pg級別就能滿足要求；還可以在單管中利用連續(xù)反應無縫銜接接頭連接和反轉錄，不僅能夠簡化純化步驟，還可以縮短文庫構建的時間，提高效率；另外，該系統(tǒng)無需進行PCR，能夠有效避免PCR帶來的偏差(bias)問題，而且操作簡單，利于實現(xiàn)高通量、自動化應用。附圖說明圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例，構建測序文庫的方法的流程示意圖；圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例，構建測序文庫的技術原理概要圖；圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例，構建測序文庫的設備的結構示意圖；圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例，構建獲得的測序文庫的電泳結果圖；以及圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例，構建獲得的測序文庫的隨機性分布結果圖。具體實施方式下面詳細描述本發(fā)明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產品。在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種構建測序文庫的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，參照圖1和圖2，該方法包括以下步驟：S100：將mRNA打斷，以便獲得片段化mRNA。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該步驟中，起始mRNA是采用去核糖體RNA方法從總RNA中分離純化獲得的。在本發(fā)明的一些實施例中，去核糖體RNA方法包括以下步驟：將總RNA與oligoDNA進行退火處理，將退火處理得到的產物進行RNaseH酶消化，將RNaseH酶消化得到的產物進行DNaseI酶消化，以及將DNaseI酶消化得到的產物進行磁珠純化，以便獲得mRNA，其中，所述OligoDNA是可與rRNA雜交的寡核苷酸單鏈片段，其長度為45-60bp，優(yōu)選為45-55bp。由此，能夠高效的獲得mRNA，且步驟簡單，操作容易，有利于提高構建測序文庫的效率。S200：將所述片段化mRNA去磷酸化，以便獲得去磷酸化mRNA。由此，能夠有效避免在后續(xù)步驟中片段化mRNA自身進行連接，有利于減少樣品丟失及提高構建文庫的效率。S300：將所述去磷酸化mRNA連接3’端接頭，以便獲得連接產物。S400：將所述連接產物進行反轉錄，以便獲得cDNA。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述反轉錄是采用攜帶生物素的引物進行的。由此，能夠在后續(xù)步驟中達到高效純化cDNA的目的，進而能夠進一步減少樣品的損失，提高構建測序文庫的效率。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述步驟S300和所述步驟S400是在同一容器中進行的。由此，連續(xù)反應無縫銜接接頭連接和反轉錄，不僅減少了切膠純化步驟，還大大縮短了構建測序文庫的時間，有利于提高構建測序文庫的效率。S500：從所述cDNA分離單鏈DNA。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以通過移除cDNA中的模板RNA，然后利用乙醇沉淀單鏈DNA的方法從所述cDNA分離單鏈DNA。根據(jù)本發(fā)明的一個具體示例，從所述cDNA分 離單鏈DNA是通過以下步驟進行的：(a)向反轉錄產物中加入1MNaOH，在PCR儀上反應98℃20min，然后向得到的混合物中加入1MHCl；(b)向步驟(a)中所得到的混合物中加入水，然后進行乙醇沉淀，并用1×TE重懸。S600：將所述單鏈DNA進行環(huán)化，以便獲得環(huán)狀DNA，所述環(huán)狀DNA構成所述測序文庫。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述步驟S600進一步包括：將所述單鏈DNA進行單鏈環(huán)化反應，以便獲得單鏈環(huán)化反應產物；利用鏈霉素磁珠對所述單鏈環(huán)化反應產物進行篩選，以便獲得所述環(huán)狀DNA。由此，能夠高效純化獲得環(huán)狀DNA，能夠有效減少樣品投入量。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的該方法，能夠快速有效的構建測序文庫，且該方法能夠有效減少樣品提取的數(shù)量和切膠和膠純化回收步驟，可以利用非常微量的RNA用于構建文庫，RNA的起始量只需要pg級別就能滿足要求；在單管中利用連續(xù)反應無縫銜接接頭連接和反轉錄，不僅能夠簡化純化步驟，還可以縮短文庫構建的時間，提高效率；另外，該方法無需進行PCR，能夠有效避免PCR帶來的偏差(bias)問題，而且步驟簡單，利于實現(xiàn)高通量、自動化應用。在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了一種測序方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括：通過前面所述的方法構建測序文庫；以及對所述測序文庫進行測序。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的該方法，能夠快速、有效的進行測序，且通過前面所述的方法構建測序文庫能夠有效減少樣品提取的數(shù)量和切膠和膠純化回收步驟，可以利用非常微量的RNA用于構建文庫，RNA的起始量只需要pg級別就能滿足要求；在單管中利用連續(xù)反應無縫銜接接頭連接和反轉錄，不僅能夠簡化純化步驟，還可以縮短文庫構建的時間，提高效率；另外，該方法無需進行PCR，能夠有效避免PCR帶來的偏差(bias)問題，而且步驟簡單，利于實現(xiàn)高通量、自動化應用。在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了一種構建測序文庫的設備。根據(jù)本發(fā)明的實施例，參照圖3，該設備包括：片段化裝置100，所述片段化裝置100用于將mRNA打斷，以便獲得片段化mRNA。根據(jù)本發(fā)明的實施例，進一步包括：提取裝置，所述提取裝置用于利用去核糖體RNA方法從總RNA中分離純化所述mRNA。在本發(fā)明的一些實施例中，提取裝置中設置有oligoDNA，所述OligoDNA是可與rRNA雜交的寡核苷酸單鏈片段，其長度為45-60bp，優(yōu)選為45-55bp。由此，能夠高效地分離純化獲得mRNA，有利于提高效率。去磷酸化裝置200，所述去磷酸化裝置200用于將所述片段化mRNA去磷酸化，以便 獲得去磷酸化mRNA。由此，能夠有效避免在后續(xù)步驟中片段化mRNA自身進行連接，有利于減少樣品丟失及提高構建文庫的效率。接頭連接裝置300，所述接頭連接裝置300用于將所述去磷酸化mRNA連接3’端接頭，以便獲得連接產物。反轉錄裝置400，所述反轉錄裝置400用于將所述連接產物進行反轉錄，以便獲得cDNA。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述反轉錄裝置中設置有攜帶生物素的引物。由此，能夠在后續(xù)步驟中達到高效純化cDNA的目的，進而能夠進一步減少樣品的損失，提高構建測序文庫的效率。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在本發(fā)明的設備中，所述接頭連接和所述反轉錄反應是在同一容器中進行的。由此，連續(xù)反應無縫銜接接頭連接和反轉錄，不僅減少了切膠純化步驟，還大大縮短了構建測序文庫的時間，有利于提高構建測序文庫的效率。分離裝置500，所述分離裝置500用于從所述cDNA分離單鏈DNA。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述分離裝置500進一步包括：熱解單元，所述熱解單元用于向反轉錄產物中加入1MNaOH，在PCR儀上反應98℃20min，然后向得到的混合物中加入1MHCl；以及沉淀單元，所述沉淀單元用于向所述熱解單元中所得到的混合物中加入水，然后進行乙醇沉淀，并用1×TE重懸。環(huán)化裝置600，所述環(huán)化裝置600用于將所述單鏈DNA進行單鏈環(huán)化，以便獲得環(huán)狀DNA，所述環(huán)狀DNA構成所述測序文庫。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述環(huán)化裝置600進一步包括：環(huán)化反應單元，所述環(huán)化反應單元用于將所述單鏈DNA進行單鏈環(huán)化反應，以便獲得單鏈環(huán)化反應產物；篩選單元，所述篩選單元用于利用鏈霉素磁珠對所述單鏈環(huán)化產物進行篩選，以便獲得所述環(huán)狀DNA。由此，能夠高效純化獲得環(huán)狀DNA，能夠有效減少樣品投入量。利用本發(fā)明的該設備，能夠有效實施前面所述的構建測序文庫的方法，可以利用非常微量的RNA用于構建文庫，RNA的起始量只需要pg級別就能滿足要求；不需要復雜的純化裝置，且不需進行PCR，不僅設備簡單，成本低廉，且能夠縮短文庫構建的時間，大大提高效率。在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了一種測序系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該系統(tǒng)包括：前面所述的構建測序文庫的設備；以及測序設備。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的該系統(tǒng)能夠快速、有效的實施前面所述的測序方法，且通過前面所述的設備構建測序文庫能夠有效減少樣品提取的數(shù)量和切膠和膠純化回收步驟，可以利用非常微量的RNA用于構建文 庫，RNA的起始量只需要pg級別就能滿足要求；還可以在單管中利用連續(xù)反應無縫銜接接頭連接和反轉錄，不僅能夠簡化純化步驟，還可以縮短文庫構建的時間，提高效率；另外，該系統(tǒng)無需進行PCR，能夠有效避免PCR帶來的偏差(bias)問題，而且操作簡單，利于實現(xiàn)高通量、自動化應用?？傊?，本發(fā)明提供了一種從非常低的RNA投入量構建cDNA文庫適用于高通量測序的構建測序文庫的方法，該方法是一種相對簡單和流線型克隆方案，相比較傳統(tǒng)克隆方案和已商業(yè)化的流線型方案導致重大的樣品丟失問題，本發(fā)明的方法通過減少樣品提取的數(shù)量和切膠回收步驟，盡可能最小化減少樣品的丟失，該方法涉及測序連接接頭和反轉錄反應在同一單管中完成，在這一單管中一個單獨的接頭連接上RNA的3’端，緊接著反轉錄形成帶有生物素(biotin)的cDNA；然后cDNA進行環(huán)化，帶有biotin的cDNAs被篩選出來。本發(fā)明的方法靈敏度高，從人類全血血漿的臨床樣品分離非常微量的RNA用于構建cDNA文庫的起始量只需要pg級別就能滿足要求；文庫制備流程簡單，整個RNA文庫制備只需要1.5天就能完成。不管從樣品投入量，時間上，成本上，此方法均優(yōu)于目前已商業(yè)化另外二大測序平臺(iontorrent和Illumina)的RNA文庫制備技術。實施例1：實驗樣本來源：采用材料是人細胞的RNA標準品(UniversalHumanReferenceRNA)購自AgilentTechnologies。具體實驗步驟：1、RNaseH純化mRNA1.1取100ng總RNA與oligoDNA退火，反應體系如下所示：其中，OligoDNA為SEQIDNO.1-SEQIDNO.195所示各單條序列按等量的分子比例混合在一起形成的混合物。1.2在PCR儀上95℃反應2min；梯度降溫，每隔1s降0.1℃至22℃；22℃反應5min，迅速置于冰上。1.3RNaseH酶消化在37℃反應30min。1.4DNaseI酶消化1.5反應結束后，產物用RNAcleanXP磁珠純化，溶于10μl無核酸酶水中。2、mRNA片段化向上一步中的洗脫液中加入3.5μL的5×第一鏈緩沖液，94℃，10min，立即置于冰上。3、片段化mRNA去磷酸化將樣品置于PCR儀中反應，反應條件：37℃30min；65℃5min；4℃保持。反應結束后，產物用RNAcleanXP磁珠純化，溶于10μl無核酸酶水中。4、3’接頭連接反應在PCR儀上30℃反應6h。其中，3’接頭具有如下所示的序列：5/rApp/GTCTCCAGTCGAAGCCCGATC/Amine/3(SEQIDNO.196)5phos/AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAAGCTCXXXXXXXXXXGAT CGGGCTTCGACTGGAGAC(SEQIDNO.197，其中，XXXXXXXXXX代表不同的標簽(barcode)序列)。5、反轉錄合成cDNA鏈混勻后在PCR儀上按照以下程序進行反應：在該步驟中，上述步驟中連接的3’接頭作為反轉錄引物。6、分離單鏈DNA移除模板RNA和乙醇沉淀cDNA產物，具體如下：往上步產物加入2μl1MNaOH，在PCR儀上反應98℃20min(105℃熱蓋)，然后加入2μl1MHCL。補水至200μl再進行乙醇沉淀，最后用15μl1×TE重懸，以便獲得單鏈DNA。7、單鏈環(huán)化連接反應在PCR儀上60℃反應2h。反應結束后80℃反應10min失活ssDNA連接酶。8、鏈霉素磁珠結合帶有生物素環(huán)化產物取30μl鏈霉親和素磁珠(StreptavidinBeads，濃度為10mg/ml))，加入120μl的1×結 合緩沖液(1×bindingbuffer，組成成分是110mMTris-HCl，200mMNaCl)，在不粘管中混勻后置于磁力架上靜止吸附，調整不粘管的方向，使得鏈霉親和素磁珠在1×bindingbuffer洗液中前后游動，棄上清液后，重復上述操作一次，取出不粘管加入30μl1×bindingbuffer懸浮，混勻后室溫待用。向20μl環(huán)化產物加入20μl2×bindingbuffer(組成成分是220mMTris-HCl，400mMNaCl)混勻，然后轉移到上步驟含有30μl1×bindingbuffer懸浮的鏈霉親和素磁珠的不粘管中混勻，將此70μl混合物置于室溫下結合15-20min，中間輕輕彈勻一次。9、破壞鏈霉素與生物素作用，得到環(huán)化文庫將上述不粘管磁力架放置3-5min，棄去上清液，用100μl的1×TE洗滌2次，方法同鏈霉親和素磁珠的洗滌方法，然后加入50μl無離子滅菌水重懸磁珠進行PCR反應，PCR反應條件如下：反應結束后，吸取上清到新的1.5mLEP管，用ssDNAQubit進行定量，并跑6％的變性膠驗證文庫結果，構建獲得的文庫的電泳結果見圖4，其中，泳道1為fermentas低范圍RNA梯(fermentaslowrangeRNAladder)，泳道2為構建獲得的文庫，可以看到在300-600nt分布的smear(成片條帶)就是構建獲得的單鏈環(huán)狀文庫。10、結果驗證將上述制備獲得的文庫在CompleteGenomics測序平臺進行常規(guī)數(shù)據(jù)分析，結果如下：將上述制備獲得的文庫與來自Rfam數(shù)據(jù)庫(人核糖體數(shù)據(jù)庫)的參考基因組進行比對，核糖體RNA占的比例結果見表1：表1比對基因序列數(shù)目百分比總共序列數(shù)目8302538100.00％總共比對上的序列數(shù)21410.03％總共未比對上的序列數(shù)830039799.97％將上述制備獲得的文庫與來自人類基因組數(shù)據(jù)庫h19的參考基因組進行比對，比對到 基因組的結果見表2：表2總共序列數(shù)總共比對序列數(shù)唯一匹配序列數(shù)8302538(100％)8253099(99.40％)7744826(93.28％)隨機性分布結果見圖5。上述結果表明，通過根據(jù)本發(fā)明實施例的上述方法，能夠成功地以少量起始樣品制備獲得符合要求的測序文庫。在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結合和組合。盡管上面已經示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領域的普通技術人員在本發(fā)明的范圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。當前第1頁1 2 3