近代科學(xué)研究從鹿茸中檢測出40余種不同成份：其中有26種微量元素，含有30％以上無機物。有19種以上氨基酸，蛋白質(zhì)占鹿茸干重50％以上，并且含有豐富的磷脂、脂肪。特別是從鹿茸中提取獲得多肽等生物活性物質(zhì)，對鹿茸的價值從模糊感性認識上升到理性認知。鹿茸多肽能從生命源頭上作用于遺傳物質(zhì)，干涉生命的全過程，控制遺傳翻譯密碼、增加蛋白質(zhì)核酸合成，促進細胞修復(fù)與再生，提高人體免疫力控制癌細胞。

二、

背景技術(shù)：

1.鹿茸組織學(xué)與鹿茸生長點

鹿茸是鹿后天生長的雄性器官。由神經(jīng)血管結(jié)締組織、皮膚軟骨等多種細胞構(gòu)成，受紫外線光信號控制，內(nèi)分泌系統(tǒng)支配生長鹿茸(鹿角)，每年一次周期性脫落。雄鹿在出生次年春從頭蓋上部骨膜隆起，突出形成兩個柱狀幼角。分布在不同地域的馬鹿、梅花鹿等都依各地光照、溫差時間不同，按規(guī)律生長不同形態(tài)鹿茸。它們內(nèi)部結(jié)構(gòu)基本一致?？萍既藛T高云從事鹿病研究，走遍全國養(yǎng)鹿場，觀察過鹿茸生長過程、鹿茸形態(tài)和結(jié)構(gòu)，以及鹿病和生茸的關(guān)系。鹿茸生長快速，每日能增加長度2公分，構(gòu)成鹿茸的各類細胞快速復(fù)制，細胞數(shù)增多是哺乳動物中生長最快的細胞，超過癌細胞。

當(dāng)鹿體內(nèi)生理條件成熟，頭頂干細胞開始萌動，以不超三個月時間，完成鹿茸生長。之后茸體骨化，生理活性物質(zhì)消失，形成鹿角干叉，只能作為熬制鹿角膠材料。通過研究我們能在鹿茸活性物質(zhì)最多時期、含量最多部位、鹿茸干細胞分化生長形成生長點，在最佳部位採取培養(yǎng)原代細胞組織材料。通過發(fā)現(xiàn)鹿茸組織生理學(xué)特點，從鹿茸角尖最佳生長點取材，作為培養(yǎng)鹿茸細胞的原始材料，是本發(fā)明創(chuàng)新點之一。

2.鹿茸組織生理學(xué)。

鹿茸是鹿角骨化前期軟骨組織器官，茸體外部具有皮膚茸毛。茸體內(nèi)部以其組織結(jié)構(gòu)不同，分為上、中、下三段。上段是皮膚及密質(zhì)的皮下質(zhì)，下連球體狀生茸組織，富含鹿茸干細胞。與之連接的是由其分化形成的含活性物質(zhì)最多的鹿茸前體細胞層，組成鹿茸生產(chǎn)點，俗稱“臘片部位”。鹿茸中段細胞分化長成軟骨組織，下段開始鈣化形成骨組織。當(dāng)梅花鹿形成4個分支，馬鹿形成5個分叉時停止生長。鹿角由下向上石灰化形成堅硬骨質(zhì)，脫皮成為格斗武器，進入配種期次年春季自行脫落。

鹿角從生長至脫落，是生物體由生長到消亡、反之也是由消亡到生長全過程的演釋。我們觀察發(fā)現(xiàn)，這種生命科學(xué)的奇妙現(xiàn)象是鹿茸活性多肽干涉控制的結(jié)果。

3.鹿茸活性物質(zhì)

鹿茸是活性物質(zhì)的天然生物存儲庫，角尖生長點存在多肽同時存在多胺、多醣等。鹿茸多肽等特殊活性物質(zhì)其功能首先是作用其鹿茸自身，其突出特點是能夠使鹿茸干細胞快速分化成鹿茸的各類型細胞， 鹿茸(鹿角)在后天分化周期性生長脫落、脫落生長，是生物界唯一特有的現(xiàn)象。這完全是由鹿茸多肽所具有的功能所致。現(xiàn)代科學(xué)研究證實多肽是由A-氨基酸以肽鏈連接在一起的化合物，多肽是由10-100個氨基酸分子脫水縮合物組成。分子量低于10000Da，由2-10個氨基酸組成的可稱為小分子肽，能透過半透膜。活性多肽有多種活性因子，控制人體的生長、發(fā)育、繁殖、新陳代謝、免疫調(diào)節(jié)，提高各器官功能，復(fù)制再生人體細胞。同時發(fā)現(xiàn)生命過程中，會由于許多原因造成人體多肽的損害和流失，以及合成肽的能力降低，而相應(yīng)發(fā)生各類疾病。研究者發(fā)現(xiàn)人的不同年齡段分泌產(chǎn)生肽的能力不同。25歲之前為充足分泌期，分泌均衡。30-50歲進入分泌失衡期，不足者將發(fā)病。50歲以上人群進入分泌匱乏期，活性肽嚴重不足，開始衰老和發(fā)生相應(yīng)疾病。60歲以上分泌終止，器官功能衰竭和細胞功能退化至喪失，需要及時補充多肽。鑒于多肽的價值和重大需求，當(dāng)代許多學(xué)者尋求高效多肽和大量分離提取多肽已形成研究熱點。

首先從大豆、芝麻等植物中提取到小分子肽，同時認識到可從動物臟器中提取多肽(如胸腺肽)，但因瘋牛病等耐高溫病毒存在感染風(fēng)險而禁用。人工合成的多肽往往沒有活性，沒有活性的多肽就沒有多肽的功能。

4.提取鹿茸多肽

近些年人們十分關(guān)注以鹿茸為原料提取鹿茸多肽。1970年前后展開大量試驗，國內(nèi)外學(xué)者以多種方法從鹿茸中提取到不同分子量的肽，證實了鹿茸多肽的強大功能。同時，也證實了以鹿茸為原料提取多肽產(chǎn)率低、成本高，做不到規(guī)?；a(chǎn)。我們證實其是因為鹿茸提取多 肽的有效部位十分短小。另外，基因重組鹿茸多肽產(chǎn)率也僅有66mg/L。

5.鹿茸生產(chǎn)和藥用。

我國漢代之前發(fā)現(xiàn)鹿茸保健醫(yī)療功效。由于野生動物生存環(huán)境遭到破壞，逐漸形成由野生變家養(yǎng)。1949年10月新中國成立后，形成了鹿的養(yǎng)殖業(yè)，向國外出口鹿茸，換取外匯。當(dāng)時東北三省、華北、西北青海、新疆等全國養(yǎng)殖梅花鹿。馬鹿近百萬只。高云研治鹿病走遍全國各地，到處可見養(yǎng)鹿破壞山林，外銷鹿茸換取外匯，以破壞生態(tài)環(huán)境為代價得不償失。隨之構(gòu)想以生物技術(shù)培養(yǎng)鹿茸細胞，創(chuàng)建生產(chǎn)鹿茸物質(zhì)新途徑。

6.鹿茸生長機制

高云建立了我國第一個野生動物疾病研究室。行使職務(wù)深入全國鹿場，研究鹿的生理病理，探討生茸機制。觀察發(fā)現(xiàn)鹿睪丸損傷切除后，使性激素分泌功能受阻，鹿茸進入病態(tài)生長，茸體細小，最終停止生長形成中性體態(tài)。在研究“鉤端螺旋體病”病源分布組織切片時，從鹿茸中觀察到根部至中部由軟骨組織構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)角尖皮下部軟組織緊密連接一個球狀微有彈性的軟組織，這個特殊的結(jié)構(gòu)可稱“角帽”是鹿茸生長的起點。向下是生長有序的鹿茸前體細胞層。鹿茸組織切片染色在根部檢查有鈣質(zhì)沉著。中部呈軟骨組織結(jié)構(gòu)，上部呈現(xiàn)特殊組織結(jié)構(gòu)，找到和確定了生茸組織的確切位置，這一發(fā)現(xiàn)確定了採取原始材料最佳部位，為建立細胞系(株)和種子細胞庫，為高效提取鹿茸多肽打下技術(shù)基礎(chǔ)。

7.鹿茸生長點。

鹿茸有三處生長點。鹿茸角尖部可以定位為第一生長點，是重要 取材部位，它是原始生長點形成的后天產(chǎn)物。其起點源于胚胎時期形成的頭頂骨膜儲備的鹿茸干細胞。光照作用于腦垂體后葉，睪丸雄性激素增加，骨膜中干細胞萌發(fā)生長鹿茸。鹿茸第二生長點是切除鹿茸之后及鹿茸生理脫落點，原處骨膜能再生鹿茸。第三生長點是鹿茸茸表骨膜中存在的干細胞，當(dāng)茸體受到外力損傷時，可無序生長鹿茸分支形成“怪角”。

我們確定從鹿茸主干、支干以及無序生長的“怪角”生長點取材均可培養(yǎng)成為原代單層細胞，其它部位取材尚不能成功培養(yǎng)。這是本發(fā)明創(chuàng)新點之一。

三、

技術(shù)實現(xiàn)要素：

將原代細胞培養(yǎng)成為傳代細胞系才能進入工業(yè)化生產(chǎn)。在生長液中加入10-20％鹿血清，提高細胞活力適應(yīng)外部環(huán)境有序生長，成為傳代細胞系(株)。此項創(chuàng)新對培養(yǎng)各種細胞系攻克傳代難點，提供技術(shù)支持。

選高產(chǎn)梅花鹿茸在生長鼎盛期鋸下，必需在30分鐘內(nèi)送入實驗室。滅菌紗布包好，以電烙燙烙表皮，無菌消毒，距角尖3公分切開于角帽組織下端取材置入短頸瓶，剪碎加生長液培養(yǎng)，置入培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)，使組織塊均勻分布，減少觀察次數(shù)不可搖動，輕置輕放。一周之后進行傳代培養(yǎng)。

生長液配方：改良MEM液、鹿血清20％、PH調(diào)至7.2。

鹿血清採取法：在6-7月采血，快速分離血清，促細胞生長作用效果最佳，優(yōu)于常用的小牛血清、胎牛血清。發(fā)現(xiàn)鹿血清應(yīng)用價值是本發(fā)明創(chuàng)新點之一。

使用鹿血清強力生長液和良好操作連續(xù)傳代至50代形成細胞系(株)，將每代細胞凍存。

從不同的種群中優(yōu)選個體取材，建立10個以上細胞系(株)，豐富和增加種細胞數(shù)量、質(zhì)量，這是本發(fā)明技術(shù)創(chuàng)新點之一。

根據(jù)達到產(chǎn)量和成本要求，可選用轉(zhuǎn)瓶以旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)技術(shù)或選擇細胞反應(yīng)罐懸浮培養(yǎng)均可規(guī)?；I(yè)化生產(chǎn)鹿茸細胞。

四、具體實施方式

1.轉(zhuǎn)瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)

首先建立2000平方米、5人操作生物藥品生產(chǎn)車間。要求滅菌消毒、空氣濾過、溫度濕度自動控制。配置3立升轉(zhuǎn)瓶、5×7轉(zhuǎn)瓶機100臺。設(shè)立連續(xù)順向生產(chǎn)的工藝步驟：生產(chǎn)準備室-器械洗滌消毒室-消化傳代試驗室-恒溫培養(yǎng)室-收藏儲備室-品質(zhì)檢測包裝室。年產(chǎn)量：約700公斤以上鹿茸細胞活性多肽干粉。

2.細胞反應(yīng)罐懸浮培養(yǎng)

建立1000平方米、五人操作生物藥品生產(chǎn)車間，要求滅菌消毒、空氣濾過、溫度濕度自動控制。配置40立升細胞反應(yīng)罐10臺。設(shè)立連續(xù)順向生產(chǎn)的工藝步驟：生產(chǎn)準備室——器械洗滌消毒室——復(fù)蘇試驗室——恒溫培養(yǎng)室-收藏儲備室——品質(zhì)檢測包裝室。年產(chǎn)量：約2000公斤以上鹿茸細胞活性多肽干粉。

以此規(guī)范作為一個生產(chǎn)單位。早期創(chuàng)造的鹿茸原始單層細胞培養(yǎng)成功，獲得國家專利第2523號。細胞反應(yīng)罐培養(yǎng)實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，成功獲得了國家專利第CN200710064481.2號。在兩項發(fā)明專利的技術(shù)基礎(chǔ)上，在不斷完善和提高過程中，創(chuàng)立了生物技術(shù)工業(yè)化生 產(chǎn)鹿茸細胞多肽新工藝。

3.鹿茸細胞多肽提取方法

首先將鹿茸細胞懸浮液稱量置入離心罐，1500RPM離心10分鐘，置入低溫冰箱快速凍融。裂解細胞壁釋放活性物質(zhì)。加入稀釋液(1∶1)，以半透膜方法提取多肽。將提取物用真空凍干機凍干成粉狀，簡稱“三步提取法”，稱量分裝，保存于-80℃低溫冰箱。鹿茸細胞多肽產(chǎn)率占鹿茸細胞總量達48.5％以上。

4.鹿茸多肽分子質(zhì)量測定

采用SDS-PAGE電泳法。

常規(guī)方法(略)

鹿茸細胞系(株)不同，鹿茸多肽分子量為：3.2-7.6kDa。

5.鹿茸細胞藥理藥化測定與鑒定

以生物技術(shù)培養(yǎng)的鹿茸細胞與鹿茸藥理藥化對比實驗，是由著名學(xué)者王本祥博士等立題研究完成的。證實兩者藥理作用相同，藥化成分含量相同或相似，受到政府主管部門和專家學(xué)者重視，由農(nóng)業(yè)部科技司主持技術(shù)鑒定。經(jīng)國家藥理學(xué)會理事長王振鋼教授、衛(wèi)生部藥物研究所所長張均田教授等六位著名藥理專家評審?fù)ㄟ^鑒定，鹿茸細胞作為保健品可用于食品飲料、酒類等，并建議鹿茸細胞參照鹿茸入藥，可申請國家新藥。

實驗例一：取材

從健康高產(chǎn)的種鹿群中優(yōu)選4-7歲長白山梅花鹿(或馬鹿)在鹿茸生長到梅花鹿二杠(或馬鹿三叉)時鋸茸，立即(30分鐘之內(nèi))送入實驗室。滅菌在鹿茸角尖下3-5公分處切開，角帽取材5-10克， 剪碎加生長液，篩除較大組織塊，分瓶培養(yǎng)(每瓶10毫升)，搖勻置入二氧化碳培養(yǎng)箱，37℃靜止培養(yǎng)三日，開始鏡檢觀察。7-10日后換液，待組織塊生長細胞達要求時，進行胰酶消化，分瓶培養(yǎng)，獲得原代細胞。

實施例二：生長液配方：常規(guī)改良MEM細胞培養(yǎng)液，加入10-20％鹿血清。

細胞傳代培養(yǎng)和形成細胞系(株)是生物技術(shù)生產(chǎn)鹿茸細胞的重要技術(shù)環(huán)節(jié)。當(dāng)傳代數(shù)次時，往往停止生長不能延續(xù)培養(yǎng)而終止。使用胎牛血清促進細胞生長，難以度過難點。我們發(fā)現(xiàn)鹿血清的應(yīng)用價值，這是本項發(fā)明創(chuàng)新點之一。鹿血占體重16分之一，可分離出3立升血清，最好從頸動脈插管放血。保證無菌狀態(tài)冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例三：創(chuàng)建鹿茸細胞系(株)和建立細胞庫。將傳代鹿茸細胞保存活力，性能不變達到50代以上創(chuàng)建細胞系(株)。從5代起均可為細胞生產(chǎn)提供種細胞，提取多肽。

由于鹿種不同、部位個體不同形成的鹿茸細胞系(株)有所差異，可從中選用。必須大量和多樣化保留鹿茸細胞系(株)，建立細胞庫，加以科學(xué)管理，科學(xué)利用自然資源。

實施例四：大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)生產(chǎn)技術(shù)

將鹿茸細胞利用轉(zhuǎn)瓶施轉(zhuǎn)培養(yǎng)或細胞反應(yīng)罐懸浮培養(yǎng)，首次作為工業(yè)化生產(chǎn)鹿茸細胞，獲得100-600萬個/ml。

實施例五：提取鹿茸細胞多肽

將鹿茸細胞懸液1500RPM，10分鐘離心沉淀，超低溫冷凍破碎細胞壁，釋放多肽等活性物質(zhì)。利用半透膜方法分離多肽，將所得置于 真空凍干機，制成多肽干粉，稱重分裝，保存在-20℃。多肽提取量占細胞總量48.5％，此法簡稱為“三步提取法”，提取效果好，保存多肽活性無藥物殘留，成本低。

實施例六、分子質(zhì)量測定

采用SDS-PAGE電泳法測定。常規(guī)方法(略)。鹿茸細胞系(株)不同，鹿茸多肽分子量在3.2-7.6kDa。

實施例七：鹿茸細胞功能。王本祥博士檢測鹿茸細胞藥理藥化作用實驗，明顯觀察到，小白鼠經(jīng)口服鹿茸細胞使肝臟核酸增多，肝細胞數(shù)量增多。系統(tǒng)研究報告發(fā)表于王本祥博士著作中。

五、附農(nóng)業(yè)部科技司科技成果鑒定書 。