本發(fā)明涉及分析微生物的方法。所述分析是基于脂質(zhì)譜，并且可以用于微生物識(shí)別。

背景技術(shù)：

理想的是迅速且簡(jiǎn)單、可靠地識(shí)別微生物。可靠的識(shí)別允許微生物樣本的致病性和/或其它特性可以被識(shí)別。確定微生物的生物分子組成可以協(xié)助識(shí)別繼而診斷。

質(zhì)譜可用于分析生物分子，一般使用軟電離技術(shù)?；|(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)-MS是這樣的技術(shù)之一，并已被廣泛地應(yīng)用于大型生物分子包括蛋白質(zhì)的分析。蛋白質(zhì)指紋圖譜使得MALDI-MS可以應(yīng)用到微生物識(shí)別和診斷中。

然而，蛋白質(zhì)指紋圖譜無(wú)法可靠地區(qū)分在同種的不同菌株。需要血清學(xué)檢測(cè)或PCR分析，以測(cè)試樣品的致病性。

已知脂質(zhì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)很重要，并且它是細(xì)胞膜和其它亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的主要組成部分。它們?cè)谥饕?xì)胞機(jī)制中是活躍的，并影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能。

US2012/0197535描述了從細(xì)菌樣本中提取糖脂類(糖脂saccharolipid)。采用質(zhì)譜技術(shù)(包括MALDI)分析糖脂組成使得可以識(shí)別細(xì)菌菌株。這種技術(shù)利用細(xì)菌外部細(xì)胞壁糖脂結(jié)構(gòu)(例如脂質(zhì)A、脂磷壁酸)的特異性。然而，該方法是開(kāi)發(fā)用于并定制用于這些糖脂的特定提取，并且發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，其不能廣泛適用。例如，它不能被用來(lái)測(cè)定其它不含這些糖脂的微生物有機(jī)體(例如酵母或真菌)的識(shí)別。

不同屬(如細(xì)菌、酵母、絲狀真菌)之間，即使是一個(gè)屬的不同種級(jí)別中，微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)可以變化非常大。例如，取決于細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征，原核生物(如細(xì)菌)分成兩大類，革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性。然而，盡管原核生物和真核生物(如酵母和真菌)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完全不同的構(gòu)造，它們都具有細(xì)胞質(zhì)膜。

磷脂(PLs)(特別是甘油磷脂和鞘磷脂)已知是許多微生物的主要膜脂質(zhì)。事實(shí)上，磷脂的生物合成的組分和磷脂本身是膜表面，并作為其它細(xì)胞膜組分的前身。[1]

例如，陽(yáng)離子磷脂酰膽堿(PC)，在真核生物中占總膜脂質(zhì)的約50％，并且磷脂酰絲氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)作為次要組分。兩性離子磷脂酰乙醇胺(PE)、陰離子磷脂酰甘油(PG)和/或心磷脂(CL)代表大多數(shù)已知細(xì)菌的主要膜脂質(zhì)(例如大腸桿菌中有高達(dá)80％的PE)[2]。其它顯著磷脂是PG的氨基酸酯(例如賴氨酰-，丙氨酰-，或鳥(niǎo)氨酰-PG)[14]。

一些其它中性脂質(zhì)(NLs)(或非極性脂質(zhì))，例如二酰基甘油(DAGs)，三?；视?TAGs)和膽固醇酯(CEs)，已知在細(xì)胞膜的功能中起重要作用。雖然在原核生物(例如細(xì)菌)中很少發(fā)現(xiàn)CEs，它們是真核生物(即酵母、真菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中更常見(jiàn)的脂質(zhì)成分。這些脂質(zhì)分子含有酯化到甘油或甾醇骨架的1-3個(gè)脂肪酸。NLs的一個(gè)重要的分組是糖基甘油二酯(例如雙半乳糖基二酰甘油酯，DGDG)，其主要見(jiàn)于革蘭氏陽(yáng)性菌(如芽孢桿菌)[14]。

PLs(和NLs)對(duì)細(xì)胞膜的重要性，是指脂質(zhì)組成的體內(nèi)平衡對(duì)于維持微生物細(xì)胞細(xì)胞膜的完整性和功能(例如，跨膜信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞間相互作用、能量代謝、細(xì)胞增殖等)，以及它們?cè)诓煌h(huán)境中的生存是非常重要的[13]。公知的，細(xì)胞磷脂組合物的改變將導(dǎo)致微生物暴露于環(huán)境壓力，如極端溫度、有毒物質(zhì)、食品添加劑和抗生素[4][5][6][7]。

因此，微生物細(xì)胞具有非常特色的、基于進(jìn)化的磷脂組合物，其可被用于化學(xué)分類的目的，由此，潛在地磷脂譜的微小差異可以用于菌株水平的區(qū)分。這允許可以識(shí)別具有特定特征的菌株，包括那些致病性和對(duì)抗生素產(chǎn)生抗藥性的菌株。

微生物的磷脂組合物是非常復(fù)雜的，并且其通常使用質(zhì)譜(MS)來(lái)分析，因?yàn)樗试S同時(shí)檢測(cè)一個(gè)單獨(dú)MS譜中的多個(gè)個(gè)體分子種類。使用MS對(duì)微生物進(jìn)行分類的第一個(gè)例子是使用氣體色譜(GC)-MS[8]。因?yàn)榱己玫纳V分離潛力，GC-MS被用于細(xì)胞脂肪酸分析[9]。然而，脂質(zhì)需要被分解成組成性脂肪酸分子進(jìn)行分析，因此不能測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的磷脂組合物。

磷脂的功能分析表明，結(jié)構(gòu)特性(如頭部、鏈長(zhǎng)、不飽和度)是膜功能的主要原因[10]。磷脂被分解成構(gòu)成性脂肪酸時(shí)，該信息也會(huì)丟失。

因此，在分析期間保存完整的磷脂結(jié)構(gòu)的檢測(cè)技術(shù)更適合化學(xué)分類的目的。一些報(bào)道已經(jīng)顯示完整的脂質(zhì)譜對(duì)于，使用軟電離技術(shù)，例如快原子轟擊(FAB)[11]和電噴霧電離(ESI)-MS來(lái)區(qū)分細(xì)菌的作用[12]。

然而，MALDI-MS通常是優(yōu)選的軟電離技術(shù)?？梢院?jiǎn)單和快速地獲得數(shù)據(jù)，并且它是相對(duì)簡(jiǎn)單的分析，因?yàn)樵趯?duì)基質(zhì)包埋的樣品進(jìn)行激光激發(fā)后，所述分子幾乎被專一地檢測(cè)為單電荷離子。。而且采用的儀器是穩(wěn)健的和可靠的，其允許分析原始(即未純化的)樣品。因此，MALDI-MS已發(fā)展成基于“蛋白質(zhì)指紋圖譜”的微生物診斷的一個(gè)常規(guī)的技術(shù)[13]。

最近，MALDI-MS已被報(bào)告為一種用于細(xì)菌磷脂分析的方法[14][15]。然而，可靠的樣品制備步驟和儀器儀表技術(shù)的缺乏阻止了這些方法的廣泛應(yīng)用。通過(guò)使用MALDI-MS的磷脂分析進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌的識(shí)別，對(duì)關(guān)系緊密的細(xì)菌是不可能的，這阻礙了其在分類學(xué)中的使用。此外，目前在其他類型的微生物(如酵母和真菌)中，尚沒(méi)有脂質(zhì)MALDI-MS的成功分析的報(bào)道，它們?nèi)员仨毻ㄟ^(guò)使用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、基因分型、和/或蛋白質(zhì)指紋圖譜來(lái)識(shí)別。

此外，使用基于MALDI-MS的磷脂分析來(lái)區(qū)分微生物菌株(在一個(gè)物種內(nèi))尚未見(jiàn)報(bào)道。也沒(méi)有用于酵母或真菌的基于MALDI-MS的脂質(zhì)譜(lipid profile)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

最基本地，本發(fā)明提供微生物分析的方法，可使用基于組成性脂質(zhì)分析來(lái)區(qū)分微生物菌株。該方法使用MALDI質(zhì)譜法。在一些情況下，該方法分析了微生物磷脂。任選的，該方法還分析微生物蛋白質(zhì)。因此，“蛋白質(zhì)指紋圖譜分析”和“脂質(zhì)指紋圖譜分析”可以在同一微生物中進(jìn)行。事實(shí)上，可以使用同樣的提取處理來(lái)獲得提取的脂質(zhì)和提取的蛋白質(zhì)。這有利于后續(xù)的MALDI-MS分析，并且該分析可以包括合并來(lái)自脂類和蛋白質(zhì)m/z范圍的數(shù)據(jù)。

分析的數(shù)據(jù)可以用來(lái)簡(jiǎn)單、可靠地識(shí)別微生物菌株。

在第一方面，本發(fā)明提供了識(shí)別微生物菌株的方法，該方法包括：

ⅰ)脂質(zhì)提取步驟，包括從微生物中提取磷脂；

ⅱ)樣品制備步驟，包括制備結(jié)合有所提取的磷脂的MALDI樣品；和

ⅲ)數(shù)據(jù)采集步驟，包括對(duì)MALDI樣品執(zhí)行基于MALDI的質(zhì)譜分析，

ⅳ)微生物識(shí)別步驟，包括對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以表征或識(shí)別微生物菌株。

與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比，可以識(shí)別菌株水平的微生物。相似的，可以使用由本申請(qǐng)發(fā)明人設(shè)計(jì)的方法來(lái)區(qū)分關(guān)系緊密的微生物。

現(xiàn)有技術(shù)中描述的通過(guò)脂質(zhì)譜識(shí)別細(xì)菌的早期過(guò)程[14]表明脂質(zhì)：“在給定的細(xì)菌中，其組成和相對(duì)含量取決于環(huán)境條件”，并認(rèn)為“這可能對(duì)使用脂質(zhì)譜來(lái)分類和區(qū)分非常相似的細(xì)菌種類造成困難”。它指出，脂質(zhì)分析可以用于“區(qū)分顯著不同的組，如從革蘭氏陰性細(xì)菌中區(qū)分革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌”。

在這方面的進(jìn)一步的工作還注意到，脂質(zhì)組成的變化源自于環(huán)境條件，例如培養(yǎng)基[15]。進(jìn)一步工作力圖提高集中于不同的步驟以加快細(xì)菌識(shí)別的早期方法。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)譜可用于識(shí)別微生物菌株。發(fā)明人已確定，在一定的時(shí)間點(diǎn)(例如24后或72小時(shí)后)由細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物中記錄的脂質(zhì)譜，或者使用特定培養(yǎng)介質(zhì)(如血液或基本瓊脂)記錄的脂質(zhì)譜允許細(xì)菌菌株的可靠區(qū)分。因此，本發(fā)明要求保護(hù)的方法允許在亞種水平的化學(xué)分類識(shí)別，并且除其它因素外，其已經(jīng)被設(shè)計(jì)用于增加信噪比和質(zhì)譜再現(xiàn)性。

本發(fā)明所保護(hù)的方法簡(jiǎn)單、快速、方便和可靠。

該方法是在臨床/醫(yī)院環(huán)境中非常有用，其進(jìn)行大量的測(cè)試(以識(shí)別微生物信息)，以及高可信度的結(jié)果是很重要的。

下面將更詳細(xì)地討論，適當(dāng)?shù)?，該方法包括獲得蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)(如磷脂)的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)。也就是說(shuō)，適當(dāng)?shù)?，該方法包括“蛋白質(zhì)指紋圖譜”以及“脂質(zhì)指紋圖譜”以區(qū)別微生物菌株。

本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一個(gè)單獨(dú)的提取步驟便于脂質(zhì)(適當(dāng)?shù)匕字?和蛋白質(zhì)的提取。如在本文實(shí)施例中所述，借助合適的基質(zhì)，可以使用含有脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的被提取的材料用于脂質(zhì)分析(通常m/z＝100至3000，例如200至2000)和蛋白質(zhì)分析(通常m/z＝2000至20000)。這種“全合一”的方式提供了一種可靠、簡(jiǎn)單、快速、低成本用于得到有價(jià)值的亞種信息的方法。

適當(dāng)?shù)?，提取步驟i)包括從微生物中提取蛋白質(zhì)。適當(dāng)?shù)?，使用相同的提取組合物(如甲醇或甲醇/水)提取脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。如下面所討論的，由于為了得到脂質(zhì)信息和蛋白質(zhì)信息只需要一種提取組合物，這便于高通量分析。

適當(dāng)?shù)?，樣品制備步驟ii)包括a)制備結(jié)合有所提取的脂質(zhì)的MALDI樣品，以及b)制備結(jié)合有所提取的蛋白質(zhì)的MALDI樣品。通常步驟ⅱ)a)和ii)b)使用不同的MALDI基質(zhì)材料。

適當(dāng)?shù)?，?shù)據(jù)采集步驟iii)包括從所提取的脂質(zhì)獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及從所提取的蛋白質(zhì)獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)。在實(shí)施方案中，脂質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以被組合/合并。

在第二方面，本發(fā)明提供一種分析微生物的方法，所述方法包括：

ⅰ)脂質(zhì)提取步驟，包括從微生物中提取脂質(zhì)；

ⅱ)樣品制備步驟，包括制備結(jié)合所提取的脂質(zhì)的MALDI樣品；和

iii)數(shù)據(jù)采集步驟，包括對(duì)MALDI樣品執(zhí)行基于MALDI的質(zhì)譜分析。

第二方面允許不同微生物獲得不同質(zhì)譜。

以與第一方面相同的方式，適當(dāng)?shù)?，提取步驟i)包括從微生物中提取蛋白質(zhì)。適當(dāng)?shù)?，使用相同的提取組合物提取脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。

并且類似地，樣品制備步驟ⅱ)可以包括a)制備結(jié)合所提取的脂質(zhì)的MALDI樣品，b)制備結(jié)合所提取的蛋白質(zhì)的MALDI樣品。通常步驟ⅱ)a)和ii)b)使用不同的MALDI基質(zhì)材料。

再次，適當(dāng)?shù)?，?shù)據(jù)采集步驟iii)包括獲得所提取的脂質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和獲得所述提取的蛋白質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。在實(shí)施例中，脂質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以被組合/合并。

在第三方面，本發(fā)明提供一種分析微生物的方法，該方法包括：

ⅰ)脂質(zhì)提取步驟，其包含向微生物中添加提取組合物以提取脂質(zhì)，其中提取組合物包含大于50體積％的醇或大于50體積％的醚；

ⅱ)樣品制備步驟，包括制備結(jié)合有所提取的脂質(zhì)的MALDI樣品；和

iii)數(shù)據(jù)采集步驟，包括對(duì)MALDI樣品執(zhí)行基于MALDI的質(zhì)譜分析。

在第三方面中所使用的基于醇或醚的溶劑允許獲得脂質(zhì)MS譜，其中所有微生物類型均可以可靠地達(dá)到亞種分辨率。優(yōu)選地，提取組合物包含大于50體積％的醇。

相比之下，現(xiàn)有技術(shù)的方法[14][15]，使用Folch試劑進(jìn)行磷脂提取。Folch試劑包含體積比為3:1到1:1的三氯甲烷和甲醇。Folch法是在脂質(zhì)分析領(lǐng)域中是最常用的脂質(zhì)提取技術(shù)。然而，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，所得到的MALDI質(zhì)譜是不可再現(xiàn)的，并且不能檢測(cè)到亞種質(zhì)譜之間的微小差異。本發(fā)明第三方面中所要求的醇基的溶劑提取技術(shù)提高了質(zhì)譜的再現(xiàn)性，并且背景噪音低。因此，亞種分辨率是可能的。出人意料的是，當(dāng)不僅執(zhí)行脂質(zhì)分析而且執(zhí)行蛋白質(zhì)分析時(shí)，也能夠?qū)崿F(xiàn)。因此，即使當(dāng)m/z范圍包括脂質(zhì)(通常m/z＝100至3000，例如200至2000)和蛋白質(zhì)(通常m/z＝2000到20000)時(shí)，本發(fā)明第三方面的定制溶劑系統(tǒng)可以適當(dāng)?shù)靥峁┝说捅尘霸胍艉土己玫脑佻F(xiàn)性。

US2012/0197535使用Folch試劑提取糖脂，并描述后續(xù)亞種區(qū)分。然而，如以上所討論的，糖脂不存在于所有微生物中。本發(fā)明人的醇基溶劑提取被設(shè)計(jì)為允許從所有微生物中提取脂質(zhì)，其中所提取的脂質(zhì)的MS譜允許后續(xù)亞種分辨率。

另外，在脂質(zhì)提取步驟中使用的醇基溶劑也將溶解基質(zhì)材料，以允許樣品制備。這避免了額外的試劑，從而降低了成本，并導(dǎo)致更清潔、可再現(xiàn)性更好的譜，其中亞種可被區(qū)分。換句話說(shuō)，與Folch試劑相比，脂質(zhì)提取中使用的醇基溶劑與基質(zhì)材料更兼容。

從圖2可以看出，利用Folch試劑返回的質(zhì)譜具有非常差的信噪(S/N)比，由于Folch試劑(特別是氯仿)與MALDI基質(zhì)材料兼容性較差。該噪聲水平使得亞種分辨是不可能的。

在一個(gè)優(yōu)選的情況中，脂質(zhì)提取步驟中提取磷脂。在提取步驟中使用的醇基溶劑已經(jīng)專門(mén)定制為這個(gè)目的，即，允許磷脂提取，這種方式允許亞種分辨。

如上所述，定制的溶劑系統(tǒng)不僅可以有效地提取脂質(zhì)(特別是磷脂)，而且可以有效地提取蛋白質(zhì)。這使得蛋白質(zhì)指紋圖譜和脂質(zhì)指紋圖譜可以使用相同的提取。

以與第一方面相同的方式，適當(dāng)?shù)?，提取步驟i)包括從微生物中提取蛋白質(zhì)。適當(dāng)?shù)兀褂孟嗤奶崛〗M合物提取脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。任選地，提取步驟i)包括向微生物添加水(例如添加到培養(yǎng)基)。這可以是添加提取組合物之前的先行步驟。可替代地或附加地，提取組合物可包含水。例如，可以使用醇/水或醚/水混合物。在實(shí)施方案中，在第一(先行)步中向微生物中添加水，隨后在第二步中添加醇(適當(dāng)?shù)貫榧状?。

類似地，樣品制備步驟ⅱ)可以包括a)制備結(jié)合有所提取的脂質(zhì)的MALDI樣品和b)制備結(jié)合有所提取的蛋白質(zhì)的MALDI樣品。通常地，步驟ⅱ)a)和ii)b)使用不同的MALDI基質(zhì)材料。

再次，適當(dāng)?shù)兀瑪?shù)據(jù)采集步驟iii)包括獲得所提取的脂質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和獲得所述提取的蛋白質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。在實(shí)施例中，脂質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以被組合/合并。

在第四方面，本發(fā)明提供一種分析微生物的方法，該方法包括：

ⅰ)脂質(zhì)提取步驟，包括從微生物中提取脂質(zhì)；

ⅱ)樣品制備步驟，包括制備結(jié)合有所提取的脂質(zhì)的MALDI樣品；和

ⅲ)數(shù)據(jù)采集步驟，包括對(duì)MALDI樣品執(zhí)行基于MALDI的質(zhì)譜分析，

其中；

脂質(zhì)提取步驟包括向微生物中添加甲醇溶液或甲醇/丙酮混合物，和/或

樣品制備步驟包括向所提取的脂質(zhì)中添加9AA或ATT基質(zhì)材料，和/或

在數(shù)據(jù)采集步驟中，在MS1質(zhì)譜中掃描的m/z范圍是從約100至約3000。

以與第一方面相同的方式，適當(dāng)?shù)?，提取步驟i)包括從微生物中提取蛋白質(zhì)。適當(dāng)?shù)?，使用相同的提取組合物提取脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。

如本文中所討論的，(脂質(zhì)和蛋白質(zhì))提取步驟可以包括依次添加水和醇(適當(dāng)?shù)剡x自甲醇或乙醇，優(yōu)選甲醇)(適當(dāng)?shù)厮畠?yōu)先)，或作為水-醇混合物添加。

類似地，樣品制備步驟ⅱ)包括a)制備結(jié)合有所提取的脂質(zhì)的MALDI樣品和b)制備結(jié)合有所提取的蛋白質(zhì)的MALDI樣品。通常步驟ⅱ)a)和ii)b)使用不同的MALDI基質(zhì)材料。在一些實(shí)施方案中，CHCA基質(zhì)材料用于所提取的蛋白質(zhì)。即，樣品制備步驟(例如步驟ii)b))包括向所提取的蛋白質(zhì)中添加CHCA基質(zhì)材料。

再次，適當(dāng)?shù)?，?shù)據(jù)采集步驟iii)包括獲得所提取的脂質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和獲得所提取的蛋白質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以被組合/合并。

這些方法允許獲得高可再現(xiàn)性、低噪音、高信息含量的脂質(zhì)譜。因此可以區(qū)分關(guān)系緊密的微生物，包括同一物種的分離菌株的質(zhì)譜。在一個(gè)優(yōu)選的情況中，脂質(zhì)提取步驟至少提取磷脂。

在一些實(shí)施方案中，數(shù)據(jù)采集步驟進(jìn)一步包括在MS1質(zhì)譜中掃描從約2000至約20000的m/z范圍。因此，適當(dāng)?shù)貟呙璧膍/z范圍用于蛋白質(zhì)分析以及用于脂質(zhì)分析。

如本文中所討論的，數(shù)據(jù)采集步驟可以包括1)對(duì)根據(jù)步驟ii)a)制備的MALDI樣品執(zhí)行MALDI-MS，和2)對(duì)根據(jù)步驟ii)b)制備的MALDI樣品執(zhí)行MALDI-MS。因此，在一些實(shí)施方案中，對(duì)相同的微生物樣品進(jìn)行處理(提取、MALDI樣品制備)，以便得到脂質(zhì)組成和蛋白質(zhì)組成的m/z數(shù)據(jù)。這使得微生物(如培養(yǎng)物)亞種信息的分配具有甚至更高的可信度和可靠性。

在第五方面，本發(fā)明提供一種分析非細(xì)菌微生物的方法，該方法包括：

ⅰ)脂質(zhì)提取步驟，包括從微生物中提取脂質(zhì)；

ⅱ)樣品制備步驟，包括制備結(jié)合有所提取的脂質(zhì)的MALDI樣品；和

iii)數(shù)據(jù)采集步驟，包括對(duì)MALDI樣品執(zhí)行基于MALDI的質(zhì)譜分析。

以與第一方面相同的方式，適當(dāng)?shù)兀崛〔襟Ei)包括從微生物中提取蛋白質(zhì)。適當(dāng)?shù)兀褂孟嗤奶崛〗M合物提取脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。

類似地，樣品制備步驟ⅱ)可以包括a)制備結(jié)合有所提取的脂質(zhì)的MALDI樣品和，b)制備結(jié)合有所提取的蛋白質(zhì)的MALDI樣品。通常步驟ⅱ)a)和ii)b)使用不同的MALDI基質(zhì)材料。

再次，適當(dāng)?shù)?，?shù)據(jù)采集步驟iii)包括獲得所提取的脂質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和獲得所提取的蛋白質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。在實(shí)施方案中，脂質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以被組合/合并。

在第六方面，本發(fā)明提供了一種分析微生物的方法，該方法包括：

ⅰ)提取步驟，包括從微生物中提取脂質(zhì)和蛋白質(zhì)；

ⅱ)樣品制備步驟，包括制備一個(gè)或多個(gè)結(jié)合有所提取的脂質(zhì)和/或所提取的蛋白質(zhì)的MALDI樣品；和

ⅲ)數(shù)據(jù)采集步驟，包括對(duì)一個(gè)或多個(gè)MALDI樣品執(zhí)行基于MALDI的質(zhì)譜分析，以便獲得微生物的脂質(zhì)組成的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和微生物的蛋白質(zhì)組成的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

在實(shí)施方案中，脂質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以被組合/合并。

適當(dāng)?shù)兀摲椒òá?微生物識(shí)別步驟，包括對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析來(lái)表征或識(shí)別微生物，優(yōu)選微生物菌株。適當(dāng)?shù)?，任何此類分析是針?duì)合并后的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行的。

如本文中所討論的，樣品制備步驟ii)典型地包括制備用于蛋白質(zhì)分析(使用例如CHCA作為基質(zhì)材料)的MALDI樣品，和用于脂質(zhì)分析的(不同的)MALDI樣品(使用例如ATT或9AA作為基質(zhì)材料)。適當(dāng)?shù)兀瑥奶崛〔襟E中獲得的組合物(通常是懸浮液)用于制備用于蛋白質(zhì)分析(例如，通過(guò)添加適當(dāng)?shù)幕|(zhì)材料如CHCA)的MALDI樣品和用于脂質(zhì)分析的MALDI樣品(例如，通過(guò)添加適當(dāng)?shù)幕|(zhì)材料例如ATT或9AA)。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的上述每個(gè)方面，所述脂質(zhì)提取步驟包括磷脂提取。在一些情況下，所提取的脂質(zhì)中的至少約20體積％、優(yōu)選40體積％、50體積％、60體積％、70體積％或80體積％是磷脂。在一些情況下，樣品中至少約20體積％、優(yōu)選40體積％、60體積％或80體積％的磷脂被提取。

優(yōu)選，在本發(fā)明的上述每個(gè)方面，所述脂質(zhì)提取步驟包括蛋白質(zhì)提取。

優(yōu)選，在本發(fā)明的上述每個(gè)方面中，數(shù)據(jù)采集步驟包括獲得脂質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)(典型地通過(guò)掃描100到3000的m/z范圍，例如200到2000)和蛋白質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)(通常通過(guò)掃描2000至20000的m/z范圍)。

任選地，本發(fā)明第二、第三、第四和第五方面的方法可以進(jìn)一步包括微生物識(shí)別步驟，包括分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)以表征或識(shí)別微生物。任選地，所述微生物識(shí)別步驟包括蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)(通常包括從2000到20000的一些或所有m/z范圍獲得的數(shù)據(jù))的分析以及脂質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)(通常包括從100到3000、通常為200至2000的一些或所有m/z范圍獲得的數(shù)據(jù))的分析。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)同時(shí)使用脂質(zhì)m/z數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)m/z數(shù)據(jù)，微生物種類和亞種信息的識(shí)別是更加可靠的，以及該信息有更高的置信度?；谠撔畔?，這對(duì)于基于該信息進(jìn)行診斷的后續(xù)治療的診所/醫(yī)院是特別相關(guān)的。

任選地，任一方面的方法可進(jìn)一步包括另外的、最初的、微生物培養(yǎng)步驟。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于實(shí)施之前的任一方面的方法的試劑盒。所述試劑盒包括實(shí)施所述方法所需的試劑，以及解釋所述方法中每個(gè)步驟的詳細(xì)說(shuō)明。

適當(dāng)?shù)?，試劑盒包括一種或多種：

(ⅰ)MALDI基質(zhì)材料，和任選的共基質(zhì)(co-matrix)材料

(ii)樣品板，

(ⅲ)陽(yáng)離子和陰離子磷脂標(biāo)準(zhǔn)品(適當(dāng)?shù)貎龈傻?的校準(zhǔn)混合物和

(ⅳ)一組用于完成如此處所述方法的指令。

優(yōu)選的基質(zhì)材料選自ATT、THAP和9AA，和/或可選的共基質(zhì)材料選自DAHC、GUA和醋酸鈉或醋酸鋰，和/或包括兩個(gè)或更多的樣品板(例如16個(gè)樣品板)，其中每個(gè)板是48孔靶玻片(slide)(例如FlexiMassTM–DS靶玻片)，和/或包括用于脂質(zhì)提取和/或基質(zhì)材料溶解的有機(jī)溶劑。

在蛋白質(zhì)被提取和分析的實(shí)施方案中，MALDI基質(zhì)材料適當(dāng)?shù)剡x自a-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、芥子酸(SA)和阿魏酸(FA)。優(yōu)選CHCA。因此，試劑盒可以包括用于脂質(zhì)分析的第一基質(zhì)材料和用于蛋白質(zhì)分析的第二基質(zhì)材料(與第一基質(zhì)材料不同)。

適當(dāng)?shù)?，試劑盒包括存放試劑?或其它成分的容器或外殼。

在本申請(qǐng)中，液體體積(體積％)百分比的計(jì)算是基于混合前組成元素的體積總和。

現(xiàn)在討論上述各種步驟，包括可選的和優(yōu)選的特征。此處將公開(kāi)本發(fā)明各個(gè)方面兼有的每種可選的和優(yōu)選的特征，以及它們的組合，如同每個(gè)特征和每個(gè)組合單獨(dú)地并明確地被引用。

脂質(zhì)提取

雖然現(xiàn)有技術(shù)的一些方法(例如，蛋白質(zhì)生物分型)已經(jīng)闡述了通過(guò)MALDI-MS直接分析活細(xì)胞，本申請(qǐng)所要求保護(hù)的方法中使用的有機(jī)溶劑提取步驟提供了幾個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)。包括：

a)滅活微生物細(xì)胞，以及破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。這便于樣本易于處理(例如，在制備和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中)，甚至當(dāng)處理與病原菌種類時(shí)，也是如此。

b)生產(chǎn)均質(zhì)脂質(zhì)溶液，最小化原始細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)所得質(zhì)譜的影響。質(zhì)譜具有更可再現(xiàn)性。

c)便于儲(chǔ)存。脂質(zhì)可以存儲(chǔ)很長(zhǎng)一段時(shí)間(例如，在約-20℃至約-80℃)，而不表示顯著劣化。與此相反，活細(xì)胞不能被存儲(chǔ)相同的時(shí)間。便于儲(chǔ)存允許分析可以容易地再次運(yùn)行，以確認(rèn)結(jié)果。

一般地，可以使用任何能夠保存脂質(zhì)、優(yōu)選至少磷脂使其完整的脂質(zhì)提取技術(shù)。這保留了全部的生物信息內(nèi)容。

在一些方面，脂質(zhì)提取步驟包括從微生物細(xì)胞中提取脂質(zhì)。

在其它方面，脂質(zhì)提取技術(shù)包括從微生物細(xì)胞中提取磷脂。在這些方面中，優(yōu)選還提取中性脂質(zhì)。

典型地，脂質(zhì)提取步驟包括向微生物中添加有機(jī)提取組合物。有機(jī)提取組合物優(yōu)選包含一種或多種有機(jī)溶劑。在一些情況下，有機(jī)提取組合物優(yōu)選包含一種或多種醇。有機(jī)提取組合物優(yōu)選包含大于約50體積％的醇，更優(yōu)選至少約51體積％、52體積％、53體積％、54體積％、55體積％、60體積％、70體積％、80體積％、或90體積％的醇。優(yōu)選短鏈醇，如C_1-4醇，其中乙醇和甲醇是尤其有利的，因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)它們可以有效地從所有類型的微生物細(xì)胞(即細(xì)菌、酵母和真菌)中提取磷脂，與細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)。在一些情況下，提取組合物包含至多100體積％的醇，優(yōu)選至多95體積％、90體積％、85體積％、80體積％、75體積％或70體積％的醇。

作為另外一種選擇或額外地，有機(jī)提取組合物包括酮、酯、和/或醚(如甲基叔丁基醚(MTBE)、丁醇(DIPE))，或它們的混合物。

這些溶劑是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兪桥c樣品制備步驟中使用的MALDI基質(zhì)材料是相容的(即它們?nèi)菀兹芙?。出于這個(gè)原因，基于醇的溶劑(其包含至少約50體積％的醇)是特別有利的。作為相容性的結(jié)果，這些溶劑在所得質(zhì)譜中產(chǎn)生相對(duì)較小的背景噪音信號(hào)。脂質(zhì)(特別是磷脂)提取是有效的和可靠的，這允許獲得可再現(xiàn)的質(zhì)譜。此外，不需要額外的試劑，節(jié)約成本。

提取組合物的另一個(gè)優(yōu)選的特征是，它不是雙相的。換句話說(shuō)，它完全包含極性溶劑或非極性溶劑。因此不需要分離步驟，這減少了處理時(shí)間并提高工作量。換句話說(shuō)，所述脂質(zhì)提取步驟簡(jiǎn)單地包括向樣品中添加溶劑，即它是一個(gè)一步提取方法。相比之下，使用Folch試劑需要在提取脂質(zhì)之后，分離極性和非極性組分相。

在一些情況下，提取組合物不包括任何鹵代有機(jī)溶劑。即，氯仿(CHCl₃)特別不是提取組合物的一部分。在其它情況下，提取組合物包含小于5體積％、優(yōu)選小于4體積％、3體積％、2體積％、1體積％、0.5體積％、0.4體積％、0.3體積％、0.2體積％或0.1體積％任何鹵代有機(jī)化合物或溶劑(包括氯仿)。

在一些情況下，有機(jī)提取組合物優(yōu)選包含醇或由醇組成，因?yàn)樗鼈儗?dǎo)致在最小的譜噪音。優(yōu)選C_1-4醇，特別優(yōu)選甲醇。有機(jī)溶劑可能基本上由甲醇組成。

在其它情況下，有機(jī)提取組合物優(yōu)選包括醇/酮混合物或由醇/酮混合物組成，所述醇/酮混合物優(yōu)選體積比為約70:30或75:25至約85:15或90:10。在優(yōu)選的情況下，有機(jī)提取組合物包含在上述比例范圍內(nèi)的C_1-4醇和C_3-4酮混合物。在特別優(yōu)選的情況下，有機(jī)提取組合物包括上述比例范圍內(nèi)的甲醇/丙酮混合物。最優(yōu)選地，有機(jī)提取組合物由體積比為約70:30或75:25至約85:15或90:10的甲醇/丙酮混合物組成。這些混合物是特別優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈冇行У靥崛【哂胁煌臉O性(包括陽(yáng)離子和陰離子磷脂、和中性脂質(zhì))的各種各樣的脂質(zhì)，同時(shí)可以最小化譜噪音并允許獲得可再現(xiàn)的質(zhì)譜。

可替代地，有機(jī)提取組合物包含大于50體積％的醚、優(yōu)選為至少約55體積％、60體積％、70體積％、80體積％、或90體積％的醚。優(yōu)選C_1-4醚(我們是指，在醚鍵任一側(cè)的碳鏈中包含1至4個(gè)碳原子)。優(yōu)選地，醚體積包含或由二異丙醚(DIPE)組成。醚基有機(jī)提取組合物可額外地包含醇、酮和/或酯，或它們的混合物。

如下面討論的，包括蛋白質(zhì)提取的方法中，提取步驟可以包括使用水，其中水作為提取組合物的一部分或作為向微生物中添加水的先行步驟。

優(yōu)選地，處理所提取的樣品以除去污染物，如蛋白質(zhì)。這提高了所得質(zhì)譜的可重復(fù)性和清晰度。自然地，在包括蛋白質(zhì)提取和分析的方法中，此可選污染物去除處理或者不進(jìn)行或進(jìn)行調(diào)整，以保存(或至少最小化除去的)蛋白質(zhì)。

在蛋白質(zhì)污染物(至少)的情況下，這些優(yōu)選從提取的溶液中沉淀出來(lái)，并通過(guò)離心去除。

蛋白質(zhì)提取

本申請(qǐng)發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，令人驚訝地，此處所討論的涉及蛋白質(zhì)提取的提取方法和溶劑系統(tǒng)，也能有效地用于從微生物中提取蛋白質(zhì)和允許通過(guò)MALDI質(zhì)譜分析提取的蛋白質(zhì)。

此外，本申請(qǐng)發(fā)明人已確定，在蛋白質(zhì)m/z數(shù)據(jù)結(jié)合脂質(zhì)m/z數(shù)據(jù)可以增加所得物種的精確度和置信度，特別是亞種識(shí)別。

本申請(qǐng)的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，除了提取組合物中的醇/醚成分，使用水能協(xié)助促進(jìn)用于隨后的MALDI-MS分析蛋白的可用度。這可以通過(guò)將水和微生物(例如和細(xì)胞培養(yǎng)物)進(jìn)行組合/混合來(lái)實(shí)現(xiàn)。這可以在與醇/醚成分進(jìn)行結(jié)合/混合之前在第一步/先行步驟中完成，和/或通過(guò)向醇/醚提取組合物中添加水來(lái)完成。

本申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)水的使用可以協(xié)助制備(微生物材料的)混懸液，其有利于形成具有良好質(zhì)量的MALDI樣品。因此，水的使用可以協(xié)助增大和/或擴(kuò)散和/或分散微生物(例如培養(yǎng)基中的細(xì)胞)，特別是在結(jié)合/混合醇/醚之前的第一/先行步驟中。

通常情況下，在與水和/或提取組合物結(jié)合/混合的步驟之后，將得到的材料進(jìn)行超聲處理。通常(超)聲波處理進(jìn)行至少1分鐘，合適地至少2分鐘，優(yōu)選至少5分鐘。典型地，超聲處理進(jìn)行不超過(guò)約20分鐘，通常不超過(guò)15分鐘。特別優(yōu)選的范圍為5至10分鐘。

任選地，包括所提取的脂質(zhì)和/或蛋白質(zhì)的組合物可以被冷卻，例如至<20℃，例如至<10℃，例如至<5℃。這可以通過(guò)將樣品(在合適的容器/器皿中)放在冰上/里而容易地實(shí)現(xiàn)。本申請(qǐng)發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這可以進(jìn)一步增強(qiáng)用于隨后MALDI-MS分析的提取物質(zhì)量。任何這樣的冷卻步驟的持續(xù)時(shí)間通常為至少10分鐘、合適地至少20分鐘、優(yōu)選至少25分鐘。通常地，所述冷卻步驟不超過(guò)60分鐘，一般不超過(guò)45分鐘，優(yōu)選不超過(guò)35分鐘。在實(shí)施方案中，冷卻進(jìn)行約30分鐘。

可選地，渦旋包括提取的脂質(zhì)和/或蛋白質(zhì)的組合物。通常這是和上述冷卻步驟同時(shí)進(jìn)行的或在其完成之后進(jìn)行的。再次，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這可以進(jìn)一步改善混懸液的均一性，所述混懸液是通過(guò)向微生物中添加提取組合物而形成的，這反過(guò)來(lái)又提高了MALDI-MS譜的質(zhì)量。

以這種方式中使用水以及醇/醚，適當(dāng)?shù)赝瑫r(shí)超聲處理，可以促進(jìn)生成親水性和疏水性組分(包括細(xì)胞蛋白和膜脂質(zhì))的均勻懸浮液。這允許從相同的樣品中，使用MALDI-MS對(duì)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)均進(jìn)行有效的分析。

樣品制備

樣品制備步驟包括向基質(zhì)材料中添加所提取的脂質(zhì)。在執(zhí)行蛋白質(zhì)分析的實(shí)施方案中，樣品制備步驟包括向基質(zhì)材料中添加所提取的蛋白質(zhì)。如下面所討論的，用于脂質(zhì)分析的基質(zhì)材料可以與用于蛋白質(zhì)分析的基質(zhì)材料不同。

在MALDI-MS中使用的基質(zhì)a)作為脂質(zhì)分子的電離促進(jìn)劑和b)作為電離減速劑，以防止相對(duì)不穩(wěn)定的脂質(zhì)分子的分裂。對(duì)于基質(zhì)的選擇沒(méi)有特別限定，只要其能實(shí)現(xiàn)該功能即可。2，5-二羥基苯甲酸(2，5-DHB)、2，4-二羥基苯甲酸(2，4-DHB)、6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)、9-氨基吖啶(9AA)和2，4，6-三羥基苯乙酮(THAP)都是合適的基質(zhì)材料。即，在一些情況下，基質(zhì)材料包括這些化合物中的一種或多種。

所使用的基質(zhì)取決于質(zhì)譜儀是否是在正離子或負(fù)離子模式下操作的。即，脂質(zhì)是否被正離子化或負(fù)離子化。

當(dāng)與磷脂(和中性脂質(zhì)，當(dāng)它們也被提取時(shí))一起工作，下面討論的一些示例性的基質(zhì)材料是特別優(yōu)選的。

在使用正離子模式操作的系統(tǒng)中，優(yōu)選2，4，6-三羥基苯乙酮(THAP)基質(zhì)。當(dāng)摻雜乙酸鈉或乙酸鋰(電離啟動(dòng)子)時(shí)，(2，4，6-三羥基苯乙酮(THAP)基質(zhì))是特別優(yōu)選的，其通過(guò)形成帶正電荷的鈉加合離子允許檢測(cè)到中性脂質(zhì)(參見(jiàn)圖3)。摻雜的鹽的濃度范圍優(yōu)選為約1-50mM，優(yōu)選10-20mM。在這些水平的摻雜使得可以完全抑制MALDI質(zhì)譜中的其它不期望的堿性反離子。

在正離子模式操作時(shí)，6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)是一種優(yōu)選的基質(zhì)材料。這對(duì)于檢測(cè)陽(yáng)離子磷脂是特別好的。ATT導(dǎo)致比THAP較軟的電離，并導(dǎo)致較不明顯的碎片產(chǎn)物，因此所得的質(zhì)譜是容易分析的。當(dāng)摻雜檸檬酸二氫銨(DAHC)時(shí)，特別優(yōu)選ATT，其抑制混合堿加合物(例如Na或K)的形成，并且允許檢測(cè)到專一質(zhì)子化的磷脂(參見(jiàn)圖3)。摻雜的鹽濃度范圍優(yōu)選為約1-100mM、更優(yōu)選10-50mM。在這些水平的摻雜使得允許專一地檢測(cè)到MALDI質(zhì)譜中質(zhì)子化的分子離子。

注意，ATT優(yōu)選于THAP，因?yàn)锳TT可以和具有更大范圍波長(zhǎng)的電離激光共同使用(即ATT與更大范圍的激光是兼容的)。

在以負(fù)離子模式操作時(shí)，9-氨基吖啶(9AA)是一種優(yōu)選的基質(zhì)材料。這對(duì)于檢測(cè)陰離子磷脂是特別好的。特別特選摻雜有鹽酸胍(9AA-GUA)或吡啶(9AA-PYR)的9AA，因?yàn)闄z測(cè)的靈敏度得以增加，并且清楚、可再現(xiàn)的圖譜結(jié)果(見(jiàn)圖3)。9AA-GUA優(yōu)選包含約3mM或4mM至約6mM或7MM的胍，最優(yōu)選約5mM。9AA-PYR優(yōu)選包含約0.3體積％或0.4體積％至約0.6體積％或0.7體積％的吡啶，最優(yōu)選約0.5體積％的吡啶。

在上述系統(tǒng)中，摻雜劑(DAHC、GUA、PYR)各自調(diào)節(jié)堿鹽加合物在所得質(zhì)譜中的貢獻(xiàn)，并促進(jìn)[M+H]⁺和[M-H]^-分別在正離子和負(fù)離子模式中的檢測(cè)。

在一些情況下，向基質(zhì)材料中添加所提取的脂質(zhì)溶液。在這種情況下，脂質(zhì)溶液優(yōu)選具有約0.5或1至約10或20μΜ的脂質(zhì)濃度，以提供最佳質(zhì)譜質(zhì)量和再現(xiàn)性。

在其他情況下，將基質(zhì)材料溶液直接添加到微生物樣品中。用于溶解基質(zhì)材料的溶劑從微生物樣品中提取脂質(zhì)，然后與基質(zhì)材料形成MALDI樣品。這種技術(shù)允許所謂的“無(wú)目標(biāo)”脂質(zhì)提??；即，對(duì)MALDI樣品板進(jìn)行脂質(zhì)提取。這是一個(gè)更快的處理工藝，因此允許更高的分析工作量。

在任一種情況下，基質(zhì)材料相對(duì)脂質(zhì)的摩爾比適當(dāng)?shù)貫榧s50000：1至約2500：1。

在關(guān)于蛋白質(zhì)被提取和分析的實(shí)施方案中，MALDI基質(zhì)材料適當(dāng)?shù)剡x自a-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、芥子酸(SA)和阿魏酸(FA)。優(yōu)選CHCA。

MALDI樣品體積優(yōu)選為約0.5至約1.5μL，最優(yōu)選約1μL。

優(yōu)選地，樣品是在聚合的或塑料的MALDI樣品板上制備的，而不是傳統(tǒng)的鋼靶(steel target)。這可以最小化背景噪音，尤其是大多數(shù)脂質(zhì)可被檢測(cè)到的低質(zhì)量范圍(即m/z<1000)的背景噪音。例如，可使用48孔FlexiMass^TM-DS(島津)靶玻片。

數(shù)據(jù)采集

可以通過(guò)以正離子模式操作(樣品的正電離)和/或負(fù)離子模式(樣品的負(fù)電離)操作質(zhì)譜儀來(lái)采集數(shù)據(jù)。

微生物中的陽(yáng)離子和陰離子磷脂種類的存在意味著，兩種模式對(duì)于評(píng)估細(xì)胞膜中的所有脂質(zhì)都是必要的。然而，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，單一模式下采集的數(shù)據(jù)足以獲得可靠的結(jié)果，并提供一種允許微生物識(shí)別的脂質(zhì)指紋圖譜。

基于以下原因，優(yōu)選負(fù)離子模式：

(a)陰離子磷脂在大多數(shù)細(xì)菌和其它微生物的細(xì)胞膜中是普遍的。所得質(zhì)譜中含有更多的信號(hào)，由此允許更容易分析和微生物識(shí)別。

(b)脂肪酸(FAs)可以在負(fù)離子模式中被檢測(cè)到，這顯著地增加了質(zhì)譜信息微生物識(shí)別質(zhì)譜信息內(nèi)容和助劑進(jìn)行檢測(cè)。這些被檢測(cè)為羧酸根陰離子。

FA是脂質(zhì)的重要結(jié)構(gòu)成分，并且其已經(jīng)被用于化學(xué)分類的目的[16]。額外的信息內(nèi)容協(xié)助區(qū)分微生物菌株。

(c)來(lái)自污染物的噪音通常是較低的。特別是，本申請(qǐng)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，來(lái)自典型的培養(yǎng)基的污染物(如血液瓊脂)含有陽(yáng)離子磷脂，其在正離子模式可被檢測(cè)到，而在負(fù)離子模式下檢測(cè)不到。

掃描的m/z范圍優(yōu)選為約100至約3000。這種寬范圍允許檢測(cè)到完整的脂質(zhì)(通常m/z>500)和脂肪酸殘基(m/z通常<500)。因此，該方法的特征在于所述m/z范圍包括范圍<500，例如約100至<500。更優(yōu)選的m/z的范圍可以是從約200、300、400或450至約1500、1800、2000、2500或2800。在實(shí)施方案中，所述m/z范圍包括約100至約500約100的范圍內(nèi)，適當(dāng)?shù)刂?00至<500，優(yōu)選約100至約450，更優(yōu)選約100至約400。

在現(xiàn)有技術(shù)的方法中，由于高噪音水平，通常不掃描此范圍(m/z<500)內(nèi)的下限。然而，本申請(qǐng)發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)脂肪酸的檢測(cè)可以改善質(zhì)譜的信息內(nèi)容。

如本文中所討論的，在蛋白質(zhì)被提取和分析的實(shí)施方案中，本申請(qǐng)所述方法的數(shù)據(jù)采集步驟包括：為蛋白質(zhì)信息掃描下述m/z范圍，典型地為約2000至20000。典型地，這是作為一個(gè)單獨(dú)步驟完成的，即在MALDI-MS實(shí)驗(yàn)，例如，在實(shí)施方案中，數(shù)據(jù)采集步驟包括兩個(gè)階段-一個(gè)是為脂質(zhì)(以及優(yōu)選地還有脂肪酸)掃描m/z范圍，一個(gè)為蛋白質(zhì)掃描m/z范圍。

通過(guò)從相同微生物獲取蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組合物信息(指紋圖譜)，借助在此討論的樣品制備技術(shù)，可以獲得更多的可用于微生物(種和亞種)識(shí)別的數(shù)據(jù)。這可以提供更精確的微生物識(shí)別，其結(jié)果具有更高的置信水平。

可以結(jié)合/合并脂質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。這可以將蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的數(shù)據(jù)集導(dǎo)出到一個(gè)電子表格如Micorsoft Excel和并合并它們來(lái)實(shí)現(xiàn)。然后可以進(jìn)行如此處所討論的聚類和/或其它分析。

在低質(zhì)量范圍內(nèi)(即m/z<1000)最小化背景噪音，在優(yōu)選的情況下使用聚合的或塑料的MALDI樣品板(而不是傳統(tǒng)的金屬靶)。

以與背景信號(hào)類似的質(zhì)量范圍，檢測(cè)到質(zhì)譜中的脂質(zhì)峰。因此，優(yōu)選使用高分辨率的儀器和技術(shù)。

這樣，可以在數(shù)據(jù)采集步驟中使用下述一個(gè)或多個(gè)質(zhì)譜技術(shù)：

a)四極離子阱(QIT)

b)飛行時(shí)間測(cè)量(TOF)

c)反射式飛行時(shí)間測(cè)量(RTOF)

d)軌道阱質(zhì)譜

e)傅里葉變換質(zhì)譜儀(FTMS)

f)串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)。

也可以使用低或高能碰撞誘導(dǎo)解離(CID)來(lái)改善脂肪酸FA的信息內(nèi)容。

通常，這些技術(shù)提高了質(zhì)譜的可再現(xiàn)性，這對(duì)實(shí)現(xiàn)可靠的微生物識(shí)別是非常重要的。它們也可以增加記錄的數(shù)據(jù)點(diǎn)的數(shù)量。

這些技術(shù)是相對(duì)使用簡(jiǎn)單的，并且具有一個(gè)或多個(gè)以下優(yōu)點(diǎn)；

-提高質(zhì)量準(zhǔn)確度；

-提高質(zhì)譜分辨率；

-降低質(zhì)譜噪音；

-增加信息內(nèi)容。

最優(yōu)選QIT-TOF，使用多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜(MSn)。

MSn還允許MS1模式的脂質(zhì)譜和主要在MS2或MS3模式的單獨(dú)脂質(zhì)種類的結(jié)構(gòu)解析。

微生物識(shí)別

在該步驟中，分析采集的數(shù)據(jù)采集，以識(shí)別或表征微生物菌株。

其可包括與現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。這些庫(kù)可以包含用于微生物菌株的脂質(zhì)質(zhì)量指紋圖譜和/或蛋白質(zhì)質(zhì)量指紋圖譜。

在一些情況下，微生物菌株明確被識(shí)別。

在其它情況下，微生物可以根據(jù)它的脂質(zhì)譜并且還優(yōu)選其蛋白質(zhì)譜來(lái)進(jìn)行表征。可以預(yù)測(cè)或確定某些性能，如對(duì)抗生素的敏感性和致病性。

微生物培養(yǎng)

在脂質(zhì)提取之前培養(yǎng)微生物。

已知微生物脂質(zhì)組成隨時(shí)間而改變。在微生物被識(shí)別或表征的方面，優(yōu)選所述培養(yǎng)步驟根據(jù)如下固定程序進(jìn)行。

在某些情況下，微生物菌株可以在液體中或在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)?；蛘?，它們可以使用血液瓊脂或基本培養(yǎng)基(例如LB瓊脂)進(jìn)行培養(yǎng)。血液瓊脂為細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選的介質(zhì)，因?yàn)樗怂斜匾臓I(yíng)養(yǎng)和細(xì)菌生長(zhǎng)更快。在這種情況下，優(yōu)選使用負(fù)電離模式，以最小化源自培養(yǎng)基的噪音信號(hào)。

在一些情況下，酵母菌株可以在GYP(葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

在一些情況下，絲狀真菌可以在麥芽提取物瓊脂上生長(zhǎng)。

優(yōu)選培育期和環(huán)境條件優(yōu)選與用于所得到的任何比較數(shù)據(jù)的樣品培養(yǎng)相同。

培養(yǎng)可以持續(xù)一段固定的時(shí)間段。這可以是12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)或更長(zhǎng)的時(shí)間。時(shí)間的精確長(zhǎng)度不是特別重要。

培養(yǎng)過(guò)程中，環(huán)境條件優(yōu)選如下；從約15℃或20℃至約25℃或37℃。培養(yǎng)優(yōu)選發(fā)生在空氣中。

附圖說(shuō)明

參照附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的特征，其中：

圖1比較了6種不同的有機(jī)溶劑(NL＝中性脂質(zhì)；PL＝磷脂)的相對(duì)脂質(zhì)提取效率。

圖2示出了向金黃色葡萄球菌施用三種不同的脂質(zhì)提取溶劑，在負(fù)電離模式下得到的三種脂質(zhì)MALDI-MS譜(頂部曲線＝Folch，中間曲線＝丙酮，和底部曲線＝甲醇)。

圖3示出了采用三種不同基質(zhì)物質(zhì)優(yōu)化對(duì)NLs(THAP-Na基質(zhì))、陽(yáng)離子PLs(ATT-DC基質(zhì))和陰離子PLs(9AA-GUA基質(zhì))的檢測(cè)而得到的MALDI-MS譜。

圖4比較了使用三種不同基質(zhì)物質(zhì)在(A)正電離模式和(B)負(fù)電離模式下不同脂類所得到的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度。

圖5示出從血液瓊脂獲得的兩種脂質(zhì)MALDI-MS譜，一個(gè)在正電離模式(下部曲線)獲得，以及一個(gè)在負(fù)電離模式(上部曲線)獲得。

圖6A示出了在負(fù)電離模式檢測(cè)大腸桿菌菌株獲得的脂質(zhì)MALDI-MS譜。這是m/z范圍為500-800代表完整PLs數(shù)據(jù)的MS1質(zhì)譜。插圖示出了在m/z范圍為240-310的相同譜顯示為FA碎片離子的代表性數(shù)據(jù)。

圖6B示出了圖6A中使用的相同的大腸桿菌菌株在m/z范圍為688、702和716的三種主要脂類的MALDI-MS/MS譜。該數(shù)據(jù)通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜法得到。這些都是MS2譜，其允許單獨(dú)的脂質(zhì)被識(shí)別。

圖7A表明在正離子模式下獲得的4種不同微生物的脂質(zhì)MALDI-MS譜(上部曲線-金黃色葡萄球菌，第二個(gè)曲線＝大腸桿菌，第三條曲線＝酵母菌(酵母)，下部曲線＝青霉菌(絲狀真菌)。

圖7B示出在負(fù)離子模式下獲得的相同的4種不同微生物的脂質(zhì)MALDI-MS譜(曲線順序與圖7A相同)。

圖8A示出表1中列出的所有微生物基于正離子模式的MALDI-MS的數(shù)據(jù)的聚類分析。

圖8B示出表1中列出的所有微生物基于負(fù)離子模式的MALDI-MS的數(shù)據(jù)的聚類分析。

圖9示出了表1中列出的4種大腸桿菌菌株在負(fù)離子模式下的MALDI質(zhì)譜，其顯示為(A)m/z范圍為240-310和(B)650-800。

圖10示出表1中列出的細(xì)菌菌株基于負(fù)離子模式的MALDI-MS的數(shù)據(jù)的聚類分析。

圖11示出了說(shuō)明表1中列出的細(xì)菌菌株之間相對(duì)相關(guān)性的最小生成樹(shù)(MST)。

圖12A至C分別表示四個(gè)獨(dú)立的針對(duì)以下的MALDI-MS測(cè)量的脂質(zhì)譜，A)在正離子模式中檢測(cè)NLs，B)在正離子模式檢測(cè)陽(yáng)離子PLs，和C)在負(fù)離子模式檢測(cè)陰離子PLs。

圖13是“多合一”微生物識(shí)別方法的示意圖，包括從相同的微生物(細(xì)胞培養(yǎng))制備用于脂質(zhì)分析的MALDI樣品和用于蛋白質(zhì)分析的MALDI樣品，和隨后兩個(gè)樣品的MALDI-MS的測(cè)量。

圖14A顯示了革蘭氏(-)大腸桿菌DH5D：9AA基質(zhì)的(-)MALDI-MS譜(上部曲線為超聲5-10分鐘之后；下部曲線為冷卻渦旋之后)。

圖14B顯示了革蘭氏(+)金黃色葡萄球菌：9AA基質(zhì)的(-)MALDI-MS譜(上部曲線為超聲5-10分鐘之后；下部曲線為冷卻渦旋之后)。

圖14C顯示了金黃色葡萄球菌：ATT基質(zhì)的(+)MALDI-MS譜(上部曲線為超聲5-10分鐘之后；下部曲線為冷卻渦旋之后)。

圖15顯示了肺炎克雷伯菌采用不同提取溶劑的(-)MALDI-MS譜(上部曲線為乙醇；中部曲線為甲醇；和底部曲線為Folch)。

圖16示出了肺炎克雷伯菌和大腸桿菌的蛋白質(zhì)分型結(jié)果，(A)使用本申請(qǐng)的提取方法；和(B)直接使用細(xì)胞培養(yǎng)物。

圖17示出了不同大腸桿菌菌株的(-)MALDI-MS譜(使用MALDI-QIT-TOF檢測(cè))(上部曲線為EPEC E2347，第二曲線為EIEC E35990，第三曲線為12M050679[大腸桿菌完全敏感]，和下部曲線為DH5α大腸桿菌)。

圖18示出了(-)MALDI脂肪分型聚類分析(m/z 200-900間選定的峰)。

圖19示出了用于酵母和絲狀真菌的蛋白質(zhì)分型結(jié)果(Saramis)。

圖20示出了不同的酵母和真菌的(+)MALDI-MS譜(使用MALDI-TOF檢測(cè))(上部曲線為釀酒酵母；第二曲線為擴(kuò)展青霉菌；第三曲線為赭曲霉；和下部曲線為出芽短梗霉)。

圖21示出了(+)MALDI脂肪型聚類分析。

圖22示出了肺炎克雷伯菌在蛋白質(zhì)m/z范圍的MALDI-MS譜，對(duì)應(yīng)于圖16的蛋白質(zhì)分析。

圖23示出了大腸桿菌DH5D在蛋白質(zhì)m/z范圍的MALDI-MS譜，對(duì)應(yīng)于圖16中的蛋白質(zhì)分析。

具體實(shí)施方式

下面描述的實(shí)施例是說(shuō)明性的，僅作為示例的方式。

方法

微生物的細(xì)胞培養(yǎng)物

培養(yǎng)13種不同的細(xì)菌種類和菌株(列于表1)。菌株于37℃在哥倫比亞血液(CB)瓊脂或基本培養(yǎng)基(LB瓊脂，Sigma)、及標(biāo)準(zhǔn)有氧條件下生長(zhǎng)過(guò)夜(24小時(shí))。

表1：培養(yǎng)的細(xì)菌菌株。菌株6a和6b是溶血葡萄球菌和紋帶棒狀桿菌(C.Striatum)的混合培養(yǎng)物。菌株7和8是抗生素敏感性的，菌株9和10是耐抗生素的和菌株11、12和13是致病性大腸桿菌菌株?；跍y(cè)定最小抑制濃度(MIC)值，針對(duì)17種不同的化合物測(cè)試了抗生素抗性。

同樣培養(yǎng)9種酵母菌株。它們屬于釀酒酵母和庫(kù)德里阿茲威(氏)釀酒酵母，和在GYP(葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨)介質(zhì)中在室溫(25℃)下生長(zhǎng)三天。

也培養(yǎng)絲狀真菌(絲孢綱)。屬于短梗霉屬、曲霉屬、青霉屬、木霉屬、節(jié)擔(dān)菌屬(Waliemia)和毛霉菌屬的真菌在室溫(25℃)下在麥芽提取物瓊脂平板中生長(zhǎng)一周。

微生物脂質(zhì)提取

使用三種脂質(zhì)的提取技術(shù)。

在所有三種技術(shù)中，在CB瓊脂或LB瓊脂(Sigma)中在37℃下過(guò)夜培養(yǎng)含有純細(xì)胞培養(yǎng)物(～10⁶個(gè)細(xì)胞)的一個(gè)10μΙ塑料環(huán)(Nunc)，然后懸浮于500μΙ的雙蒸餾水中，立刻渦旋并在微型離心機(jī)中以3000g離心3分鐘。然后除去上清液，留下細(xì)菌細(xì)胞團(tuán)塊，并將其懸浮在40μΙ的雙蒸餾水中。在進(jìn)行脂質(zhì)提取之前再重復(fù)一次該過(guò)程。

在酵母和絲狀真菌的情況下使用相同的步驟。

方法1：甲醇提取

向懸浮的細(xì)胞團(tuán)中添加200μΙ甲醇(Sigma)。然后微生物細(xì)胞懸浮液在室溫下超聲處理5分鐘，隨后在冰上放置15分鐘。然后將懸浮液渦旋幾秒鐘，在冰上再放置15分鐘，以完成脂質(zhì)提取。然后將所得懸浮液以12000g離心5分鐘以沉淀細(xì)胞碎片。然后將上清液儲(chǔ)存在-20℃直至進(jìn)行MS分析。

方法2：丙酮提取

向懸浮的微生物細(xì)胞團(tuán)中添加200μΙ丙酮。然后將細(xì)菌懸浮液置于冰上30分鐘。然后將所得懸浮液在3000g離心3分鐘。然后將上清液儲(chǔ)存在-20℃直至進(jìn)行MS分析。

方法2a：甲醇：丙酮提取

測(cè)試各種甲醇/丙酮的混合物用于酵母和真菌的脂質(zhì)提取，結(jié)果顯示出各種甲醇/丙酮的混合物均適合于提供良好的質(zhì)譜質(zhì)量。最好混合物范圍為從70:30(體積)至90:10。

方法3：氯仿/甲醇提取

向懸浮的微生物細(xì)胞團(tuán)中添加300μΙ氯仿：甲醇＝70：30(v/v)，然后將其放置在冰上30分鐘。然后將75μΙ的0.7M甲酸添加到細(xì)胞懸浮液并在冰上放置另外15分鐘。然后將細(xì)菌懸浮液渦旋幾秒鐘并置于冰上另外15分鐘，以分離成上層水相上部和下層有機(jī)相。之后將細(xì)胞懸浮液以12000g離心5分鐘，用移液管吸出包含被提取的脂質(zhì)的下相并將其轉(zhuǎn)移至新的樣品瓶。最后脂質(zhì)提取物被儲(chǔ)存在-20℃直至進(jìn)行MS分析。

MALDI樣品制備

使用不同脂類特異性共基質(zhì)系統(tǒng)，以獲得MALDI脂質(zhì)譜。

溶解在包含10mM乙酸鈉的丙酮:甲醇(MeOH)＝70:30(v/v)中的2，4，6-三羥基苯乙酮(THAP)用于檢測(cè)中性脂質(zhì)(如DAGs、TAGs、DGDCs等等)。

溶解在包含10mM檸檬酸氫二銨(DAHC)的乙醇(EtOH)：水(H₂O)＝90:10(v/v)中的6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)用于檢測(cè)陽(yáng)離子磷脂(例如PC、SM)。

溶解在包含5mM的鹽酸胍(GUA)或0.5％吡啶(PYR)作為基質(zhì)添加劑的異丙醇：乙腈(ACN)＝60：40(v/v)中的9-氨基吖啶(9AA)用于檢測(cè)陰離子PLs(如PA、PE、PG、PS、PI、CL)。

將少量體積(如0.3-0.5μΙ)且濃度為10g/L的基質(zhì)點(diǎn)在MALDI靶表面，緊接著是等體積微生物脂質(zhì)提取物。該已知的“干滴技術(shù)”對(duì)于脂質(zhì)分析而言，是靈活的和完全自動(dòng)化的點(diǎn)樣方法[17]。

FlexiMass^TM-DS(島津，曼徹斯特，英國(guó))48孔一次性聚合的目標(biāo)玻片被用作樣品支持物，因?yàn)樗鼈兿鄬?duì)于傳統(tǒng)的不銹鋼靶板(targets)提供了最佳表現(xiàn)而不會(huì)在低質(zhì)量范圍(如m/z<1000)產(chǎn)生任何干擾的背景噪音。

結(jié)晶后，將樣品插入到MALDI質(zhì)譜儀，立即使用攜帶多達(dá)四個(gè)樣品板的特定目標(biāo)適配器(AXIMA-PrecisionTM，島津，曼徹斯特，英國(guó))進(jìn)行分析。

在制備用于蛋白質(zhì)分析的MALDI樣品的情況下，基質(zhì)的溶液由溶解在包含最終濃度為3％TFA的33/33/33乙腈/乙醇/水的1ml的飽和的CHCA溶液組成。

制備：稱取約40毫克的CHCA，將其溶解在包含最終濃度為3％TFA的1mL 33/33/33乙腈/乙醇/水中(預(yù)先制備的)。渦旋混合。在室溫下，得到飽和溶液；離心或允許任何不溶解的固體沉淀。

分析混合物(脂質(zhì)+蛋白質(zhì)顆粒，或僅是蛋白質(zhì)顆粒)：將1μΙ樣品直接轉(zhuǎn)移到MALDI靶，然后添加1μl CHCA基質(zhì)溶液(見(jiàn)上)。

MALDI分析步驟與脂質(zhì)分析相同，除了質(zhì)量范圍不同(2000-22000最大值)以及在正離子模式下進(jìn)行。

MALDI-MS的測(cè)量

使用裝配有氮激光器(λ＝337nm)和用于直接觀察靶表面和研究中的基質(zhì)的集成單色視頻-影像系統(tǒng)(25倍放大倍率)的MALDI-反射-TOF(RTOF)質(zhì)譜儀(AXIMA-CFR+或AXIMA-Performance，島津，曼徹斯特，英國(guó))獲得MALDI脂質(zhì)譜。

離子加速電壓設(shè)為20千伏，以及反射器分析器在25千伏下進(jìn)行操作。使用峰的基線單一同位素質(zhì)量分辨率的離子延時(shí)引出，在正(+)或負(fù)(-)離子模式下進(jìn)行測(cè)量。

根據(jù)制造商的額定值(最大功率180)，將激光能量調(diào)整到激光輻射閾值以上的10-20％(功率90-100)，由此使用被調(diào)整到靶表面上的基質(zhì)斑點(diǎn)的形態(tài)的圓形激光光柵(～500-1000μm直徑)。

微生物識(shí)別

進(jìn)行層級(jí)聚類分析，基于脂質(zhì)/蛋白質(zhì)圖譜的不同，使用市售統(tǒng)計(jì)軟件包DataLab 3.5(http://www.lohninger.com/datalab)和BioNumerics 7.1(應(yīng)用數(shù)學(xué)，比利時(shí))建立可以顯示微生物種類之間的關(guān)聯(lián)性的樹(shù)狀圖(dendrogramme)。在DataLab的情況下，使用歐幾里德距離度量，并且聯(lián)桿類型(linkage type)是基于沃德方法。

統(tǒng)計(jì)分析前，對(duì)MALDI-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行了處理。首先，將每個(gè)單獨(dú)生物的MALDI數(shù)據(jù)導(dǎo)出到所謂的包含m/z值和相應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度的“質(zhì)量名單”至Microsoft Excel 2007。其次，對(duì)來(lái)自所有樣本的m/z值執(zhí)行升序數(shù)據(jù)排列，以及從中減去來(lái)自培養(yǎng)介質(zhì)(如CB或LB瓊脂)的信號(hào)、用于脂質(zhì)提取的信號(hào)管以及基質(zhì)背景信號(hào)(記錄自空白樣品)。這導(dǎo)致了全部樣品中發(fā)現(xiàn)的m/z值和相應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度的一個(gè)數(shù)據(jù)基質(zhì)。第三，將每個(gè)生物體所有峰的信號(hào)強(qiáng)度歸一化為信號(hào)的總和(即顯示為％相對(duì)強(qiáng)度)，并導(dǎo)入到用于聚類分析的軟件程序。

實(shí)施例

實(shí)施例1-提取溶劑的比較

圖1示出了6種不同的有機(jī)溶劑對(duì)帶電荷的磷脂(PLs)和中性脂質(zhì)(NLs)的提取效率。提取效率是基于在MALDI-MS譜中相應(yīng)的脂質(zhì)種類的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)計(jì)算的。

可以看出Folch、MTBE和MeOH溶劑優(yōu)先允許檢測(cè)到PLs，而丙酮?jiǎng)t有利于NLs的檢測(cè)。使用DIPE/BuOH時(shí)觀察到兩種脂類具有幾乎相等的效率，而己烷的結(jié)果最差。

基于這些初步結(jié)果，進(jìn)一步評(píng)價(jià)Folch、MeOH和丙酮在脂質(zhì)提取步驟中的應(yīng)用和在針對(duì)來(lái)自不同的細(xì)菌、酵母和真菌種類的磷脂的MALDI-MS分析。

將這三種溶劑施用于革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌)。從圖2可以看出，甲醇得到帶有最佳信噪比(S/N)的脂質(zhì)MALDI-MS譜。

實(shí)施例2-基質(zhì)物質(zhì)的比較

圖3示出了包含不同脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的混合物的相同樣本的三種不同的質(zhì)譜。根據(jù)上述的方法，使用不同的基質(zhì)物質(zhì)得到質(zhì)譜。由此可以看出，在負(fù)離子模式下，9AA-GUA允許檢測(cè)到大量峰。這些對(duì)應(yīng)于陰離子磷脂。

也可以看出，ATT和THAP在正離子模式均能返回清晰的譜圖。在ATT-DC譜峰對(duì)應(yīng)于陽(yáng)離子磷脂，以及THAP-Na峰對(duì)應(yīng)于中性脂質(zhì)。由此可以看出，在正離子模式下，檢測(cè)到更少的峰。

本申請(qǐng)發(fā)明人評(píng)估了三種不同的基質(zhì)物質(zhì)對(duì)于電離生物膜中存在的不同的主PL類的選擇度。結(jié)果示于圖4。

數(shù)據(jù)顯示，在正離子模式下，來(lái)自等摩爾PL-混合物的陽(yáng)離子磷脂(PC和SM)比陰離子磷脂(如PA、PE、PS)更容易被電離和檢測(cè)到，陰離子磷脂要么沒(méi)有被檢測(cè)到要么僅表現(xiàn)出微弱的信號(hào)(圖2A)。ATT在正電離模式下，在所有磷脂PL范圍內(nèi)的測(cè)試中表現(xiàn)出最好的電離。

與此相反，在負(fù)離子模式下陰離子磷脂(如PA、PE、PG、PS、PI、CL)容易被檢測(cè)到，但是PC和SM無(wú)法被檢測(cè)到(圖2B)。9AA允許對(duì)所有陰離子磷脂幾乎相等的檢測(cè)，而THAP和ATT顯示出傾向PG和PS而非其它PL類的電離。

因此，ATT和9AA分別顯示出在(+)和(-)離子模式下用于微生物脂質(zhì)譜的優(yōu)選基質(zhì)物質(zhì)。這些是優(yōu)選的基質(zhì)組分。

實(shí)施例3-培養(yǎng)介質(zhì)和電離模式的影響

圖5示出了在甲醇脂質(zhì)提取溶劑存在下，來(lái)自血液瓊脂的質(zhì)譜。當(dāng)在(+)的MALDI模式下而非(-)MALDL模式下測(cè)量時(shí)，可以在脂質(zhì)譜質(zhì)量范圍(m/z 700-1500)內(nèi)看到幾個(gè)背景峰。

這是因?yàn)檠涵傊泻幸恍┭獫{脂質(zhì)(例如，源自血細(xì)胞和脂蛋白)，其為主要的陽(yáng)離子PL-類(主要為L(zhǎng)PC、PC和SM)，和它們因此優(yōu)先在(+)離子模式下被檢測(cè)到。

這個(gè)問(wèn)題可以在(+)MALDI模式通過(guò)使用基本培養(yǎng)基(沒(méi)有外源脂質(zhì))代替血液瓊脂來(lái)規(guī)避。所得脂質(zhì)質(zhì)譜基本上是相同的，但含有較少的培養(yǎng)基污染物。然而，使用基本培養(yǎng)基通常導(dǎo)致不太有利的培養(yǎng)條件，并導(dǎo)致更長(zhǎng)的溫育時(shí)間以獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞用于分析。該(-)模式允許在培養(yǎng)中使用血液瓊脂，同時(shí)最小化來(lái)自瓊脂的信號(hào)。

實(shí)施例4-脂肪酸檢測(cè)的

負(fù)電離模式允許檢測(cè)到構(gòu)成脂質(zhì)的脂肪酸殘基分解產(chǎn)生的羧酸根陰離子。這有助于微生物識(shí)別，因?yàn)椴煌木臧ú煌腇As。

圖6A示出了根據(jù)所要求保護(hù)的方法用于大腸桿菌菌株得到的脂質(zhì)MALDl-MS譜。插圖示出了7個(gè)峰，其被認(rèn)為是在大腸桿菌的脂質(zhì)提取物中記錄的PL的7種主要FA-殘基。

基于羧酸鹽離子分配到在MS1模式下記錄的脂質(zhì)譜的特定的峰，在(-)模式下，使用串聯(lián)質(zhì)譜計(jì)算可檢測(cè)的所有完整的PL的FA-組合物。

圖6B示出通過(guò)對(duì)來(lái)自圖6A的質(zhì)譜中三個(gè)最豐富(abundant)的信號(hào)(M/Z 688.5，702.5，716.5)進(jìn)行低能量碰撞誘導(dǎo)解離(CID)分析。

可以清楚地看到，每種MS2譜僅包含一個(gè)在MS1模式下測(cè)定的選定數(shù)量的[RCOO]-離子。基于該信息，可以識(shí)別代表三個(gè)峰的脂質(zhì)種類組合物如下所示：

-PE(16:0/16:1(9Z)),PE(17:1(9Z)/15:0)的m/z值為688.5；

-PE(16:0/17:1(9Z)),PE(17:0/16:1(9Z))的m/z值為702.5；和

-PE(6:0/18:1(9Z)),PE(17:0/17:1(9Z))的m/z值為716.5。

這些發(fā)現(xiàn)與先前公布的通過(guò)(-)LC-ESI-MS/MS獲得的大腸桿菌的脂質(zhì)組成的數(shù)據(jù)相匹配[18]。然而，MALDl-MS分析更簡(jiǎn)單，并可以更快地執(zhí)行。

然而，應(yīng)該指出的是，F(xiàn)A-殘基的確切結(jié)構(gòu)(例如包括鏈支化、環(huán)化或雙鍵的位置)不能使用低能量的CID(例如cy17:0和17:1之間的區(qū)別)闡明。為了得到該信息，使用允許高能量的MALDI-CID-MS/MS的儀器是必要的[19]。

實(shí)施例5-譜的可再現(xiàn)性

通過(guò)對(duì)屬于釀酒酵母和庫(kù)德里阿茲威(氏)釀酒酵母的9種不同的酵母菌株根據(jù)所要求保護(hù)的方法獲得MALDI質(zhì)譜圖。

釀酒酵母的脂質(zhì)組成是眾所周知的[20]。因此，可以將通過(guò)不同質(zhì)譜得到的峰容易地分配到特定的脂質(zhì)。

MALDI脂質(zhì)譜中單個(gè)種類的可再現(xiàn)性測(cè)量為相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度變化(RSIV)，所述RSIV是在(+)和(-)MALDI模式下，使用THAP、ATT和9AA基質(zhì)從同一生物制備的4個(gè)獨(dú)立樣品中記錄到的Nls和PLs的單個(gè)峰的變化系數(shù)(CV)測(cè)定的。參見(jiàn)圖12A到12C。

-與釀酒酵母的主要二酰甘油(DAG)和三酰甘油(TAG)分子種類相關(guān)的14個(gè)峰代表的NL-譜的RSIV顯示平均CV值為10.4±5.2。

-與主要溶血磷脂酰膽堿(LPC)和磷脂酰膽堿(PC)的分子種類相關(guān)的25個(gè)峰代表的陽(yáng)離子PL-譜的RSIV顯示平均CV值為13.2±7.9。

-與主要磷脂酸(PA)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰肌醇相關(guān)的24個(gè)峰代表的陰離子PL-譜的RSIV顯示平均CV值為15.8±10.8。

這些數(shù)據(jù)是在常規(guī)分析系統(tǒng)誤差的范圍內(nèi)。因此，該譜是高度可再現(xiàn)的，并且所要求保護(hù)的方法滿足可靠地用于微生物診斷的要求。

實(shí)施例6-4種不同的微生物種類的分化

對(duì)4種微生物進(jìn)行甲醇脂質(zhì)提取。這些是：

1.金黃色葡萄球菌-革蘭氏陽(yáng)性菌

2.大腸桿菌-革蘭氏陰性菌

3.酵母菌-酵母

4.青霉菌-絲狀真菌

單獨(dú)將每個(gè)脂質(zhì)提取物添加到ATT基質(zhì)中，并在正離子模式下得到MALDI-MS譜。結(jié)果示于圖7A。

單據(jù)將每個(gè)脂質(zhì)提取物添加到9AA基質(zhì)中，并且在負(fù)離子模式下得到MALDI-MS譜。結(jié)果示于圖7B。

對(duì)MALDI質(zhì)譜的目視檢查清楚地表明，微生物可以被區(qū)分。記錄在m/z400-1000之間(最多1500，在負(fù)離子模式下)的包括60-80種選定的脂類相關(guān)的峰基于(+)和(-)MALDI脂質(zhì)譜數(shù)據(jù)的聚類分析，顯示了不同微生物物種之間良好的區(qū)分。參見(jiàn)圖8A和8B。

基于聚類分析的不同微生物分類，其(+)和(-)MALDI模式下的脂質(zhì)譜是基本相同的。這一觀察表明只使用一種電離模式的對(duì)于可靠地區(qū)分微生物是足夠的。

實(shí)施例7-在菌株水平的細(xì)菌區(qū)分

大腸桿菌代表一種與屬于“腸桿菌”科的其他種(如腸桿菌屬，志賀氏菌，沙門(mén)氏菌，克雷伯氏菌屬等)關(guān)系緊密的革蘭氏陰性菌的不同組，，其通常居住在溫血生物體(例如，不同的哺乳動(dòng)物物種包括人類)的腸道。

根據(jù)上述方法分析表1中列出的13種細(xì)菌，包括抗生素抗性、抗生素敏感性和致病性大腸桿菌菌株。

圖9顯示了四種大腸桿菌在m/z范圍為240-400和650-800的MALDI質(zhì)譜。

MALDI-MS譜之間的差異是非常明顯的。特別是，菌株#7和#8(即對(duì)抗生素敏感的兩個(gè))的圖譜與菌株#11和#13(即耐藥株)的圖譜明顯不同。

通過(guò)觀察MALDI-QIT-TOF-MS/MS的FA圖譜(即基于[RCOO]-離子的檢測(cè))(圖9A)，表明，這些差異主要?dú)w因于17:1(cy17：0)和18：1的不同內(nèi)容，其代表由圓圈指出的在m/z 702和716(圖9B)處峰的主要FA殘基。

表1中列出的所有物種的聚類分析顯示了以下兩大主要群體的區(qū)分；

(1)革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌(#1)，表皮葡萄球菌(#3)，及溶血葡萄球菌和紋帶棒狀桿菌的混合培養(yǎng)物(#6)；和

(2)革蘭氏陰性腸桿菌與大腸桿菌三個(gè)子群集及相關(guān)物種(例如，銅綠假單胞菌和糞腸球菌)。

見(jiàn)圖10。

由此，抗生素敏感株(#7)可以清楚地分別從抗生素抗性株(#9、#10)與致腸病菌株EIEC(#11)、EAEC(#12)和EPEC(#13)中區(qū)分。

在聚類分析中，更遠(yuǎn)處的簇中發(fā)現(xiàn)完全敏感性致腎盂腎炎(UPEC)大腸桿菌12M050679菌株(#8)和銅綠假單胞菌和糞腸球菌。

使用其他軟件工具(BioNumerics)對(duì)同一數(shù)據(jù)集也進(jìn)行聚類分析，結(jié)果非常相似。這表明，該方法是穩(wěn)健的。

在所謂的“最小生成樹(shù)”(MST)的形式顯示的結(jié)果，表明我們的研究中分析的不同細(xì)菌的相對(duì)關(guān)聯(lián)性(見(jiàn)圖11)。

其他實(shí)施例及分析

圖13顯示了“多合一”微生物識(shí)別方法(相同微生物的脂質(zhì)指紋圖譜和蛋白質(zhì)指紋圖譜)，其利用快速單步提取(～5-10分鐘，取決于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的剛性)，以及使用甲醇或乙醇和超聲波降解。由此，形成親水性和疏水性分子(即主要是細(xì)胞蛋白質(zhì)和膜脂質(zhì))的均勻懸浮液。這使得允許通過(guò)使用最合適的MALDI基質(zhì)系統(tǒng)(即CHCA用于蛋白質(zhì)；ATT或9AA用于脂質(zhì))及在正和/或負(fù)離子模式下的MALDI-MS分析同時(shí)分析蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，。最后，將獲得的MS數(shù)據(jù)使用生物信息學(xué)軟件工具(例如，多變量數(shù)據(jù)分析)從數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索。

相比已知的用于細(xì)胞提取的方法(例如Bruker)，其耗時(shí)少且靈敏，因?yàn)樗梢员苊獬浞窒礈?、提取、干燥和重懸，其?huì)帶來(lái)樣品流失和修飾的風(fēng)險(xiǎn)(例如人工氧化和降解)。

通過(guò)將分析的有效質(zhì)量范圍從2-20kDa擴(kuò)大到0.2-20kDa，并包含不同類型的分子(如蛋白質(zhì)和脂質(zhì))的信息內(nèi)容，這種方法相對(duì)于僅僅聚焦于蛋白質(zhì)模式識(shí)別(即MALDI蛋白質(zhì)分型)的現(xiàn)存方法具有顯著的改善。

圖14和15示出了通過(guò)MALDI-MS用于分析細(xì)菌脂質(zhì)的單步提取的提高。使用超聲提取方法，可以在比傳統(tǒng)方法更短的時(shí)間內(nèi)獲得來(lái)自革蘭氏陰性(圖14A)和革蘭氏陽(yáng)性(圖14B)的高質(zhì)量質(zhì)譜(5分鐘超聲vs冰上渦旋30分鐘)，使得該方法更適合于日常工作(例如，在臨床實(shí)驗(yàn)室)。此外，可以檢測(cè)到額外的脂質(zhì)種類(例如來(lái)自金黃色葡萄球菌的賴氨酰-PG)，這增加了分析的信息內(nèi)容。例如甲醇或乙醇的使用提高了質(zhì)譜的質(zhì)量(圖15A和15B)，并相比用于脂質(zhì)提取的傳統(tǒng)溶劑(例如氯仿)，其降低了背景信號(hào)(例如，“塑料峰”)的貢獻(xiàn)(圖15C)。

圖16至圖18表明“多合一”方式對(duì)于細(xì)菌識(shí)別的優(yōu)點(diǎn)。圖16顯示了不同大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的SARAMIS搜索結(jié)果?？梢钥闯觯冢D和數(shù)據(jù)計(jì)數(shù)(評(píng)分)的使用單步提取方法((A)藍(lán)色、頂部集、提?。郊状?的確認(rèn)水平相比來(lái)自培養(yǎng)板的直接細(xì)胞分析((B)紅，底部集)基本上更高。在肺炎克雷伯菌包含相比大腸桿菌更為剛性的細(xì)胞壁的情況下，差異尤其明顯。這清楚地表明我們蛋白分型方法的優(yōu)勢(shì)。使用另外的基于在負(fù)離子模式下檢測(cè)脂肪酸(即羧酸根陰離子)和完整的磷脂(PLs)的脂質(zhì)譜的信息內(nèi)容(圖17)，可以得到基于聚類分析的大腸桿菌菌株的清晰分類(圖18)。這允許區(qū)分兩種致病(紅色上部框EIEC E35990，和第三框EPEC E2347)和非致病性(黑色第二個(gè)框12M050679大腸桿菌完全敏感性，和下框DH5阿爾法大腸桿菌)菌株，而基于單獨(dú)的蛋白分型(SARAMIS)則無(wú)法實(shí)現(xiàn)該區(qū)分(圖16)。

這證明了MALDI脂質(zhì)分型(lipotyping)對(duì)于識(shí)別關(guān)系緊密的的細(xì)菌種類提供了附加值。

圖19至21表明“全合一”方式對(duì)于真菌識(shí)別的優(yōu)點(diǎn)。圖19顯示了不同酵母和絲狀真菌的SARAMIS搜索結(jié)果?？梢钥闯?，確認(rèn)水平(列標(biāo)題為“％”)(甚至在從細(xì)胞提取蛋白質(zhì)后)要么非常差要么在許多情況下沒(méi)有有用的用于識(shí)別的質(zhì)譜。這表明了蛋白質(zhì)分型用于識(shí)別酵母菌特別是絲狀真菌的一般問(wèn)題，與大多數(shù)細(xì)菌相比所述絲狀真菌包含更剛性的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。相反，在正離子模式下使用脂質(zhì)譜，隨后是單步提取方法(圖20)，可以得到酵母(例如酵母屬)和不同的絲狀真菌(例如曲霉屬、青霉屬、木霉屬等等)的的良好區(qū)分(圖21)。

圖22和23示出了對(duì)應(yīng)于圖16的蛋白質(zhì)分析的樣品的蛋白質(zhì)m/z范圍。良好信噪比和峰值分辨率有助于高置信水平(圖16的％值)。

關(guān)于將給定微生物的脂質(zhì)組分和蛋白質(zhì)組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行合并，本申請(qǐng)發(fā)明人已獲得釀酒酵母的蛋白質(zhì)質(zhì)譜(使用CHCA基質(zhì))和相同的微生物的脂質(zhì)質(zhì)譜(使用ATT基質(zhì))，然后結(jié)合/合并它們。具體地，通過(guò)合并m/z范圍從500至900的脂質(zhì)數(shù)據(jù)和m/z范圍從2000到15000的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，得到m/z范圍從500到15000的合并數(shù)據(jù)集?；诖撕喜⒌馁|(zhì)譜數(shù)據(jù)的聚類分析，可以使得菌株水平的識(shí)別。

這些結(jié)果證明了結(jié)合脂質(zhì)和蛋白質(zhì)提取的優(yōu)點(diǎn)，以及用于識(shí)別真菌的分析方法的優(yōu)點(diǎn)。在這個(gè)和其他情況下(例如細(xì)菌和真菌孢子、分枝桿菌、脂包膜病毒等)，其中常規(guī)蛋白質(zhì)分型因?yàn)槿狈m當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)提取和/或缺乏信息蛋白圖譜而妥協(xié)，MALDI脂質(zhì)分型(lipotyping)顯示出其具有作為微生物識(shí)別的新的獨(dú)立的工具的潛力。

參考文獻(xiàn)：

以上引用了很多出版物，以便更充分地描述和公開(kāi)本發(fā)明以及與本發(fā)明有關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)。以下提供了這些參考文獻(xiàn)的完整引用。將每個(gè)這些參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容全部并入本文。

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