本發(fā)明涉及一種絲蛋白膜的生物礦化方法，尤其是涉及一種顯著提高絲蛋白膜力學(xué)性能的生物礦化方法，屬于材料的加工方法。

背景技術(shù)：
羥基磷灰石具有良好的生物相容性，是構(gòu)成人體骨骼和牙齒的主要無機(jī)成分。全世界每年因外傷、疾病、遺傳等各種因素造成的骨缺損患者多達(dá)數(shù)千萬人。模擬天然骨骼主要成分，通過礦物質(zhì)和材料相結(jié)合制備的生物支架，使得骨修復(fù)成為一種可能。將天然高分子材料通過礦化的方法，能夠制備出與天然骨成分在物化性質(zhì)上相近的支架材料，這也是是生物支架材料制備中常用的方法。家蠶絲蛋白、野蠶絲蛋白(柞蠶絲和天蠶絲等)和蜘蛛絲等絲蛋白纖維是天然的高分子。絲蛋白纖維具有良好的生物相容性和機(jī)械強(qiáng)度，是一種可降解的生物高分子材料，其降解產(chǎn)物對細(xì)胞或者機(jī)體無毒副作用，也很少產(chǎn)生免疫排斥或者炎癥反應(yīng)，利用絲蛋白的這些優(yōu)點(diǎn)，可將絲蛋白加工成多孔支架或者膜材料，然后進(jìn)行生物礦化，用于科學(xué)研究和臨床應(yīng)用。然而普通的礦化方法(物理或者化學(xué)礦化)使得絲蛋白膜的力學(xué)性能顯著降低，而且普遍存在礦化不完全，容易生成除羥基磷灰石以外的雜物，因此不能滿足科學(xué)研究與生產(chǎn)的需要。如公開日為2012年07月04日，公開號(hào)為CN102532573A的中國專利中，公開了一種絲膠蛋白/羥基磷灰石復(fù)合膜的快速成型方法，該方法是對絲膠蛋白/羥基磷灰石復(fù)合膜進(jìn)行快速成型，但容易生成羥基磷灰石的副產(chǎn)物。綜上所述，目前還沒有一種工序簡單，操作容易，礦化物純凈，又能提高絲蛋白膜力學(xué)性能的仿生礦化方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，利用仿生礦化方法，通過絲蛋白肽鏈中的某些功能基團(tuán)(如羧基)來誘導(dǎo)羥基磷灰石在絲蛋白膜表面的成核，快速地使羥基磷灰石沉積在絲蛋白膜表面。在該礦化體系中，羥基磷灰石提供強(qiáng)有力的剛性，而絲蛋白膜提供較大的延展性，使得羥基磷灰石與絲蛋白膜兩者優(yōu)勢互補(bǔ)，發(fā)明出一種顯著提高絲蛋白膜力學(xué)性能的新型礦化方法。本發(fā)明解決上述問題所采用的技術(shù)方案是如下：一種通過生物礦化提高絲蛋白膜力學(xué)性能的方法，具體包括如下步驟：(1)將絲蛋白水溶液或者絲蛋白粉溶解在六氟丙酮、六氟異丙醇、甲酸等有機(jī)溶劑中，得到絲蛋白溶液，再將絲蛋白水溶液或者絲蛋白溶液滴加到塑料板上，干燥后得到絲蛋白膜；(2)將步驟(1)中的絲蛋白膜進(jìn)行后處理，得到不溶性的絲蛋白膜；(3)將步驟(2)中的絲蛋白膜浸漬于pH值為6.0-8.0的CaCl2水溶液中浸泡半小時(shí)，得到預(yù)礦化的柞蠶絲蛋白膜；(4)將一定量納米羥基磷灰石粉末加入到40mL去離子水中，再加入0.64mL濃度為0.1摩爾每升的HCl，超聲10分鐘，使其形成均一的乳白色懸濁液，為羥基磷灰石工作液；(5)將步驟(4)中的羥基磷灰石工作液，加入3gNaCl和200mL去離子水，持續(xù)攪拌均勻，得到羥基磷灰石礦化液，將步驟(3)中的預(yù)礦化的絲蛋白膜放入羥基磷灰石礦化液中攪拌并緩慢將pH調(diào)至7.4；(6)持續(xù)攪拌0.1-48h，溫度控制在4-100度，使得絲蛋白膜表面逐漸沉積羥基磷灰石晶體，得到礦化的絲蛋白膜；(7)力學(xué)性能測試表明礦化的絲蛋白膜力學(xué)性能顯著提高，紅外光譜和X-射線衍射結(jié)果表明得到的礦化沉積物為單一的羥基磷灰石晶體。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明人MSC細(xì)胞和MG-63細(xì)胞能夠在礦化的絲蛋白膜上粘附與增殖，具有良好的生物相容性。作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述步驟(1)中絲蛋白種類是家蠶絲素、絲膠蛋白、絲腺蛋白、野蠶絲素、絲膠蛋白、蜘蛛絲蛋白、重組絲蛋白、柞蠶絲蛋白中的任意一種。作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述步驟(1)中，溶解絲蛋白的有機(jī)溶劑是六氟丙酮、六氟異丙醇、乙酸、甲酸中的任意一種。作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述步驟(2)中的后處理方法，是將絲蛋白膜浸泡在含甲醇、乙醇、甲醚、乙醚、丙酮和甲基丙二醇中的一種或幾種中溶液中處理0.1-48h。作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述步驟(4)中，使用到的羥基磷灰石粉末為自制或者商業(yè)購買。作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述步驟(4)中，對羥基磷灰石工作液配置，加入的羥基磷灰石粉末與去離子水質(zhì)量比為1：10-1：1000作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述步驟(5)中，絲蛋白膜與礦化液質(zhì)量比為1：10-1：200。本發(fā)明所述的方法工藝簡單，操作容易，制備周期短，生物相容性好。通過這種礦化方法，礦化羥基磷灰石附著在絲蛋白膜的表面，能夠確保得到的無機(jī)礦化物為羥基磷灰石晶體，羥基磷灰石純度很高。這種方法不僅可用于家蠶、野蠶(柞蠶絲和天蠶絲等)和蜘蛛等絲蛋白膜的礦化，甚至可用于其它大分子材料的礦化。本發(fā)明制備的礦化絲蛋白膜材料具有生物相容性。通過此方法礦化后的柞蠶絲素膜楊氏模量可達(dá)70MPa，是普通柞蠶絲素膜的2.5倍。此發(fā)明豐富了生物礦化的類型，為生物材料和組織工程領(lǐng)域提供新思路，具有廣闊的應(yīng)用前景。由于上述技術(shù)方案的運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下突出特點(diǎn)：(1)顯著提高了絲蛋白膜的力學(xué)性能(包括彈性模量和最大應(yīng)力)，通過本發(fā)明制備而成的成品做成的生物膜與家蠶絲素或者其它天然高分子蛋白做成的生物膜相比，具有很高的彈性模量以及應(yīng)力，從而達(dá)到科學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用。(2)操作簡單，生產(chǎn)周期短：提取工藝簡單、高效，沒有復(fù)雜繁瑣的礦化過程，時(shí)間上大為節(jié)省。(3)因?yàn)槭褂酶呒兊牧u基磷灰石晶體，因此礦化過程中得到的晶體始終是羥基磷灰石，沒有其它雜物的污染。(4)良好的生物相容性：絲蛋白膜或者降解物對細(xì)胞或組織無毒性反應(yīng)；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出較高的細(xì)胞粘附率和增殖率，具有良好的生物相容性，生物安全性高，能滿足生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。附圖說明圖1-為實(shí)施例1中幾種礦化時(shí)間不同的絲蛋白膜力學(xué)性能的比較，其中，ASF為柞蠶絲素膜；ASF-8h為礦化8h的柞蠶絲素膜；ASF-24h為礦化24h的柞蠶絲素膜。具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以下實(shí)施例是對本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1本實(shí)施例中生物礦化提高絲蛋白膜力學(xué)性能的方法依次包括如下步驟：(1)將柞蠶絲素粉溶解在六氟丙酮機(jī)溶劑中，得到柞蠶絲素蛋白溶液，再將柞蠶絲素蛋白溶液滴加到塑料板上，干燥后得到絲蛋白膜；(2)將步驟(1)中的絲蛋白膜浸泡在75％的酒精當(dāng)中處理12h，得到不溶性的柞蠶絲素蛋白膜；(3)將步驟(2)中的柞蠶絲素蛋白膜浸漬于pH值為6.0的CaCl2水溶液中浸泡半小時(shí)，得到預(yù)礦化的柞蠶絲素蛋白膜；(4)將1g納米羥基磷灰石粉末加入到40mL去離子水中，再加入0.64mL濃度為0.1摩爾每升的HCl，超聲10分鐘，使其形成均一的乳白色懸濁液，為羥基磷灰石工作液；(5)將步驟(4)中的羥基磷灰石工作液，加入3gNaCl和200mL去離子水，持續(xù)攪拌均勻，得到羥基磷灰石礦化液，將步驟(3)中的預(yù)礦化的柞蠶絲素蛋白膜放入羥基磷灰石礦化液中攪拌并緩慢將pH調(diào)至7.4；(6)持續(xù)攪拌8h，溫度控制在25度，使得柞蠶絲素蛋白膜表面逐漸沉積羥基磷灰石晶體，得到礦化的柞蠶絲素蛋白膜；(7)紅外光譜和X-射線衍射結(jié)果表明得到的礦化柞蠶絲素蛋白膜表面的沉積物為單一的羥基磷灰石晶體；(8)力學(xué)性能測試該礦化的柞蠶絲素蛋白膜，楊氏模量可達(dá)60MPa。彈性模量作為衡量材料產(chǎn)生彈性變形難易程度的指標(biāo)，其值越大，使材料發(fā)生一定彈性變形的應(yīng)力也越大，即材料剛度越大。圖1為實(shí)施例1中幾種礦化時(shí)間不同的絲蛋白膜彈性模量的比較，ASF為柞蠶絲素膜；ASF-8h為礦化8h的柞蠶絲素膜；ASF-24h為礦化24h的柞蠶絲素膜。柞蠶絲素膜作為對照組，在未礦化時(shí)，其楊氏模量約為33MPa；礦化8小時(shí)后，楊氏模量約為50MPa；礦化24小時(shí)后，楊氏模量約為61MPa，與柞蠶絲素膜相比，差異極顯著，**p<0.01。說明通過此礦化方法能夠顯著提高絲蛋白膜的力學(xué)性能，同時(shí)，隨著礦化時(shí)間的增加，絲蛋白礦化膜的力學(xué)性能也逐漸增加。實(shí)施例2本實(shí)施例中促進(jìn)細(xì)胞生長的柞蠶絲素的生物礦化方法依次包括如下步驟：(1)將絲素蛋白粉溶解在六氟異丙醇中，得到絲素蛋白溶液，再將絲蛋白溶液滴加到塑料板上，干燥后得到絲素蛋白膜；(2)將步驟(1)中的絲素蛋白膜浸泡在75％的酒精中處理24h，得到不溶性的絲素蛋白膜；(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膜浸漬于pH值為7.0的CaCl2水溶液中浸泡半小時(shí)，得到預(yù)礦化的絲素蛋白膜；(4)將2g納米羥基磷灰石粉末加入到40mL去離子水中，再加入0.64mL濃度為0.1摩爾每升的HCl，超聲10分鐘，使其形成均一的乳白色懸濁液，為羥基磷灰石工作液；(5)將步驟(4)中的羥基磷灰石工作液加入3gNaCl和200mL去離子水，持續(xù)攪拌均勻，得到羥基磷灰石礦化液，將步驟(3)中的預(yù)礦化的絲素蛋白膜放入羥基磷灰石礦化液中攪拌并緩慢將pH調(diào)至7.4；(6)持續(xù)攪拌24h，溫度控制在25度，使得絲素蛋白膜表面逐漸沉積羥基磷灰石晶體，得到礦化的絲素蛋白膜；(7)紅外光譜和X-射線衍射結(jié)果表明得到的礦化絲素蛋白膜表面的沉積物為單一的羥基磷灰石晶體；(8)力學(xué)性能測試該礦化的柞蠶絲素蛋白膜，楊氏模量可達(dá)70MPa。實(shí)施例3本實(shí)施例中生物礦化提高絲蛋白膜力學(xué)性能的方法依次包括如下步驟：(1)將柞蠶絲素粉溶解在六氟丙酮機(jī)溶劑中，得到柞蠶絲素蛋白溶液，再將柞蠶絲素蛋白溶液滴加到塑料板上，干燥后得到絲蛋白膜；(2)將步驟(1)中的絲蛋白膜浸泡在75％的酒精當(dāng)中處理12h，得到不溶性的柞蠶絲素蛋白膜；(3)將步驟(2)中的柞蠶絲素蛋白膜浸漬于pH值為6.0的CaCl2水溶液中浸泡半小時(shí)，得到預(yù)礦化的柞蠶絲素蛋白膜；(4)將1g納米羥基磷灰石粉末加入到40mL去離子水中，再加入0.64mL濃度為0.1摩爾每升的HCl，超聲10分鐘，使其形成均一的乳白色懸濁液，為羥基磷灰石工作液；(5)將步驟(4)中的羥基磷灰石工作液，加入3gNaCl和200mL去離子水，持續(xù)攪拌均勻，得到羥基磷灰石礦化液，將步驟(3)中的預(yù)礦化的柞蠶絲素蛋白膜放入羥基磷灰石礦化液中攪拌并緩慢將pH調(diào)至7.4；(6)持續(xù)攪拌24h，溫度控制在25度，使得柞蠶絲素蛋白膜表面逐漸沉積羥基磷灰石晶體，得到礦化的柞蠶絲素蛋白膜。(7)MG-63細(xì)胞接種在該礦化的柞蠶絲素蛋白膜上，細(xì)胞能夠在礦化的柞蠶絲素蛋白膜上粘附與增殖，具有良好的生物相容性。實(shí)施例4本實(shí)施例中生物礦化提高絲蛋白膜力學(xué)性能的方法依次包括如下步驟：(1)將柞蠶絲素粉溶解在六氟丙酮機(jī)溶劑中，得到柞蠶絲素蛋白溶液，再將柞蠶絲素蛋白溶液滴加到塑料板上，干燥后得到絲蛋白膜；(2)將步驟(1)中的絲蛋白膜浸泡在75％的酒精當(dāng)中處理12h，得到不溶性的柞蠶絲素蛋白膜；(3)將步驟(2)中的柞蠶絲素蛋白膜浸漬于pH值為6.0的CaCl2水溶液中浸泡半小時(shí)，得到預(yù)礦化的柞蠶絲素蛋白膜；(4)將1g納米羥基磷灰石粉末加入到40mL去離子水中，再加入0.64mL濃度為0.1摩爾每升的HCl，超聲10分鐘，使其形成均一的乳白色懸濁液，為羥基磷灰石工作液；(5)將步驟(4)中的羥基磷灰石工作液，加入3gNaCl和200mL去離子水，持續(xù)攪拌均勻，得到羥基磷灰石礦化液，將步驟(3)中的預(yù)礦化的柞蠶絲素蛋白膜放入羥基磷灰石礦化液中攪拌并緩慢將pH調(diào)至7.4；(6)持續(xù)攪拌24h，溫度控制在25度，使得柞蠶絲素蛋白膜表面逐漸沉積羥基磷灰石晶體，得到礦化的柞蠶絲素蛋白膜。(7)人MSC細(xì)胞接種在該礦化的柞蠶絲素蛋白膜上，細(xì)胞能夠在礦化的柞蠶絲素蛋白膜上粘附與增殖，具有良好的生物相容性。實(shí)施例5本實(shí)施例中生物礦化提高絲蛋白膜力學(xué)性能的方法依次包括如下步驟：(1)將柞蠶絲素粉溶解在六氟丙酮機(jī)溶劑中，得到柞蠶絲素蛋白溶液，再將柞蠶絲素蛋白溶液滴加到塑料板上，干燥后得到絲蛋白膜；(2)將步驟(1)中的絲蛋白膜浸泡在75％的酒精當(dāng)中處理12h，得到不溶性的柞蠶絲素蛋白膜；(3)將步驟(2)中的柞蠶絲素蛋白膜浸漬于pH值為6.0的CaCl2水溶液中浸泡半小時(shí)，得到預(yù)礦化的柞蠶絲素蛋白膜；(4)將1g納米羥基磷灰石粉末加入到40mL去離子水中，再加入0.64mL濃度為0.1摩爾每升的HCl，超聲10分鐘，使其形成均一的乳白色懸濁液，為羥基磷灰石工作液；(5)將步驟(4)中的羥基磷灰石工作液，加入3gNaCl和200mL去離子水，持續(xù)攪拌均勻，得到羥基磷灰石礦化液，將步驟(3)中的預(yù)礦化的柞蠶絲素蛋白膜放入羥基磷灰石礦化液中攪拌并緩慢將pH調(diào)至7.4；(6)持續(xù)攪拌8h，溫度控制在25度，使得柞蠶絲素蛋白膜表面逐漸沉積羥基磷灰石晶體，得到礦化的柞蠶絲素蛋白膜。(7)人HEK-293細(xì)胞接種在該礦化的柞蠶絲素蛋白膜上，細(xì)胞能夠在礦化的柞蠶絲素蛋白膜上粘附與增殖，具有良好的生物相容性。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。