纖維素酶法提取白花蛇舌草多糖的工藝方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于中藥活性成分提取生產(chǎn)工藝領(lǐng)域，具體涉及一種響應(yīng)面分析優(yōu)化纖維素酶法提取白花蛇舌草多糖方法及最佳提取工藝條件。本發(fā)明采用纖維素酶法提取白花蛇舌草多糖，用纖維素酶法熱水浸提、滅活酶、濃縮、醇沉、脫蛋白、醇沉、脫色素、醇沉、提取率測(cè)定等步驟，即按照1：8～12料液比和添加2％左右的纖維素酶熱水浸提兩次，80％醇沉三次，三氯乙酸脫蛋白兩次，活性炭吸附脫色兩次。本發(fā)明由響應(yīng)面三維圖獲得白花蛇舌草多糖最佳提取工藝條件為：PH7左右、溫度55℃、纖維素酶用量2％，在此條件下白花蛇舌草多糖提取率為9.83％。
【專(zhuān)利說(shuō)明】纖維素酶法提取白花蛇舌草多糖的工藝方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥活性成分提取生產(chǎn)工藝領(lǐng)域，具體涉及一種用響應(yīng)面分析優(yōu)化纖 維素酶法提取白花蛇舌草多糖方法及最佳提取工藝條件。

【背景技術(shù)】
[0002] 多糖又稱(chēng)為多聚糖，是由醛糖或酮糖等單糖通過(guò)苷鏈聚合在一起的一類(lèi)天然高分 子化合物，其分子量一般為數(shù)萬(wàn)甚至達(dá)數(shù)百萬(wàn)，廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞膜，植物和微生物細(xì)胞 壁中，到目前為止，已有300多種多糖類(lèi)化合物從天然產(chǎn)物中被提取出來(lái)，其中從中藥材中 獲得的水溶性多糖最為重要。研究表明：中藥多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗 氧化、抗輻射、降血糖、降血脂、保肝等多種功能，其中中藥多糖的免疫調(diào)節(jié)活性及抗腫瘤作 用倍受關(guān)注，是中藥多糖研究的中心課題。目前，多糖提取的主要方法有熱水浸提法、酸浸 提法、堿浸提法、超聲波提取法和微波提取法等，這些方法都存在一定的不足，如提取率較 低、純度不高，或者提取溫度太高破壞多糖活性，或者會(huì)引起多糖分子的降解等。目前，多 糖提取工藝多為均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)，這些設(shè)計(jì)是采用固定其他因素，改變一個(gè)因素的單 因素考察法確定工藝條件，不能考察因素之間的相互作用，同時(shí)也很難考察多個(gè)響應(yīng)值與 因素之間的交互作用關(guān)系，因此精確度不高。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)已開(kāi)始將生物酶應(yīng)用于中藥活 性成分的提取，多糖存在于植物的細(xì)胞壁中，纖維素酶可使纖維素、半纖維素等物質(zhì)降解， 裂解植物的細(xì)胞壁，從而增大細(xì)胞內(nèi)有效成分向提取介質(zhì)的擴(kuò)散而提高多糖得率。響應(yīng)面 分析是一種最優(yōu)化方法，它是將體系的響應(yīng)作為一個(gè)或多個(gè)因素的函數(shù)，運(yùn)用圖形技術(shù)將 這種函數(shù)關(guān)系顯示出來(lái)，以供我們憑借直覺(jué)的觀察來(lái)選擇試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最優(yōu)化條件，可以 準(zhǔn)確找到整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，是理想的方法。響應(yīng)面分析法克 服了正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)只能處理離散的水平值，無(wú)法找出整個(gè)區(qū)域上的最佳組合和響應(yīng)值的最 優(yōu)值的缺陷，用該法研究提取工藝參數(shù)，求得的回歸方程精確度高。白花蛇舌草是茜草科 (Rubiaceae)耳草屬植物白花蛇舌草（Herba Hedyotis.)的干燥全草，白花蛇舌草多糖是 其重要的活性成分，具有抗菌消炎、抗腫瘤和提高機(jī)體免疫功能等作用。為提高白花蛇舌草 多糖的提取率，并準(zhǔn)確地找出工藝條件的最佳組合，本發(fā)明提供了響應(yīng)面分析優(yōu)化纖維素 酶法提取白花蛇舌草多糖的工藝，以酶解與熱水浸提相結(jié)合的方法提取白花蛇舌草多糖， 工藝簡(jiǎn)便、省時(shí)，提取率高；提取工藝采用響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)，所得最佳工藝參數(shù)可靠、精確， 為白花蛇舌草多糖的規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用提供了一種實(shí)用的方法，對(duì)于白花蛇舌草的綜合開(kāi)發(fā) 利用及提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有實(shí)際意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明采用纖維素酶法對(duì)白花蛇舌草多糖進(jìn)行提取，并采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定最佳 工藝條件，最大限度的去除蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)，制備出含量相對(duì)穩(wěn)定的白花蛇舌草多糖。
[0004] 本發(fā)明所用的方法為采用纖維素酶法從白花蛇舌草提取白花蛇舌草多糖的工藝 方法。
[0005] 本發(fā)明采用纖維素酶法提取白花蛇舌草多糖的工藝方法為：將干燥的白花蛇舌 草進(jìn)行粉碎，加入纖維素酶進(jìn)行浸提，酶滅活、濃縮、醇濃、脫蛋白、脫色素步驟，具體要求 為，按照白花蛇舌草與水重量比1 :8?12料液比配制進(jìn)行浸提，在上述料液中加入1. 5? 2. 5%的纖維素酶，用熱水浸提兩次，滅活酶、80%醇沉三次，三氯乙酸脫蛋白兩次，活性炭 吸附脫色兩次，苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量和提取率。工藝分為：添加纖維素酶熱水浸提、 滅活酶、濃縮、醇沉、脫蛋白、醇沉、脫色素、醇沉等步驟，具體按如下步驟進(jìn)行：
[0006] (1)添加纖維素酶熱水浸提：兩次浸提，將白花蛇舌草粉碎過(guò)40目篩。稱(chēng)取白花 蛇舌草粉末，按重量比1 :8?12的料液比加入水，混合均勻；用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH為7左 右，添加1. 5?2. 5 %的纖維素酶，混勻，55°C水浴攪拌浸提60分鐘；90°C滅活酶10分鐘， 抽濾得濾液；將濾渣按重量比1 :8?12的料液比加入水，混合均勻，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH 為7左右，添加1. 5?2. 5 %的纖維素酶，混勻，55°C水浴攪拌浸提60分鐘；90°C滅活酶10 分鐘，抽濾得濾液；合并兩次濾液。
[0007] (2)濃縮：將濾液真空旋轉(zhuǎn)減壓濃縮至濃度為含生藥0. 5?1克/毫升左右，放至 室溫；
[0008] (3)第一次醇沉：濃縮液中加入95%乙醇至醇濃度為80%，邊加邊攪拌，密封蓋 嚴(yán)，靜置24?48小時(shí)；抽濾，得白花蛇舌草粗多糖；
[0009] (4)脫蛋白：將白花蛇舌草粗多糖加適量水溶解，白花蛇舌草粗多糖與水比例w:v 為1:1?1. 5kg/L，加等體積5%的三氯乙酸，邊加邊攪拌，靜置60分鐘，3000rmp離心5分 鐘，取上清液；再重復(fù)以上操作進(jìn)行第二次脫蛋白，得脫蛋白多糖溶液；
[0010] (5)第二次醇沉：脫蛋白多糖液中加入95%乙醇至醇濃度為80%，邊加邊攪拌，密 封蓋嚴(yán)，靜置24?48小時(shí)；抽濾，無(wú)水乙醇洗滌2-3次，真空干燥，得脫蛋白多糖；
[0011] (6)脫色素：將以上所得多糖用適量水溶解，白花蛇舌草粗多糖與水比例w:v為 1:1?1. 5kg/L，加入重量1%的活性炭，混勻，加熱至80°C攪拌30分鐘，過(guò)濾，取濾液。濾 液再按照以上重復(fù)操作一次，得脫色素多糖溶液；
[0012] (7)第三次醇沉：將以上制得的脫色素多糖液加入95%乙醇至醇濃度為80%，邊 加邊攪拌，密封蓋嚴(yán)，靜置24小時(shí)；抽濾，無(wú)水乙醇洗滌2-3次，真空干燥，得精制多糖。采 用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，并計(jì)算多糖得率。
[0013] 本發(fā)明應(yīng)用了響應(yīng)面分析優(yōu)化設(shè)計(jì)的方法對(duì)多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)。
[0014] (1)各單因素對(duì)白花蛇舌草多糖提取率的影響
[0015] 1)纖維素酶用量對(duì)多糖提取率的影響：纖維素酶用量對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)表 1。從表1可以看出，隨著纖維素酶用量的增加，多糖的提取率也隨之增大，當(dāng)纖維素酶用量 達(dá)2%時(shí)，繼續(xù)增加纖維素酶用量，多糖提取率基本不再增加。
[0016] 表1纖維素酶用量對(duì)多糖含量和多糖提取率的影響

【權(quán)利要求】
1. 一種纖維素酶法提取白花蛇舌草多糖的工藝方法，其特征在于：按照白花蛇舌草與 水重量比1 :8?12的料液比配制提取液，在提取液中添加纖維素酶熱水浸提，80%醇沉，脫 蛋白，脫色素，最后精制而成； 具體按如下步驟進(jìn)行： (1) 熱水浸提：將白花蛇舌草進(jìn)行粉碎，過(guò)40目篩，按1 :8?12重量比的料液比加入 水配制成白花蛇舌草提取液；用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH為7,加入1. 5?2. 5%的纖維素酶，混 勻，55°C水浴攪拌加熱提取60分鐘，抽濾得濾液；將濾渣按1 :8?12重量比的料液比加入 水，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH為7,再加入1. 5?2. 5%的纖維素酶，混勻，55°C水浴攪拌加熱提 取60分鐘再提取一次，抽濾得濾液，合并兩次濾液，對(duì)濾液進(jìn)行90°C滅活酶10分鐘； (2) 濃縮：將濾液真空旋轉(zhuǎn)減壓濃縮至濃度為含生藥0. 5?1克/毫升，放至室溫； (3) 第一次醇沉：在濃縮液中加入95%乙醇至醇濃度為80%，邊加邊攪拌，密封蓋嚴(yán)， 靜置24?48小時(shí)；抽濾，得白花蛇舌草粗多糖； (4) 脫蛋白：將白花蛇舌草粗多糖加適量水溶解，加等體積5%的三氯乙酸，邊加邊攪 拌，靜置60分鐘，3000rmp離心5分鐘，取上清液，再重復(fù)以上操作進(jìn)行第二次脫蛋白，得脫 蛋白多糖溶液； (5) 第二次醇沉：在脫蛋白后的白花蛇舌草多糖液中加入95%乙醇至醇濃度為80%， 邊加邊攪拌，密封蓋嚴(yán)，靜置24?48小時(shí)；抽濾，用無(wú)水乙醇洗滌2-3次，真空干燥，得白花 蛇舌草多糖； (6) 脫色素：將白花蛇舌草多糖用適量水溶解，加入重量1 %的活性炭，混勻，加熱至 80°C溫度攪拌30分鐘，過(guò)濾，收取濾液；將濾液加入重量1 %的活性炭，混勻，加熱至80°C溫 度攪拌30分鐘，過(guò)濾，得脫色素白花蛇舌草多糖溶液； (7) 第三次醇沉：將脫色素白花蛇舌草多糖液加入95%乙醇至醇濃度為80%，邊加邊 攪拌，密封蓋嚴(yán)，靜置24小時(shí)；抽濾，用無(wú)水乙醇洗滌2-3次，真空干燥，得精制白花蛇舌草 多糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶法提取白花蛇舌草多糖的工藝方法，其特征在于： (1)取白花蛇舌草進(jìn)行粉碎，過(guò)40目篩，稱(chēng)取白花蛇舌草粉末20克，加水至200毫升，混合 均勻；用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH為7左右，在料液中添加2%的纖維素酶，混勻，55°C水浴攪拌 浸提60分鐘；對(duì)濾渣進(jìn)行第二次熱水浸提，加水至200毫升，混合均勻，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié) pH為7左右，添加2%的纖維素酶，混勻，55°C水浴攪拌浸提60分鐘，抽濾得濾液，合并二次 濾液進(jìn)行90°C滅活酶10分鐘； (2) 濃縮：將濾液真空旋轉(zhuǎn)減壓濃縮至30?40毫升，放至室溫； (3) 第一次醇沉：以上制備的濃縮液中加入95%乙醇至醇濃度為80%，邊加邊攪拌，密 封蓋嚴(yán)，靜置24小時(shí)；抽濾，真空干燥，得白花蛇舌草粗多糖； (4) 第一次脫蛋白：將以上所制得的白花蛇舌草粗多糖加20?30毫升超純水溶解，力口 等體積5%的三氯乙酸，邊加邊攪拌，靜置60分鐘，3000rmp離心5分鐘，取上清液； (5) 第二次脫蛋白：將上清液再加等體積5%的三氯乙酸，邊加邊攪拌，靜置60分鐘， 3000rmp離心5分鐘，取上清液，得脫蛋白多糖溶液； (6) 第二次醇沉：以上脫蛋白多糖溶液中加入95%乙醇至醇濃度為80%，邊加邊攪拌， 密封蓋嚴(yán)，靜置24小時(shí)；進(jìn)行抽濾，用無(wú)水乙醇洗滌2?3次，脫蛋白多糖與無(wú)水乙醇w:v 為1:3?5kg/L，真空干燥，得脫蛋白多糖； (7) 第一次脫色素：將以上制得的脫蛋白多糖加20?30毫升超純水溶解，按照1%重 量加入活性炭，攪勻，加熱至80°C攪拌30分鐘，過(guò)濾，取濾液； (8) 第二次脫色素：將以上所得濾液再按照1%濃度加入活性炭攪勻，加熱至80°C攪拌 30分鐘，過(guò)濾，取濾液； (9) 第三次醇沉：將以上制得的脫色素多糖液加入95%乙醇至醇濃度為80%，邊加邊 攪拌，密封蓋嚴(yán)，靜置24小時(shí)；抽濾，無(wú)水乙醇洗滌2-3次，真空干燥，得白花蛇舌草精制多 糖1. 76?1. 79克。
【文檔編號(hào)】C08B37/00GK104059159SQ201410269480
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月17日
【發(fā)明者】賀建華, 符晨星, 瞿俊勇, 游思湘, 劉湘新 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)