3D體外雙相軟骨-骨構建物發(fā)明背景多種疾病與關節(jié)軟骨的退行性變化或骨髓中的誤導(misguided)分化過程有關。肌肉-骨骼系統(tǒng)的疾病代表德國疾病治療中繼心血管系統(tǒng)疾病和消化系統(tǒng)疾病之后的第三大高成本集中因素。成功治療這種疾病的一個先決條件是了解骨髓中造成這些疾病或與其有關的細胞過程。因此，通過置換患者的造血系統(tǒng)來治療例如白血病是可能的。但是，還有自身免疫性疾病，如類風濕性關節(jié)炎或紅斑狼瘡，也被長壽命的血漿和居于骨髓特化生態(tài)位的記憶T細胞調節(jié)。骨髓是多功能的多細胞組織，其與其他物質位于長骨腔中。在軟骨內骨化的背景下——長骨發(fā)育，在第4個月左右胚胎發(fā)育期間，組織發(fā)育。骨髓的特征在于多孔結構，其由松質骨和充滿大量薄壁血管的特化結締組織——骨髓竇狀隙——形成。骨髓的主要功能之一是為造血系統(tǒng)中造血細胞分化提供適當的環(huán)境。造血干細胞(HSC)代表這些分化過程的起點，其中造血干細胞以未分化的狀態(tài)居于骨髓松質骨結構的造血干細胞生態(tài)位中。造血干細胞生態(tài)位被分成兩種功能不同的亞型。在成骨細胞-生態(tài)位中，造血HSCs通過不同的附著和信號傳導分子與特化成骨細胞相互作用，從而使HSCs保持處于圓形非增殖狀態(tài)。在發(fā)動HSCs后，干細胞遷移至位于竇狀隙的血管干細胞生態(tài)位，在此HSCs呈現(xiàn)增殖增加。根據當今對骨髓中的造血干細胞生態(tài)位的理解，干細胞生態(tài)位系統(tǒng)的最小單位由成骨細胞生態(tài)位和位于松質骨竇狀隙血管的血管生態(tài)位的組合形成。除干細胞生態(tài)位的功能結構外，當前的研究公開了骨髓作為免疫學記憶的來源。間充質基質細胞(MSC)充當血漿和記憶T細胞的存活生態(tài)位的細胞構建件。總之，骨髓的生物學功能性取決于多種細胞，如HSC、MSC、內皮細胞和成骨細胞，及其在空間隔室中的適當相互作用。關節(jié)的透明軟骨，由于其對于壓力高彈性的性質和非常均勻的表面，允許關節(jié)弱摩擦運動。該組織的主要部分由多種胞外基質蛋白形成，而細胞組分——軟骨細胞——單獨或以小組(硫酸軟骨素)稀少地嵌入該基質中。神經纖維和血管的缺乏和導致的組織的氧和營養(yǎng)物低供給，為軟骨細胞生成獨特的微環(huán)境。軟骨組織可分成多個層，其中，由于基質分子的水平定向，最上層可抵抗摩擦，并且由于垂直定向，下方中層和下層可吸收源自運動的沖擊力。雖然軟骨細胞在間充質凝聚初始過程的軟骨內骨化過程早期出現(xiàn)并且這些細胞顯著貢獻于骺過程的骨生長，但關節(jié)中的透明軟骨組織僅在胚胎發(fā)生過程的很晚的時間點發(fā)育。軟骨的完全分化的全功能層僅在出生后通過開始組織的機械刺激才形成。在成年生物體內，軟骨組織的穩(wěn)態(tài)高度依賴于嵌入軟骨細胞的機械負載和微環(huán)境的種類和強度。已做出大量努力以開發(fā)和提供骨和軟骨組織的體外模型和測試系統(tǒng)。但是，這些方法涉及單獨提供骨或軟骨組織。因此，這些模型僅部分地和不充分地代表發(fā)生骨、骨髓和軟骨組織的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)的天然環(huán)境。本發(fā)明的一個目的是克服現(xiàn)有技術的一個或多個問題。

技術實現(xiàn)要素：
第一方面，本發(fā)明涉及三維(3D)體外模型，其考慮軟骨和骨組織的緊密相互作用和協(xié)作。本發(fā)明提供3D體外雙相軟骨-骨類器官(organoid)，包括：a)人造軟骨組織層；和b)人造骨組織層，其中人造骨組織包括結構提供支架和骨髓結構；其中人造軟骨組織層接觸人造骨組織層的至少一個表面。人造軟骨組織3D體外雙相軟骨-骨類器官可利用間充質祖細胞制備，優(yōu)選利用這樣的間充質祖細胞：其包括至少50％的下列細胞或由下列細胞組成：CD105+、CD106+、CD44+、CD73+、CD90+和CD13+，更優(yōu)選來自分離的原代軟骨細胞。具體地，人造軟骨組織可通過下文所述的本發(fā)明方法制備。本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官的人造骨組織的骨髓結構通過在結構提供支架上接種間充質干細胞來制備。人造骨組織的骨髓結構優(yōu)選通過如下制備：在結構提供支架上接種間充質干細胞，和在結構提供支架上培養(yǎng)間充質干細胞2至10天，優(yōu)選5至8天，更優(yōu)選7天后，添加造血干細胞。本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官的人造骨組織的結構提供支架優(yōu)選包括下列或由下列組成：生物學或非生物學材料，更優(yōu)選3D陶瓷支架。根據另一方面，本發(fā)明涉及生產本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官的方法。所述方法包括下列步驟或由下列步驟組成：-在結構提供支架上接種間充質干細胞；-在所述結構提供支架上培養(yǎng)所述間充質干細胞2至10天，優(yōu)選5至8天，更優(yōu)選7天；-向結構提供支架上培養(yǎng)的間充質干細胞添加造血干細胞，和培養(yǎng)所得混合物至少5天，優(yōu)選5天至8周，更優(yōu)選1周至4周，從而制備人造骨組織層，其包括接種有骨髓結構的結構提供支架；-提供通過權利要求13至15中任一項所述方法制備的人造軟骨組織；和-將所述人造軟骨組織層布置于所述人造骨組織層的至少一個表面上。根據另一方面，本發(fā)明涉及移植物，其包括本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官。進一步，本發(fā)明提供藥物組合物，其包括本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官或本發(fā)明的移植物和至少一種藥學上可接受的賦形劑。本發(fā)明還涉及體外篩選調節(jié)軟骨或骨組織的性質的物質的方法，包括下列步驟：-提供本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官的樣品；-將各個樣品分成多個部分；-用待篩選物質溫育至少一個部分；和-比較已處理部分與未用待篩選物質溫育的另一部分的測量參數。根據本發(fā)明的進一步方面，提供自我包含式3D體外雙相軟骨-骨類器官在芯片上的裝置，其包括至少一個介質供給儲器、至少一個器官生長部件，該器官生長部件包括至少一個器官腔，容納本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官，其中介質供給儲器通過微流體供給通道連接于該至少一個器官生長部件。本發(fā)明還涉及制備軟骨形成細胞聚集體的方法，包括步驟：a)提供間充質祖細胞；和b)在非附著條件下培養(yǎng)間充質祖細胞，以形成軟骨形成細胞聚集體。本方法使用的間充質祖細胞優(yōu)選包括至少50％的下列細胞或由下列細胞組成：CD105+、CD106+、CD44+、CD73+、CD90+和CD13+。更優(yōu)選地，所述間充質祖細胞包括下列或由下列組成：分離的原代軟骨細胞。本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)：骨組織或軟骨組織的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)受這兩種組織的存在和相互作用影響。早已知道，骨組織的形成和分化受施加于發(fā)育中的骨的物理力的存在、延伸和方向影響。在天然環(huán)境中，這些力通常通過其與軟骨組織的接觸表面施加于骨組織。軟骨組織的一個功能是使來自身體運動的沖擊力適當地轉移至下方骨組織。這種相互作用不僅對骨組織的定向和強度有影響，而且還影響骨中骨髓和干細胞生態(tài)位的限定和組構(organization)。毫無疑問，骨髓和干細胞生態(tài)位的組構和分化對個體免疫系統(tǒng)具有顯著影響。因此，兩種組織——骨組織和軟骨組織——應被認為形成一個共同的器官。本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官表現(xiàn)了這種情況，并且允許模擬這兩種組織的存在對骨組織——分別對骨髓和干細胞生態(tài)位的組構和分化——和軟骨組織的發(fā)育和分化的影響。因此，本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官第一次能夠研究這兩種組織類型的緊密相互作用的相互影響。具體地，如果將3D體外雙相軟骨-骨類器官用于測試系統(tǒng)——其中人造軟骨組織層可通過機械刺激暴露于限定物理力，則提供這樣的模型系統(tǒng)：接近地模擬天然情況，因此能夠實現(xiàn)對這些組織生物學的新見解，以及能夠實現(xiàn)對與這些組織或過程相互作用的物質的適當篩選系統(tǒng)。在下文中，更詳細地提供本發(fā)明的不同方面。如此限定的各方面可與任意其他一個或多個方面組合，除非明確相反陳述。具體地，作為優(yōu)選或優(yōu)勢顯示的任意特征可與作為本發(fā)明的部分顯示或作為優(yōu)選或優(yōu)勢顯示的任意其他一個或多個特征組合。本發(fā)明涉及3D體外雙相軟骨-骨類器官?；诒景l(fā)明的目的，術語“類器官”表示體外不同細胞類型的人造的、從頭生成的、功能細胞聚集體，其顯示出各器官或組織的至少一個一般功能，優(yōu)選顯示各器官或組織的大部分一般功能。本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官包括人造軟骨組織層。人造軟骨組織是從頭和體外制備和組裝的軟骨組織。通常，人造軟骨組織包括完全或至少部分分化的軟骨細胞和胞外基質組分——包括膠原蛋白II、IX和XI。技術人員可利用多種技術制備體外人造軟骨組織。由于軟骨組織通常不止包括軟骨細胞的簡單2D層，優(yōu)選3D培養(yǎng)技術生成的人造軟骨組織。適當的技術被總結于Tortelli和Cancedda中(“Three-dimensionalculturesofosteogenicandchondrogeniccells:Atissueengineeringapproachtomimicboneandcartilageinvitro”,EuropeanCellsandMaterials(2009),17,1-14)。人造軟骨組織層可例如得自如下技術：包括通過水凝膠封裝、微團(micromass)培養(yǎng)、形成高密度細胞團塊和應用生物相容性可降解的或非可降解的支架來培養(yǎng)和/或組構細胞或細胞聚集體。根據本發(fā)明的制備人造軟骨組織的另一優(yōu)選方法在下文中被進一步描述為制備軟骨形成細胞聚集體的方法。為提供人造軟骨組織層，利用間充質干細胞(MCS)——也被稱為間充質祖細胞——制備人造軟骨組織。優(yōu)選地，利用分離的間充質祖細胞。術語“分離的”意為間充質祖細胞是已被從天然來源分離，或代表其子代——例如已通過細胞增殖而衍生——的細胞。所用間充質祖細胞優(yōu)選衍生自供體——個體或患者——的軟骨組織。優(yōu)選地，間充質祖細胞是還未被轉化或永生化的原代細胞。具體地，間充質祖細胞可包括成年間充質祖細胞或由成年間充質祖細胞組成。這種成年間充質祖細胞衍生自供體——個體或患者——的非胚胎軟骨組織。間充質祖細胞可衍生自已分化以包括軟骨組織的任意供體組織的軟骨組織。優(yōu)選地，間充質祖細胞衍生自關節(jié)的軟骨組織，更優(yōu)選供體的膝或肘的軟骨。間充質祖細胞優(yōu)選是人細胞。人間充質祖細胞衍生自人源的軟骨組織。間充質祖細胞可包括至少50％的如下細胞：CD105+、CD106+、CD44+、CD73+、CD90+和CD13+，或可由如下細胞組成：CD105+、CD106+、CD44+、CD73+、CD90+和CD13+。優(yōu)選地，間充質祖細胞包括下列或由下列組成：分離的原代軟骨細胞，如例如人原代軟骨細胞。本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官包括人造骨組織層，其中人造骨組織包括結構提供支架和骨髓結構。人造骨組織是已從頭和體外制備和組裝的骨組織。通常，人造骨組織包括完全或部分分化的成骨細胞、破骨細胞和造血干細胞。技術人員可利用多種技術制備體外人造骨組織。由于骨組織通常不止包括某細胞類型的簡單2D層，優(yōu)選3D培養(yǎng)技術生成的人造骨組織。適當的技術被總結于Tortelli和Cancedda中(“Three-dimensionalculturesofosteogenicandchondrogeniccells:Atissueengineeringapproachtomimicboneandcartilageinvitro”,EuropeanCellsandMaterials(2009),17,1-14)。人造骨組織層可例如得自如下技術：包括通過微團培養(yǎng)和應用生物相容性可降解的或非可降解的支架來培養(yǎng)和/或組構細胞或細胞聚集體。適當的培養(yǎng)技術和支架在本領域已知。例如可應用包括生物學或非生物學材料或由生物學或非生物學材料組成的生物可降解的或非可降解的支架。合成型聚合物用作支架以及膠原蛋白型支架、金屬型支架如例如鈦型支架、或陶瓷型支架的應用已被描述。用于制備人造骨組織的細胞可包括間充質干細胞(MSC)和造血干細胞(HSC)。優(yōu)選地，應用分離的MSCs和/或分離的HSCs。術語“分離的”意為MSCs和/或HSCs是已被從天然來源分離或代表其子代——例如已通過細胞增殖衍生——的細胞。所用的MSCs和/或HSCs優(yōu)選衍生自供體——個體或患者——的適當組織。優(yōu)選地，MSCs和/或HSCs是還未轉化或未永生化的原代細胞。具體地，MSCs和/或HSCs可包括下列或由下列組成：成年MSCs和/或HSCs。這種成年MSCs和/或HSCs衍生自供體——個體或患者——的非胚胎組織，優(yōu)選骨或骨髓組織。MSCs和/或HSCs優(yōu)選是人細胞。人MSCs和/或HSCs優(yōu)選衍生自人源骨或骨髓組織。根據本發(fā)明的制備人造骨組織的優(yōu)選方法包括在陶瓷3D支架上接種和培養(yǎng)MSCs。將被棲居的陶瓷3D支架培養(yǎng)預定時間段，隨后可添加HSCs。在優(yōu)選的實施方式中，在陶瓷支架上培養(yǎng)MSCs2至10天后添加HSCs。然后將被棲居的陶瓷3D支架在靜態(tài)培養(yǎng)條件下或在連續(xù)營養(yǎng)物供應灌注系統(tǒng)中進一步培養(yǎng)。生成人造骨組織的技術可被進一步改動。例如，可添加生長因子或其他信號傳導分子以支持骨髓功能?？蓱玫脱鯒l件，其類似于骨髓必須面對的天然條件。培養(yǎng)時間以及給予支架不同細胞類型的順序可能必須被優(yōu)化。除MSCs和HSCs外，進一步的細胞類型也可用于生成人造骨組織。這些另外的細胞可包括通常存在于骨或骨髓結構中的細胞類型，例如免疫細胞、內皮細胞及類似細胞類型。本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官可用作體外和/或體內的研究工具。其可用于研究生物學或其組分的一種或多種?？蛇x地，其可用于體外和/或體內篩選調節(jié)軟骨或骨組織性質的物質的方法。本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官的移植物和包括本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官或本發(fā)明的移植物和至少一種藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。在進一步方面，本發(fā)明涉及體外篩選調節(jié)軟骨或骨組織性質的物質的方法，包括步驟：-提供本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官的樣品；-將各樣品分成多個部分；-用待篩選物質溫育至少一個部分；和-比較已處理部分與未用待篩選物質溫育的另一部分的測量參數。在優(yōu)選的實施方式中，在用待篩選物質溫育該部分前，使該部分經過自我包含式器官在芯片上的裝置。簡言之，本發(fā)明方法，通過本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官，使對軟骨或骨組織產生影響的物質的鑒定和分析成為可能。樣品——根據本發(fā)明應被理解為包括一定數量的產物對象——被分成多個部分。提供至少兩個子組；一組用于篩選，而另一組充當陰性對照。優(yōu)選地，篩選部分的數量超過對照部分的數量。通常，多個部分進行高通量篩選。在本發(fā)明方法中待篩選的物質不以任何方式受限。在本發(fā)明的實施方式中，物質選自核酸——包括RNAi、核糖酶、適配子(aptamers)、抗體、肽、糖、聚合物、分子量在50和1.000Da之間的小分子、和蛋白質——優(yōu)選抗體、細胞因子和脂鈣蛋白。這些物質通常可在庫中獲得。優(yōu)選在樣品的不同部分中溫育單種化合物。但是，也可以通過在一個部分中溫育至少兩種物質來研究物質的協(xié)同效應。將另一個子組的對象在不存在物質的情況下同時溫育。溫育過程取決于多種參數，例如細胞類型和檢測靈敏度，其優(yōu)化按照本領域技術人員已知的常規(guī)程序。根據本發(fā)明的有效物質鑒定優(yōu)選間接進行，例如通過確定改變的表達圖譜和/或細胞生活力?？稍谔囟〞r間進行確定，并與實驗開始時的信號強度和陰性對照關聯(lián)。適當的測試本領域技術人員已知或可容易按常規(guī)設計。本發(fā)明還公開了自我包含式3D體外雙相軟骨-骨類器官在芯片上的裝置，其包括如WO2009/146911描述的自我包含式器官在芯片上的裝置和本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官。形成本發(fā)明的自我包含式3D體外雙相軟骨-骨類器官在芯片上的裝置，以允許建立或保持小型化芯片形式的本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官，小型化芯片形式適于通過活細胞成像和例如雙光子顯微術在線觀察及其如下的應用：例如測試化合物的活性、藥效學和藥代動力學，或研究器官或類器官和干細胞生態(tài)位的自組裝、穩(wěn)態(tài)、破壞、再生或相互作用，以及成熟、衰老、死亡和生物鐘學現(xiàn)象。因此，本發(fā)明的自我包含式3D體外雙相軟骨-骨類器官在芯片上的裝置包括至少一個介質供給儲器、至少一個器官生長部件——包括至少一個器官腔，容納本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官，其中介質供給儲器通過微流體供給通道連接于至少一個器官生長部件。本發(fā)明的主題允許建立包括軟骨和骨組織的類器官的小型化體外培養(yǎng)物。所得的本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官例如在允許連續(xù)供應氧和營養(yǎng)物的條件如例如連續(xù)灌注條件下培養(yǎng)時適于上至3個月的長時間培養(yǎng)。本發(fā)明的主題允許機械刺激的整合——以模擬例如源自身體運動的物理力，和類器官中血管結構的引入——因此，提供接近于天然情況的環(huán)境?；谶@些性質，本發(fā)明的主題允許產生在組織工程、細胞和組織分化分子生物學以及再生藥物領域的多種科學發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的主題還可導致成本和勞動密集型動物實驗被體外測試替代。當前，還未有嘗試提供與長期培養(yǎng)技術如灌注培養(yǎng)相容并且允許引入血管系統(tǒng)的、在一個單獨的整合系統(tǒng)中組合功能上相互關聯(lián)的組織骨、骨髓和軟骨的3D體外類器官。通過使系統(tǒng)暴露于機械力或其他刺激，將會在此前從未達到的程度上模擬天然環(huán)境。另一方面，本發(fā)明涉及體外制備軟骨形成細胞聚集體的方法。該方法包括步驟：a)提供分離的間充質祖細胞；和b)在非附著條件下培養(yǎng)間充質祖細胞，以形成軟骨形成細胞聚集體。已經驚人地發(fā)現(xiàn)，分離的間充質祖細胞能夠形成三維細胞聚集體，其呈現(xiàn)軟骨形成分化，而不影響胚胎細胞。這種效果通過在非附著條件下培養(yǎng)間充質祖細胞而實現(xiàn)?？娠@示，在這種非附著培養(yǎng)條件下，間充質祖細胞相互自由排列并凝聚成細胞聚集體，其呈現(xiàn)對軟骨形成分化的特異性標記的表達，并且因此指示軟骨形成細胞聚集體。在下文中，更詳細地提供本發(fā)明的不同方面。如此限定的各方面可與任意其他方面或方面組合，除非明確相反陳述。具體地，作為優(yōu)選或優(yōu)勢顯示的任意特征可與作為本發(fā)明的部分顯示或作為優(yōu)選或優(yōu)勢顯示的任意其他特征或特征組合。本發(fā)明的方法涉及體外軟骨形成細胞聚集體的制備?；诒景l(fā)明的目的，術語“軟骨形成細胞聚集體”指代呈現(xiàn)對軟骨細胞或軟骨組織特異的至少一個功能的功能細胞聚集體。優(yōu)選地，本發(fā)明的軟骨形成細胞聚集體呈現(xiàn)分化軟骨細胞或軟骨組織的大部分或基本上全部的器官或組織功能。具體地，本發(fā)明的軟骨形成細胞聚集體可表現(xiàn)如同功能軟骨組織和/或能夠在體外和/或體內誘導軟骨發(fā)育或分化。本發(fā)明的軟骨形成細胞聚集體可特征在于與軟骨細胞或軟骨組織發(fā)育或分化有關的標記基因或蛋白質的表達升高。優(yōu)選地，本發(fā)明的軟骨形成細胞聚集體可特征在于，與間充質祖細胞在經歷非附著培養(yǎng)條件前即刻的表達相比，膠原蛋白II、IX和XI的上調表達以及膠原蛋白I和XII的下調表達。本發(fā)明的軟骨形成細胞聚集體通過本發(fā)明的方法形成。軟骨形成細胞聚集體可呈現(xiàn)基本上圓形或球形的細胞聚集體。其可具有0,5mm至3mm的平均直徑，優(yōu)選0,5mm至2mm的平均直徑。本發(fā)明的軟骨形成細胞聚集體不具有非源自用于生產軟骨形成細胞聚集體的細胞的任何人造生物學或非生物學支架或載體。本發(fā)明的軟骨形成細胞聚集體優(yōu)選由本發(fā)明方法形成的細胞聚集體組成，其中該方法已在不使用或添加非直接源自用于所述方法的細胞的任意生物學或非生物學支架或載體的情況下進行。在本發(fā)明的方法中，使用分離的間充質祖細胞。術語“分離的”意為間充質祖細胞是已從天然來源分離的細胞或其子代——其例如已通過細胞增殖衍生——分離的細胞。所用的間充質祖細胞優(yōu)選衍生自供體——個體或患者——的軟骨組織。優(yōu)選地，間充質祖細胞是還未轉化或未永生化的原代細胞。具體地，間充質祖細胞可包括成年間充質祖細胞或由成年間充質祖細胞組成。這種成年間充質祖細胞衍生自供體——個體或患者——的非胚胎軟骨組織。間充質祖細胞可衍生自已分化以包括軟骨組織的任意供體組織的軟骨組織。優(yōu)選地，間充質祖細胞衍生自供體的關節(jié)的軟骨組織，更優(yōu)選膝或肘的軟骨。用于本發(fā)明方法的間充質祖細胞優(yōu)選是人細胞。人間充質祖細胞衍生自人源軟骨組織。間充質祖細胞可包括至少50％的如下細胞：CD105+、CD106+、CD44+、CD73+、CD90+和CD13+，或可由如下細胞組成：CD105+、CD106+、CD44+、CD73+、CD90+和CD13+。優(yōu)選地，間充質祖細胞包括下列或由下列組成：分離的原代軟骨細胞，如例如人原代軟骨細胞。在本發(fā)明的方法中，間充質祖細胞可經歷在分離后的任意階段、在非附著條件下的培養(yǎng)。但是，如果間充質祖細胞已在附著2D單層條件下進行至少一些培養(yǎng)，則會進一步增強細胞聚集體的形成。優(yōu)選地，間充質祖細胞在進行在非附著條件下培養(yǎng)前已在2D單層培養(yǎng)中被培養(yǎng)至少5代。為確保去分化表型，需要在2D單層附著條件中培養(yǎng)間充質祖細胞至少10代。細胞聚集體形成的高效力保持在很多代中。但是，已發(fā)現(xiàn)，如果間充質祖細胞已在2D單層培養(yǎng)中被培養(yǎng)至少5代和不多于20代，則實現(xiàn)最佳結果。優(yōu)選地，間充質祖細胞在分離后在2D單層中培養(yǎng)至少5代和不多于15代后進行非附著培養(yǎng)。在本發(fā)明的方法中，在提供分離的間充質祖細胞后，使間充質祖細胞經歷非附著培養(yǎng)條件，以形成軟骨形成細胞聚集體。如果間充質祖細胞在特定濃度下經歷非附著培養(yǎng)條件，則細胞聚集體的形成尤其有效。如果濃度過低，則細胞相互僅極少接觸，向細胞聚集體的凝聚有效性較小。另一方面，如果間充質祖細胞的濃度過高，細胞靈活性或移動性較小，因此，細胞聚集體的形成有效性較小。優(yōu)選地，間充質祖細胞在5×104至5×107/ml的濃度下經歷非附著培養(yǎng)條件。如果間充質祖細胞在1×105至1×107/ml，優(yōu)選5×105至5×106/ml，和最優(yōu)選9×105至1,1×106/ml的濃度下經歷非附著培養(yǎng)條件，會實現(xiàn)更好的結果。在本發(fā)明的方法中，在非附著培養(yǎng)條件下培養(yǎng)分離的間充質祖細胞。這意為在如下條件下培養(yǎng)間充質祖細胞：其中細胞不采取顯示強依附和附著于培養(yǎng)表面的扁平、散開的形狀。優(yōu)選地，間充質祖細胞在接種后保持圓形，如果這樣的話，僅弱關聯(lián)于培養(yǎng)表面。適當的非附著細胞培養(yǎng)手段在本領域公知。非附著培養(yǎng)條件可包括在具有不支持間充質祖細胞附著的培養(yǎng)表面的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)間充質祖細胞。例如，可使用具有呈現(xiàn)超低細胞依附的培養(yǎng)表面的培養(yǎng)容器。因此，可使用具有中性或帶正電的培養(yǎng)表面的培養(yǎng)容器。優(yōu)選地，培養(yǎng)表面可被進一步減少間充質祖細胞和培養(yǎng)表面相互作用的材料層涂布。培養(yǎng)表面可覆有親水水凝膠。顯示在非附著培養(yǎng)條件下間充質祖細胞相當迅速地締合并凝聚成細胞聚集體。在非附著細胞培養(yǎng)24小時后，間充質祖細胞聚集成一個大復合體。但是，為制備代表具有進展的發(fā)育、分化和/或功能的軟骨形成細胞聚集體的細胞聚集體，進行非附著培養(yǎng)超過24小時的一段時間是有益的。在本發(fā)明的方法中，可在非附著條件下培養(yǎng)間充質祖細胞至少48小時，優(yōu)選至少72小時，更優(yōu)選至少1周，還更優(yōu)選至少2周，最優(yōu)選至少4周。因此，可在非附著條件下培養(yǎng)間充質祖細胞48小時至8周，優(yōu)選60小時至6周，更優(yōu)選72小時至5周。在普通培養(yǎng)皿中培養(yǎng)后，聚集體附著皿表面，并且細胞開始遷移和增殖，導致聚集體結構瓦解。因此，聚集體優(yōu)選在整個培養(yǎng)期間保持在非附著條件下。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選在非附著條件下培養(yǎng)間充質祖細胞，至少直到呈現(xiàn)圓形的細胞聚集體形成，其具有0,5mm至3mm的平均直徑，更優(yōu)選0,5mm至2mm的平均直徑。通過本發(fā)明方法生成的軟骨形成細胞聚集體的適應性取決于其誘導或提供分化軟骨細胞或軟骨組織的能力。因此，優(yōu)選在非附著條件下培養(yǎng)分離的間充質祖細胞，直到所得細胞聚集體開始呈現(xiàn)部分或完全分化的軟骨細胞或軟骨組織的性質和/或功能?？赏ㄟ^各標記基因、蛋白質或結構的相對表達監(jiān)測分化進程。優(yōu)選地，在非附著條件下培養(yǎng)分離的間充質祖細胞，至少直到形成的細胞聚集體，與經歷非附著培養(yǎng)條件前即刻的間充質祖細胞表達相比，呈現(xiàn)膠原蛋白II、IX和XI上調表達以及膠原蛋白I和XII下調表達。由于階段特異標記分子的表達分析揭示保持的N-鈣粘蛋白表達和膠原蛋白II型的升高水平而非膠原蛋白X型的表達，因此表明在軟骨形成前體和柱形軟骨細胞之間的分化表型而非至肥大前階段的進一步分化。這種表型反映出在關節(jié)軟骨組織中捕獲的軟骨細胞表型?；虻南鄬Ρ磉_水平通過公知方法可容易確定，如例如定量或半定量RT-PCR或RNA印跡法。蛋白質的相對表達水平也可通過公知方法確定，如例如蛋白質印跡法和ELISA技術。除關于mRNA和蛋白質水平的表達模式分析外，進一步通過免疫組織化學染色以及抗壓性測定進行的聚集體結構的詳細表征也被包括，以指定聚集體的質量(quality)?，F(xiàn)有技術中大多數方法遭遇的缺點之一是，在這些方法中，需要存在人造生物學或非生物學支架或載體，在其上或其中培養(yǎng)細胞以形成軟骨組織。生物學或非生物學支架或載體被認為是人造的或添加的——如果所述支架或載體是從外部提供的和不是直接由在細胞聚集體形成期間用于本發(fā)明方法的細胞形成。在本發(fā)明的方法中，無需這種人造生物學或非生物學支架或載體的使用或存在。本發(fā)明的方法在不使用任何這種非源自所用細胞的人造生物學或非生物學支架或載體的情況下生成根據本發(fā)明所述的軟骨形成細胞聚集體。在優(yōu)選的實施方式中，實施本發(fā)明的方法，使得在軟骨形成細胞聚集體形成過程中不添加生物學或非生物學支架。在本發(fā)明的方法中，利用標準培養(yǎng)基，在附著或非附著條件下培養(yǎng)間充質祖細胞。無需特殊培養(yǎng)基以在非附著條件下誘導適當細胞聚集。技術人員公知適當的培養(yǎng)基。一般，使用標準DMEM并帶有一定含量的胎牛血清(FCS)，優(yōu)選FCS存在的濃度為5％至15％，更優(yōu)選濃度為10％的FCS。盡管事實上適當的軟骨形成分化在聚集體形成后被誘導而無需額外的處理，但進一步優(yōu)化可以是有益的。因此，在本發(fā)明的方法中，一旦聚集過程完成，關于生長因子給予或低氧條件下培養(yǎng)的進一步優(yōu)化步驟將進一步改善發(fā)育和分化。本發(fā)明還涉及移植物，其包括下列或由下列組成：本發(fā)明的人造軟骨形成細胞聚集體或由其衍生的組織或結構。在本發(fā)明另一方面，提供藥物組合物，其包括本發(fā)明的人造軟骨形成細胞聚集體、由其衍生的組織或結構或本發(fā)明的移植物和至少一種藥學上可接受的賦形劑。本發(fā)明的人造軟骨形成細胞聚集體、本發(fā)明的移植物或本發(fā)明的藥物組合物可用于治療軟骨損傷和/或破壞或軟骨損失。由于本發(fā)明的方法利用衍生自非胚胎來源的分離的間充質祖細胞發(fā)揮作用，該方法允許從得自具體供體或患者的細胞開始產生人造軟骨形成細胞聚集體。因此，可以提供已經從將要用本發(fā)明的人造軟骨形成細胞聚集體、藥物組合物或移植物治療的人的細胞衍生的人造軟骨形成細胞聚集體。因此，顯示可以提供這樣的移植物：其主要、基本上或完全衍生自移植物受體本身的細胞，使得排斥反應將減少至最小或完全不存在。本發(fā)明的人造軟骨形成細胞聚集體可用于體外或體內生成分化的軟骨細胞或軟骨組織。本發(fā)明的人造軟骨形成細胞聚集體、本發(fā)明的移植物或本發(fā)明的藥物組合物可用作可體外和體內使用的研究工具。本發(fā)明的人造軟骨形成細胞聚集體、本發(fā)明的移植物或本發(fā)明的藥物組合物可用于體外或體內篩選調節(jié)軟骨細胞或軟骨組織性質的物質的方法。本發(fā)明另外教導了體外篩選調節(jié)軟骨細胞或軟骨組織性質的物質的方法，包括步驟：-提供本發(fā)明的人造軟骨形成細胞聚集體或通過本發(fā)明方法制備的細胞聚集體或由其衍生的組織的樣品；-將各樣品分成多個部分；-用待篩選物質溫育至少一個部分；和-比較已處理部分與未用待篩選物質溫育的另一部分的測量參數。在優(yōu)選的實施方式中，在用待篩選物質溫育該部分前，使該部分經過自我包含式器官在芯片上的裝置。簡言之，本發(fā)明方法，通過本發(fā)明的人造軟骨形成細胞聚集體，使對軟骨細胞或軟骨組織具有影響的物質的鑒定和分析成為可能。樣品——根據本發(fā)明應被理解為包括一定數量的產物對象——被分成多個部分。提供至少兩個子組；一組用于篩選，而另一組充當陰性對照。優(yōu)選地，篩選部分的數量超過對照部分的數量。通常，多個部分進行高通量篩選。在本發(fā)明方法中待篩選的物質不以任何方式受限。在本發(fā)明的實施方式中，物質選自核酸——包括RNAi、核糖酶、適配子、抗體、肽、糖、聚合物、分子量在50和1.000Da之間的小分子和蛋白質——優(yōu)選抗體、細胞因子和脂鈣蛋白。這些物質通?？稍趲熘蝎@得。優(yōu)選在樣品的不同部分中溫育單種化合物。但是，也可以通過在一個部分中溫育至少兩種物質來研究物質的協(xié)同效應。將另一個子組的對象在不存在物質的情況下同時溫育。溫育過程取決于多種參數，例如細胞類型和檢測靈敏度，其優(yōu)化按照本領域技術人員已知的常規(guī)程序。根據本發(fā)明的有效物質鑒定優(yōu)選間接進行，例如通過確定改變的表達圖譜和/或細胞生活力?？稍谔囟〞r間進行確定，并與實驗開始時的信號強度和陰性對照關聯(lián)。適當的測試本領域技術人員已知或可容易按常規(guī)設計。由于本發(fā)明的人造軟骨形成細胞聚集體可被認為是器官、類器官或器官或其部分的前體，其可尤其有益于使用測試系統(tǒng)——其中可在模擬天然灌注的條件下長時間制備和/或培養(yǎng)人造軟骨形成細胞聚集體。其顯示出尤其適于將本發(fā)明的方法和/或本發(fā)明的人造軟骨形成細胞聚集體結合在分析系統(tǒng)中，該分析系統(tǒng)基于申請?zhí)朎P10008244的歐洲專利申請或公開號WO2009/146911的PCT申請中描述的自我包含式器官在芯片上的裝置系統(tǒng)。本發(fā)明還公開了自我包含式人造軟骨形成細胞聚集體類器官在芯片上的裝置，其包括WO2009/146911描述的自我包含式器官在芯片上的裝置和本發(fā)明的人造軟骨形成細胞聚集體。形成本發(fā)明的自我包含式人造軟骨形成細胞聚集體類器官在芯片上的裝置以允許建立或保持小型化芯片形式的本發(fā)明的人造軟骨形成細胞聚集體，小型化芯片形式適于通過活細胞成像和例如雙光子顯微術在線觀察及其如下的應用：例如測試化合物的活性、藥效學和藥代動力學，或研究器官或類器官和干細胞生態(tài)位的自組裝、穩(wěn)態(tài)、破壞、再生或相互作用，以及成熟、衰老、死亡和生物鐘學現(xiàn)象。因此，本發(fā)明的自我包含式人造軟骨形成細胞聚集體類器官在芯片上的裝置包括至少一個培養(yǎng)基供給儲器、至少一個器官生長部件——包括至少一個器官腔，容納本發(fā)明的人造軟骨形成細胞聚集體，其中培養(yǎng)基供給儲器通過微流體供給通道連接于至少一個器官生長部件。本發(fā)明首次提供人造軟骨形成細胞聚集體及其生產方法，其特征在于非強制細胞組裝，無需任何人造生物學或非生物學支架或載體，和由成年細胞生產，從而無需胚胎細胞或組織。本發(fā)明的人造軟骨形成細胞聚集體代表功能誘導性聚集體，其能夠誘導或引發(fā)體外和體內軟骨組織發(fā)育。所得軟骨組織的特征在于以生理順序排列、一般形成軟骨組織部分的結構的可驗證存在。附圖說明圖1顯示去分化的軟骨細胞呈現(xiàn)間充質干細胞特征。[A]將去分化的軟骨細胞染色，用于間充質表面標記組(panel)。細胞為CD105、CD106、CD44、CD73、CD90和CD13陽性，和造血標記CD34和CD45陰性(顯示一個代表性實驗，n＝6)。脂肪形成性分化。[B-D]用脂肪形成性培養(yǎng)基處理去分化的軟骨細胞28天。通過光學顯微鏡術和油紅O染色評價脂肪細胞分化。B)單層細胞的陰性對照，未染色；C)單層細胞的陰性對照，油紅O染色；D)通過細胞質中脂質填充液滴的形成證明28天后的脂肪細胞分化；分化脂肪細胞中脂質填充液滴的油紅O染色；(顯示一個代表性實驗，n＝6)；成骨細胞分化。[F-G]用成骨培養(yǎng)基處理去分化的軟骨細胞28天。通過vonKossa染色評價成功的分化。E)染色陰性對照；F)通過vonKossa染色證明鈣化基質的積累；(顯示一個代表性實驗，n＝6)；線＝50μm。圖2顯示低依附板中的凝聚動力學。特殊處理的培養(yǎng)皿表面用于該3D培養(yǎng)系統(tǒng)，在此細胞無法依附。在低依附板中供應細胞懸浮液(106個細胞/ml)。在3D培養(yǎng)誘導后細胞立即開始相互作用；(顯示一個代表性實驗，n＝6)。圖3顯示凝聚階段期間軟骨形成相關基因的基因表達動力學。與單層表達比較，在3D培養(yǎng)誘導后的前90或72小時內的基因表達的實時PCR分析。管家基因比以對數標度顯示，(n＝6)通過Mann-WhitneyU_-測試進行統(tǒng)計學分析。圖4顯示在低依附培養(yǎng)28天后軟骨形成相關基因的基因表達。與單層表達比較，在3D培養(yǎng)誘導后28天的基因表達的實時PCR分析。管家基因比以對數標度顯示，(n＝6)通過Mann-WhitneyU_-測試進行統(tǒng)計學分析。圖5顯示差異表達基因的分類。[A]凝聚階段(24h)和[B]分化階段(28天)的兩個獨立微陣列實驗分別的評價。根據Panther基因本體數據庫顯示所選基因本體組中上調和下調基因的數量。圖6顯示PTX處理細胞的細胞凝聚。在凝聚過程中將百日咳毒素(PertussisToxine)以三種不同的濃度給予去分化的軟骨細胞。在PTX處理后，未觀察到凝聚表現(xiàn)方面的顯著變化(顯示一個代表性實驗，n＝3)。圖7顯示凝聚過程中的細胞相互作用和亞聚集體連接。通過3D低依附培養(yǎng)誘導的凝聚；網狀連接在培養(yǎng)誘導后12小時可見；(顯示一個代表性實驗，n＝6)。圖8顯示本發(fā)明的自我包含式3D體外雙相軟骨-骨類器官在芯片上的裝置的示意圖。圖9顯示3D陶瓷培養(yǎng)系統(tǒng)中MSCs的表現(xiàn)。(A)生態(tài)位ECM組分的免疫組織化學和2-光子顯微術，(i)膠原蛋白-I，(ii)纖連蛋白和(iii)整聯(lián)蛋白4a在培養(yǎng)的(a)第1天和(b)第7天之間高度表達。(標度線：100μm)。(B)SEM成像示例(i，iii)3D培養(yǎng)2周后的MSCs與(ii，iv)骨松質(標度線：10μm)之間的結構相似性。(C)3D培養(yǎng)1周后MSCs的自發(fā)成骨分化，通過陽性VonKossa(i)染色和Alizarin紅(iii)染色可見——與未接種的陶瓷(ii，iv)相比。(D)與單層相比在1和4周后共培養(yǎng)系統(tǒng)中的已知生態(tài)位分子的實時PCR分析。(n＝3，誤差線：平均值的SD，***p<0.001)。圖10顯示HSPC存活和表型。(A)HSPCs在接種后在3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中存活(i)1周，(ii)2周，(iii)4周和(iv)8周，通過熒光顯微術可見。MSC核用DAPI復染成藍色。(標度線：100μm)。(B)代表性FACS圖和(C，D)定量——3D和傳統(tǒng)共培養(yǎng)系統(tǒng)中原始的(CD34+CD38-)和分化的(CD34+CD38+)HSPCs。(n＝8，誤差線-平均值的SD，**p<0.01，***p<0.001)。圖11顯示HSPC增殖。(A)顯示不同培養(yǎng)系統(tǒng)中HSPCs的差異增殖的CFSE-FACS分析的代表性柱狀圖。虛線描述慢(右側)和快(左側)增殖細胞部分。(B)四個培養(yǎng)系統(tǒng)中慢增殖細胞的定量。(C，D，E)在培養(yǎng)1、2和4周后各培養(yǎng)系統(tǒng)中慢和快增殖細胞部分的原始(CD34+CD38-)HSPCs的定量。(n＝6，誤差線-平均值的SD，*p<0.05，***p<0.001)。圖12顯示HSPC生活力和功能性。(A)代表性FACS圖和(B，C)定量——3D和傳統(tǒng)共培養(yǎng)系統(tǒng)中的壞死(PI陽性)和凋亡(膜聯(lián)蛋白V陽性)HSPCs。(n＝8，誤差線-平均值的SD，*p<0.05**p<0.01，***p<0.001)。(D,E)來自3D共培養(yǎng)系統(tǒng)的HSPCs的多系分化潛能。代表性(i)GEMM，(ii)BFU-E，(iii)GM集落和(E)CFU-GEMM分析后的集落評分(n＝3)。圖13顯示3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中組分的相互作用。(A)在培養(yǎng)2周后3D共培養(yǎng)系統(tǒng)的免疫組織化學和2-光子顯微術。顯示當與未染色的對照(i)(標度線：100μm)比較時，綠色追蹤的HSCs和紅色追蹤的MSCs與Alexa350(藍色)染色的ECM組分(ii)膠原蛋白I和(iii)纖連蛋白，以及與信號傳導分子(iv)C-Kit(v)整聯(lián)蛋白4a(vi)N鈣粘蛋白共同定位。(B)SEM成像示例在3D培養(yǎng)2周后較小圓形HSPCs和較大扁平附著MSCs之間的物理相互作用(標度線：10μm)。實施例：實施例A：I.人造骨組織的形成：細胞通過標準程序分離間充質干細胞(MSC)。簡言之，將骨髓吸出物用PBS仔細漂洗，并通過Ficoll密度梯度離心分離PBMC(周圍血液單核細胞)。通過塑料附著然后上至4代的擴增期分離間充質先祖。利用MACS技術(MiltenyiBiotec)通過CD34表達從臍血樣品分離人造血干細胞。在補充培養(yǎng)基(的TPO,FLT3,IL6和SCF)中培養(yǎng)HSC。平臺通過3D陶瓷支架(Zellwerk)提供人造骨髓的平臺。為誘導協(xié)調的增殖、分化和根據胞外基質沉積的微環(huán)境和信號傳導分子表達的再調節(jié)，在添加造血干細胞前一周將間充質干細胞接種在該陶瓷上。然后將陶瓷在靜態(tài)培養(yǎng)中或在連續(xù)營養(yǎng)物供應的灌注系統(tǒng)中進一步培養(yǎng)。通過基因表達分析、通過FACS技術的不同細胞群組成和一般生物學功能(HSC保持和增殖、個體干細胞生態(tài)位發(fā)育、免疫學問題)的確定，評價骨髓的功能。II.軟骨形成細胞聚集體或人造軟骨組織的形成：骨關節(jié)炎和類風濕性關節(jié)炎是影響軟骨結構的退行性疾病。由不同因素(例如，機械過載、年齡、損傷和炎癥)引起，組織結構被不可逆地損失，因為軟骨內的細胞僅具有非常低的固有自我修復能力。因此，為找到誘導軟骨再生過程的替代性策略，近幾十年已做出多種嘗試。近些年，自體細胞在再生藥物中的應用是深入研究的主題。但是，仍要建立間充質祖細胞的理想來源和體外分化的最佳培養(yǎng)條件。間充質基質/干細胞由于其分化成所有間充質組織的能力脫穎而出，雖然可得自骨髓或其他組織來源的細胞數量是受限的。因此，自健康組織分離然后擴增的自體細胞的應用是解決這種困難的一項有希望的策略。不幸地，細胞在撤銷其正常組織微環(huán)境后失去其分化表型。因此，通過酶消化和隨后的二維單層培養(yǎng)使軟骨細胞自其正常三維關節(jié)軟骨基質分離導致細胞改變，在此過程中細胞重新進入細胞周期，失去其圓形表型，并將其基質分子生產從膠原蛋白II、IX和XI型切換成I、III和V型。另外，已證明，2D-培養(yǎng)的軟骨細胞表達間充質干細胞表面標記并且具有多系分化潛能。該過程被稱為去分化，并突出了完整3D環(huán)境對于保持軟骨細胞表型的重要性。因此，近年來，顯現(xiàn)發(fā)育過程不僅由可溶性因子控制，而且另外還由附著分子提供的空間排列控制，其不僅介導細胞-細胞和細胞-基質相互作用，還有助于通過附著信號傳導進行的基因表達調節(jié)。因此，在3D結構中培養(yǎng)祖細胞呈現(xiàn)為體外軟骨形成性再分化過程中的關鍵刺激因素之一。因此，多種3D培養(yǎng)系統(tǒng)已因此被建立。常用四種在3D系統(tǒng)中培養(yǎng)間充質細胞或祖細胞的技術：1)水凝膠封裝、2)微團培養(yǎng)、3)高密度細胞團塊和4)生物相容性支架。在3D微環(huán)境中培養(yǎng)和防止單層形成是所有所述培養(yǎng)系統(tǒng)的原理。盡管事實上所有培養(yǎng)模型均能夠誘導軟骨形成分化——通過膠原蛋白II型和蛋白多糖的上調證明，但仍存在顯著缺陷。細胞由于離心(團塊培養(yǎng))或通過重力(微團)被強制形成細胞3D聚集體。另一方面，在生物相容性支架上水凝膠封裝或培養(yǎng)后，細胞相互作用的能力受限，或成不可能。但是，體外模擬軟骨細胞分化的完整體內過程，以獲得再生應用的最佳先決條件，以及提供模型培養(yǎng)系統(tǒng)，以擴展該多步過程的充分了解，似乎是合理的。間充質凝聚代表骨骼成分發(fā)育的第一步，其中先祖遷移至未來骨骼形成的位點，并開始積累和凝聚，生成高密度細胞聚集體。在體外再分化的過程中，主要目標是整合該第一步——聚集體形成。不幸地，沒有常用3D培養(yǎng)系統(tǒng)適于這種目的，因為其全部缺乏在凝聚過程前獨立單細胞移動性的先決條件。發(fā)明人已建立了無支架培養(yǎng)系統(tǒng)，其包括分離的去分化軟骨細胞的初始細胞凝聚和隨后軟骨形成再分化。凝聚過程以及再分化細胞的集中特征在于綜合基因表達分析。由于軟骨形成分化通過膠原蛋白II型表達的劇烈上調和蛋白多糖的大量分泌和積累來證明，這種新的3D培養(yǎng)系統(tǒng)首次提供研究體外間充質凝聚刺激過程的機會。細胞聚集期間趨化因子信號傳導的抑制證明，凝聚過程與細胞遷移無關，但由附著分子和增強的細胞-細胞接觸介導。材料和方法原代軟骨細胞的分離和培養(yǎng)來自志愿者供體的關節(jié)膝軟骨得自MusculoskeletalResearchCenterBerlin，Charité(Berlin，德國)以及得自InstituteofExperimantalPathologyCharité，CampusVirchow。研究經當地倫理委員會(CharitéCampusMitte，UniversityHospitalBerlin)批準。將軟骨組織切成小塊，并通過利用DMEM中的膠原蛋白酶(1mg/ml，Sigma-Aldrich)在37℃下酶消化過夜釋放軟骨細胞。通過70μm尼龍細胞染色器(BDFalconTM，Belgium)過濾，將細胞從消化的組織分離，用PBS洗滌，并在包含10％FCS的DMEM中培養(yǎng)。將原代軟骨細胞在帶有加濕氣氛(5％CO2/空氣)的水套式培育箱中、在37℃下、在補充10％FCS和青霉素/鏈霉素(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)。將細胞傳代至少10次，以生成完全的去分化表型。去分化軟骨細胞的表征通過FACS的表面表達分析。通過直接免疫熒光染色分析去分化軟骨細胞的不同間充質干細胞(MSC)表面標記分子的表達。通過胰蛋白酶消化和離心收集細胞，并將細胞團塊重懸浮于PBS/BSA(0.5％)中。用熒光標記的抗體在RT下培育細胞15min。作為同種型對照，將細胞用與MSC抗體相同的同種型的T-細胞標記分子染色。然后將染色分析用PBS/BSA洗滌，并離心去除未結合的抗體。將細胞團塊重懸浮于400μlPBS/BSA中，并在FACSCaliburTM(BDBiosciences)上進行分析。對于死亡細胞的檢測，在流式細胞術分析前即刻添加碘化丙啶(propidiumjodid)。獲得并利用CellQuestTM軟件分析30,000個事件。分化潛能。利用已知培養(yǎng)基補充(DMEM，帶有10％FCS、10μg/ml胰島素、0,2mM吲哚美辛(Indomethacin)、1μM地塞米松(Dexamethasone)、0,5mM3-異丁基-甲基-黃嘌呤(Sigma))，在2D培養(yǎng)中誘導脂肪形成性分化。將去分化的軟骨細胞接種在6孔板(Corning-100.000個細胞每孔)中，并在DMEM+10％FCS中培養(yǎng)到細胞匯合。刺激細胞28天，其中每4天更換培養(yǎng)基。脂類油紅O染色：在28d后將細胞在4％多聚甲醛中固定10min，用PBS洗滌，隨后用新過濾的油紅O染色溶液(0,7％在丙烯甘油中)(Sigma)培育1h。在用蒸餾水漂洗細胞兩次后，通過光學顯微鏡術評價染色。利用適當的分化培養(yǎng)基(DMEM+10％FCS、10mMβ-磷酸甘油(Sigma)、10nM地塞米松(Sigma)、0,1mML抗壞血酸2-磷酸酯(Sigma)，在單層培養(yǎng)中誘導成骨分化。簡言之，將細胞接種在6孔板(Corning-100.000個細胞每孔)中，并在DMEM+10％FCS中培養(yǎng)到細胞達到匯合。每4天更換培養(yǎng)基，并在成骨刺激21天后，通過分泌的Ca2+基礦物化基質的vonKossa染色作為成骨細胞分化的標記，將細胞染色。用4％多聚甲醛(Sigma)固定細胞。將硝酸銀溶液(5％，Sigma)給予固定的細胞，并將培養(yǎng)板置于UV光中20min。最終，將細胞用水漂洗，并通過光學顯微鏡術進行評價。3D培養(yǎng)系統(tǒng)對于3D低依附培養(yǎng)，收集去分化的軟骨細胞，并將其重懸浮于DMEM+10％FCS中，以在單個細胞懸浮液中生成106個細胞/ml。將細胞懸浮液(1ml每孔)給予24孔低依附板(UltraLowClusterPlate，Corning，德國)。與標準組織培養(yǎng)皿的帶負電親水性表面相反，超低依附板具有中性的、親水水凝膠涂布的表面，其很大程度上最小化依附蛋白質的結合。通過利用這種特殊培養(yǎng)皿，細胞不會如同微團培養(yǎng)通過細胞附著在低聚層構建物中沉降。防止2D單層培養(yǎng)物的形成，并且細胞在此懸浮培養(yǎng)保持條件下保持圓形。此外，與其中細胞通過離心被強制沉降的團塊培養(yǎng)系統(tǒng)相反，低依附培養(yǎng)系統(tǒng)提供在初始凝聚過程中自由細胞運動和細胞細胞相互作用的機會。為確保恒定培養(yǎng)條件，每3天定期更換培養(yǎng)基。為干擾低依附培養(yǎng)中G-蛋白結合受體引起的趨化信號傳導，將百日咳毒素(Sigma，德國)以不同的濃度(10、100和1000ng/ml)給予在低依附凝聚實驗中的培養(yǎng)基。組織學將收集的聚集體的部分在低溫恒溫器中切成5-μm厚，并安置于SuperfrostPlus玻片(Menzel)上。將玻片干燥和固定。蘇木精染色。將切片在蘇木精染色溶液(Sigma)中溫育3min，隨后在自來水中漂洗。將切片脫水和安置。通過光學顯微鏡術分析染色切片。阿爾新藍染色。將玻片在3％酸性酸中預溫育3min，然后在室溫下用阿爾新藍(Sigma)(3％，在3％乙酸中)溶液處理30min。將切片用水洗滌，脫水和安置。通過光學顯微鏡術分析染色切片。II型膠原蛋白染色。將玻片用蛋白質阻斷劑(block)(DakoCytomation)在RT下處理10min，然后用抗2A型膠原蛋白的一級單克隆抗體(BDBiosciences)在4℃下溫育過夜。第二天，將切片用Cy3結合的二級抗體(DakoCytomation)溫育1h，并將核通過DAPI復染。通過熒光顯微術分析染色切片。實時PCR。在所示時間點溶解細胞，利用RNAII試劑盒(Machery和Nagel)提取RNA。通過逆轉錄400ng總RNA(Taqman，Roche)合成cDNA。利用下列條件進行實時PCR實驗：1μlcDNA，各0.5μM引物，6mMMgCl2，200mMdNTP，50mMTris(pH8.8)，500ng/mlBSA，Immolase0.05U/ml(Bioline)，1×Sybrgreen(MolecularProbes)。表達相對水平以與GAPDH表達的比給出。DNA微陣列分析。根據生產協(xié)議利用人基因組CGH微陣列44K(Agilent)。微陣列實驗基于雙色比雜交和低RNA輸入熒光線性擴增試劑盒(Agilent)進行RNA標記。簡言之，將500ng總RNA用低聚(dT)-T7啟動子引物和Moloney鼠白血病病毒-逆轉錄酶(MMLV-RT)逆轉錄，以合成cDNA的第一鏈和第二鏈。用同時包括花青3-胞苷5'-三磷酸酯(3-CTP)或花青5-CTP的T7RNA聚合酶合成熒光反義cRNA。通過花青3-CTP的A552nm的吸光度和花青5-CTP的A650nm的吸光度定量純化產物，并用Nanodrop光度計(Kisker)驗證標記效力。在雜交前，將2μg各標記的cRNA產物片段化，并根據供應商協(xié)議(Agilent)與對照靶標和雜交緩沖液混合。雜交在60℃下進行過夜。然后洗滌玻片，并利用DNA微陣列激光掃描儀(Agilent)以5-μm分辨率進行微陣列掃描。利用采用默認設置的圖像分析工具A6.1.1版(Agilent)提取特征。在RosettaInformaticsPlatformResolverBuilt4.0上進行數據分析。通過嚴格的數據評價和2-倍表達截斷結合僅選擇低p值(p<0.05)數據點的要求，鑒定表達圖譜的變化。通過應用此策略，數據評價獨立于RosettaResolver系統(tǒng)(Agilent)中實施的誤差模型。結果為實現(xiàn)完全表型去分化，將分離的軟骨細胞以單層培養(yǎng)至少10代。如前所述，細胞采用明確的先祖表型，該先祖表型由如下標記：MSC表面標記(CD105、CD106、CD44、CD73、CD90和CD13)和多分化潛能(脂肪細胞和骨細胞)(圖1)(Rosowski等，2006)的表達。根據表面表達，觀察到均一的去分化軟骨細胞群。低依附培養(yǎng)后的細胞凝聚這種培養(yǎng)技術的基本思路是避免細胞依附于培養(yǎng)皿表面和保持細胞移動性。為防止依附單層形成，將培養(yǎng)細胞接種于具有特殊處理的表面的低依附板的孔中。在數小時內，細胞開始相互附著，生成網狀結構。在接下來的72小時過程中，帶孔結構凝聚，并最終在每孔生成一個高密度細胞聚集體，其平均直徑為1-2毫米(圖2)。將細胞聚集體再培養(yǎng)4周，而尺寸或形狀無任何明顯變化。將培養(yǎng)過程細分為早期和晚期階段，并分別評價。體外間充質凝聚–早期事件在第一步中，分析軟骨形成分化的基因特征的表達(圖3)。轉錄因子SOX-5的mRNA水平在培養(yǎng)12小時后略微上調。在較晚時間點時，表達回落至單層水平。驚人地發(fā)現(xiàn)，轉錄調節(jié)因子SOX-9與單層培養(yǎng)相比下調3倍。這種減少的mRNA水平在凝聚形成的前三天內保持。然而，兩種轉錄因子在單層和低依附培養(yǎng)中均高度表達，其由GAPDH比指示。去分化的軟骨細胞顯示不同的TGF-β1表達；但是，這種生長因子在細胞凝聚中保持不變。如預期的，低依附凝聚中的N-鈣粘蛋白表達在凝聚前幾個小時內顯著上調。在較晚時間點，當凝聚物已形成時，檢測到附著分子的基因表達減少4倍。驚人地，甚至在3D培養(yǎng)的初始階段也測量到所選基質分子的mRNA水平的顯著變化。發(fā)現(xiàn)單層培養(yǎng)中1A1型膠原蛋白大量表達，但該分子在3D培養(yǎng)誘導后4小時下調10倍，并顯示在接下來的90小時內進一步逐步減少。相反，發(fā)現(xiàn)軟骨基質分子2A1型膠原蛋白在低依附培養(yǎng)90小時后被誘導12倍。但是，蛋白多糖組分聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的mRNA水平在很早期時間點(4小時)顯著降低10倍，并在3D培養(yǎng)接下來的4天內進一步降低(圖3)。軟骨形成分化–晚期事件為分析低依附3D培養(yǎng)系統(tǒng)的軟骨形成潛能，限定具體胞外基質組分的積累(圖4)。此外，通過實時PCR定量軟骨形成相關基因的表達(圖4)。在28天后，將聚集體切片，用于組織學分析。聚集體切片的蘇木精染色證實高細胞密度。此外，通過阿爾新藍染色可觀察胞外基質蛋白多糖的大量積累。在3D培養(yǎng)4周后2A1型膠原蛋白表達增加3個數量級，是確定的基質分子的最突出結果。2A1型膠原蛋白表達的動力學免疫組織學分析證實2A1型膠原蛋白的積累，甚至在3D培養(yǎng)初始階段期間。在培養(yǎng)誘導后的前兩天內，未檢測到2A1膠原蛋白信號。但是，在細胞凝聚誘導后8天證實了顯著信號，和在培養(yǎng)4周后，證實了甚至更廣泛的2A1型膠原蛋白沉積。此外，與單層培養(yǎng)相比，證實1A1型膠原蛋白表達減少——mRNA水平減少25倍。意外地，聚集蛋白聚糖mRNA水平與增殖2D培養(yǎng)相比減少5倍(圖4)。驚人地，轉錄因子Sox-9呈現(xiàn)在增殖單層細胞中異常高水平的基因表達——通過GAPDH比指示。在聚集體形成期間表達暫時減少后，mRNA水平返回單層基礎值。另一方面，可檢測到Sox-5表達進一步增加14倍。因此，Sox-5相對表達在低依附培養(yǎng)4周后超過相對Sox-9表達。此外，可確定在3D培養(yǎng)中TGFβ1和附著分子N-鈣粘蛋白的mRNA水平的進一步增加(圖4)。綜合分析凝聚和分化過程為應用無支架分化系統(tǒng)，利用基因組范圍的微陣列分析進一步研究細胞分化以及表征凝聚過程中表達圖譜的變化。進行兩個獨立實驗——利用各自的原代細胞培養(yǎng)。將熒光標記的探針雜交在Agilent44KDNA芯片上。將兩芯片的所得數據合并以進行評價。如果兩陣列證明基因表達至少2倍變化，則基因被命名為被調控基因。p值截斷被預先指定為p<0.05。為獲得該具體研究的生物學過程的總體思路，根據PantherGO分類將被調控基因分組(表1-5)。在早期和晚期階段均具有最高數量的被調控基因的組是細胞-細胞通信，發(fā)育過程和信號轉導(圖5)，表明誘導分化過程所需的功能組的基因表達被大幅調節(jié)。但是，3D培養(yǎng)系統(tǒng)的目的是去分化軟骨細胞的再分化。因此，更詳細地探尋Panther分類”骨骼系統(tǒng)發(fā)育。凝聚階段。如表1和2顯示，生長因子TGF-β3和GDF-15以及轉錄因子Fos是此分組中的最高上調基因。顯著地，Hox-A簇的數個成員表達被定義為在凝聚階段中升高。TGF-β組成員Inhibin-_B代表最強下調基因，并且在培養(yǎng)28天后抑制也很明顯和。28天后的聚集體(表3和4)。在28天后最突出的上調基因是軟骨相關基質分子膠原蛋白II、IX和XI?；|Gla-蛋白和軟骨酸性蛋白也顯示mRNA水平增加，而意外但與實時PCR數據一致的是，聚集蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖合成酶HAS呈現(xiàn)被下調。在此分組中的最高上調基因是轉錄因子Fos和Runx2以及生長因子GDF-15，而非軟骨基質分子膠原蛋白I和XII急劇減少。凝聚過程由細胞-細胞附著介導間充質凝聚過程的特征在于松散間充質的聚集。然而，關于如何介導這種祖細胞密度增加所知甚少。由于Panther分類中的幾個蛋白質家族的多功能性，根據KEGG數據庫將附著分子和趨化分子以較窄意義細分。由于DNA微陣列數據證明了差異表達的趨化因子和相應的受體(表5)，應用這種3D培養(yǎng)系統(tǒng)的第一個嘗試，應分析凝聚過程中趨化因子和遷移性細胞活性的潛在參與。大部分趨化因子受體是七種跨膜受體家族的部分。這類蛋白質通過G-蛋白關聯(lián)的信號轉導發(fā)出其信號傳導。百日咳毒素(PTX，百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis))通過G亞單元——異三聚G蛋白復合體——的ADP-核糖基化擾亂該途徑。為在凝聚期間消除趨化因子活性，通過添加不同濃度的PTX進行低依附培養(yǎng)實驗。意外地，在前72小時內，PTX處理的培養(yǎng)的細胞凝聚呈現(xiàn)出與對照實驗無差別，而與施加的濃度無關(圖6)。在培養(yǎng)誘導后即刻，細胞形成小細胞簇，通過網狀過渡階段進一步變稠，直到最終形成一個高密度細胞聚集體，而與PTX給予無關，并且具有相似動力學。該觀察結果顯示，細胞聚集過程不涉及趨化因子介導的細胞遷移。有意思的是，微陣列評價結果證明，75％的差異表達的附著分子呈現(xiàn)被上調，這表明凝聚步驟期間細胞間相互作用增加(表5)。該假設通過更詳細的顯微術觀察被確認。在多個亞聚集體出現(xiàn)的不同過渡階段，長枝狀細胞產物變得可見。連接直接從一個至下一個細胞亞中心形成(圖7A-C)或通過具有相反方向的兩個延伸的單個細胞建立(圖7D)。在晚期階段，利用這些細串將全部亞聚集體連接成最終聚集體。因此，凝聚過程通過附著分子表達增加被驅動，導致相對于趨化因子介導的細胞遷移，細胞相互作用增加?？偨Y自體祖細胞的應用代表恢復骨關節(jié)炎中破壞的軟骨組織的有希望的策略。這些細胞可被觸發(fā)進行分化，成為功能活性軟骨細胞，生成新合成的軟骨。到目前為止，為此已建立數種培養(yǎng)系統(tǒng)。由于軟骨形成分化起始于體內間充質凝聚步驟，對于完全表征體外第一譜系特異性步驟具有極大意義。因此，研發(fā)無支架低依附3D培養(yǎng)系統(tǒng)，模擬包括初始凝聚階段的整個軟骨形成過程。培養(yǎng)系統(tǒng)能夠誘導軟骨形成分化，該軟骨形成分化由關鍵轉錄因子Sox-5和II和IX型膠原蛋白的基因表達增加來指示。與其他已建立的3D培養(yǎng)系統(tǒng)相比，低依附板培養(yǎng)的應用提供了如下優(yōu)勢：分析從此前分離和擴張的間充質源的人原代細胞的單獨細胞懸浮液開始的細胞聚集的不同階段。早期階段的分析證明，凝聚過程由增加的細胞-細胞附著介導，而非由趨化因子信號傳導介導。因此，低依附3D培養(yǎng)系統(tǒng)可最終有助于鑒定對于體內軟骨形成分化誘導或用于臨床應用的體外生成移植物至關重要的關鍵因子。III.自我包含式3D體外雙相軟骨-骨類器官在芯片上的裝置：在圖8中，描述本發(fā)明的自我包含式3D體外雙相軟骨-骨類器官在芯片上的裝置。自我包含式3D體外雙相軟骨-骨類器官在芯片上的裝置1包括基底2，其中形成兩個培養(yǎng)基供給儲器5，其通過培養(yǎng)基供給通道6相互連接。自我包含式3D體外雙相軟骨-骨類器官在芯片上的裝置1進一步包括器官腔7，其中容納3D體外雙相軟骨-骨類器官，該3D體外雙相軟骨-骨類器官包括人造軟骨組織層4和人造骨組織層3，其中人造軟骨組織4直接接觸人造骨組織3的表面。為允許在3D體外雙相軟骨-骨類器官上施加機械力，可存在致動器8。實施例B：材料和方法1.MSCs的分離和擴張在具有按照EthicsboardoftheCharite-UniversitatsmedizinBerlin指南的書面同意的情況下，人MSCs分離自在關節(jié)置換手術后獲得的股骨頭骨髓，如前所述。然后細胞在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中擴張，該培養(yǎng)基具有4.5g/l葡萄糖(PAALaboratories，Austria)，包含10％FBS(PAALaboratories，Austria)和青霉素-鏈霉素(PAAlaboratories)。4和7代之間的MSCs用于共培養(yǎng)實驗。2.HSPCs的分離在具有按照EthicsboardoftheCharite-UniversitatsmedizinBerlin指南的書面同意的情況下，人HSPCs分離自臍帶血。臍帶血被收集在PBS-BSA-EDTA溶液中，并且單核細胞通過密度梯度離心被分離。然后利用MACSCD34+分離試劑盒(MiltenyiBiotec，德國)并按照生產商的指示，通過免疫磁性分離來分離HSPCs。然后新分離的細胞以2×104細胞/培養(yǎng)的密度被導入不同培養(yǎng)系統(tǒng)。3.陶瓷1mm厚并且1cm直徑的基于氧化鋯的、羥磷灰石涂布的Sponceram陶瓷盤購自Zellwerkgmbh，德國。該盤在使用前經熱壓處理。4.細胞培養(yǎng)系統(tǒng)在接種HSCs前7天，將陶瓷盤接種約106個細胞/盤密度的MSCs。陶瓷盤浸入超低依附24孔板(Corninginc.，USA)中的DMEM-高葡萄糖(PAALaboratories，Austria)，其包含10％FBS(PAALaboratories，Austria)和青霉素-鏈霉素。板保持在37℃，5％CO2下。每48小時更換培養(yǎng)基。同時，將6孔板也接種MSCs，使得其在24小時內實現(xiàn)匯合。將這些板中的一組用與陶瓷相同的培養(yǎng)基培養(yǎng)，而另一組用包含地塞米松、抗壞血酸和β-磷酸甘油(Sigma，USA)的骨誘導培養(yǎng)基處理。在接種MSCs后7天，將新分離的HSPCs導入4種培養(yǎng)條件中：1.3D共培養(yǎng)，其中MSCs接種在陶瓷中；2.2D共培養(yǎng)，其中MSC單層接種在6孔板中；3.2D共培養(yǎng)，其中骨誘導MSC單層接種在6孔板中；和4.在補充有100ng/mlIL-6、SCF、TPO和FLT-3L(Peprotech，UK)的Stemspan培養(yǎng)基(StemcellTechnologiesinc.，Canada)中懸浮培養(yǎng)。9個獨立的MSC和HSC樣品用于此研究。在培養(yǎng)開始后1、2和4周通過流式細胞術和免疫組織化學分析來自各培養(yǎng)系統(tǒng)的細胞。分析另外的時間點——8周——的3D培養(yǎng)，以確定長時間培養(yǎng)潛能。5.RNA分離、cDNA制備和qPCR按照提供的指示，利用RNAII試劑盒(Macherey-Nagel，德國)進行RNA分離。將在陶瓷中培養(yǎng)的細胞直接在陶瓷上溶解。按照生產商的指示，通過利用逆轉錄試劑cDNA試劑盒(AppliedBiosystems，USA)進行mRNA逆轉錄。在96-孔PCR板(BiozymScientific，德國)中利用1μlcDNA與1μl引物混合物和SensiFASTTMSybrNo-ROX試劑盒(Bioline，德國)進行實時PCR，并利用StratageneMX3005PTMMultiplexQuantitativePCR系統(tǒng)(AgilentTechnologies，USA)讀取。引物購自TIBMolBiol(德國)。6.細胞追蹤為通過熒光顯微術長期追蹤HSPCs和MSCs，在培養(yǎng)前按照生產商的指示分別用525細胞標記試劑盒和細胞TrackerTMRedCMTPX(Invitrogen，USA)標記細胞。為追蹤細胞分裂，在分離后即刻按照生產商的指示用2.5μΜ濃度的羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯(CFSE，Invitrogen，USA)標記HSPCs。然后門控出(gatedout)綠色標記的細胞，并利用流式細胞術在1、2和4周后追蹤細胞分裂。7.免疫組織化學為可視化陶瓷支架中的ECM和信號傳導分子，在接種被追蹤的HSPCs后2周，將具有細胞的陶瓷固定在-20℃的丙酮(Sigma，USA)中。然后用手術刀將盤切割，并以150μΙ總體積在96孔板中用膠原蛋白I(鼠抗人，Sigma，USA)，C-Kit(鼠抗人，SantaCruzBiotechnologyInc，USA)，纖連蛋白(鼠抗人，Millipore，USA)，整聯(lián)蛋白4a(鼠抗人，Abeam，UK)和N-鈣粘蛋白(鼠抗人，SantaCruzBiotechnologyInc，USA)的一級抗體染色。然后將樣品用結合Alexa350或Alexa594(Invitrogen，USA)的山羊抗鼠二級抗體染色，洗滌，并通過顯微鏡檢查可視化。8.熒光和2-光子顯微術1、2、4和8周后共培養(yǎng)系統(tǒng)中綠色追蹤的HSPCs的存在通過在用DAPI(Sigma，US)復染核后，將其在數字熒光顯微鏡(BZ9000，Keyence，德國)下可視化而確定。ECM和信號傳導分子利用2光子顯微鏡(TrimscopeII，LaVisionBioTec，德國)被可視化為3D堆疊，并利用Imaris7.5版(BitplaneScientificSoftware，Switzerland)渲染。9.掃描電子顯微鏡(SEM)SEM用于可視化細胞接種的陶瓷培養(yǎng)系統(tǒng)和骨髓之間的結構相似性以及對HSPCs和MSCs的物理相互作用。將在共培養(yǎng)2周后帶有MSCs和HSPCs的陶瓷盤和從股骨頭切除的1cm2骨髓片固定，用丙酮脫水，并通過臨界點干燥而制備。然后將這些樣品涂布以金和銀，并利用HitachiS-520SEM(Hitachi，Japan)可視化。10.流式細胞術通過流式細胞術分析，在表面標記表達的基礎上，比較來自全部培養(yǎng)系統(tǒng)的HSPCs的表型。通過在溫育箱中在37℃下用1×胰蛋白酶-EDTA(PAALaboratories，Austria)溫育30分鐘，收集來自全部附著培養(yǎng)系統(tǒng)的細胞。將懸浮液細胞簡單移送到收集管中。然后按照生產商的指示將細胞用下列抗體染色：CD34-APC(MiltenyiBiotec，德國)、CD38-PE(USA)、膜聯(lián)蛋白V-PacificBlue(BioLegend，USA)、碘化丙啶(Sigma，USA)。利用Analyzer(Miltenyi，德國)流式細胞儀進行流式細胞術分析，并利用FlowJoSoftware，7.6.5版(TreeStarinc.，USA)分析數據。11.CFU-GEMM分析利用集落形成單元——粒細胞、紅細胞、巨噬細胞、巨核細胞分析，測試得自在接種后1、2、4和8周的陶瓷共培養(yǎng)系統(tǒng)的HSPCs的髓樣分化潛能。將1000個細胞接種在CFU-GEMM培養(yǎng)基(MiltenyiBiotec，德國)中，并可視化集落和在2周后評分。12。統(tǒng)計學分析利用GraphPad軟件5.0版(GraphPadSoftwareInc.，USA)，對數據組進行2因素ANOVA分析，然后Bonferroni校準。大于或等于0.05的P值被認為顯著。數據表示為平均值+/-標準偏差。結果1.在陶瓷中培養(yǎng)7天內，MSCs產生具有與骨髓接近的結構相似性的微環(huán)境。3D培養(yǎng)條件對骨髓MSCs的分化和ECM產生的影響已被廣泛記載。剛性支架，如本研究使用的陶瓷，已顯示出使MSCs易于成骨分化。因此確定在導入HSPCs前陶瓷支架中的3D培養(yǎng)對MSCs的影響。免疫組織化學分析顯示，在接種7天后MSCs產生由膠原蛋白I和纖連蛋白組成的ECM的網狀網絡(圖9A(i，ii))，其中存在MSCs。還產生整聯(lián)蛋白4a(圖9A(iii))。膠原蛋白I和纖連蛋白已知涉及HSC生態(tài)位在骨髓中的保持，并且被認為介導HSPCs與骨髓的固定。整聯(lián)蛋白4a已知在生態(tài)位中的MSC-HSC相互作用中起作用。掃描電子顯微鏡(圖9B)揭示MSC接種的陶瓷結構(圖9B(i、iii)與人骨髓基質結構(圖9B(ii、iv))的驚人相似性。陽性茜素紅(AlizarinRed)(圖9C(i、ii))、VonKossa染色(圖9C(iii、iv))顯示，接種在陶瓷中的MSCs在培養(yǎng)7天后進行自發(fā)的成骨分化。與MSCs單層培養(yǎng)相比，早期成骨標記——骨橋蛋白——的表達的Q-PCR分析(圖9D)確認，MSCs至少部分自發(fā)成骨分化。在骨內生態(tài)位具有推定性影響的其他分子，即Jagged1、N-鈣粘蛋白、BMPR1a、ICAM1和CXCR4，與單層相比，也在3D培養(yǎng)中被上調，表明MSCs在陶瓷支架中培養(yǎng)時自發(fā)地產生微環(huán)境，這有助于HSC保持。確定7天是將造血干細胞和祖細胞導入系統(tǒng)的適當時間點。2.原始CD34+CD38-HSPCs保持在3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中長至8周。驗證3D共培養(yǎng)系統(tǒng)作為支持HSPCs的手段的第一考慮因素是接種到陶瓷中的HSPCs是否進入其中，并且長時間段保持在其中。利用熒光顯微術，在接種后1、2、4和8周(圖10A)于共培養(yǎng)系統(tǒng)中檢測到細胞追蹤劑-綠色標記的HSPCs，表明HSPCs滲入MSC接種的陶瓷，并穩(wěn)定保持長至8周。未測試進一步的時間點。為確定HSPCs是否保持其原始(CD34+CD38-)表型和探索3D共培養(yǎng)系統(tǒng)相對于已應用的HSPC培養(yǎng)策略的優(yōu)勢，通過CD34和CD38表達細胞(圖10B、C、D)的流式細胞術檢測比較了保持在陶瓷共培養(yǎng)系統(tǒng)中與保持在傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)和與骨誘導和非誘導MSC單層的共培養(yǎng)上至4周中原始HSPCs的百分比。發(fā)現(xiàn)保持在陶瓷共培養(yǎng)系統(tǒng)中的CD34+、CD38-細胞百分比在接種后長至8周在50％左右保持穩(wěn)定。然而，在所有其他培養(yǎng)條件下，CD34+、CD38-細胞的比例穩(wěn)定減少(圖10C)，直到存在小于5％的原始HSPCs。發(fā)現(xiàn)單層共培養(yǎng)中大百分比的HSPCs(約50％)為分化(CD34+CD38+)細胞，其在2周后檢測不到。在3D系統(tǒng)中也始終觀察到小百分比(<5％)的這些細胞(圖10D)。3.在陶瓷型共培養(yǎng)系統(tǒng)中保持的HSPCs緩慢分裂并且為靜態(tài)。接著，通過在第1、2和4周流式細胞術分析CFSE標記的HPSCs，將3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中HSPCs的增殖與之前述及的常規(guī)培養(yǎng)方法進行比較。已經歷1次或更少分裂(CFSE柱狀圖中從右開始前2個峰)的細胞被認為是慢增殖，而所有其他細胞被認為是快增殖。流式細胞術分析和隨后柱狀圖生成(圖11A)顯示，3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中的細胞是所有培養(yǎng)系統(tǒng)中的最慢增殖。發(fā)現(xiàn)3D共培養(yǎng)中大比例(>70％)的HSPCs是慢增殖細胞。發(fā)現(xiàn)該百分比在第2和4周之間略微(<10％)減少(圖11B)。發(fā)現(xiàn)所有常規(guī)培養(yǎng)中慢增殖細胞的比例與3D共培養(yǎng)系統(tǒng)相比相對較低，并且到培養(yǎng)4周時減少至小于10％(圖11B)。在通過CD34和CD38的流式細胞術分析研究培養(yǎng)1、2和4周后慢和快增殖HSPCs的表型時，發(fā)現(xiàn)來自3D共培養(yǎng)系統(tǒng)的HSPCs在培養(yǎng)1、2和4周后保持最大比例的具有原始CD34+CD38-表型的細胞(圖11C、D、E)。3D共培養(yǎng)的超過50％的慢和快增殖HSPCs保持原始表型長至4周。如預期的，快增殖細胞中CD34+CD38-細胞的比例小于慢增殖細胞中CD34+CD38-細胞的比例。傳統(tǒng)共培養(yǎng)的慢和快增殖部分中原始細胞的百分比隨時間穩(wěn)定減小(圖11C、D、E)。4.在陶瓷型共培養(yǎng)系統(tǒng)中保持的HSPCs是活的和非凋亡的。在已經確認在3D培養(yǎng)中最佳保持原始HSPC表型的情況下，通過測量膜聯(lián)蛋白V——廣泛使用的早期凋亡指示劑——和碘化丙啶(PI)——被晚期凋亡和壞死細胞獲取——的表達，確定所有培養(yǎng)系統(tǒng)中的細胞生活力。在上至第2周，3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中很小比例(<0.2％)的HSPCs表達膜聯(lián)蛋白V(圖12C)，和獲取PI(圖12B)，然后這些細胞不再存在。在常規(guī)系統(tǒng)中，特別是在懸浮培養(yǎng)和與骨誘導MSCs的共培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)略大比例的HSPCs(0.5-1.5％)凋亡或壞死(圖12B,C)。由此數據，得出如下結論：在所有培養(yǎng)條件中大部分HSPCs保持存活和非凋亡長至8周。5.來自陶瓷共培養(yǎng)的HSPCs具有功能性并且能夠多系分化。在確認在3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中保持的HSPCs保留其原始表型和存活后，利用CFU-GEMM分析，測試這些細胞是否保留HSPCs的多系分化潛能特征。在接種后1、2和4周分離自3D共培養(yǎng)系統(tǒng)的CD34+細胞生成CFU-GEMM、BFU-E和CFU-GM集落(圖12D)。在計數這些集落的基礎上，在不同時間點未發(fā)現(xiàn)顯著差異(圖12E)。因此，在3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中保持的CD34+細胞不僅存活，而且保留其特征性多系分化潛能。6.3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中的HSPCs與其微環(huán)境的ECM和細胞組分相互作用。最后，為示例在陶瓷共培養(yǎng)系統(tǒng)中較大程度地模擬骨髓HSPC生態(tài)位中的相互作用，研究陶瓷系統(tǒng)中HSPCs和MSCs的物理相互作用。雖然此前觀察到HSPCs和MSCs的共同定位(圖10A)，但未獲得物理接觸的證據或相互作用機制的任何標志。掃描電子顯微鏡(SEM)揭示，始終發(fā)現(xiàn)在陶瓷共培養(yǎng)系統(tǒng)中具有約10μm直徑的小圓形HSPCs緊密接觸一個或多個扁平的大MSCs(圖13B)。為進一步闡明這些相互作用所涉及的因素，進行免疫組織學分析。2-光子顯微術揭示，發(fā)現(xiàn)熒光標記的MSCs(紅)和HSPCs(綠)嵌入主要由纖連蛋白和膠原蛋白I組成的ECM網絡(圖13Aii，iii)。信號傳導分子C-kit、整聯(lián)蛋白4a和N-鈣粘蛋白的免疫染色顯示，這些分子位于HSPCs與MSCs接觸的區(qū)域(圖13Aiv、v、vi)，表明3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中的HSPCs和MSCs通過這些分子相互作用，十分類似于認為在骨髓的骨內造血生態(tài)位中存在的相互作用。討論已知骨內造血生態(tài)位——其中造血干細胞和祖細胞(HSPCs)作為慢增殖原始細胞保持——是高度復雜的系統(tǒng)。幾種不同的細胞類型，包括成骨細胞、成骨先祖和間充質干細胞，已被發(fā)現(xiàn)有助于生態(tài)位調控——通過多種機制，如生成ECM分子，直接細胞與細胞接觸和生成信號傳導分子。雖然各自的細胞類型、信號傳導途徑和物理標準被隱含在生態(tài)位保持的不同方面中，但仍然不清楚這些因素之間的相互作用和其在生態(tài)位中的確切作用。因此，有效模擬骨內生態(tài)位的體外模型的開發(fā)將會對研究生態(tài)位相互作用具有很大用處。最近的研究已經顯示，為成功模擬骨內生態(tài)位內的相互作用，需要存在基質支持細胞和3D結構。若干獨立研究已經揭示，骨髓間充質干細胞(MSCs)在原始、靜態(tài)HSCs的體外保持和增殖中尤其有效。MSCs被認為通過生成信號傳導分子如整聯(lián)蛋白、包括膠原蛋白I和纖連蛋白的ECM組分以及通過細胞相互作用來介導生態(tài)位保持。已知膠原蛋白I和纖連蛋白通過結合表面受體和截獲分泌因子來介導HSC尋靶(homing)。還已知MSCs是成骨細胞的前體，成骨細胞是在生態(tài)位中HSPCs的已知伙伴。已顯示，貢獻于骨髓HSPC生態(tài)位的成骨細胞是混合群，其包括處于不同分化程度的細胞。為盡可能接近地模擬所有這些因子，利用羥磷灰石涂布的接種骨髓MSCs的3D陶瓷支架作為臍帶血衍生的HSPCs的培養(yǎng)系統(tǒng)。陶瓷支架被優(yōu)化用于細胞附著，并已被報道誘導MSCs的自發(fā)成骨分化。然而，顯示分化程度小于用BMPs或其他因子誘導的培養(yǎng)，表明在單獨陶瓷支架上培養(yǎng)MSCs，如在骨髓生態(tài)位中那樣，會生成處于不同成骨分化程度的細胞群。在對接種MSCs的陶瓷進行免疫組織化學分析時，觀察到ECM分子——膠原蛋白I和纖連蛋白——的表達，其構成貫穿陶瓷觀察到的密集網絡狀結構的主要組分。還檢測到整聯(lián)蛋白4a的水平增加。MSC接種的陶瓷和股骨頭骨松質的掃描電子顯微鏡分析揭示，二者之間高度的結構相似性。該培養(yǎng)系統(tǒng)的實時PCR分析顯示，早期成骨標記——骨橋蛋白——以及在骨內生態(tài)位中具有已知作用的分子——Jagged-1、C-X-C趨化因子受體4型(CXCL12)、BMP受體1A(BMPR1A)、N-鈣粘蛋白和細胞間附著分子-1(ICAM-1)——的表達在3D培養(yǎng)中上調。已知骨橋蛋白通過限制HSPC增殖和移動來促進生態(tài)位保持和HSPCs靜止。Jagged-1被認為通過Notch-信號傳導來介導HSPC自更新。CXCL12、BMPR1A和N-鈣粘蛋白均已被隱含在HSC尋靶中，并且ICAM-1是細胞間結合的已知介導物。因此，在將MSCs接種到陶瓷支架中1周內，觀察到具有與骨髓生態(tài)位結構和分子相似性的微環(huán)境形成。為完成該假定人造生態(tài)位，然后將CD34+HSPCs導入該系統(tǒng)。利用熒光顯微術，能夠檢測到在3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中熒光標記的HSPCs上至8周——在將其導入陶瓷后，表明HSPCs不僅進入陶瓷，而且長時間保留于此。通過流式細胞術分析，證明陶瓷共培養(yǎng)中大比例(超過50％)的HSPCs從培養(yǎng)1周上至8周穩(wěn)定地保留原始CD34+CD38-表型。相反，發(fā)現(xiàn)常規(guī)單層共培養(yǎng)中或作為限定的細胞因子補充培養(yǎng)基中的懸浮培養(yǎng)而培養(yǎng)的HSPCs始終失去其原始表型。還確認所有培養(yǎng)系統(tǒng)中的細胞均未凋亡或壞死。由于骨內生態(tài)位中的原始HSPCs特征還在于其慢速增殖，因此利用CFSE稀釋研究來研究各培養(yǎng)系統(tǒng)中的HSPC增殖。證明3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中的HSPCs，與常規(guī)培養(yǎng)的HSPCs相比，在4周內經歷極少分裂(<2)。懸浮培養(yǎng)中的細胞尤其高度增殖。還發(fā)現(xiàn)3D共培養(yǎng)的較大百分比的慢增殖細胞保留CD34+CD38-表型。在已經由此確認3D共培養(yǎng)系統(tǒng)能夠在體外長時間保持存活的慢增殖的CD34+CD38-HSPCs后；利用CFUGEMM分析證明這些細胞具有功能性，并且能夠形成紅系和髓樣集落。來自陶瓷的HSPCs的集落形成能力不隨培養(yǎng)時間變化，表明功能性HSPCs被穩(wěn)定保持。在檢測共培養(yǎng)系統(tǒng)中的分子相互作用時，發(fā)現(xiàn)MSCs和HSPCs在前述纖連蛋白和膠原蛋白I構成的網絡中位置緊密接近。還看到生態(tài)位介導分子：干細胞生長因子受體(C-kit)、N-鈣粘蛋白和整聯(lián)蛋白4a與HSPCs和MSCs共同定位，表明這兩種細胞類型可通過這些分子相互作用。C-kit是干細胞生長因子的受體，并且被認為通過介導對生態(tài)位基質的附著來促進HSC在生態(tài)位中的保持。N-鈣粘蛋白和整聯(lián)蛋白4a也被認為具有相似作用。進一步SEM成像揭示了附著MSCs和HSPCs之間的物理相互作用，清楚表明3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中的生態(tài)位樣細胞相互作用。近來的研究成功在與MSCs的共培養(yǎng)中、在分別由膠原蛋白I和纖維蛋白構成的3D凝膠基質中保持HSPCs。這些研究有效證明，成功體外保持HSPCs需要3D支架、適當ECM和伙伴細胞的組合。其他工作已證明，成骨分化的細胞是在3D中HSPCs的有效支持細胞。單層共培養(yǎng)和移植研究已顯示，MSCs使HSPC保持在體外和體內均高度改善。3D共培養(yǎng)系統(tǒng)組合明確限定的剛性支架、自發(fā)地生成適當ECM組分和進行自發(fā)分化的骨髓MSCs以及原始HSPCs，以產生人造系統(tǒng)，其在細胞、分子和結構組成方面接近地模擬骨髓HSPC生態(tài)位。這種系統(tǒng)能夠比之前描述的系統(tǒng)使原始HSPCs維持更長時間。結論陶瓷型3D共培養(yǎng)系統(tǒng)接近地模擬骨內HSPC生態(tài)位的最重要方面，并且將提供有用的體外模型，以研究健康和患病狀態(tài)的生態(tài)位的相互作用。其作為物質測試平臺，用于靶向生態(tài)位任意部分的藥物也具有很大的潛能。這種系統(tǒng)還可形成移植的有效HSPC擴張策略的基礎。表1分分類骨骼發(fā)育[上調基因；24h][FD：倍數變化；AV：平均值]表2分類骨骼發(fā)育[下調基因；24h][FD：倍數變化；AV：平均值]表3分類骨骼發(fā)育[上調基因；28天][FD：倍數變化；AV：平均值]表4分類骨骼發(fā)育[下調基因；28天][FD：倍數變化；AV：平均值]。