本發(fā)明涉及融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一種融合的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPS)及其編碼基因、獲得該融合蛋白的方法及其在培育抗草甘膦植物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
草甘膦是一種非選擇性除草劑，具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、高效、廣譜、低毒、低殘留、易于被微生物分解、不破壞土壤環(huán)境等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，成為目前世界上生產(chǎn)量最大的農(nóng)藥品種。草甘膦的作用機理主要是競爭性抑制莽草酸途徑中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。該酶是真菌、細菌、藻類和高等植物體內(nèi)芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成過程中的一個關(guān)鍵酶，其具有由兩個保守的亞基組成的啞鈴狀結(jié)構(gòu)。草甘膦是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的類似物，是競爭性EPSPS抑制劑，草甘膦、EPSPS和三磷酸莽草酸(S3P)結(jié)合形成EPSPS-S3P-草甘膦復(fù)合體(此復(fù)合體非常穩(wěn)定)，抑制EPSPS的活性導(dǎo)致分支酸合成受阻，阻斷芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，最終導(dǎo)致一些激素和關(guān)鍵性代謝物如類黃酮、木質(zhì)素和酚類化合物代謝失調(diào)，從而擾亂生物體正常的氮代謝而使其死亡。1976年，美國孟山都公司的草甘膦類除草劑-農(nóng)達(Roundup)研制成功并得到廣泛應(yīng)用。隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，抗草甘膦除草劑的轉(zhuǎn)基因作物研究已成為熱點。目前，轉(zhuǎn)EPSPS基因的抗草甘膦除草劑轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)在多個國家廣泛應(yīng)用。目前利用EPSPS基因開展植物抗草甘膦研究主要有兩種方法：第一種，是在植物中過量表達EPSPS，并以此拮抗草甘膦的競爭性抑制。Amrhein等通過逐漸增加草甘膦的濃度，加大草甘膦的選擇壓力，分離獲得了一個耐草甘膦的矮牽牛細胞系。分析這個細胞系中的EPSPS基因，發(fā)現(xiàn)該細胞系的基因組中EPSPS基因的拷貝數(shù)擴增了20倍，使該酶的產(chǎn)量大大增加(AmrheinN,JohanningD,etal.Biochemicalbasisforglyphosate-toleranceinabacteriumandplanttissueculture.FEBSLett.,1983,157:191-196)。第二種，是使EPSPS發(fā)生突變，使其在保持催化活性的同時降低對草甘膦的親和性，甚至不親和。Stalker等從鼠傷寒沙門氏菌中分離到對草甘膦表現(xiàn)抗性的菌株，研究發(fā)現(xiàn)EPSPS的第101位的脯氨酸殘基變?yōu)榻z氨酸殘基,將突變體編碼基因轉(zhuǎn)入煙草后可使轉(zhuǎn)基因煙草對草甘膦的抗性提高(StalkerDM,HiattWR,etal.Aaminoacidsubstitutionintheenzyme5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthaseconfersresistancetotheherbicideglyphosate.JBiolChem,1985,260:4724-4728)；Padgette等將來自大腸桿菌的aroA基因編碼的EPSPS的第96位的甘氨酸殘基突變?yōu)楸彼釟埢Y(jié)果發(fā)現(xiàn)突變蛋白對草甘膦的結(jié)合活性顯著降低，將編碼該突變蛋白的基因在矮牽牛中表達后可顯著提高其對草甘膦的抗性(PadgetteSR,ReDB,GasserCS,etal.Site-directedmutagenesisofaconservedregionofthe5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthaseactivesite.JBiolChem,1991,266:22364-22369)；朱楨等(2005，專利申請?zhí)枺?00510002739.7)通過易錯PCR(Error-PronePCR)方法獲得水稻的抗草甘膦突變體，其EPSPS的第106位氨基酸殘基由脯氨酸殘基變?yōu)榱涟彼釟埢?；MichaelSpnecer等將玉米EPSPS第102位的蘇氨酸殘基突變?yōu)楫惲涟彼釟埢?06位脯氨酸殘基突變?yōu)榻z氨酸殘基，使含有該突變的EPSPS的編碼基因的植株獲得抗除草劑特性(美國專利號：6040497)。本申請人曾將來自棉花的EPSPS第101位蘇氨酸殘基定點突變?yōu)楫惲涟彼釟埢?，?05位脯氨酸殘基改變?yōu)榻z氨酸殘基，獲得可提供一定草甘膦抗性的EPSPS突變基因(PCT/CN2010/078327)。某些外源基因(例如EPSPS編碼基因)在植物中過量表達會增加植物的草甘膦抗性，但是外源基因的過量表達在一定程度上會影響受體的正常生長發(fā)育。因此，獲得新的EPSPS編碼基因，使其在同樣的表達強度下實現(xiàn)更高的草甘膦抗性水平，是開展植物草甘膦抗性基因工程的優(yōu)選方案。目前為止，所有的研究報道均是在不改變EPSPS長度的情況下，利用對功能域氨基酸殘基的定點突變，增加酶對草甘膦的抗性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的思路是以微減棉花EPSPS蛋白突變體BHR2(PCT/CN2010/078327,下文稱為MC-EPSPS)的活性中心容積為目的,采用不同EPSPS同源對比差異互補的設(shè)計思路獲得一批突變體融合蛋白，并進一步進行草甘膦抗性鑒定分析，篩選功能顯著改善的突變?nèi)诤系鞍住Ｆ渲械囊粋€設(shè)計實現(xiàn)了本發(fā)明的內(nèi)容。根據(jù)上述發(fā)明思路，發(fā)明人通過對MC-EPSPS和另外一種EPSPS蛋白G2-aroA(中國專利03826892.2)的氨基酸序列進行同源對比分析，發(fā)現(xiàn)MC-EPSPS在不同區(qū)域存在小段氨基酸的缺失或冗余(圖1)。據(jù)此發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明采用蛋白質(zhì)工程和基因工程相結(jié)合的技術(shù)，獲得了一個EPSPS突變體融合蛋白(下文稱為MC2-EPSPS)，該融合蛋白是在MC-EPSPS蛋白的N端融合了G2-aroA蛋白N端的26個氨基酸殘基。通過原核表達及轉(zhuǎn)基因植物功能鑒定發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明融合蛋白MC2-EPSPS的抗草甘膦水平較MC-EPSPS和G2-aroA均有顯著提高。本發(fā)明首次采用EPSPS融合蛋白篩選方案，獲得了草甘膦抗性顯著提高的EPSPS突變體融合蛋白(MC2-EPSPS)及編碼所述MC2-EPSPS融合蛋白的基因，這使得可在外源EPSPS基因表達水平相同的情況下，獲得草甘膦抗性更強的轉(zhuǎn)基因植物，從而提供了一種獲得抗草甘膦除草劑轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)選方案。本發(fā)明的第一方面提供一種融合蛋白，其序列為SEQIDNO：2。本發(fā)明的第二方面提供編碼本發(fā)明第一方面所述融合蛋白的核苷酸序列；優(yōu)選地，所述核苷酸序列具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。本發(fā)明的第三方面提供一種重組表達載體，其包含本發(fā)明第二方面所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列與表達載體的表達控制序列可操作地連接。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述表達載體為pET28b；在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述表達載體為pCAMBIA2300。本發(fā)明的第四方面提供一種重組細胞，其包含本發(fā)明第二方面所述的核苷酸序列或者本發(fā)明第三方面所述的重組表達載體；在一個優(yōu)選的實施方案中，所述重組細胞為重組大腸桿菌細胞；在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述重組細胞為重組農(nóng)桿菌細胞。本發(fā)明的第五方面提供一種改善植物草甘膦抗性的方法，包括：將本發(fā)明第二方面所述的核苷酸序列或者本發(fā)明第三方面所述的重組表達載體導(dǎo)入植物細胞、組織、器官或植株并使所述核苷酸序列表達；在一個優(yōu)選的實施方案中，所述植物為煙草；在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述植物為棉花。本發(fā)明的第六方面提供一種制備融合蛋白的方法，其包括將本發(fā)明第二方面所述的核苷酸序列插入表達載體并使所述核苷酸序列與所述表達載體的表達調(diào)控序列可操作地連接，然后將所得重組表達載體導(dǎo)入生物體使所述基因表達；在一個優(yōu)選的實施方案中，所述生物體是大腸桿菌；在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述生物體為煙草；在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述生物體為棉花。本發(fā)明的第七方面提供本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白、本發(fā)明第二方面所述的核苷酸序列、本發(fā)明第三方面所述的重組表達載體或本發(fā)明第四方面所述的重組細胞用于改善植物草甘膦抗性以及用于植物育種的用途；在一個優(yōu)選的實施方案中，所述植物為煙草；在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述植物為棉花。附圖說明圖1：棉花MC-EPSPS蛋白與EPSPS蛋白G2-aroA的氨基酸序列進行同源對比分析的結(jié)果。圖2：原核表達載體pET28b-MC2的質(zhì)粒圖。圖3：分別含pET28b-MC2、pET28b-MC、pET28b-G2或pET28b的BL21(DE3)PlysS轉(zhuǎn)化子在含150mM草甘膦的液體M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長曲線圖。圖4：BL21(pET28b-MC)、BL21(pET28b-MC2)和BL21(pET28b-G2)中蛋白的表達情況。其中第1泳道為蛋白Marker(名稱：UnstainedProteinMolecularWeightMarker；購自深圳研順生物科技有限公司)；第2和3泳道為BL21(pET28b-G2)兩個克隆子的蛋白粗提物，第4和5泳道為BL21(pET28b-MC)兩個克隆子的蛋白粗提物，第6和7泳道為BL21(pET28b-MC2)兩個克隆子蛋白粗提物，第8和9泳道為BL21(pET28b)兩個克隆子蛋白粗提物。圖5：pBI121-ATP-G2的質(zhì)粒圖。圖6：pBI121-PTP-G2的質(zhì)粒圖。圖7：pBI121-CTP-G2的質(zhì)粒圖。圖8：圖8a為pCAMBIA2300-2的構(gòu)建流程；圖8b和8c為pCAMBIA-35S-PTP-MC2的構(gòu)建流程。圖9：將6～7葉期的非轉(zhuǎn)基因煙草再生幼苗和T0代轉(zhuǎn)基因煙草幼苗隨機排列，噴施2000ppm草甘膦15天后，再次噴施3000ppm草甘膦7天后觀察到的結(jié)果。圖9a為兩個轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因的煙草植物，其余抗性植物與其類似，在此未示出；圖9b為兩個轉(zhuǎn)PTP-MC-EPSPS基因的煙草植株，其余植株與其類似，在此未示出；圖9c為兩個轉(zhuǎn)PTP-G2基因煙草植株，其余植株與其類似，在此未示出；圖9d為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?。圖10：對轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草進行RT-PCR檢測的電泳結(jié)果。1-3為轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因的抗3000ppm草甘膦T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株，4-6為轉(zhuǎn)PTP-MC-EPSPS基因的不抗3000ppm草甘膦T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株，7-9為轉(zhuǎn)PTP-G2-EPSPS基因的不抗3000ppm草甘膦草甘膦T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株，10-12為轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因不抗3000ppm草甘膦的T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株，13為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵?。?nèi)參為煙草內(nèi)源Actin基因(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB158612.1)。圖11：將4～5葉期的非轉(zhuǎn)基因棉花幼苗和T0代轉(zhuǎn)基因棉花幼苗隨機排列，噴施3000ppm草甘膦至飽和(每平米噴施50ml)10天后所觀察到的結(jié)果。圖11a為兩個轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因抗性棉花植株，其余抗性植株與其類似，在此未示出；圖11b為兩個轉(zhuǎn)PTP-MC-EPSPS基因抗性棉花植株，其余抗性植株與其類似，在此未示出；圖11c為兩個轉(zhuǎn)PTP-G2基因抗性棉花植株，其余抗性植株與其類似，在此未示出；圖11d為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辍D12：對轉(zhuǎn)基因棉花機非轉(zhuǎn)基因?qū)φ彰藁ㄟM行RT-PCR檢測的電泳結(jié)果。1-2為轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因的抗草甘膦T0代轉(zhuǎn)基因棉花植株，3-5為PTP-MC-EPSPS基因的不抗草甘膦T0代轉(zhuǎn)基因棉花植株，6-8為轉(zhuǎn)PTP-G2基因的不抗草甘膦的T0代棉花，9-11為不抗草甘膦的轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因的T0代棉花，12為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ彰藁?。陸地棉?nèi)源Actin基因(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/32186889)為內(nèi)參。圖13為pCAMBIA-35S-PTP-MC2的質(zhì)粒圖。具體實施方式提供以下實施例，以方便本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明。所述實施例僅出于示例性目的，并非意在限制本發(fā)明的范圍。實施例中使用的化合物或試劑可通過商業(yè)途徑購得，或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備得到；所使用的實驗儀器可通過商業(yè)途徑購得。實施例1MC2-EPSPS編碼基因的獲得1.棉花5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因C-EPSPS的克隆取鄂雜棉11F1(創(chuàng)世紀轉(zhuǎn)基因技術(shù)有限公司銷售)葉片0.5g，按植物RNA提取試劑盒(購自Invitrogen)說明書操作提取棉花葉片的總RNA。棉花葉片總RNA逆轉(zhuǎn)錄：在0.2mlEP管中，加入2.0μl總RNA(0.1μg/μl)和2.0μlOligo(dT12-18)(2μM)，混勻，65℃水浴10分鐘，立即冰浴5分鐘，然后加入2.0μl10×RTbuffer，2.0μl250μMdNTPmix，2.0μl100mMDTT，9.8μlDEPCH2O，0.2μl200U/μlSuperScriptIII(Invitrogen)，混勻后50℃反應(yīng)60分鐘；然后在70℃失活15分鐘；-20℃保存。棉花EPSPS編碼基因的獲得：以上述所得棉花cDNA為模板，擴增得到包括棉花EPSPS編碼基因的5’端非翻譯區(qū)(5’UTR)、葉綠體導(dǎo)肽(CTP)、EPSPS編碼基因和3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)在內(nèi)的基因組序列。反應(yīng)體系如下：50μlPCR反應(yīng)體系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlcDNA，1.0μlPrimeSTARHSDNA聚合酶(購自TAKARA)、10μM的引物SEQIDNO:3和SEQIDNO:4各2.0μl(便于后續(xù)構(gòu)建，在引物兩端分別引入EcoRI、SacI識別位點)，以及30μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min、5個循環(huán)(94℃變性45s、56℃退火45s、72℃延伸2min)，25個循環(huán)(94℃變性45s、60℃退火45s、72℃延伸2min)，72℃延伸7min。所得的擴增產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和SacI酶切后插入到克隆載體pBluescriptIISK(-)(下文稱為pBluescript載體，購自深圳研順生物技術(shù)有限公司)的EcoRI和SacI多克隆酶切位點之間，連接反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下：酶切后的PCR產(chǎn)物3μl，2×T4DNA連接酶緩沖液5μl，酶切后的pBluescript載體1μl，T4DNA連接酶1μl，于4℃連接過夜。所得載體命名為pBluescript-C-EPSPS。取10μL連接反應(yīng)產(chǎn)物，加入到100μL大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞(購自TAKARA)中并混勻，冰浴30min、42℃熱休克60s、冰浴2min，另加250μLLB培養(yǎng)液(含1％胰蛋白胨，購自O(shè)XOID；0.5％酵母提取物，購自O(shè)XOID；1％NaCl，購自國藥)后置于37℃搖床中，以225r/min振蕩培養(yǎng)30min。取200μL培養(yǎng)后的菌液涂布于含50μg/mL氨芐青霉素(購自北京拜爾迪)的LB固體培養(yǎng)平板(含1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、1.5％瓊脂)上，37℃培育18h。挑取克隆子并分別進行PCR(反應(yīng)體系及條件同上)驗證，將PCR陽性克隆送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序，測序所用引物為BcaBESTTMSequencingPrimerRV-M(SEQIDNO:5),BcaBESTTMSequencingPrimerM13-47(SEQIDNO:6),特異性引物(SEQIDNO:7)，測序所得序列為SEQIDNO:8。8SEQIDNO:8中第7bp－184bp為5’UTR區(qū)；第185bp－418bp為葉綠體導(dǎo)肽核苷酸序列；第419bp－1750bp為編碼EPSPS蛋白的核苷酸序列(命名為C-EPSPS)，所述C-EPSPS對應(yīng)的氨基酸序列為SEQIDNO:9(其為去除導(dǎo)肽并在N端增加甲硫氨酸后的EPSPS蛋白的氨基酸序列)；第1751－2028bp為3’UTR。2.棉花EPSPS編碼基因C-EPSPS的定點突變以上述經(jīng)過測序驗證的pBluescript-C-EPSPS質(zhì)粒為模板，對C-EPSPS基因進行定點突變，將其所編碼蛋白N端第三個α螺旋中的蘇氨酸(SEQIDNO:9中第102位氨基酸)改變?yōu)楫惲涟彼?，脯氨?SEQIDNO:9中第106位氨基酸)改變?yōu)榻z氨酸。為表達載體構(gòu)建需要，將SEQIDNO:9中第208位的脯氨酸及第406位的丙氨酸進行同義突變，消除了原基因中存在的NdeI(SEQIDNO:8中第1038bp處的“CATATG”突變?yōu)椤癈TTATG”)和NcoI(SEQIDNO:8中第1632bp處的“CCATGG”突變?yōu)椤癈TATGG”)兩個酶切位點對后續(xù)構(gòu)建的影響。所述定點突變過程如下：1)使用突變引物SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12，并將其5’端磷酸化以利于后續(xù)PCR產(chǎn)物的連接、環(huán)化。引物磷酸化反應(yīng)過程如下：引物SEQIDNO:10(50μM)：5μl引物SEQIDNO:11(50μM)：5μl引物SEQIDNO:12(50μM)：5μl10×T4DNAPolynucleotideKinaseBuffer(購自TAKARA)：3μlT4DNAPolynucleotideKinase(購自TAKARA)：1μlATP(10mM)：3μl補水至30μl37℃反應(yīng)45min后置于4℃終止反應(yīng)并保存。定點突變過程：以所述含C-EPSPS基因的克隆載體pBluescript-C-EPSPS為模板，反應(yīng)過程使用STRATAGENE的QuikChangeMulti突變試劑盒并參照其說明書操作(在25μl反應(yīng)體系中，加入約70ng模板質(zhì)粒，2.5μl10×QuickchangeMultiBuffer，3.0μl磷酸化的引物混合物，1.0μldNTPMix，1.0μlMultienzymeblend，加水至25μl。反應(yīng)條件：95.0℃預(yù)變性1min；30個循環(huán)(95.0℃變性1min；55℃退火1min；65℃延伸10min)，反應(yīng)完成后通過冰浴將溫度降至37.0℃以下，加1μlDpnI，37.0℃消化2h，取2μl消化產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌)。將所得的突變后的載體命名為pBluescript-MC-EPSPS。取3μL突變后的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞進行克隆測序驗證(反應(yīng)體系及方法同上)。經(jīng)PCR及測序驗證得到發(fā)生目標突變的克隆子后保存?zhèn)溆?。設(shè)計引物SEQIDNO:13和SEQIDNO:14，以上述經(jīng)驗證發(fā)生目標突變的pBluescript-MC-EPSPS質(zhì)粒為模板，擴增除導(dǎo)肽序列以外的棉花EPSPS編碼區(qū)序列，其5’端增加起始密碼子ATG以便于后續(xù)構(gòu)建。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下：50μlPCR反應(yīng)體系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlpBluescript-MC-EPSPS質(zhì)粒，1.0μlPrimeSTARHSDNA聚合酶(購自TAKARA)、10μM的引物SEQIDNO:13和SEQIDNO:14各2.0μl，以及30μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min、33個循環(huán)(94℃變性45s、56℃退火45s、72℃延伸2min)，72℃延伸7min。兩引物末端分別設(shè)計NcoI和XhoI位點，將擴增產(chǎn)物用NcoI和XhoI酶切后插入至pET28b的NcoI和XhoI多克隆位點之間，獲得重組表達載體pET28b-MC。取10μL連接反應(yīng)產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化到100μL大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中(方法同上)。取200μL培養(yǎng)后的菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素(購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)的LB固體培養(yǎng)平板上，37℃培育18h。挑選正常生長的菌落進行測序驗證，所得突變后的基因序列為SEQIDNO:15，并將其命名為MC-EPSPS。3.融合基因MC2-EPSPS克隆根據(jù)G2-aroA蛋白(專利申請?zhí)枺?3826892.2)的氨基酸序列，在保持其氨基酸不變的前提下，根據(jù)棉花密碼子偏好性設(shè)計G2基因，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(序列為SEQIDNO:16)。將合成的G2基因T克隆至pUC57-T載體中，所得的重組質(zhì)粒命名為pUC57-G2。設(shè)計引物SEQIDNO:17和SEQIDNO:18，以擴增G2基因5’端的78個核苷酸序列，并使其5’端帶NcoI位點，3’端帶NdeI位點。采用TAKARA的PrimeSTARHSDNA聚合酶，以上述pUC57-G2質(zhì)粒為模板進行PCR反應(yīng)。50μlPCR反應(yīng)體系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlpUC57-G2質(zhì)粒，1.0μlPrimeSTARHSDNA聚合酶、10μM的引物SEQIDNO:17和SEQIDNO:18各2.0μl，以及30μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，33個循環(huán)(94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸10s)，72℃延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物加A尾：PCR產(chǎn)物加2.5倍體積的無水乙醇，-20℃放置10分鐘，離心，去上清，晾干，用21μl雙蒸水溶解。加入2.5μl10×ExBuffer，0.5μl5mM的dATP，2.5μlExTaq。ExTaq及10×ExBuffer均購自TAKARA。反應(yīng)條件：70℃反應(yīng)30分鐘。將得到的約100bp的DNA片段回收(使用購自O(shè)mega的回收試劑盒)，并將其連接至pGEMT-easy載體(購自Promega),然后轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞((購自TAKARA)(連接體系及轉(zhuǎn)化方法同上)，隨機挑取10個白色菌落于含有50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),37℃培養(yǎng)過夜后加甘油至終濃度20％，-80℃保存?zhèn)溆谩＝?jīng)NcoI和NdeI雙酶切鑒定后將得到2個陽性克隆送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序，保留測序正確克隆子，命名為pGEM-G2(78)。利用引物SEQIDNO:19和SEQIDNO:14，以上述經(jīng)測序驗證的pET28b-MC質(zhì)粒為模板擴增MC-EPSPS基因，使其5’端帶NdeI位點，3’端帶XhoI位點，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，33個循環(huán)(94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min)，72℃延伸10min。將所得PCR產(chǎn)物連接到pGEMT-easy載體(購自Promega),然后轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞進行克隆測序驗證(反應(yīng)體系及方法同上)。經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切鑒定正確后，將得到2個陽性克隆送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序，保留測序正確克隆子,命名為pGEM-MC。用NcoI和XhoI酶切pET28b，并回收載體片段；用NcoI和NdeI雙酶切pGEM-G2(78),并回收約78bp大小的片段；用NdeI和XhoI雙酶切pGEM-MC，回收1300bp大小的片段，將上述三個片段進行三片段連接，獲得重組質(zhì)粒pET28b-MC2(見圖2)，G25’端的78bp加MC-EPSPS基因組成的融合基因命名為MC2-EPSPS。經(jīng)轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞后進行克隆測序驗證(方法同上)，該融合基因的核苷酸序列為SEQIDNO:1，其所對應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQIDNO:2。實施例2MC2-EPSPS基因原核表達產(chǎn)物抗草甘膦特性分析原核表達載體構(gòu)建：參照上述pET28b-MC2載體的構(gòu)建策略和步驟，使用引物SEQIDNO:17和SEQIDNO:20在G2基因兩端分別引入NcoI和XhoI位點，并通過NcoI和XhoI酶切將G2基因插入到pET28b載體，獲得原核表達載體pET28b-G2。抗草甘膦功能分析：將上述pET28b-MC、pET28b-MC2和pET28b-G2表達載體及質(zhì)粒對照pET28b分別轉(zhuǎn)化原核表達菌株BL21(DE3)PlysS(購自上海博麥德生物技術(shù)有限公司)，轉(zhuǎn)化方法參照《分子克隆》(第三版)中的描述。將所得陽性轉(zhuǎn)化子分別命名為BL21(pET28b-MC)、BL21(pET28b-MC2)、BL21(pET28b-G2)及BL21(pET28b)，并將其分別接種到含有50μg/mL卡那霉素的液體M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含48mMNa2PO4·7H2O，22mMKH2PO4，8.5mMNacl，19mMNH4Cl，2mMMgSO4，0.1mMCaCl2和0.4％葡萄糖)，37℃下活化過夜后，按1:100(V/V)稀釋。分別取300μL稀釋后的菌液接種到30mL液體M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含卡那霉素50μg/mL)中，以200rpm,37℃空氣浴的條件培養(yǎng)。培養(yǎng)到OD600＝0.100左右，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，購自TAKARA)至終濃度為1mmol/L，加入草甘膦(購自山東濱州九安化工有限公司)至終濃度150mM，以200rpm，37℃空氣浴的條件培養(yǎng)14小時，然后繼續(xù)培養(yǎng)并每隔2小時測定一次培養(yǎng)物OD600，并記錄其生長情況。每組設(shè)兩個重復(fù)，測定結(jié)果見表1。將每組的值求平均值后，繪制生長曲線圖(圖3)。表1150mM草甘膦濃度下攜帶不同基因的BL21(DE3)PlysS生長情況表從表1和圖3可看出，在含有150mM草甘膦的M9基本培養(yǎng)基中，攜帶MC2-EPSPS基因的轉(zhuǎn)化子BL21(pET28b-MC2)的生長速度顯著快于攜帶MC-EPSPS基因的轉(zhuǎn)化子BL21(pET28b-MC)或攜帶G2基因的轉(zhuǎn)化子BL21(pET28b-G2)；而只攜帶pET28b質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在含有150mM的草甘膦的M9基本培養(yǎng)基中的生長已受到嚴重的抑制。每組的兩重復(fù)間的結(jié)果基本一致。由此可見，MC2-EPSPS蛋白的抗草甘膦能力比MC-EPSPS蛋白或G2蛋白的抗草甘膦能力有顯著提高。原核表達情況分析：挑取BL21(pET28b-MC)、BL21(pET28b-MC2)和BL21(pET28b-G2)單菌落分別接種到液體LB(含卡那霉素50μg/mL)中，37℃下活化過夜后，按1:100(V/V)稀釋。各取50μL所述稀釋液分別接種到5mL液體LB(含卡那霉素50μg/mL)中，在37℃、200rpm下培養(yǎng)到OD600＝0.6左右，分別加入IPTG至終濃度為1mmol/L，于37℃振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)表達3h。分別離心并收集沉淀的菌體，用2×SDS上樣緩沖液重懸菌體，沸水中煮5min得到蛋白粗提物，12000rpm離心1min，分別取15μL上清進行SDS-PAGE電泳分析。參考Sambrook等(1989)的方法，用10％SDS-PAGE電泳分離蛋白，0.25％考馬斯亮藍R-250染色。結(jié)果如圖4所示，第1泳道為蛋白Marker(名稱：UnstainedProteinMolecularWeightMarker；購自深圳研順生物科技有限公司)；第2和3泳道為BL21(pET28b-G2)兩個克隆子的蛋白粗提物，第4和5泳道為BL21(pET28b-MC)兩個克隆子的蛋白粗提物，第6和7泳道為BL21(pET28b-MC2)兩個克隆子蛋白粗提物，第8和9泳道為BL21(pET28b)兩個克隆子蛋白粗提物。由電泳圖可以看出，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的攜帶MC-EPSPS、MC2-EPSPS和G2基因的克隆子均可表達出大小約為47kDa的目的蛋白，并且MC2-EPSPS蛋白略大于MC-EPSPS和G2蛋白。這表明，在相同的表達條件下，三者均可獲得有效表達，并且電泳結(jié)果顯示三者的蛋白表達水平?jīng)]有顯著差異。綜上可知，MC2-EPSPS抗草甘膦能力的提高不是由于蛋白的過量表達引起的，而是由于蛋白結(jié)構(gòu)的改變引起的。實施例3葉綠體導(dǎo)肽篩選、鑒定1.載體構(gòu)建對NCBI已報道的擬南芥、矮牽牛和棉花的葉綠體導(dǎo)肽基因ATP、PTP和CTP的DNA序列進行密碼子分析，經(jīng)同義替換消除ATP和PTP中的稀有密碼子，并在所述3種導(dǎo)肽的5’端加BamHI酶切位點，3’端加NcoI酶切位點，所得序列分別為SEQIDNO:21(ATP)、SEQIDNO:22(PTP)和SEQIDNO:23(CTP)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。將所述三個序列分別T克隆至pUC57-T載體中，所得重組質(zhì)粒分別命名為pUC57-ATP、pUC57-PTP和pUC57-CTP。利用引物SEQIDNO:17和SEQIDNO:24，采用TAKARA的PrimeSTARHSDNA聚合酶，以pUC57-G2質(zhì)粒為模板進行PCR反應(yīng)來擴增G2基因，使其5’端帶NcoI位點，3’端帶SacI位點。50μlPCR反應(yīng)體系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlpUC57-G2質(zhì)粒，1.0μlPrimeSTARHSDNA聚合酶、10μM的引物SEQIDNO:17和SEQIDNO:24各2.0μl，以及30μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，33個循環(huán)(94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s)，72℃延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物加A尾：PCR產(chǎn)物加2.5倍體積的無水乙醇，-20℃放置10分鐘，離心，去上清，晾干，用21μl雙蒸水溶解。加入2.5μl10×ExBuffer，0.5μl5mM的dATP，2.5μlExTaq。ExTaq及10×ExBuffer均購自TAKARA。反應(yīng)條件：70℃反應(yīng)30分鐘。將得到約1300bp的DNA片段回收(使用購自O(shè)mega的回收試劑盒)，并將其連接至pGEMT-easy載體(購自Promega),然后轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞(連接體系及轉(zhuǎn)化方法同上)，隨機挑取10個白色菌落分別接種于含有50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)過夜后加甘油至終濃度20％，-80℃保存?zhèn)溆?。?jīng)NcoI和SacI雙酶切鑒定后將得到2個陽性克隆送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序，保留測序正確克隆子，命名為pGEM-G2。用BamHI和NcoI雙酶切質(zhì)粒pUC57-ATP，回收ATP片段；用NcoI和SacI雙酶切pGEM-G2，回收G2片段，用BamHI和SacI雙酶切質(zhì)粒pBI121(購自北京華夏遠洋科技有限公司)，回收載體片段，以三片段連接方式將上述回收的ATP和G2片段同時插入pBI121中，獲得植物表達載體pBI121-ATP-G2。同理構(gòu)建pBI121-PTP-G2和pBI121-CTP-G2,圖譜分別如圖5，6，7所示。將上述質(zhì)粒分別通過電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404(購自Invitrogen，轉(zhuǎn)化方法參照匡小嬰等.影響根癌農(nóng)桿菌的電擊轉(zhuǎn)化條件.食品與生物技術(shù)學(xué)報.2005年04期)，并通過抗生素及PCR篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化克隆。將含有所述質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落接種于含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平(購自深圳市凱聯(lián)生物技術(shù)有限公司)的YEB液體培養(yǎng)基(含0.1％酵母提取物，0.5％牛肉膏，0.5％蛋白胨，0.5％蔗糖，0.05％MgSO4.7H2O)中。28℃、200rpm振蕩暗培養(yǎng)過夜至對數(shù)期(OD600值0.8～1.2)用于植物轉(zhuǎn)化。2.轉(zhuǎn)化煙草用75％酒精浸泡煙草種子(NicotianatabacumL.，國家煙草中期庫，獲取單位：中國農(nóng)科院煙草所，庫編號I5A00660)30s，用滅菌雙蒸水洗兩次。再用0.1％升汞浸泡8min，用滅菌雙蒸水洗兩次，完成表面滅菌。將表面滅菌的煙草種子置于MS固體培養(yǎng)基(含18.78mMKNO3，1.25mMKH2PO4，20.6mMNH4NO3，1.5mMMgSO4，3.0mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNa2EDTA，100μMFeSO4，7.4g/L瓊脂，蔗糖30g/L)上于無菌條件下發(fā)芽，制備無菌苗。取無菌苗葉片剪成5mm×5mm大小的葉盤，將處于對數(shù)生長期的分別含表達載體pBI121-ATP-G2、pBI121-PTP-G2或pBI121-CTP-G2質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404浸染葉盤10min，吸干菌液，在黑暗條件下共培養(yǎng)2天(MS固體培養(yǎng)基)。將葉片轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基(MS+1mg/L細胞分裂素(BA，購自上海稼豐園藝用品有限公司)+0.1mg/L萘乙酸(NAA，購自上海稼豐園藝用品有限公司)+50mg/L卡那霉素+500mg/L頭孢霉素(購自深圳市凱聯(lián)生物技術(shù)有限公司))上，光照條件下培養(yǎng)45天左右，待芽長大后切下轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(MS+50mg/L卡那霉素+500mg/L頭孢霉素)中培養(yǎng)30天左右，待根系發(fā)達后將小苗轉(zhuǎn)入含有500mg/L頭孢霉素的MS培養(yǎng)基上進行編號保存。在轉(zhuǎn)化過程中部分葉盤不作浸染，讓其再生為正常小苗，在后續(xù)實驗中作為陰性對照。取獲得的轉(zhuǎn)基因煙草葉片，提取DNA(方法參照《分子克隆》(第三版))，用SEQIDNO:17和SEQIDNO:24作為檢測引物。50μlPCR反應(yīng)體系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlDNA，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO:17和SEQIDNO:24各2.0μl，以及35μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，33個循環(huán)(94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min)，并將PCR鑒定為陽性的植株保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜鋈N質(zhì)粒分別獲得約30個轉(zhuǎn)化事件。3.抗草甘膦功能鑒定將6～7葉期的非轉(zhuǎn)基因煙草再生幼苗和T0代轉(zhuǎn)基因煙草幼苗隨機排列，噴施2000ppm草甘膦(商品名：農(nóng)達，購自深圳詩佳貿(mào)易公司)至飽和(每平米噴施50ml)。7天后觀察試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓陣乐匚瑁D(zhuǎn)基因煙草結(jié)果如下：其中28株轉(zhuǎn)ATP-G2基因的煙草均表現(xiàn)不同程度萎蔫，未發(fā)現(xiàn)抗性植株；29株轉(zhuǎn)CTP-G2基因的煙草中只有1株抗性植株；30株轉(zhuǎn)PTP-G2基因的煙草中有5株抗性植株。后續(xù)研究中，均以PTP作為EPSPS基因的導(dǎo)肽序列。實施例4MC2-EPSPS基因植物表達載體構(gòu)建選擇植物雙元表達載體pCAMBIA2300(購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司)作為植物表達載體，用Pnos啟動子替換NPTII基因含雙增強子的35S啟動子，以降低NPTII蛋白在植物中的表達。選擇含雙增強子的35S啟動子及Tnos終止子分別作為MC2-EPSPS基因的啟動子和終止子。用引物SEQIDNO:25和SEQIDNO:26以植物表達載體pBI121(購自北京華夏遠洋科技有限公司)為模板擴增Pnos啟動子，使其兩端分別帶EcoRI、BglII酶切位點。50μlPCR反應(yīng)體系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μlpBI121質(zhì)粒，1.0μlPrimeSTARHSDNA聚合酶(購自TAKARA)、10μM的引物SEQIDNO:25和SEQIDNO:26各2.0μl，以及31μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，33個循環(huán)(94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃延伸10min。通過EcoRI、BglII酶切將所得PCR產(chǎn)物插入到pCAMBIA2300(購自Promega，T4連接酶盒)獲得pCAMBIA2300-1。使用引物SEQIDNO:27和SEQIDNO:28，以pBI121質(zhì)粒為模板擴增Tnos終止子，使其兩端分別帶SacI、EcoRI酶切位點。50μlPCR反應(yīng)體系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μlpBI121質(zhì)粒，1.0μlPrimeSTARHSDNA聚合酶(購自TAKARA)、10μM的引物SEQIDNO:27和SEQIDNO:28各2.0μl，以及31μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，33個循環(huán)(94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃延伸10min。通過SacI、EcoRI酶切將所得PCR產(chǎn)物插入到pCAMBIA2300-1獲得pCAMBIA2300-2，具體構(gòu)建流程如圖8a所示。使用引物SEQIDNO:29和SEQIDNO:30，以載體pCAMBIA2300為模板擴增含雙增強子的35S啟動子。所述兩條引物的5’端分別帶HindIII和BamHI，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后插入到pUC18載體(購自TAKARA)中，得到重組質(zhì)粒pUC18-35S。根據(jù)公布的OK(Omega&Kozak)序列及PS序列(Processing&Splicingsequence)(兩者已在ZL95119563.8中充分公開)合成BamHI-OK-PstI-XhoI-PS-SacI片段，其序列為SEQIDNO:31。其中，該片段的5’端和3’端分別帶BamHI和SacI酶切位點，在OK與PS之間以PstI、XhoI兩酶切位點相連，兩個酶切位點間插入保護堿基便于后續(xù)的酶切構(gòu)建。利用BamHI和SacI酶切，將OK-PstI-XhoI-PS插入到所述重組質(zhì)粒pUC18-35S中，獲得重組質(zhì)粒pUC18-35S-OK-PS。設(shè)計引物SEQIDNO:32和SEQIDNO:33，以質(zhì)粒pUC57-PTP為模板擴增PTP序列，使其5’端添加PstI酶切位點，其3’端添加NcoI酶切位點，通過酶切以三片段連接的方式將PstI-PTP-NcoI(經(jīng)PstI和NcoI雙酶切)及NcoI-MC2-EPSPS-XhoI(將上述pET28b-MC2用NcoI和XhoI雙酶切)兩個片段同時插入到pUC18-35S-OK-PS(PstI和XhoI雙酶切)中，獲得重組質(zhì)粒pUC18-35S-OK-PTP-MC2-PS利用HindIII和SacI酶切將所述重組質(zhì)粒pUC18-35S-OK-PTP-MC2-PS35S至PS的片段(SEQIDNO:34)插入到pCAMBIA2300-2中，并進行克隆測序檢測(感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化、篩選及測序方法同上)，獲得植物表達載體pCAMBIA-35S-PTP-MC2(見圖13)，具體構(gòu)建流程如圖8(圖8b-8c)所示。參照與pCAMBIA-35S-PTP-MC2載體構(gòu)建相同的步驟，獲得重組質(zhì)粒pUC18-35S-OK-PTP-MC-PS和pUC18-35S-OK-PTP-G2-PS。分別將兩質(zhì)粒中35S至PS的片段(分別為SEQIDNO:35，SEQIDNO:36)插入到pCAMBIA2300-2的HindIII和SacI多克隆酶切位點之間并克隆測序檢測(感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化、篩選及測序方法同上)，獲得植物表達載體pCAMBIA-35S-PTP-MC和pCAMBIA-35S-PTP-G2。分別用上述獲得的陽性植物表達載體pCAMBIA-35S-PTP-MC2、pCAMBIA-35S-PTP-MC或pCMABIA-35S-PTP-G2質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，將篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化克隆暗培養(yǎng)過夜至對數(shù)期(OD600值0.8～1.2)用于植物轉(zhuǎn)化(方法同實施例3)。實施例5利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草用實施例4中所得的處于對數(shù)生長期的分別含表達載體pCAMBIA-35S-PTP-MC2、pCAMBIA-35S-PTP-MC或pCAMBIA-35S-PTP-G2質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404浸染煙草葉盤，轉(zhuǎn)化方法及陰性對照煙草獲得方法如實施例3。取獲得的轉(zhuǎn)基因煙草葉片，提取DNA(方法參照《分子克隆》(第三版))，使用引物SEQIDNO:37和SEQIDNO:38(50μlPCR反應(yīng)體系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlDNA，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO:37和SEQIDNO:38各2.0μl，以及35μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，33個循環(huán)(94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min)，72℃延伸10min)，并將鑒定結(jié)果為陽性的植株保存?zhèn)溆谩Ｋ雒糠N質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因分別獲得約80個轉(zhuǎn)化事件。實施例6過表達EPSPS轉(zhuǎn)基因煙草T0代植株抗草甘膦功能鑒定將6～7葉期的非轉(zhuǎn)基因煙草再生幼苗和T0代轉(zhuǎn)基因煙草幼苗隨機排列，噴施2000ppm草甘膦(商品名：農(nóng)達，購自深圳詩佳貿(mào)易公司)至飽和(每平米噴施50ml)。7天后觀察試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?CK1)植株嚴重萎蔫，而分別轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS、PTP-MC-EPSPS或PTP-G2基因的煙草均有部分植株表現(xiàn)出草甘膦抗性，其中轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因煙草的抗性植株比率為33.7％，顯著高于轉(zhuǎn)PTP-MC-EPSPS基因煙草的抗性植株比率(17.3％)和轉(zhuǎn)PTP-G2基因煙草抗性植株比率(13.9％)(統(tǒng)計結(jié)果見表2)。CK1為用草甘膦處理的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，CK2為未處理的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?。?轉(zhuǎn)基因煙草的草甘膦抗性鑒定結(jié)果噴施2000ppm草甘膦15天后，對上述抗性轉(zhuǎn)基因煙草再次噴施3000ppm草甘膦，噴施方法同上。7天后觀察結(jié)果(見圖9a-9d)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因的28株煙草中除5株葉片輕度發(fā)黃、萎蔫外，其余23株均生長正常(圖9a為兩個轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因煙草植株，其余抗性植株與其類似，在此未示出)；而14株轉(zhuǎn)PTP-MC-EPSPS基因煙草(圖9b為兩個轉(zhuǎn)PTP-MC-EPSPS基因煙草植株，其余植株與其類似，在此未示出)和11株轉(zhuǎn)PTP-G2基因煙草(圖9c為兩個轉(zhuǎn)PTP-G2基因煙草植株，其余植株與其類似，在此未示出)均表現(xiàn)不同程度葉片發(fā)黃、萎蔫，甚至死亡，在所述草甘膦濃度處理下未篩選到抗性植株；非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?圖9d)死亡。所述結(jié)果表明，轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因煙草植株的草甘膦抗性顯著高于轉(zhuǎn)PTP-MC-EPSPS基因或PTP-G2基因煙草植株的草甘膦抗性。根據(jù)噴施3000ppm草甘膦的鑒定結(jié)果，隨機選取其中轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因植株中的抗草甘膦和不抗草甘膦轉(zhuǎn)基因煙草植株各3棵、轉(zhuǎn)PTP-MC-EPSPS和轉(zhuǎn)PTP-G2不抗草甘膦轉(zhuǎn)基因煙草植株各3棵、及1棵非轉(zhuǎn)基因煙草植株，用植物RNA提取試劑盒(invitrogen)分別提取葉片總RNA。紫外分光光度測定總RNA在260nm和280nm的吸光度值，計算各RNA濃度。依照invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒(SuperScriptIIIReverseTranscriptase)所提供的方法進行反轉(zhuǎn)錄(1μg總RNA作為模板，反轉(zhuǎn)錄引物分別為SEQIDNO:38)。使用引物SEQIDNO:37和SEQIDNO:38擴增PTP，檢測該融合蛋白的相對表達情況(PTP與EPSPS基因融合表達，檢測PTP的轉(zhuǎn)錄水平即代表EPSPS基因的轉(zhuǎn)錄水平)。50μlPCR反應(yīng)體系：50μlPCR反應(yīng)體系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlcDNA，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO:37和SEQIDNO:38各2.0μl，以及35μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，33個循環(huán)(94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min)，72℃延伸10min。以煙草內(nèi)源Actin基因(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB158612.1)作為內(nèi)參，對上述轉(zhuǎn)基因樣品進行RT-PCR檢測。反轉(zhuǎn)錄引物為SEQIDNO:40；PCR引物為SEQIDNO:39和SEQIDNO:40。反轉(zhuǎn)錄及PCR體系和條件同上。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖10所示：1-3為轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因的抗3000ppm草甘膦T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株，4-6為轉(zhuǎn)PTP-MC-EPSPS基因的不抗3000ppm草甘膦T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株，7-9為轉(zhuǎn)PTP-G2基因的不抗3000ppm草甘膦草甘膦T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株，10-12為轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因不抗3000ppm草甘膦的T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株，13為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵?。上述檢測結(jié)果表明,對照煙草植株中沒有PTP基因的轉(zhuǎn)錄；不抗草甘膦的轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因煙草植株中目的基因轉(zhuǎn)錄較弱或沒有轉(zhuǎn)錄；抗3000ppm草甘膦T0代轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因的煙草植株與不抗草甘膦的轉(zhuǎn)PTP-MC-EPSPS基因和轉(zhuǎn)PTP-G2基因的煙草中目的基因轉(zhuǎn)錄程度基本一致(第9泳道轉(zhuǎn)PTP-G2基因植株轉(zhuǎn)錄較弱除外)。以上結(jié)果表明，在所轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄基本水平一致的情況下，轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因煙草植株的草甘膦抗性顯著高于轉(zhuǎn)PTP-MC-EPSPS基因或PTP-G2基因煙草植株的草甘膦抗性。實施例7利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行棉花的遺傳轉(zhuǎn)化。具體操作步驟如下：1.無菌苗制備(1)棉花種子用濃硫酸(H2SO4)脫去短絨，自來水洗掉種子表面的硫酸，晾干后用70％乙醇浸泡對種子進行表面消毒1min，再用10％～15％過氧化氫(H2O2)處理2～4h，用無菌水沖洗2～3次；(2)在無菌水中浸泡18～24h,待種子露白，再在無菌條件下剝?nèi)シN皮，種入種苗培養(yǎng)基(1/2MS(含9.39mMKNO3，0.625mMKH2PO4，10.3mMNH4NO3，0.75mMMgSO4，1.5mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNaEDTA，100μMFeSO4)+瓊脂6g/L，pH6.8)中；(3)25℃～28℃光培養(yǎng)3～5天備用。2.棉花外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)取無菌苗的下胚軸，用解剖刀切成0.5～0.6cm小段，浸入含表達載體pCAMBIA-35S-PTP-MC2質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液(OD600為0.8～1.2)中5～10min，然后取出下胚軸段，用滅菌濾紙吸干多余的菌液，放在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(MS+2，4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+乙酰丁香酮200mg/L+瓊脂6g/L，pH5.0，培養(yǎng)基表面鋪一層滅菌濾紙)，用封口膜封口。于22℃～25℃在暗處共培養(yǎng)2天。3.愈傷組織誘導(dǎo)及抗性愈傷組織的篩選(1)愈傷組織的誘導(dǎo)將所述共培養(yǎng)后的下胚軸段放入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(MS+2,4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L+MgCl20.91g/L+脫乙酰吉蘭糖膠2.0g/L+卡那霉素50～100mg/L+頭孢霉素500mg/L+葡萄糖30g/L，pH5.8)，在25℃培養(yǎng)2個月(一個月?lián)Q一次相同的培養(yǎng)基)。4.愈傷組織的增殖繼代將誘導(dǎo)出的抗性愈傷組織接入增殖培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+MgCl20.91g/L+脫乙酰吉蘭糖膠2.0g/L+葡萄糖30g/L,pH5.8)中，25℃培養(yǎng)，每隔一個月繼代一次，直到愈傷組織分化。在第一次和第二次轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基后有部分愈傷組織褐化死亡，正常愈傷組織增殖也不快，第二次繼代后，愈傷組織增殖速度才加快。5.愈傷組織的分化及轉(zhuǎn)基因苗移栽愈傷組織經(jīng)幾次繼代后，有的愈傷組織轉(zhuǎn)成米粒狀顆粒，將其轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中(無NH4+、且KNO3加倍的MS+谷氨酰胺1.0g/L+天門冬酰胺0.5g/L+MgCl20.91～1.35g/L+脫乙酰吉蘭糖膠2.0～3.0g/L+葡萄糖20～30g/L,pH5.8)，進一步分化成胚狀體，胚狀體長成為幼苗后再轉(zhuǎn)入大的三角瓶中，待根長好后練苗移栽。洗去再生棉株根部的培養(yǎng)基，栽到滅菌蛭石中，澆足1/2MS(含9.39mMKNO3，0.625mMKH2PO4，10.3mMNH4NO3，0.75mMMgSO4，1.5mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNa2EDTA，100μMFeSO4，蔗糖30g/L)。栽好的再生棉苗放入控溫22℃、控濕80～85％的人工培養(yǎng)箱中5～7d，再在溫室中培養(yǎng)10～20d后移栽到土盆或大田中。取獲得的轉(zhuǎn)基因棉花葉片，提取DNA(方法參照《分子克隆》(第三版))，如實施例4，利用PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因苗，保留經(jīng)鑒定為陽性的植株。使用與上述相同的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，分別使用含植物表達載體pCAMBIA-35S-PTP-MC或pCAMBIA-35S-PTP-G2的農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化棉花，并通過PCR進行轉(zhuǎn)基因幼苗檢測。所述每種質(zhì)粒分別獲得約30個轉(zhuǎn)化事件。實施例8過表達PTP-MC2-EPSPS轉(zhuǎn)基因棉花T0代植株抗草甘膦功能鑒定將4～5葉期的非轉(zhuǎn)基因棉花幼苗和T0代轉(zhuǎn)基因棉花幼苗隨機排列，噴施3000ppm草甘膦(商品名：農(nóng)達，購自深圳詩佳貿(mào)易公司)至飽和(每平米噴施50ml)噴施10天后觀察試驗結(jié)果(見圖11a-11d)發(fā)現(xiàn)，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甓紘乐匚枭踔了劳?圖11d)，轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因的31株棉花中除8株葉片輕度發(fā)黃、萎蔫外其余23株均生長正常(圖11a為兩個轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因抗性棉花植株，其余抗性植株與其類似，在此未示出)；而27株轉(zhuǎn)PTP-MC-EPSPS基因棉花(圖11b為兩個轉(zhuǎn)PTP-MC-EPSPS基因抗性棉花植株，其余抗性植株與其類似，在此未示出)和29株轉(zhuǎn)PTP-G2基因的棉花(圖11c為兩個轉(zhuǎn)PTP-G2基因抗性棉花植株，其余抗性植株與其類似，在此未示出)均表現(xiàn)不同程度葉片發(fā)黃、萎蔫，在所述草甘膦濃度處理下未篩選到抗性植株。所述結(jié)果表明，轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因棉花植株的草甘膦抗性顯著高于轉(zhuǎn)PTP-MC-EPSPS基因或PTP-G2基因棉花植株的草甘膦抗性。根據(jù)抗性鑒定結(jié)果，隨機選取所述轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因植株中的抗草甘膦棉花植株2棵和不抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花植株3棵、轉(zhuǎn)PTP-MC-EPSPS基因和轉(zhuǎn)PTP-G2基因不抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花植株各3棵、及1棵非轉(zhuǎn)基因棉花植株提取RNA，進行RT-PCR檢測，所用引物及操作步驟如實施例6所述。以陸地棉內(nèi)源Actin基因(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/32186889)作為內(nèi)參，對上述轉(zhuǎn)基因樣品進行RT-PCR檢測。反轉(zhuǎn)錄引物為SEQIDNO:42；PCR引物為SEQIDNO:41：和SEQIDNO:39。反轉(zhuǎn)錄及PCR體系和條件同實施例6中煙草Actin基因的檢測。擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖12所示：1-2為轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因的抗草甘膦T0代轉(zhuǎn)基因棉花植株，3-5為轉(zhuǎn)PTP-MC-EPSPS基因的不抗草甘膦T0代轉(zhuǎn)基因棉花植株，6-8為轉(zhuǎn)PTP-G2基因的不抗草甘膦的T0代棉花，9-11為不抗草甘膦的轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因的T0代棉花，12為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ彰藁?。上述檢測結(jié)果表明,對照棉花植株中沒有PTP的轉(zhuǎn)錄；不抗草甘膦的轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因棉花植株中目的基因轉(zhuǎn)錄較弱或沒有轉(zhuǎn)錄；抗草甘膦T0代轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因棉花植株與不抗草甘膦的轉(zhuǎn)PTP-MC-EPSPS基因和轉(zhuǎn)PTP-G2基因棉花中目的基因轉(zhuǎn)錄程度基本一致(第8泳道轉(zhuǎn)PTP-G2基因棉花轉(zhuǎn)錄較弱除外)。上述結(jié)果表明，在所轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄水平基本一致的情況下，轉(zhuǎn)PTP-MC2-EPSPS基因棉花植株的草甘膦抗性顯著高于轉(zhuǎn)PTP-MC-EPSPS基因或轉(zhuǎn)PTP-G2基因棉花植株的草甘膦抗性。從實施例2、6和8的結(jié)果可知，MC2-EPSPS融合蛋白的抗草甘膦能力比單獨的MC-EPSPS蛋白或G2蛋白的抗草甘膦能力有顯著提高，并且所述草甘膦抗性的提高是由于蛋白結(jié)構(gòu)的改變引起的，而不是由于基因轉(zhuǎn)錄或蛋白表達量的增加引起的。因此，可在外源EPSPS基因表達水平相同的情況下，獲得草甘膦抗性更強的轉(zhuǎn)基因植物，從而可規(guī)避通過增強外源基因表達水平來提高抗性這一技術(shù)方案可能影響受體植物正常生長發(fā)育的負面風險。