蛋白質(zhì)本申請(qǐng)為申請(qǐng)?zhí)枮?00480038699.5，申請(qǐng)日為2004年12月23日，發(fā)明名稱為蛋白質(zhì)的分案申請(qǐng)。相關(guān)申請(qǐng)的參照參考了下列相關(guān)申請(qǐng)：1999年7月20日提交的美國(guó)申請(qǐng)流水號(hào)09/750,990；美國(guó)申請(qǐng)流水號(hào)10/409,391；2003年7月23日提交的美國(guó)申請(qǐng)流水號(hào)60/489,441；2003年12月24日提交的英國(guó)申請(qǐng)GB0330016.7；和2004年1月15日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/IB2004/000655。據(jù)此將這每一份申請(qǐng)和這每一份申請(qǐng)中引用的每一份文件（“申請(qǐng)引用的文件”）以及申請(qǐng)所引用的文件中參考或引用的每一份文件（無(wú)論是在正文中或是在那些申請(qǐng)的整個(gè)過(guò)程中）以及所述的整個(gè)過(guò)程中支持先進(jìn)專利性（patentabilityadvanced）的所有爭(zhēng)論收入本文作為參考。本文還引用了多份文件（“本文引用的文件”）。據(jù)此將本文引用的每一份文件以及本文所引用文件中引用或參考的每一份文件收入本文作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于生成酶變體的方法。本發(fā)明還涉及新型酶變體以及這些新型酶變體的用途。技術(shù)背景脂:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶為人所知已有一些時(shí)間（見(jiàn)例如Buckley，Biochemistry，1983，22，5490-5493）。具體而言，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了甘油磷脂:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶（GCAT），它像植物和/或哺乳動(dòng)物卵磷脂:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（LCAT）一樣，催化磷脂酰膽堿與膽固醇之間的脂肪酸轉(zhuǎn)移。Upton和Buckley（TIBS，1995年5月20日，178-179）以及Brumlik和Buckley（J.ofBacteriology，1996年4月，2060-2064）講授了來(lái)自嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila）的一種脂肪酶/?；D(zhuǎn)移酶，它能夠在水性介質(zhì)中將?；D(zhuǎn)移給醇受體。已經(jīng)對(duì)嗜水氣單胞菌?；D(zhuǎn)移酶鑒定了這種酶的推定底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和活性位點(diǎn)（見(jiàn)例如Thornton等，1988，Biochem.etBiophys.Acta.959，153-159；以及Hilton和Buckley，1991，J.Biol.Chem.266，997-1000）。Buckley等人（J.Bacteriol.1996，178(7)，2060-4）講授了Ser16、Asp116、和His291是維持酶活性所必須保留的必需氨基酸。Robertson等人（J.Biol.Chem.1994，269，2146-50）講授了嗜水氣單胞菌酰基轉(zhuǎn)移酶的一些具體突變，即Y226F、Y230F、Y30F、F13S、S18G、S18V，它們都不是本發(fā)明所涵蓋的。發(fā)明概述本發(fā)明是基于含GDSX脂?；D(zhuǎn)移酶的特殊變體的發(fā)現(xiàn)而建立的，這些變體的轉(zhuǎn)移酶活性比親本酶升高。具體而言，依照本發(fā)明的變體具有比親本酶升高的使用半乳糖脂作為?；w的轉(zhuǎn)移酶活性。這些脂酰基轉(zhuǎn)移酶在本文中稱為糖脂?；D(zhuǎn)移酶(glycolipidacyltransferase)。依照本發(fā)明的變體可以額外具有比親本酶升高的使用半乳糖脂作為?；w的轉(zhuǎn)移酶活性與磷脂轉(zhuǎn)移酶活性比率（GL:PL比）和/或升高的使用半乳糖脂作為?；w的轉(zhuǎn)移酶活性與半乳糖脂水解活性比率（GLt:GLh比）。依照第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于生成糖脂?；D(zhuǎn)移酶變體的一種方法，包括：(a)選擇特征為包含氨基酸序列基序GDSX的脂酰基轉(zhuǎn)移酶作為親本酶，其中X是下列氨基酸殘基中的一種或多種：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、或S；(b)更改一個(gè)或多個(gè)氨基酸以生成脂?；D(zhuǎn)移酶變體；(c)在半乳糖脂底物，和任選磷脂底物和/或任選甘油三酯底物上測(cè)試脂?；D(zhuǎn)移酶變體的活性；(d)選擇對(duì)半乳糖脂的活性比親本酶升高的酶變體；并任選(e)制備一定量的酶變體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了特征為包含氨基酸序列基序GDSX的一種糖脂?；D(zhuǎn)移酶變體，其中X是下列氨基酸殘基中的一種或多種：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、或S，且其中酶變體相對(duì)于親本序列在（下文限定的）第2組、第4組、第6組、或第7組限定的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸更改。在還有一個(gè)方面，本發(fā)明提供了特征為包含氨基酸序列基序GDSX的一種糖脂?；D(zhuǎn)移酶變體，其中X是下列氨基酸殘基中的一種或多種：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、或S，且其中酶變體相對(duì)于親本序列在（下文限定的）第2組(set2)、第4組(set4)、第6組(set6)、或第7組(set7)限定的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸更改，所述組是通過(guò)結(jié)構(gòu)對(duì)比所述親本序列與本文限定的P10480結(jié)構(gòu)模型而鑒定的，優(yōu)選是通過(guò)如本文所講授的結(jié)構(gòu)對(duì)比P10480晶體結(jié)構(gòu)坐標(biāo)與1IVN.PDB和/或1DEO.PDB而獲得的。本發(fā)明還提供了特征為包含氨基酸序列基序GDSX的一種糖脂?；D(zhuǎn)移酶變體，其中X是下列氨基酸殘基中的一種或多種：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、或S，且其中酶變體相對(duì)于親本序列在（下文限定的）第2組講授的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸更改，所述第2組是如所講授的對(duì)比所述親本序列與pfam共有序列（SEQIDNo.1）而鑒定的并依照P10480的結(jié)構(gòu)模型更改以確保最佳符合交疊(bestfitoverlap)（見(jiàn)圖55）。依照還有一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種糖脂酰基轉(zhuǎn)移酶變體，其中酶變體包含SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.12、SEQIDNo.14、SEQIDNo.16、SEQIDNo.18、SEQIDNo.20、SEQIDNo.22、SEQIDNo.24、SEQIDNo.26、SEQIDNo.28、SEQIDNo.30、SEQIDNo.33、SEQIDNo.34、SEQIDNo.36、SEQIDNo.37、SEQIDNo.39、SEQIDNo.41、SEQIDNo.43、或SEQIDNo.45所示氨基酸序列，只是在（下文限定的）第2組、第4組、第6組、或第7組限定的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸更改，所述組是通過(guò)與SEQIDNo.2序列對(duì)比而鑒定的。在還有一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種糖脂?；D(zhuǎn)移酶變體，其中酶變體包含SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.12、SEQIDNo.14、SEQIDNo.16、SEQIDNo.18、SEQIDNo.20、SEQIDNo.22、SEQIDNo.24、SEQIDNo.26、SEQIDNo.28、SEQIDNo.30、SEQIDNo.33、SEQIDNo.34、SEQIDNo.36、SEQIDNo.37、SEQIDNo.39、SEQIDNo.41、SEQIDNo.43、或SEQIDNo.45所示氨基酸序列，只是在第2組、第4組、第6組、或第7組限定的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸更改，所述組是通過(guò)結(jié)構(gòu)對(duì)比所述親本序列與本文限定的P10480結(jié)構(gòu)模型而鑒定的，優(yōu)選是通過(guò)如本文所講授的結(jié)構(gòu)對(duì)比P10480晶體結(jié)構(gòu)坐標(biāo)與1IVN.PDB和/或1DEO.PDB而獲得的。依照還有一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種糖脂?；D(zhuǎn)移酶變體，其中酶變體包含SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.12、SEQIDNo.14、SEQIDNo.16、SEQIDNo.18、SEQIDNo.20、SEQIDNo.22、SEQIDNo.24、SEQIDNo.26、SEQIDNo.28、SEQIDNo.30、SEQIDNo.33、SEQIDNo.34、SEQIDNo.36、SEQIDNo.37、SEQIDNo.39、SEQIDNo.41、SEQIDNo.43、或SEQIDNo.45所示氨基酸序列，只是在第2組講授的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸更改，所述第2組是如所講授的對(duì)比所述親本序列與pfam共有序列（SEQIDNo.1）而鑒定的并依照P10480的結(jié)構(gòu)模型更改以確保最佳符合交疊（見(jiàn)圖55）。本發(fā)明還提供了依照本發(fā)明的糖脂分解酶變體(variantglycolipolyticenzyme)或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的一種糖脂分解酶變體用于在制造底物（優(yōu)選食品）中制備溶血糖脂的用途，例如用依照本發(fā)明的或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的脂肪分解酶變體處理糖脂(glycolipid)（例如二半乳糖基甘油二酯（DGDG）或單半乳糖基甘油二酯（MGDG））而生成部分水解產(chǎn)物即溶血糖脂（例如二半乳糖基甘油一酯（DGMG）或單半乳糖基甘油一酯（MGMG）。在還有一個(gè)方面，本發(fā)明提供了依照本發(fā)明或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的一種脂肪分解酶變體用于在制造底物（優(yōu)選食品）中制備溶血磷脂的用途，例如用依照本發(fā)明的或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的脂肪分解酶變體處理磷脂（例如卵磷脂）而生成部分水解產(chǎn)物即溶血磷脂（例如溶血卵磷脂）。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及制作食品的一種方法，該方法包括向食品的一種或多種成分中添加依照本發(fā)明的或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的脂肪分解酶變體。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及由生面團(tuán)制作焙烤產(chǎn)品的一種方法，該方法包括向生面團(tuán)中添加依照本發(fā)明的或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的脂肪分解酶變體。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了依照本發(fā)明的或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的一種脂肪分解酶變體在制造基于蛋的產(chǎn)品以生成溶血磷脂中的用途。在另一個(gè)方面，提供了處理蛋或基于蛋的產(chǎn)品的一種方法，包括向蛋或基于蛋的產(chǎn)品中添加依照本發(fā)明的脂肪分解酶變體以生成溶血磷脂。本發(fā)明的變體可用于與WO02/065854類似的生產(chǎn)點(diǎn)心諸如方便面的過(guò)程。本發(fā)明涉及依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶變體在例如食品中實(shí)現(xiàn)優(yōu)選的技術(shù)效果或其組合的用途（諸如本文“技術(shù)效果”中所列）。本發(fā)明的還有一個(gè)方面提供了使植物油或食用油酶促脫膠的一種過(guò)程，包括用依照本發(fā)明或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的一種脂肪分解酶變體處理食用油或植物油從而水解大部分極性脂質(zhì)（例如磷脂和/或糖脂）。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括處理磷脂從而水解脂肪酰基的一種過(guò)程，該過(guò)程包括將所述磷脂與依照本發(fā)明或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的一種脂肪分解酶變體混合。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了降低食用油磷脂含量的一種過(guò)程，包括用依照本發(fā)明或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的一種脂肪水解酶變體處理油從而水解大部分磷脂，并由油分離含有水解后磷脂的水相。還提供了制備依照本發(fā)明或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的一種脂肪水解酶變體的一種方法，該方法包括用包含編碼所述脂肪分解酶變體的核苷酸序列的重組核酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞能夠表達(dá)編碼脂肪分解酶多肽的核苷酸序列，在核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并收獲脂肪分解酶變體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及依照本發(fā)明或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的一種脂肪分解酶變體在生物轉(zhuǎn)化極性脂質(zhì)（優(yōu)選糖脂）以生成諸如碳水化合物酯和/或蛋白質(zhì)酯和/或蛋白質(zhì)亞基酯和/或羥基酸酯等高價(jià)值產(chǎn)品中的用途。將極性脂質(zhì)（優(yōu)選糖脂）生物轉(zhuǎn)化成高價(jià)值產(chǎn)品的一種方法，該方法包括將所述極性脂質(zhì)與依照本發(fā)明或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的一種脂肪分解酶變體混合。本發(fā)明還涉及依照本發(fā)明或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的一種固定化脂肪分解酶變體。權(quán)利要求書和下面的注釋呈現(xiàn)了本發(fā)明的各個(gè)方面。關(guān)注本發(fā)明所使用的核苷酸序列的其它方面包括：包含本發(fā)明序列的一種構(gòu)建物；包含本發(fā)明所使用的序列的一種載體；包含本發(fā)明所使用的序列的一種質(zhì)粒；包含本發(fā)明所使用的序列的一種經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞；包含本發(fā)明所使用的序列的一種經(jīng)轉(zhuǎn)化組織；包含本發(fā)明所使用的序列的一種經(jīng)轉(zhuǎn)化器官；包含本發(fā)明所使用的序列的一種經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主；包含本發(fā)明所使用的序列的一種經(jīng)轉(zhuǎn)化生物體。本發(fā)明還涵蓋使用它們來(lái)表達(dá)本發(fā)明所使用的核苷酸序列的方法，諸如在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)；包括用于轉(zhuǎn)移它們的方法。本發(fā)明還涵蓋用于分離核苷酸序列的方法，諸如由宿主細(xì)胞進(jìn)行分離。關(guān)注本發(fā)明所使用的氨基酸序列的其它方面包括：編碼本發(fā)明所使用的氨基酸序列的一種構(gòu)建物；編碼本發(fā)明所使用的氨基酸序列的一種載體；編碼本發(fā)明所使用的氨基酸序列的一種質(zhì)粒；編碼本發(fā)明所使用的氨基酸序列的一種經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞；編碼本發(fā)明所使用的氨基酸序列的一種經(jīng)轉(zhuǎn)化組織；編碼本發(fā)明所使用的氨基酸序列的一種經(jīng)轉(zhuǎn)化器官；編碼本發(fā)明所使用的氨基酸序列的一種經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主；編碼本發(fā)明所使用的氨基酸序列的一種經(jīng)轉(zhuǎn)化生物體。本發(fā)明還涵蓋使用它們來(lái)純化本發(fā)明所使用的氨基酸序列的方法，諸如在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)；包括轉(zhuǎn)移它們及然后純化所述序列的方法。為了易于參考，現(xiàn)在在適當(dāng)?shù)亩温錁?biāo)題下描述本發(fā)明的這些和其它方面。但是每一段的講授不必限于具體的每一段。組的定義第1組氨基酸：（注意，這些是1IVN－圖57和圖58－中的氨基酸。）Gly8、Asp9、Ser10、Leu11、Ser12、Tyr15、Gly44、Asp45、Thr46、Glu69、Leu70、Gly71、Gly72、Asn73、Asp74、Gly75、Leu76、Gln106、Ile107、Arg108、Leu109、Pro110、Tyr113、Phe121、Phe139、Phe140、Met141、Tyr145、Met151、Asp154、His157、Gly155、Ile156、Pro158由第1組中清除高度保守的基序諸如GDSX和催化殘基（標(biāo)有下劃線的殘基）。為了避免疑惑，第1組限定1IVN模型活性位點(diǎn)中甘油中央碳原子10內(nèi)的氨基酸殘基。第2組氨基酸：（注意，氨基酸的編號(hào)指P10480成熟序列中的氨基酸。）Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、和Val290。第1組和第2組中所選殘基的比較表第3組氨基酸：第3組氨基酸與第2組相同，但是指殺鮭氣單胞菌（Aeromonassalmonicida）編碼序列，即第3組中的氨基酸殘基編號(hào)要大18，這反映了成熟蛋白質(zhì)（SEQIDNo.2）與包含信號(hào)序列的蛋白質(zhì)（SEQIDNo.28）中氨基酸編號(hào)之間的差異。殺鮭氣單胞菌GDSX（SEQIDNo.28）與嗜水氣單胞菌GDSX（SEQIDNo.2）的成熟蛋白有五個(gè)氨基酸不同。它們是Thr3Ser、Gln182Lys、Glu309Ala、Ser310Asn、Gly318-，其中殺鮭氣單胞菌的殘基列于前而嗜水氣單胞菌的殘基列于后（圖59）。嗜水氣單胞菌蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度只有317個(gè)氨基酸，缺少第318位的殘基。與嗜水氣單胞菌蛋白質(zhì)相比，殺鮭氣單胞菌GDSX具有相當(dāng)高的對(duì)極性脂質(zhì)的活性，諸如對(duì)半乳糖脂底物的活性。對(duì)所有五個(gè)氨基酸位置進(jìn)行了位點(diǎn)掃描。第4組氨基酸：第4組氨基酸是S3、Q182、E309、和-318。第5組氨基酸：F13S、D15N、S18G、S18V、Y30F、D116N、D116E、D157N、Y226F、D228N、Y230F。第6組氨基酸：第6組氨基酸是Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、-318。第6組中氨基酸的編號(hào)指P10480（SEQIDNo.2）中的氨基酸殘基－可以通過(guò)與P10480和/或1IVN的同源對(duì)比和/或結(jié)構(gòu)對(duì)比來(lái)確定其它序列主鏈中的相應(yīng)氨基酸。第7組氨基酸：第7組氨基酸是Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、-318、Y30X（其中X選自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、Y226X（其中X選自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、Y230X（其中X選自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、S18X（其中X選自A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、或Y）、D157X（其中X選自A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y）。第7組中氨基酸的編號(hào)指P10480（SEQIDNo.2）中的氨基酸殘基－可以通過(guò)與P10480和/或1IVN的同源對(duì)比和/或結(jié)構(gòu)對(duì)比來(lái)確定其它序列主鏈中的相應(yīng)氨基酸。發(fā)明詳述優(yōu)選的是，親本脂?；D(zhuǎn)移酶包含下列氨基酸序列中的任何一種：SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.12、SEQIDNo.14、SEQIDNo.16、SEQIDNo.18、SEQIDNo.20、SEQIDNo.22、SEQIDNo.24、SEQIDNo.26、SEQIDNo.28、SEQIDNo.30、SEQIDNo.33、SEQIDNo.34、SEQIDNo.36、SEQIDNo.37、SEQIDNo.39、SEQIDNo.41、SEQIDNo.43或SEQIDNo.45，或是與SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.12、SEQIDNo.14、SEQIDNo.16、SEQIDNo.18、SEQIDNo.20、SEQIDNo.22、SEQIDNo.24、SEQIDNo.26、SEQIDNo.28、SEQIDNo.30、SEQIDNo.33、SEQIDNo.34、SEQIDNo.36、SEQIDNo.37、SEQIDNo.39、SEQIDNo.41、SEQIDNo.43或SEQIDNo.45所示序列中的任何一種具有75％或更高同一性的氨基酸序列。合適的是，依照本發(fā)明的親本脂?；D(zhuǎn)移酶包含與SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.12、SEQIDNo.14、SEQIDNo.16、SEQIDNo.18、SEQIDNo.20、SEQIDNo.22、SEQIDNo.24、SEQIDNo.26、SEQIDNo.28、SEQIDNo.30、SEQIDNo.33、SEQIDNo.34、SEQIDNo.36、SEQIDNo.37、SEQIDNo.39、SEQIDNo.41、SEQIDNo.43或SEQIDNo.45所示序列中的任何一種具有至少80％、優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、更優(yōu)選至少95％、更優(yōu)選至少98％同源性的氨基酸序列。合適的是，所述親本脂酰基轉(zhuǎn)移酶可以由下列核苷酸序列中的任何一種編碼：SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11、SEQIDNo.13、SEQIDNo.15、SEQIDNo.17、SEQIDNo.19、SEQIDNo.21、SEQIDNo.23、SEQIDNo.25、SEQIDNo.27、SEQIDNo.29、SEQIDNo.31、SEQIDNo.32、SEQIDNo.35、SEQIDNo.38、SEQIDNo.40、SEQIDNo.42、SEQIDNo.44、或SEQIDNo.46，或是由與SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11、SEQIDNo.13、SEQIDNo.15、SEQIDNo.17、SEQIDNo.19、SEQIDNo.21、SEQIDNo.23、SEQIDNo.25、SEQIDNo.27、SEQIDNo.29、SEQIDNo.31、SEQIDNo.32、SEQIDNo.35、SEQIDNo.38、SEQIDNo.40、SEQIDNo.42、SEQIDNo.44或SEQIDNo.46所示序列中的任何一種具有至少75％或更高同一性的核苷酸序列編碼。合適的是，所述核苷酸序列可以與SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11、SEQIDNo.13、SEQIDNo.15、SEQIDNo.17、SEQIDNo.19、SEQIDNo.21、SEQIDNo.23、SEQIDNo.25、SEQIDNo.27、SEQIDNo.29、SEQIDNo.31、SEQIDNo.32、SEQIDNo.35、SEQIDNo.38、SEQIDNo.40、SEQIDNo.42、SEQIDNo.44、或SEQIDNo.46所示序列中的任何一種具有80％或更高、優(yōu)選90％或更高、更優(yōu)選95％或更高、甚至更優(yōu)選98％或更高同一性。優(yōu)選的是，親本酶在與參考序列（SEQIDNo.2）對(duì)比或與P10480結(jié)構(gòu)模型結(jié)構(gòu)對(duì)比或與pfam共有序列對(duì)比并依照P10480結(jié)構(gòu)模型更改時(shí)在第2組、第4組、第6組、或第7組限定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處發(fā)生了更改。合適的是，酶變體可以具有比親本酶升高的對(duì)半乳糖脂的活性與對(duì)磷脂和/或甘油三酯的活性比率。合適的是，依照本發(fā)明的方法可以包括：(i)用半乳糖脂底物測(cè)試脂?；D(zhuǎn)移酶變體的轉(zhuǎn)移酶活性，和(ii)用磷脂底物測(cè)試脂?；D(zhuǎn)移酶變體的轉(zhuǎn)移酶活性；并選擇對(duì)半乳糖脂的轉(zhuǎn)移酶活性與對(duì)磷脂的轉(zhuǎn)移酶活性之比率比親本酶升高的酶變體。合適的是，依照本發(fā)明的酶變體對(duì)半乳糖脂的轉(zhuǎn)移酶活性與對(duì)磷脂的轉(zhuǎn)移酶活性之比率可以是至少1、至少2、至少3、至少4、或至少5。合適的是，依照本發(fā)明的方法可以包括：(i)用半乳糖脂底物測(cè)試脂酰基轉(zhuǎn)移酶變體的轉(zhuǎn)移酶活性，和(ii)用半乳糖脂底物測(cè)試脂?；D(zhuǎn)移酶變體的水解活性；并選擇對(duì)半乳糖脂的轉(zhuǎn)移酶活性與對(duì)糖脂的水解活性之比率比親本酶升高的酶變體。合適的是，對(duì)半乳糖脂的轉(zhuǎn)移酶活性與對(duì)半乳糖脂的水解活性之比率可以是超過(guò)1、至少1.5、至少2、至少4、或至少5。例如實(shí)施例8中講授了用于測(cè)定對(duì)半乳糖脂和/或磷脂的轉(zhuǎn)移酶和水解活性的測(cè)定法。術(shù)語(yǔ)“對(duì)半乳糖脂(galactolipid)的活性升高”指在以半乳糖脂作為脂質(zhì)?；w時(shí)酶的轉(zhuǎn)移酶活性（半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶活性）比親本酶升高（即更高）和/或半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶活性與磷脂轉(zhuǎn)移酶活性之比率比親本酶升高（GLt:GLt比率）和/或半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶活性與半乳糖脂水解活性之比率比親本酶升高（GLt:GLh比率）。合適的是，與親本酶相比，酶變體可以具有升高的半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶活性和相同或較低的半乳糖脂水解活性。換言之，合適的是，酶變體可以具有比親本酶高的半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶活性與半乳糖脂水解活性之比率。合適的是，酶變體可以優(yōu)先將?；砂肴樘侵D(zhuǎn)移給酰基受體，而非簡(jiǎn)單的水解半乳糖脂。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的酶可以具有比親本酶升高的對(duì)磷脂的轉(zhuǎn)移酶活性（即磷脂轉(zhuǎn)移酶活性升高）。這種升高的磷脂轉(zhuǎn)移酶活性可能獨(dú)立于升高的對(duì)半乳糖脂的活性。但是，合適的是，酶變體可以具有升高的半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶活性和升高的磷脂轉(zhuǎn)移酶活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了特征為包含氨基酸序列基序GDSX的脂?；D(zhuǎn)移酶變體，其中X是下列氨基酸殘基中的一種或多種：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、或S，其中所述變體對(duì)磷脂的活性優(yōu)選磷脂轉(zhuǎn)移酶活性比親本酶升高，且其中酶變體相對(duì)于親本序列在第2組、第4組、第6組、或第7組限定的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸更改。術(shù)語(yǔ)“更改”在用于本文時(shí)指添加、替代、和/或刪除。優(yōu)選的是，術(shù)語(yǔ)“更改”指“替代”。為了避免疑惑，在替代親本酶中的氨基酸時(shí)，優(yōu)選用與親本酶中該位置處最初發(fā)現(xiàn)的氨基酸不同的氨基酸替代它，從而生成酶變體。換言之，術(shù)語(yǔ)“替代”不打算覆蓋用一種氨基酸替代相同氨基酸。優(yōu)選的是，親本酶包含SEQIDNo.2和/或SEQIDNo.28所示氨基酸序列。優(yōu)選的是，酶變體包含SEQIDNo.2所示氨基酸序列，只是在第2組、第4組、第6組、或第7組限定的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸更改。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的是，酶變體相對(duì)于親本序列在第4組限定的至少一個(gè)氨基酸殘基處包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸更改。合適的是，酶變體相對(duì)于親本酶包含一個(gè)或多個(gè)下列氨基酸更改：S3E、A、G、K、M、Y、R、P、N、T、或G；E309Q、R、或A，優(yōu)選Q或R；-318Y、H、S、或Y，優(yōu)選Y。優(yōu)選的是，GDSX基序中的X是L。由此，優(yōu)選的是，親本酶包含氨基酸基序GDSL。優(yōu)選的是，用于生成脂?；D(zhuǎn)移酶變體的方法還包括一個(gè)或多個(gè)下列步驟：1)結(jié)構(gòu)同源性定位，或2)序列同源性對(duì)比。合適的是，結(jié)構(gòu)同源性定位包括一個(gè)或多個(gè)下列步驟：1)對(duì)比親本序列與圖52所示結(jié)構(gòu)模型（1IVN.PDB）；2)選擇活性位點(diǎn)中以甘油分子中央碳原子為中心的10范圍內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基（見(jiàn)圖53）（諸如第1組或第2組限定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基）；并3)更改所述親本序列中依照步驟(2)選擇的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇的氨基酸殘基可以位于活性位點(diǎn)中以甘油分子中央碳原子為中心的9、優(yōu)選8、7、6、5、4、或3范圍內(nèi)（見(jiàn)圖53）。合適的是，結(jié)構(gòu)同源性定位可以包括一個(gè)或多個(gè)下列步驟：1)對(duì)比親本序列與圖52所示結(jié)構(gòu)模型（1IVN.PDB）；2)選擇活性位點(diǎn)中以甘油分子中央碳原子為中心的10范圍內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基（見(jiàn)圖53）（諸如第1組或第2組限定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基）；3)測(cè)定依照步驟(2)選擇的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是否是高度保守的（特別是活性位點(diǎn)殘基和/或部分GDSX基序和/或部分GANDY基序）；并4)更改所述親本序列中依照步驟(2)選擇的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，排除依照步驟(3)鑒定的保守區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇的氨基酸殘基可以位于活性位點(diǎn)中以甘油分子中央碳原子為中心的9、優(yōu)選8、7、6、5、4、或3范圍內(nèi)（見(jiàn)圖53）。作為上文所述結(jié)構(gòu)同源性定位的替換或聯(lián)合，可以通過(guò)選擇由pfam對(duì)比（對(duì)比2，圖56）衍生的與P10480模型和1IVN交疊的特定環(huán)區(qū)(loopregion)（LR）或中間區(qū)(interveningregion)（IVR）來(lái)進(jìn)行結(jié)構(gòu)同源性定位。下表定義了環(huán)區(qū)（LR）或中間區(qū)（IVR）：在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，?；D(zhuǎn)移酶變體不僅在第1-4組和第6-7組中任一組限定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸處包含氨基酸更改，而且在一個(gè)或多個(gè)上文限定的中間區(qū)（IVR1-6）（優(yōu)選在IVR3、5、和6中的一個(gè)或多個(gè)中，更優(yōu)選在IVR5或IVR6中）和/或一個(gè)或多個(gè)上文限定的環(huán)區(qū)（LR1-5）（優(yōu)選在LR1、LR2、或LR5中的一個(gè)或多個(gè)中，更優(yōu)選在LR5中）中包含至少一個(gè)氨基酸更改。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的?；D(zhuǎn)移酶變體或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的?；D(zhuǎn)移酶變體可以包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸更改，它不僅是由第2、4、6、和7組中的一個(gè)或多個(gè)組限定的，而且位于IVR1-6中的一個(gè)或多個(gè)IVR內(nèi)（優(yōu)選IVR3、5、或6內(nèi)，更優(yōu)選IVR5或IVR6內(nèi)）或是LR1-5中的一個(gè)或多個(gè)LR內(nèi)（優(yōu)選LR1、LR2、或LR5內(nèi)，更優(yōu)選LR5內(nèi)）。合適的是，依照本發(fā)明的酰基轉(zhuǎn)移酶變體或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的?；D(zhuǎn)移酶變體可以包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸更改，它不僅在第1或2組中，而且在IVR3內(nèi)。合適的是，依照本發(fā)明的?；D(zhuǎn)移酶變體或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的?；D(zhuǎn)移酶變體可以包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸更改，它不僅在第1或2組中，而且在IVR5內(nèi)。合適的是，依照本發(fā)明的?；D(zhuǎn)移酶變體或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的?；D(zhuǎn)移酶變體可以包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸更改，它不僅在第1或2組中，而且在IVR6內(nèi)。合適的是，依照本發(fā)明的?；D(zhuǎn)移酶變體或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的?；D(zhuǎn)移酶變體可以包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸更改，它不僅在第1或2組中，而且在LR1內(nèi)。合適的是，依照本發(fā)明的?；D(zhuǎn)移酶變體或通過(guò)依照本發(fā)明的方法獲得的?；D(zhuǎn)移酶變體可以包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸更改，它不僅在第1或2組中，而且在LR2內(nèi)。同樣，在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，酰基轉(zhuǎn)移酶變體不僅在活性位點(diǎn)中以甘油分子中央碳原子為中心的10、優(yōu)選9、8、7、6、5、4、或范圍內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處包含氨基酸更改（見(jiàn)圖53），而且在一個(gè)或多個(gè)上文限定的中間區(qū)（IVR1-6）（優(yōu)選在IVR3、5、和6中的一個(gè)或多個(gè)中，更優(yōu)選在IVR5或IVR6中）和/或一個(gè)或多個(gè)上文限定的環(huán)區(qū)（LR1-5）（優(yōu)選在LR1、LR2、或LR5中的一個(gè)或多個(gè)中，更優(yōu)選在LR5中）中包含至少一個(gè)氨基酸更改。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的是，氨基酸更改位于10范圍內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處，而且在LR5內(nèi)。由此，結(jié)構(gòu)同源性定位可以包括一個(gè)或多個(gè)下列步驟：1)對(duì)比親本序列與圖52所示結(jié)構(gòu)模型（1IVN.PDB）；2)選擇活性位點(diǎn)中以甘油分子中央碳原子為中心的10范圍內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基（見(jiàn)圖53）（諸如第1組或第2組限定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基）；和/或選擇IVR1-6內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基（優(yōu)選在IVR3、5、或6內(nèi)，更優(yōu)選在IVR5或IVR6內(nèi)）；和/或選擇LR1-5內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基（優(yōu)選在LR1、LR2、或LR5內(nèi)，更優(yōu)選在LR5內(nèi)）；并3)更改所述親本序列中依照步驟(2)選擇的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇的氨基酸殘基可以位于活性位點(diǎn)中以甘油分子中央碳原子為中心的9、優(yōu)選8、7、6、5、4、或3范圍內(nèi)（見(jiàn)圖53）。合適的是，結(jié)構(gòu)同源性定位可以包括一個(gè)或多個(gè)下列步驟：1)對(duì)比親本序列與圖52所示結(jié)構(gòu)模型（1IVN.PDB）；2)選擇活性位點(diǎn)中以甘油分子中央碳原子為中心的10范圍內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基（見(jiàn)圖53）（諸如第1組或第2組限定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基）；和/或選擇IVR1-6內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基（優(yōu)選在IVR3、5、或6內(nèi)，更優(yōu)選在IVR5或IVR6內(nèi)）；和/或選擇LR1-5內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基（優(yōu)選在LR1、LR2、或LR5內(nèi)，更優(yōu)選在LR5內(nèi)）；3)測(cè)定依照步驟(2)選擇的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是否是高度保守的（特別是活性位點(diǎn)殘基和/或部分GDSX基序和/或部分GANDY基序）；并4)更改所述親本序列中依照步驟(2)選擇的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，排除依照步驟(3)鑒定的保守區(qū)。合適的是，上文詳述的方法中選擇的一個(gè)或多個(gè)氨基酸不僅在活性位點(diǎn)中以甘油分子中央碳原子為中心的10范圍內(nèi)（見(jiàn)圖53）（諸如第1組或第2組限定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基），而且在一個(gè)或多個(gè)IVR1-6內(nèi)（優(yōu)選在IVR3、5或6內(nèi)，更優(yōu)選在IVR5或IVR6內(nèi)）或是在一個(gè)或多個(gè)LR1-5內(nèi)（優(yōu)選在LR1、LR2、或LR5內(nèi)，更優(yōu)選在LR5內(nèi)）。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的是，一個(gè)或多個(gè)氨基酸更改在LR5內(nèi)。當(dāng)更改在LR5內(nèi)時(shí)，更改不是第5組限定的。合適的是，一個(gè)或多個(gè)氨基酸更改不僅在LR5限定的區(qū)域內(nèi)，而且構(gòu)成第2組、第4組、第6組、或第7組中的一組或多組內(nèi)的氨基酸。合適的是，序列同源性對(duì)比可以包括一個(gè)或多個(gè)下列步驟：1)選擇第一種親本脂酰基轉(zhuǎn)移酶；2)鑒定具有期望活性的第二種相關(guān)脂?；D(zhuǎn)移酶；3)對(duì)比所述第一種親本脂?；D(zhuǎn)移酶與第二種相關(guān)脂酰基轉(zhuǎn)移酶；4)鑒定兩種序列間不同的氨基酸殘基；并5)更改所述親本脂?；D(zhuǎn)移酶中依照步驟(4)鑒定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。合適的是，序列同源性對(duì)比可以包括一個(gè)或多個(gè)下列步驟：1)選擇第一種親本脂?；D(zhuǎn)移酶；2)鑒定具有期望活性的第二種相關(guān)脂?；D(zhuǎn)移酶；3)對(duì)比所述第一種親本脂?；D(zhuǎn)移酶與第二種相關(guān)脂?；D(zhuǎn)移酶；4)鑒定兩種序列間不同的氨基酸殘基；5)測(cè)定依照步驟(4)選擇的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是否是高度保守的（特別是活性位點(diǎn)殘基和/或部分GDSX基序和/或部分GANDY基序）；并6)更改所述親本序列中依照步驟(4)鑒定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，排除依照步驟(e)鑒定的保守區(qū)。合適的是，所述第一種親本脂?；D(zhuǎn)移酶可以包含下列氨基酸序列中的一種或多種：SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.12、SEQIDNo.14、SEQIDNo.16、SEQIDNo.18、SEQIDNo.20、SEQIDNo.22、SEQIDNo.24、SEQIDNo.26、SEQIDNo.28、SEQIDNo.30、SEQIDNo.33、SEQIDNo.34、SEQIDNo.36、SEQIDNo.37、SEQIDNo.39、SEQIDNo.41、SEQIDNo.43、或SEQIDNo.45。合適的是，所述第二種相關(guān)脂?；D(zhuǎn)移酶可以包含下列氨基酸序列中的一種或多種：SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.12、SEQIDNo.14、SEQIDNo.16、SEQIDNo.18、SEQIDNo.20、SEQIDNo.22、SEQIDNo.24、SEQIDNo.26、SEQIDNo.28、SEQIDNo.30、SEQIDNo.33、SEQIDNo.34、SEQIDNo.36、SEQIDNo.37、SEQIDNo.39、SEQIDNo.41、SEQIDNo.43、或SEQIDNo.45。酶變體相對(duì)于親本酶必須包含至少一個(gè)氨基酸更改。在有些實(shí)施方案中，酶變體相對(duì)于親本酶可以包含至少2個(gè)、優(yōu)選至少3個(gè)、優(yōu)選至少4個(gè)、優(yōu)選至少5個(gè)、優(yōu)選至少6個(gè)、優(yōu)選至少7個(gè)、優(yōu)選至少8個(gè)、優(yōu)選至少9個(gè)、優(yōu)選至少10個(gè)氨基酸更改。合適的是，依照本發(fā)明的方法可以包括另一個(gè)步驟，即將酶變體配制到酶組合物和/或食品組合物，諸如面包改良組合物中。為了對(duì)比GDSx多肽序列（親本序列）與SEQIDNo.2（P01480），可以使用序列對(duì)比，諸如成對(duì)對(duì)比（http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html）。由此，可以確定和更改備選親本GDSx多肽中就SEQIDNo.2而言與第2組、第4組、第6組、或第7組限定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的等價(jià)氨基酸。正如技術(shù)人員將容易地領(lǐng)會(huì)，在使用emboss成對(duì)對(duì)比時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置通常就足夠了。為了生成覆蓋兩個(gè)序列的全長(zhǎng)的對(duì)比，可以使用“needle”來(lái)鑒定相應(yīng)的氨基酸殘基。然而，也有可能使用“water”而在兩個(gè)序列之間發(fā)現(xiàn)最佳的相似區(qū)域?；蛘?，特別是在親本GDSx多肽與SEQIDNo.2享有低同源性的情況中，可以通過(guò)與P10480結(jié)構(gòu)模型的結(jié)構(gòu)對(duì)比來(lái)確定備選GDSX多肽中就SEQIDNo.2而言與第2組、第4組、第6組、或第7組限定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的相應(yīng)氨基酸，所述P10480結(jié)構(gòu)模型是通過(guò)使用（由www.expasy.org/spdbv/獲得的）“DeepViewSwiss-PDB瀏覽器”比較由P10480衍生的結(jié)構(gòu)模型與1IVN.PDB和1DEO.PDB的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)而獲得的（圖53和實(shí)施例1）。鑒定的等價(jià)殘基即是與得到的P010480結(jié)構(gòu)模型中的殘基交疊或最密切接近的殘基，正如第1組與第2組的比較表（見(jiàn)上文題為“組的定義”的部分）所示。這樣，可以比較其它GDSX多肽與1IVN.PDB晶體坐標(biāo)，并確定第1組的等價(jià)殘基?；蛘撸貏e在親本GDSX多肽與SEQIDNo.2享有低同源性的情況中，可以根據(jù)由PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)（PFAM共有序列）得到的對(duì)比確定備選GDSX多肽中就SEQIDNo.2而言與第2組、第4組、第6組、或第7組限定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的等價(jià)殘基，所述PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)對(duì)比1（圖55）所示結(jié)構(gòu)對(duì)比經(jīng)過(guò)修改。基于結(jié)構(gòu)模型的修改可能必須略微移動(dòng)對(duì)比，從而確保最佳符合交疊。對(duì)比1（圖55）提供了這個(gè)方面的指導(dǎo)。依照本發(fā)明的酶變體優(yōu)選不包含第5組中限定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸更改。合適的是，可以使用定點(diǎn)誘變來(lái)制備酶變體?；蛘?，可以使用商品化試劑盒諸如Stratagene的GeneMorphPCR誘變?cè)噭┖谢駽lontech的DiversifyPCR隨機(jī)誘變?cè)噭┖须S機(jī)導(dǎo)入突變。EP0583265涉及優(yōu)化基于PCR的誘變的方法，它也可以聯(lián)合使用誘變性DNA類似物，諸如EP0866796中所述。錯(cuò)誤傾向PCR技術(shù)適用于生成具有優(yōu)選特征的脂酰基轉(zhuǎn)移酶變體。WO02/06457涉及脂肪酶的分子進(jìn)化。獲取新序列的第三種方法是使用任何數(shù)目的限制酶或諸如DNA酶I等酶將不同的核苷酸序列片段化，并重新裝配成編碼功能性蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)核苷酸序列（下文稱為“改組”）?；蛘?，可以使用一種或多種不同的核苷酸序列，并在重新裝配全長(zhǎng)核苷酸序列的過(guò)程中導(dǎo)入突變。DNA改組和家族改組技術(shù)適于生成具有優(yōu)選特征的脂?；D(zhuǎn)移酶變體。適于進(jìn)行“改造”的方法見(jiàn)EP0752008、EP1138763、EP1103606。改組還可以聯(lián)合其它DNA誘變形式，正如US6,180,406和WO01/34835中所述。由此，有可能在體內(nèi)或在體外在核苷酸序列中生成大量的定點(diǎn)或隨機(jī)誘變，并隨后通過(guò)多種手段對(duì)編碼的多肽變體篩選改進(jìn)的功能。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，還可以將多核苷酸序列的突變或天然變體與野生型或其它突變或天然變體重組，從而生成新的變體。也可以對(duì)這些新的變體篩選所編碼多肽的改進(jìn)的功能性?？赡軆?yōu)選選擇下列區(qū)域用于定位隨機(jī)誘變和/或改組：IVR3、IVR5、IVR6、LR1、LR2、和/或LR5，最優(yōu)選LR5。為了生成變體庫(kù)，可以使用微生物的真核或原核表達(dá)宿主。為了確保變體庫(kù)內(nèi)的均勻表達(dá)，可能優(yōu)選低拷貝數(shù)目，優(yōu)選單一事件染色體表達(dá)系統(tǒng)。還優(yōu)選具有高轉(zhuǎn)化頻率的表達(dá)系統(tǒng)，特別是用于表達(dá)大型變體庫(kù)（>1000個(gè)菌落），諸如使用隨機(jī)誘變和/或改組技術(shù)構(gòu)建的文庫(kù)。EP1131416中描述了適于使用真核表達(dá)宿主即酵母來(lái)生成酶的方法?？赡軆?yōu)選微生物的真核表達(dá)宿主諸如酵母來(lái)表達(dá)使用真核酰基轉(zhuǎn)移酶親本基因生成的變體庫(kù)。WO02/14490描述了適于使用芽孢桿菌即枯草芽孢桿菌作為表達(dá)宿主來(lái)生成酶的方法?？赡軆?yōu)選微生物的原核表達(dá)宿主諸如芽孢桿菌來(lái)表達(dá)使用原核酰基轉(zhuǎn)移酶親本基因例如P10480參考序列（SEQIDNo.2）生成的變體庫(kù)。合適的是，依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶變體保留了至少70％、優(yōu)選至少80％、優(yōu)選至少90％、優(yōu)選至少95％、優(yōu)選至少97％、優(yōu)選至少99％與親本酶的同源性。合適的親本酶可以包括具有酯酶或脂肪酶活性的任何酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂?；D(zhuǎn)移酶變體保留或摻入了在GDSX、GANDY、和HPT模塊中發(fā)現(xiàn)的至少一個(gè)或多個(gè)pfam00657共有序列氨基酸殘基?？梢允褂梅肿舆M(jìn)化工具突變諸如在水性環(huán)境中沒(méi)有或具有低脂?；D(zhuǎn)移酶活性的脂肪酶等酶，從而導(dǎo)入或增強(qiáng)轉(zhuǎn)移酶活性，由此生成適用于本發(fā)明組合物和方法的具有顯著轉(zhuǎn)移酶活性的脂?；D(zhuǎn)移酶變體。合適的是，用于本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶可以是與親本酶相比對(duì)極性脂質(zhì)優(yōu)選糖脂的酶活性增強(qiáng)的變體。優(yōu)選的是，這些變體還具有低的或沒(méi)有對(duì)溶血極性脂質(zhì)的活性。對(duì)極性脂質(zhì)優(yōu)選糖脂的活性增強(qiáng)可能是水解酶活性和/或轉(zhuǎn)移酶活性或二者組合的結(jié)果。用于本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶變體對(duì)甘油三酯和/或甘油一酯和/或甘油二酯的活性與親本酶相比可能降低。合適的是，酶變體可沒(méi)有對(duì)甘油三酯和/或甘油一酯和/或甘油二酯的活性。在將要用于面包房應(yīng)用、用于處理蛋或基于蛋的產(chǎn)品、和/或用于將油脫膠的酶變體中優(yōu)選對(duì)甘油三酯的低活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，合適的是，酶變體具有對(duì)甘油二酯的高活性，且沒(méi)有或具有對(duì)甘油三酯的低活性。本文在提及具體的氨基酸殘基時(shí)，編號(hào)是通過(guò)對(duì)比變體序列與SEQIDNo.2所示參考序列而獲得的。在一個(gè)方面，優(yōu)選的是，酶變體包含下列氨基酸替代中的一個(gè)或多個(gè)：S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或L17A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或S18A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W或Y；和/或K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或Y30A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或G40A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或P81A、C、D、E、F、G、H,I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或K82A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或W111A、C、D、E、F、G、H,I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或A114C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或Y117A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或LI18A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或P156A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或G159A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或Q160A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或N161A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或P162A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或S163A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或A164C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或R165A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y；和/或S166A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或Q167A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或K168A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或V169A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或V170A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或E171A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或A172C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或N181A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或Q182A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y，優(yōu)選K；和/或M209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或L210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或R211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或Y226A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或Y230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或K284A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或M285A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或V290A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或E309A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y。另外/或者，其中可以存在一個(gè)或多個(gè)C端延伸。優(yōu)選的是，額外的C端延伸包含一個(gè)或多個(gè)脂肪族氨基酸，優(yōu)選非極性氨基酸，更優(yōu)選I、L、V、或G。由此，本發(fā)明還提供了包含一個(gè)或多個(gè)下列C端延伸的酶變體：318I、318L、318V、318G。在根據(jù)與P10480和/或1IVN的同源對(duì)比和/或結(jié)構(gòu)對(duì)比的測(cè)定，親本主鏈中的殘基與P10480（SEQIDNo.2）中殘基有所不同的情況中，可能希望分別用在P10480中發(fā)現(xiàn)的殘基替代與P10480（SEQIDNo.2）中的任何一個(gè)或多個(gè)下列氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的殘基：Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、或Ser310。發(fā)現(xiàn)P10480的下列野生型殘基是保留好活性所優(yōu)選的，特別是好的對(duì)半乳糖脂的轉(zhuǎn)移酶活性：L17、W111、R221、S3、G40、N88、K22、Y117、L118、N181、M209、M285、E309、M23。由此，優(yōu)選的是，酶變體包含在P10480中在這些位點(diǎn)中的任何一個(gè)或多個(gè)處發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基。對(duì)極性脂質(zhì)的水解活性升高的酶變體對(duì)極性脂質(zhì)的轉(zhuǎn)移酶活性可能也升高。對(duì)磷脂諸如磷脂酰膽堿（PC）的水解活性升高的酶變體對(duì)磷脂的轉(zhuǎn)移酶活性可能也升高。對(duì)半乳糖脂諸如DGDG的水解活性升高的酶變體對(duì)半乳糖脂的轉(zhuǎn)移酶活性可能也升高。對(duì)磷脂諸如磷脂酰膽堿（PC）的轉(zhuǎn)移酶活性升高的酶變體對(duì)磷脂的水解活性可能也升高。對(duì)半乳糖脂諸如DGDG的轉(zhuǎn)移酶活性升高的酶變體對(duì)半乳糖脂的水解活性可能也升高。對(duì)極性脂質(zhì)的轉(zhuǎn)移酶活性升高的酶變體對(duì)極性脂質(zhì)的水解活性可能也升高。合適的是，下列位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)可能參與底物結(jié)合：Leu17、Ala114、Tyr179、His180、Asn181、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290。依照本發(fā)明的酶變體與親本酶相比可以具有一項(xiàng)或多項(xiàng)下列功能性：1)與PC相比對(duì)半乳糖脂（DG）的相對(duì)轉(zhuǎn)移酶活性升高，以%TDG/TPC計(jì)算（如實(shí)施例8所示）2)對(duì)半乳糖脂（DG）的絕對(duì)轉(zhuǎn)移酶活性升高（如實(shí)施例8所示）3)使用半乳糖脂作為供體的轉(zhuǎn)移酶活性（TDG）相對(duì)于對(duì)半乳糖脂（DG）的水性活性（HDG）升高（如實(shí)施例8所示）4)對(duì)PC的絕對(duì)轉(zhuǎn)移酶活性升高（如實(shí)施例8所示）其中DG指半乳糖脂（例如DGDG）（而且在本文中也可以稱為GL），而PC指磷脂（例如卵磷脂）。對(duì)半乳糖脂的活性升高的變體包括上文1)、2)、和3)類的變體。對(duì)半乳糖脂的活性升高的變體對(duì)磷脂的活性可能也升高（按照上文4)類）。1.一個(gè)或多個(gè)下列殘基的更改可能導(dǎo)致與PC相比酶變體對(duì)DG的相對(duì)轉(zhuǎn)移酶活性（以%TDG/TPC計(jì)算）升高：-318、N215、L210、S310、E309、H180、N80、V112、Y30X（其中X選自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、V290、Q289、K22、G40、Y179、M209、L211、K22、P81、N87、Y117、N181、Y230X（其中X選自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、Q182。通常，可能優(yōu)選下列替代中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、或Y，優(yōu)選M、R、N、G、T、Q、P、Y、S、L、E、W，最優(yōu)選QK22A、E、C、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選A、C、E、或RY30A、C、D、H、K、M、N、P、Q、R、T、V、W、G、I、L、S、M、A、R、或E，優(yōu)選H、T、W、N、D、C、Q、G、I、L、S、M、A、R、或EG40L、N、T、V、或AN80N、R、D、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選H、I、Y、C、Q、M、S、W、L、N、R、D、或FP81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選I、M、F、G、V、Y、D、C、或AK82A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選H、K、S、或RN87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選I、Y、M、T、Q、S、W、F、V、或PN88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選C、V、A、或FV112CY117A、C、D、E、F、H、T、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、或W，優(yōu)選A、N、E、H、T、I、F、C、P、或SL118A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y、優(yōu)選FV112A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、或Y，優(yōu)選I、M、F、Y、N、E、T、Q、H、或PY179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W，優(yōu)選F、C、H、I、L、M、P、V、或WH180K、Q、A、C、D、E、F、G、I、L、M、P、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選M、F、C、K、或QN181A或VQ182A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選KM209L、K、M、A、C、D、E、F、G、H、I、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選I、F、T、D、C、H、L、K、M、或PL210G、I、H、E、M、S、W、V、A、R、N、D、Q、T、C、F、K、P、或Y，優(yōu)選G、I、H、E、M、S、W、V、A、R、N、D、Q、T、Y、或FR211G、Q、K、D、A、C、E、F、H、I、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選G、Q、K、D、H、I、M、F、P、S、Y、N、C、L、或WN215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選I、F、P、T、W、H、或AY230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W，優(yōu)選I、T、G、D、R、E、V、M、或S，最優(yōu)選I、D、R、或EQ289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選F、W、H、I、Y、L、D、C、K、V、E、G、R、N、或P，更優(yōu)選R、T、D、K、N、或PV290A、C、D、E、H、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、或YE309S、Q、R、A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、T、V、W、或Y，優(yōu)選F、W、N、H、I、M、S、Q、R、A、或YS310A、P、T、H、M、K、G、C、D、E、F、I、L、N、Q、R、V、W、或Y，優(yōu)選F、Y、C、L、K、A、P、T、H、M、K、或G-318A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、Y、H、或S優(yōu)選的是，下列更改中的一項(xiàng)或多項(xiàng)可能導(dǎo)致與PC相比酶變體對(duì)DG的相對(duì)轉(zhuǎn)移酶活性（以%TDG/TPC計(jì)算）升高：S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、或Y，優(yōu)選M、R、N、G、T、Q、P、Y、S、L、E、W，最優(yōu)選QG40L、N、T、V、或AK82A、C、D、E、F、G、H,I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選H、K、S、或RN88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選C、V、A、或FY230A、C、D、E、G、H,I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W，優(yōu)選I、T、G、D、R、E、V、M、或S，最優(yōu)選D、R、或EQ289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選F、W、H,I、Y、L、D、C、K、V、E、G、或P，更優(yōu)選R、T、D、K、或P下列更改中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的更改可能導(dǎo)致與PC相比酶變體對(duì)DG的相對(duì)轉(zhuǎn)移酶活性（以%TDG/TPC計(jì)算）升高：-318Y、H、或SN215HL210G、I、H、E、M、S、W、V、A、R、N、D、Q、或TS310A、P、T、H、M、K、或GE309S、Q、A、或RH180K、T、或QN80N、R、或DV112CY30G、I、L、S、M、A、R、或E，更優(yōu)選Y30M、A、或RV290R、E、H、或AQ289R、T、D、或NK22EG40LY179V或RM209L、K、或ML211G、Q、K、或DY230VG40Q、L、或VN88WN87R或D對(duì)于有些實(shí)施方案，下列替代可能也是合適的：K22A或CP81GN87MY117A、N、E、H、或TN181A或VY230IV290HN87R、D、E、或MQ182T優(yōu)選的是，為了提高半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶與磷脂轉(zhuǎn)移酶活性比率而更改的殘基是下列中的一個(gè)或多個(gè)：-318、N215、L210、E309、H180、N80。通常，優(yōu)選下列替代中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：-318Y、H、或S，最優(yōu)選YN215HL210D、Q、或TE309Q或RH180K或QN80N、R、或D2.一個(gè)或多個(gè)下列殘基的更改可能導(dǎo)致變體對(duì)DG的絕對(duì)轉(zhuǎn)移酶活性升高：-318、N215、L210、S310、E309、H180、N80、V112、Y30X（其中X選自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、V290、Q289、K22、G40、Y179、M209、L211、K22、P81、N87、Y117、N181、Y230X（其中X選自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、V290、N87、Q182、S3、S310、K82、A309。具體而言，下列更改中的一項(xiàng)或多項(xiàng)可能導(dǎo)致變體對(duì)DG的絕對(duì)轉(zhuǎn)移酶活性升高：-318Y、H、S、A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、或W，優(yōu)選Y、H、S、或IN215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選H、I、F、P、T、W、或A，最優(yōu)選H、S、L、R、YL210G、I、H、E、M、S、W、V、A、R、N、D、Q、T、C、F、K、P、或Y，優(yōu)選D、Q、T、Y、或FS310A、P、T、H、M、K、G、C、D、E、F、I、L、N、Q、R、V、W、或Y，優(yōu)選F、Y、C、L、K、或PE309S、Q、R、A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選S、Q、R、F、W、N、H、I、M、或Y，最優(yōu)選S、Q、R、N、P、或AH180A、C、D、E、F、G、I、K、QL、M、P、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選K、Q、M、F、或C，最優(yōu)選T、K、或QN181A或VN80N、R、D、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選H、I、Y、C、Q、M、S、W、L、N、R、D、或F，最優(yōu)選N、R、D、P、V、A、或GV112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、或Y，優(yōu)選I、M、F、Y、N、E、T、Q、H、或PY30G、I、L、S、A、E、C、D、H、K、M、N、P、Q、R、T、V、或W，優(yōu)選H、T、W、N、D、C、或QV290A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、或YQ289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選R、E、G、P、N、或RK22A、C、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選CY179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W，優(yōu)選F、C、H、I、L、M、P、或W，更優(yōu)選E、R、N、V、K、SM209A、C、D、E、F、G、H、I、L、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選R、N、Y、E、或VR211A、C、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、K、D、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選H、I、M、F、P、S、Y、N、C、L、或W，最優(yōu)選RS310C、D、E、F、I、L、N、Q、R、V、W、或Y，優(yōu)選F、Y、C、L、K、或PS3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、或Y，優(yōu)選M、R、N、A、G、T、Q、P、Y、或S，最優(yōu)選Q或NK82A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選H、K、S、E、或RP81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選I、M、F、V、Y、D、C、或AN87A、C、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、D、E、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選L、G、或AY117A、N、E、H、T、C、D、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、V、或W，優(yōu)選I、F、C、P、或SN87A、C、F、G、H、I、K、L、P、Q、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選I、Y、T、Q、S、W、F、V、或PQ182A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選D或KY230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W，優(yōu)選W、H、Q、L、P、或C，最優(yōu)選T或GD157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選CG40LY226I通常，優(yōu)選下列替代中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：-318Y、H、或SN215HL210G、I、H、E、M、S、W、V、A、R、N、D、Q、或TS310A、P、T、H、M、K、或GE309S、Q、或RH180K或QN80N、R、或DV112CY30G、I、L、S、M、A、R、或E，更優(yōu)選Y30M、A、或RV290R、E、H、或AQ289R或NK22EG40LY179VM209L、K、或ML211G、Q、K、或D對(duì)于有些實(shí)施方案，下列替代可能也是合適的：K22A或CP81GN87MY117A、N、E、H、或TN181A或VY230IV290HN87R、D、E、或MQ182T優(yōu)選的是，為了提高對(duì)半乳糖脂底物（DGDG）的轉(zhuǎn)移酶活性而更改的殘基是下列中的一個(gè)或多個(gè)：-318、N215、L210、E309、H180、N80。通常，優(yōu)選下列替代中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：-318Y、H、或S，最優(yōu)選YN215HL210D、Q、或TE309Q或RH180K或QN80N、R、或D3.一個(gè)或多個(gè)下列殘基的更改可能導(dǎo)致酶變體對(duì)DG的轉(zhuǎn)移酶活性TDG相對(duì)于水解活性HDG升高：Y230、S310、H180、Q289、G40、N88、Y179、N215、L210、N80、Y30X（其中X選自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、N87、M209、R211、S18X（其中X明確選自A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W、或Y）優(yōu)選的是，下列更改中的一項(xiàng)或多項(xiàng)可能導(dǎo)致酶變體對(duì)DG的轉(zhuǎn)移酶活性TDG相對(duì)于水解活性HDG升高：Y230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、或W，優(yōu)選W、H、Q、L、P、或CS310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、或Y，優(yōu)選F、Y、C、L、K、或PY179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、或W，優(yōu)選F、C、H,I、L、M、P、或WH180A、C、D、E、F、G,I、K、L、M、P、Q、R、S、V、W、或Y，優(yōu)選M、F、或CQ289A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、V、W、或Y，優(yōu)選F、W、H、I、Y、L、D、C、K、V、E、G、或PG40A、C、D、E、F、H、I、K、M、N、P、R、S、T、W、或Y，優(yōu)選I、P、W、或YN88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、或Y，優(yōu)選I或HN87A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選I、Y、T、Q、S、W、F、V、或P通常，優(yōu)選下列替代中的一項(xiàng)或多項(xiàng)，這些酶變體（對(duì)半乳糖脂和/或磷脂）的水解活性可能降低和/或?qū)Π肴樘侵霓D(zhuǎn)移酶活性可能升高：Y179E、R,N、或QN215GL210D、H、R、E、A、Q、P、N、K、G、R、T、W,I、V、或SN80GY30LN87G通常，優(yōu)選下列替代中的一項(xiàng)或多項(xiàng)，這些酶變體（對(duì)半乳糖脂和/或磷脂）的水解活性可能降低，而對(duì)半乳糖脂的轉(zhuǎn)移酶活性保持顯著：Y179E、R、N、和QN215GL210D、H、R、E、A、Q、P、N、K、G、R、T、W、I、V、和SN80GY30LN87GH180I和TM209YR211D、T、和GS18G、M、和TG40R和MN88WN87C、D、R、E、和G4.一個(gè)或多個(gè)下列殘基的更改可能導(dǎo)致酶變體對(duì)磷脂的絕對(duì)轉(zhuǎn)移酶活性升高：S3、D157、S310、E309、Y179、N215、K22、Q289、M23、H180、M209、L210、R211、P81、V112、N80、L82、N88、N87可能提供對(duì)磷脂的轉(zhuǎn)移酶活性升高的酶變體的具體實(shí)施方案可能選自下列中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、或Y，優(yōu)選N、E、K、R、A、P、或M，最優(yōu)選S3AD157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選D157S、R、E、N、G、T、V、Q、K、或CS310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、或Y，優(yōu)選S310T-318EE309A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、或Y，優(yōu)選E309R、E、L、R、或AY179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W，優(yōu)選Y179D、T、E、R、N、V、K、Q、或S，更優(yōu)選E、R、N、V、K、或QN215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選N215S、L、R、或YK22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選K22E、R、C、或AQ289A、C、D、E、F、G、H,I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選Q289R、E、G、P、或NM23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選M23K、Q、L、G、T、或SH180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選H180Q、R、或KM209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選M209Q、S、R、A、N、Y、E、V、或LL210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選L210R、A、V、S、T、I、W、或MR211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選R211TP81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選P81GV112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、或Y，優(yōu)選V112CN80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選N80R、G、N、D、P、T、E、V、A、或GL82A、C、D、E、F、G、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選L82N、S、或EN88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選N88CN87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，優(yōu)選N87M或G下列殘基中的一個(gè)或多個(gè)的更改可能導(dǎo)致酶變體對(duì)磷脂的絕對(duì)轉(zhuǎn)移酶活性升高：S3N、R、A、或GM23K、Q、L、G、T、或SH180RL82GY179E、R、N、V、K、或QE309R、S、L、或A5.其修飾導(dǎo)致對(duì)半乳糖脂底物（DGDG）的轉(zhuǎn)移酶活性升高且半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶與磷脂轉(zhuǎn)移酶活性比率升高的殘基包括下列中的一個(gè)或多個(gè)：-318、N215、L210、S310、E309、H180、N80、V112、Y30X（其中X選自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、V290、Q289、K22、G40、Y179、M209、L211、K22、P81、N87、Y117、N181、Y230X（其中X選自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、Q182通常，優(yōu)選下列替代中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：-318Y、H、或SN215HL210G、I、H、E、M、S、W、V、A、R、N、D、Q、或TS310A、P、T、H、M、K、或GE309S、A、Q、或RH180K或QN80N、R、或DV112CY30G、I、L、S、M、A、R、或E，更優(yōu)選Y30M、A、或RV290R、E、H、或AQ289R或NK22EG40LY179VM209L、K、或ML211G、Q、K、或D對(duì)于有些實(shí)施方案，下列替代可能也是合適的：K22A或CP81GN87MY117A、N、E、H、或TN181A或VY230IV290HN87R、D、E、或MQ182T優(yōu)選的是，為了提高對(duì)半乳糖脂底物（DGDG）的轉(zhuǎn)移酶活性和/或提高半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶與磷脂轉(zhuǎn)移酶活性比率而更改的殘基是下列中的一個(gè)或多個(gè)：-318、N215、L210、E309、H180、N80。通常，優(yōu)選下列替代中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：-318Y、H、或S，最優(yōu)選YN215HL210D、Q、或TE309Q或RH180K或QN80N、R、或D6.發(fā)現(xiàn)P10480的下列野生型殘基是保持好的活性特別是好的對(duì)半乳糖脂的轉(zhuǎn)移酶活性所優(yōu)選的：W111、R211、N181、S3、L17、G40、N88、Y117、L118、N181、K22、M209、M285、M23優(yōu)選的是，在酶變體中保留這些殘基。在構(gòu)建GDSX?；D(zhuǎn)移酶變體以提高對(duì)半乳糖脂底物的轉(zhuǎn)移酶活性時(shí)，其中親本酶在與P10480序列位置W111、R211、N181、S3、L17、G40、N88、Y117、L118、N181、K22、M209、M285、M23對(duì)應(yīng)的位置具有與P10480不同的殘基，所述變體可以優(yōu)選在相應(yīng)位置包含替代，以包含在P10480序列中發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基。L17是優(yōu)選的疏水性氨基酸殘基。7.下列組合可能提高對(duì)半乳糖脂底物（DGDG）的轉(zhuǎn)移酶活性和/或提高半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶活性與磷脂轉(zhuǎn)移酶活性比率：N215H及-318YN215H及L210D、Q、或T-318Y及L210D、Q、或TN215H及-318Y及L210D、Q、或T上述組合還可以任選包含C端氨基酸添加，諸如-318Y、H、或S，優(yōu)選-318Y。上述組合還可以任選包含下列更改：合適的是，下列組合中的一項(xiàng)或多項(xiàng)可能提高對(duì)半乳糖脂底物（DGDG）的轉(zhuǎn)移酶活性和/或提高半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶活性與磷脂轉(zhuǎn)移酶活性比率：E309A、Q、或RN215H及-318Y、H、或S，優(yōu)選YL210D、Q、或T及-318Y、H、或S，優(yōu)選YN215H及E309A、Q、或RL210D、Q、或T及E309A、Q、或R-318Y及E309A、Q、或R上述組合還可以任選包含位置Q182處的替代，優(yōu)選Q182K。下列組合可能提高對(duì)半乳糖脂底物（DGDG）的轉(zhuǎn)移酶活性和/或提高半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶活性與磷脂轉(zhuǎn)移酶活性比率，和/或提高半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶與水性活性之比率：N215H及N80G-318Y及N80GL210D或Q及N80GN215H及N88N-318Y及N88NL210D或Q及N88NN215H及Y30L-318Y及Y30LL210D或Q及Y30LN215H及N87G-318Y及N87GL210D或Q及N87GN215H及Y179E、R、N、或Q-318Y及Y179E、R、N、或QL210D或Q及Y179E、R、N、或Q如上所述，本文在提及具體的氨基酸殘基時(shí)，編號(hào)是通過(guò)對(duì)比變體序列與SEQIDNo.2所示參考序列而獲得的。為了避免疑惑，在講授位于一個(gè)具體位點(diǎn)的一個(gè)具體氨基酸時(shí)，例如L118，它指位于SEQIDNo.2中編號(hào)118的殘基處的具體氨基酸。然而，在不同親本酶中位于位點(diǎn)118的氨基酸殘基可能不是亮氨酸。由此，在講授位于殘基118處的氨基酸的替代時(shí)，盡管可以參照L118，技術(shù)人員可以容易地領(lǐng)會(huì)，當(dāng)親本酶不是SEQIDNo.2所示時(shí)，所替代的氨基酸可能不是亮氨酸。因此，在替代不具有SEQIDNo.2所示氨基酸序列的親本酶中的氨基酸序列時(shí)，新的（替代）氨基酸有可能與SEQIDNo.2中講授的相同。例如，當(dāng)位于所述第118位殘基的氨基酸不是亮氨酸，因而與SEQIDNo.2中第118位殘基的氨基酸不同時(shí)，可能就是這種情況。換言之，例如第118位殘基，如果親本酶在該位置具有亮氨酸以外的氨基酸，那么可以依照本發(fā)明用亮氨酸替代該氨基酸。術(shù)語(yǔ)“脂酰基轉(zhuǎn)移酶”在用于本文時(shí)指具有?；D(zhuǎn)移酶活性的酶（通常依照國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)命名委員會(huì)的酶命名規(guī)則（1992）歸入E.C.2.3.1.x），由此酶能夠?qū)Ⅴ；芍|(zhì)轉(zhuǎn)移給一種或多種受體底物，諸如下列中的一種或多種：固醇、stanol、碳水化合物、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)亞基、甘油。優(yōu)選的是，脂?；D(zhuǎn)移酶能夠?qū)Ⅴ；芍|(zhì)轉(zhuǎn)移給至少一種固醇和/或stanol，例如膽固醇。優(yōu)選的是，依照本發(fā)明和/或用于本發(fā)明方法和/或用途的脂?；D(zhuǎn)移酶變體能夠?qū)Ⅴ；桑ū疚南薅ǖ模┲|(zhì)轉(zhuǎn)移給下列?；荏w底物中的一種或多種：固醇、stanol、碳水化合物、蛋白質(zhì)或其亞基、或甘油。對(duì)于有些方面，依照本發(fā)明的“?；荏w”可以是含有羥基（-OH）的任何化合物，諸如例如多價(jià)醇，包括甘油；固醇；stanol；碳水化合物；羥酸，包括果酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸、和抗壞血酸；蛋白質(zhì)或其亞基，諸如例如氨基酸、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、和肽（部分水解的蛋白質(zhì)）；及其混合物和衍生物。優(yōu)選的是，依照本發(fā)明的“?；荏w”不是水。在一個(gè)實(shí)施方案中，?；荏w優(yōu)選不是甘油一酯和/或甘油二酯。在一個(gè)方面，優(yōu)選的是，酶變體能夠?qū)Ⅴ；芍|(zhì)轉(zhuǎn)移給固醇和/或stanol。在一個(gè)方面，優(yōu)選的是，酶變體能夠?qū)Ⅴ；芍|(zhì)轉(zhuǎn)移給碳水化合物。在一個(gè)方面，優(yōu)選的是，酶變體能夠?qū)Ⅴ；芍|(zhì)轉(zhuǎn)移給蛋白質(zhì)或其亞基。合適的是，蛋白質(zhì)亞基可以是下列中的一種或多種：氨基酸、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、肽、二肽、寡肽、或多肽。合適的是，在蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基中，酰基受體可以是下列蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基成分中的一種或多種：絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、或半胱氨酸。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)亞基是氨基酸時(shí)，合適的是，氨基酸可以是任何合適的氨基酸。合適的是，氨基酸可以是例如絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、或半胱氨酸中的一種或多種。在一個(gè)方面，優(yōu)選的是，酶變體能夠?qū)Ⅴ；芍|(zhì)轉(zhuǎn)移給甘油。在一個(gè)方面，優(yōu)選的是，酶變體能夠?qū)Ⅴ；芍|(zhì)轉(zhuǎn)移給羥酸。在一個(gè)方面，優(yōu)選的是，酶變體能夠?qū)Ⅴ；芍|(zhì)轉(zhuǎn)移給多價(jià)醇。在一個(gè)方面，除了能夠?qū)Ⅴ；芍|(zhì)轉(zhuǎn)移給固醇和/或stanol，脂?；D(zhuǎn)移酶變體還能夠?qū)Ⅴ；芍|(zhì)轉(zhuǎn)移給下列中的一種或多種：碳水化合物、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)亞基、或甘油。優(yōu)選的是，依照本發(fā)明的脂酰基轉(zhuǎn)移酶變體所作用的脂質(zhì)底物是下列脂質(zhì)中的一種或多種：磷脂，諸如卵磷脂，例如磷脂酰膽堿、三酰甘油酯(triacylglyceride)、心磷脂、甘油二酯、或糖脂，諸如例如二半乳糖基甘油二酯（DGDG）或單半乳糖基甘油二酯（MGDG）。更優(yōu)選的是，依照本發(fā)明的酶變體作用于DGDG和MGDG中的一種或二者。優(yōu)選的是，依照本發(fā)明的酶變體對(duì)二半乳糖基甘油一酯（DGMG）或單半乳糖基甘油一酯（MGMG）沒(méi)有活性（或具有有限的活性）。由此，優(yōu)選的是，脂質(zhì)底物不是DGMG或MGMG中的一種或二者。該脂質(zhì)底物在本文中可以稱為“脂質(zhì)?；w”。術(shù)語(yǔ)卵磷脂在用于本文時(shí)涵蓋磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、和磷脂酰甘油。術(shù)語(yǔ)“半乳糖脂”在用于本文時(shí)指一種或多種DGDG或DGMG。術(shù)語(yǔ)“磷脂”在用于本文時(shí)指卵磷脂，包括磷脂酰膽堿。術(shù)語(yǔ)“極性脂質(zhì)”在用于本文時(shí)指磷脂和/或半乳糖脂，優(yōu)選磷脂和半乳糖脂。對(duì)于有些方面，優(yōu)選的是，脂?；D(zhuǎn)移酶變體所作用的脂質(zhì)底物是磷脂，諸如卵磷脂，例如磷脂酰膽堿。對(duì)于有些方面，優(yōu)選的是，脂質(zhì)底物是糖脂，諸如例如DGDG或MGDG。優(yōu)選的是，脂質(zhì)底物是食品脂質(zhì)，即食品的脂質(zhì)成分。對(duì)于有些方面，優(yōu)選的是，依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶變體不能或基本上不能作用于甘油三脂和/或1-甘油一酯和/或2-甘油一酯。合適的是，脂質(zhì)底物或脂質(zhì)酰基供體可以是一種或多種下列物質(zhì)中存在的一種或多種脂質(zhì)：脂肪，包括豬油、牛脂、和黃油；油，包括油棕櫚油、葵花籽油、大豆油、紅花油、棉籽油、落花生油、玉米油、橄欖油、花生油、椰子油、和油菜籽油榨取或衍生的油。來(lái)自大豆、油菜籽、或蛋黃的卵磷脂也是合適的脂質(zhì)底物。脂質(zhì)底物可以是燕麥脂質(zhì)或其它含有半乳糖脂的基于植物的材料。在一個(gè)方面，脂質(zhì)?；w優(yōu)選蛋黃中的卵磷脂（諸如磷脂酰膽堿）。對(duì)于本發(fā)明的有些方面，脂質(zhì)可以選自脂肪酸鏈長(zhǎng)度為8-22個(gè)碳的脂質(zhì)。對(duì)于本發(fā)明的有些方面，脂質(zhì)可以選自脂肪酸鏈長(zhǎng)度為16-22個(gè)碳、更優(yōu)選16-20個(gè)碳的脂質(zhì)。對(duì)于本發(fā)明的有些方面，脂質(zhì)可以選自脂肪酸鏈長(zhǎng)度不超過(guò)14個(gè)碳的脂質(zhì)，合適的是選自脂肪酸鏈長(zhǎng)度4-14個(gè)碳、合適的是4-10個(gè)碳、合適的是4-8個(gè)碳的脂質(zhì)。合適的是，依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶變體可能展示下列脂肪酶活性中的一種或多種：糖脂酶活性（E.C.3.1.1.26）、三酰甘油脂肪酶活性（E.C.3.1.1.3）、磷脂酶A2活性（E.C.3.1.1.4）、或磷脂酶A1活性（E.C.3.1.1.32）。術(shù)語(yǔ)“糖脂酶活性”在用于本文時(shí)涵蓋“半乳糖酯酶活性”。合適的是，依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶變體可能具有下列活性中的至少一種或多種：糖脂酶活性（E.C.3.1.1.26）和/或磷脂酶A1活性（E.C.3.1.1.32）和/或磷脂酶A2活性（E.C.3.1.1.4）。對(duì)于有些方面，依照本發(fā)明的脂酰基轉(zhuǎn)移酶變體可能至少具有糖脂酶活性（E.C.3.1.1.26）。合適的是，對(duì)于有些方面，依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶變體可能能夠?qū)Ⅴ；商侵?或磷脂轉(zhuǎn)移給下列受體底物中的一種或多種：固醇、stanol、碳水化合物、蛋白質(zhì)、或甘油。對(duì)于有些方面，優(yōu)選的是，依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶變體能夠?qū)Ⅴ；商侵?或磷脂轉(zhuǎn)移給固醇和/或stanol，從而形成至少一種固醇酯和/或stanol酯。對(duì)于有些方面，優(yōu)選的是，依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶變體能夠?qū)Ⅴ；商侵?或磷脂轉(zhuǎn)移給碳水化合物，從而形成至少一種碳水化合物酯。對(duì)于有些方面，依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶變體能夠?qū)Ⅴ；商侵?或磷脂轉(zhuǎn)移給蛋白質(zhì)，從而形成至少一種蛋白質(zhì)酯（或蛋白質(zhì)脂肪酸縮合物）。對(duì)于有些方面，優(yōu)選的是，依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶變體能夠?qū)Ⅴ；商侵?或磷脂轉(zhuǎn)移給甘油，從而形成至少一種甘油二酯和/或甘油一酯。對(duì)于有些方面，優(yōu)選的是，依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶變體不展示三酰甘油脂肪酶活性（E.C.3.1.1.3）。在有些方面，脂酰基轉(zhuǎn)移酶變體可能能夠?qū)Ⅴ；芍|(zhì)轉(zhuǎn)移給固醇和/或stanol。由此，在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的“?；荏w”可以是固醇或stanol或是二者的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的是，固醇和/或stanol可以包含下列結(jié)構(gòu)特色中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：1)3-β羥基或3-α羥基；和/或2)順式位置的A:B環(huán)或反式位置的A:B環(huán)或是C5-C6是不飽和的。合適的固醇?；荏w包括膽固醇和植物甾醇，例如α-谷甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇、麥角甾醇、菜油甾醇、5,6-二氫甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、β-菠菜甾醇、γ-菠菜甾醇、δ-菠菜甾醇、巖藻甾醇、dimosterol、子囊甾醇、serebisterol、表甾醇、anasterol、hyposterol、chondrillasterol、鏈甾醇、海綿甾醇、多孔甾醇、clionasterol（γ-谷甾醇）、固醇糖苷、以及其它天然或合成的同質(zhì)異構(gòu)形式和衍生物。在本發(fā)明的一個(gè)方面，合適的是，超過(guò)一種固醇和/或stanol可以擔(dān)當(dāng)?；荏w，合適的是，超過(guò)兩種固醇和/或stanol可以擔(dān)當(dāng)酰基受體。換言之，在本發(fā)明的一個(gè)方面，合適的是，可以生成超過(guò)一種固醇酯和/或stanol酯。合適的是，當(dāng)?；荏w是膽固醇時(shí)，一種或多種其它固醇或者一種或多種stanol也可以擔(dān)當(dāng)?；荏w。由此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于原位生成膽固醇酯及至少一種固醇酯或stanol酯的組合的方法。換言之，本發(fā)明有些方面的脂?；D(zhuǎn)移酶可以將?；芍|(zhì)轉(zhuǎn)移給膽固醇及至少一種其它固醇和/或至少一種stanol。在一個(gè)方面，優(yōu)選的是，固醇酰基受體是下列中的一種或多種：α-谷甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇、麥角甾醇和菜油甾醇。在一個(gè)方面，優(yōu)選的是，固醇?；荏w是膽固醇。在脂?；D(zhuǎn)移酶變體的?；荏w是膽固醇的情況中，食品中游離膽固醇的數(shù)量與暴露于脂?；D(zhuǎn)移酶變體前的食品相比和/或與未用脂?；D(zhuǎn)移酶變體處理的等價(jià)食品相比減少了。合適的stanol?；荏w包括phytostanol，例如β-phytostanol(sitostanal)或ss-phytostanol。在一個(gè)方面，優(yōu)選的是，固醇和/或stanol酰基受體是膽固醇以外的固醇和/或stanol。在有些方面，依照本發(fā)明制作的食品可用于降低血清膽固醇和/或降低低密度脂蛋白。血清膽固醇和低密度脂蛋白都與某些人類疾病有關(guān)，諸如例如動(dòng)脈粥樣硬化和/或心臟病。由此，設(shè)想依照本發(fā)明制作的食品可用于降低這些疾病的風(fēng)險(xiǎn)。由此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了依照本發(fā)明的食品用于治療和/或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和/或心臟病的用途。這是可以將食品考慮作為類藥劑營(yíng)養(yǎng)品（neutraceutical）的一個(gè)方面。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含依照本發(fā)明的食品的藥物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療和/或預(yù)防人類或動(dòng)物患者疾病的方法，該方法包括對(duì)患者施用有效量的依照本發(fā)明的食品。合適的是，食品中可能天然存在固醇和/或stanol“酰基受體”。或者，可以向食品中添加固醇和/或stanol。在向食品中添加固醇和/或stanol的情況中，可以在添加依照本發(fā)明的脂酰基轉(zhuǎn)移酶之前、同時(shí)、和/或之后添加固醇和/或stanol。合適的是，本發(fā)明可以涵蓋在添加依照本發(fā)明的酶變體之前或同時(shí)向食品中添加外源固醇和/或stanol，特別是植物固醇/植物stanol。對(duì)于有些方面，可以在依照本發(fā)明添加脂?；D(zhuǎn)移酶變體之前或同時(shí)將食品中存在的一種或多種固醇轉(zhuǎn)變成一種或多種stanol。可以采用適于將固醇轉(zhuǎn)變成stanol的任何方法。例如，可以通過(guò)例如化學(xué)氫化來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)變?？梢栽谔砑右勒毡景l(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶變體之前或同時(shí)實(shí)施轉(zhuǎn)變。合適的是，WO00/061771中講授了用于將固醇轉(zhuǎn)變成stanol的酶。合適的是，本發(fā)明可用于在食品中原位生成phytostanol酯。phytostanol酯穿過(guò)脂膜的溶解性提高、生物利用度提高、且健康利益提高（見(jiàn)例如WO92/99640）。在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，stanol酯和/或固醇酯可以是增香劑和/或質(zhì)地改良劑(texturiser)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)用依照本發(fā)明的酶變體處理油而在食用油（諸如植物油，諸如例如大豆油）中生成植物固醇酯和/或stanol酯和溶血卵磷脂但不形成游離脂肪酸的方法。在這種情況中，可以通過(guò)脫膠過(guò)程清除由此生成的溶血卵磷脂?？梢圆捎萌魏蚊撃z過(guò)程，諸如一種或多種已知的脫膠過(guò)程。如果需要，可以通過(guò)除臭來(lái)清除任何游離脂肪酸。注意，通過(guò)除臭過(guò)程不能清除油中生成的任何stanol/固醇酯。由此，所生成的食用油包含固醇酯和/或stanol酯，它們可能具有有益的營(yíng)養(yǎng)和/或類藥劑營(yíng)養(yǎng)(nutriceutical)作用，諸如降低血液膽固醇水平?？梢詫?duì)其執(zhí)行此方法的合適的油格外包含卵磷脂和固醇/stanol。合適的是，在處理時(shí)油是粗制的油。合適的是，食用油可以是下列中的一種或多種：玉米胚芽油、棉籽油、亞麻籽油、棕櫚油、花生油、油菜籽油、大豆油、葵花籽油、和小麥胚芽油。對(duì)于本發(fā)明的有些方面，依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶變體可以利用碳水化合物作為?；荏w。碳水化合物?；荏w可以是下列中的一種或多種：?jiǎn)翁?、二糖、寡糖、或多糖。?yōu)選的是，碳水化合物是下列中的一種或多種：葡萄糖、果糖、脫水果糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、木糖、木糖寡糖、阿拉伯糖、麥芽糖寡糖、塔格糖、microthecin、ascopyroneP、ascopyroneT、cortalcerone。合適的是，食品中可能天然存在碳水化合物“?；荏w”。或者，可以向食品中添加碳水化合物。在向食品中添加碳水化合物的情況中，可以在添加依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶變體之前、同時(shí)、和/或之后添加碳水化合物。碳水化合物酯在食品中可以作為有價(jià)值的乳化劑發(fā)揮功能。由此，在酶發(fā)揮將酰基轉(zhuǎn)移給糖的功能的情況中，本發(fā)明涵蓋在食品中原位生成第二種乳化劑。在有些實(shí)施方案中，脂?；D(zhuǎn)移酶變體可以利用固醇和/或stanol及碳水化合物二者作為酰基受體。能夠?qū)Ⅴ；D(zhuǎn)移給碳水化合物以及固醇和/或stanol的脂?；D(zhuǎn)移酶變體的利用對(duì)于包含蛋的食品是特別有利的。具體而言，蛋和蛋制品中糖特別是葡萄糖的存在常?？醋魇遣焕摹５包S可能包含可多達(dá)1％的葡萄糖。通常，可以用葡萄糖氧化酶處理蛋或基于蛋的產(chǎn)品，從而清除部分或所有的葡萄糖。然而，依照本發(fā)明，可以通過(guò)將糖“酯化”而形成糖酯，從而容易的清除不需要的糖。對(duì)于本發(fā)明的有些方面，依照本發(fā)明的脂酰基轉(zhuǎn)移酶變體可以利用蛋白質(zhì)作為?；荏w。合適的是，蛋白質(zhì)可以是在食品中例如在乳制品和/或肉制品中發(fā)現(xiàn)的一種或多種蛋白質(zhì)。只是作為例示，合適的蛋白質(zhì)可以是在凝乳或乳清中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，諸如乳球蛋白。其它合適的蛋白質(zhì)包括來(lái)自蛋的卵清蛋白、麥醇溶蛋白、麥谷蛋白、嘌呤二氫吲哚(puroindoline)、來(lái)自谷類的脂轉(zhuǎn)移蛋白、和來(lái)自肉類的肌球蛋白。優(yōu)選的是，可以使用下列標(biāo)準(zhǔn)來(lái)鑒定依照本發(fā)明的親本脂?；D(zhuǎn)移酶：(1)酶具有可以定義為酯轉(zhuǎn)移活性的?；D(zhuǎn)移酶活性，由此將脂質(zhì)?；w的最初酯鍵的?；糠洲D(zhuǎn)移給?；荏w，從而形成新的酯；和(2)酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸殘基中的一種或多種：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、或S。優(yōu)選的是，GDSX基序中的X是L。由此，優(yōu)選的是，依照本發(fā)明的酶包含氨基酸序列基序GDSL。GDSX基序由四個(gè)保守氨基酸組成。優(yōu)選的是，基序中的絲氨酸是脂酰基轉(zhuǎn)移酶的催化性絲氨酸。合適的是，GDSX基序的絲氨酸可以位于與Brumlik和Buckley（JournalofBacteriology，1996年4月，Vol.178，No.7，p2060-2064）中講授的嗜水氣單胞菌脂肪分解酶中Ser-16對(duì)應(yīng)的位置。為了確定蛋白質(zhì)是否具有依照本發(fā)明的GDSX基序，優(yōu)選將序列與pfam數(shù)據(jù)庫(kù)的隱藏Markov模型序型(profile)（HMM序型）進(jìn)行比較。pfam是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域家族的數(shù)據(jù)庫(kù)。pfam包含排列好的每個(gè)家族的多重序列對(duì)比，以及用于在新序列中鑒定這些結(jié)構(gòu)域的序型隱藏Markov模型（序型HMM）。關(guān)于pfam的介紹見(jiàn)BatemanA等，2002，NucleicAcidsRes.30：276-280。隱藏Markov模型在致力于蛋白質(zhì)分類的許多數(shù)據(jù)庫(kù)中得到采用，綜述見(jiàn)BatemanA和HaftDH，2002，BriefBioinform3：236-245。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=12230032&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=11752314&dopt=Abstract關(guān)于隱藏Markov模型的詳細(xì)解釋和它們?cè)趐fam數(shù)據(jù)庫(kù)中是如何應(yīng)用的見(jiàn)DurbinR、EddyS、和KroghA，1998，Biologicalsequenceanalysis;probabilisticmodelsofproteinsandnucleicacids.CambridgeUniversityPress，ISBN0-521-62041-4。Hammer軟件包可以由華盛頓大學(xué)（StLouis，USA）獲得。或者，可以使用Hammer軟件包來(lái)鑒定GDSX基序，其說(shuō)明書見(jiàn)DurbinR、EddyS、和KroghA，1998，Biologicalsequenceanalysis;probabilisticmodelsofproteinsandnucleicacids.CambridgeUniversityPress，ISBN0-521-62041-4及其參考文獻(xiàn)，以及該說(shuō)明書中提供的HMMER2序型。可以通過(guò)例如目前位于下列網(wǎng)站的幾個(gè)服務(wù)器訪問(wèn)PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)。http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtmlhttp://pfam.wustl.edu/http://pfam.jouy.inra.fr/http://pfam.cgb.ki.se/數(shù)據(jù)庫(kù)提供了能夠輸入蛋白質(zhì)序列的搜索工具。使用數(shù)據(jù)庫(kù)的默認(rèn)參數(shù)，就將對(duì)蛋白質(zhì)序列分析是否存在Pfam結(jié)構(gòu)域。GDSX結(jié)構(gòu)域是數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)確定的結(jié)構(gòu)域，因此它在任何檢索序列中的存在都將受到識(shí)別。數(shù)據(jù)庫(kù)將對(duì)檢索序列報(bào)告其與Pfam00657共有序列的對(duì)比。可以通過(guò)下列方式獲得包括殺鮭氣單胞菌或嗜水氣單胞菌在內(nèi)的多重對(duì)比：1)手工遵循上文所述流程，獲得目的蛋白與Pfam00657共有序列的對(duì)比，并獲得P10480與Pfam00657共有序列的對(duì)比；或2)通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)在鑒定了Pfam00657共有序列之后，數(shù)據(jù)庫(kù)提供選項(xiàng)以顯示檢索序列與Pfam00657共有序列種子對(duì)比(seedalignment)的對(duì)比。P10480是該種子對(duì)比的一部分，以GCAT_AERHY表示。檢索序列和P10480二者都將在同一個(gè)窗口中得到顯示。嗜水氣單胞菌參考序列：嗜水氣單胞菌GDSX脂肪酶的殘基在NCBI文件P10480中進(jìn)行了編號(hào)，本文中的編號(hào)就是該文件中給出的編號(hào)，在本發(fā)明中用于在優(yōu)選實(shí)施方案中確定本發(fā)明脂?；D(zhuǎn)移酶中存在的具體氨基酸。進(jìn)行了Pfam對(duì)比（圖33和圖34）：可以識(shí)別下列保守殘基，而且在優(yōu)選實(shí)施方案中它們可以存在于本發(fā)明組合物和方法所使用的酶變體中；模塊1－GDSX模塊hidhidhidhidGlyAspSerhid2829303132333435模塊2－GANDY模塊hidGlyhidAsnAsphid130131132133134135模塊3－HPT模塊His309其中“hid”指選自下組的疏水殘基：Met、Ile、Leu、Val、Ala、Gly、Cys、His、Lys、Trp、Tyr、Phe。優(yōu)選的是，可以將本發(fā)明組合物/方法所使用的親本和/或變體脂?；D(zhuǎn)移酶與Pfam00657共有序列進(jìn)行對(duì)比。優(yōu)選的是，與pfam00657結(jié)構(gòu)域家族的隱藏Markov模型序型（HMM序型）的正匹配指示存在依照本發(fā)明的GDSL或GDSX結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的是，在與Pfam00657共有序列對(duì)比時(shí)，本發(fā)明組合物/方法所使用的親本和/或變體脂酰基轉(zhuǎn)移酶具有GDSX模塊、GANDY模塊和HPT模塊中的至少一個(gè)、優(yōu)選超過(guò)一個(gè)、優(yōu)選超過(guò)兩個(gè)。合適的是，親本和/或變體脂?；D(zhuǎn)移酶可以具有GDSX模塊和GANDY模塊?；蛘?，親本和/或變體酶可以具有GDSX模塊和HPT模塊。優(yōu)選的是，親本和/或變體酶包含至少GDSX模塊。優(yōu)選的是，在與Pfam00657共有序列對(duì)比時(shí)，與嗜水氣單胞菌多肽參考序列即SEQIDNo.26相比，本發(fā)明組合物/方法所使用的親本和/或變體酶具有下列氨基酸殘基中的至少一個(gè)、優(yōu)選超過(guò)一個(gè)、優(yōu)選超過(guò)兩個(gè)、優(yōu)選超過(guò)三個(gè)、優(yōu)選超過(guò)四個(gè)、優(yōu)選超過(guò)五個(gè)、優(yōu)選超過(guò)六個(gè)、優(yōu)選超過(guò)七個(gè)、優(yōu)選超過(guò)八個(gè)、優(yōu)選超過(guò)九個(gè)、優(yōu)選超過(guò)十個(gè)、優(yōu)選超過(guò)十一個(gè)、優(yōu)選超過(guò)十二個(gè)、優(yōu)選超過(guò)十三個(gè)、優(yōu)選超過(guò)十四個(gè)：28hid、29hid、30hid、31hid、32gly、33Asp、34Ser、35hid、130hid、131Gly、132Hid、133Asn、134Asp、135hid、309His。pfam00657是區(qū)分具有此結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)與其它酶的獨(dú)特鑒別物。pfam00657共有序列在圖1中顯示為SEQIDNo.1。它衍生自對(duì)第6版數(shù)據(jù)庫(kù)pfam家族00657的鑒定，在本文中也可稱為pfam00657.6。可以使用pfam數(shù)據(jù)庫(kù)的較新版本更新共有序列。例如，圖33和圖34顯示了第11版數(shù)據(jù)庫(kù)的00657家族的pfam對(duì)比，在本文中也可稱為pfam00657.11。在來(lái)自數(shù)據(jù)庫(kù)兩個(gè)版本的pfam家族00657中都發(fā)現(xiàn)存在GDSX、GANDY和HPT模塊。可以使用更新版本的pfam數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)鑒定pfam家族00657。優(yōu)選的是，可以使用下列標(biāo)準(zhǔn)來(lái)鑒定依照本發(fā)明的親本脂?；D(zhuǎn)移酶：(1)酶具有可以定義為酯轉(zhuǎn)移活性的?；D(zhuǎn)移酶活性，由此將脂質(zhì)?；w的最初酯鍵的酰基部分轉(zhuǎn)移給?；荏w，從而形成新的酯；(2)酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸殘基中的一種或多種：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、或S；和(3)酶包含His-309或者在與圖2（SEQIDNo.2或SEQIDNo.36）所示嗜水氣單胞菌脂肪分解酶中His-309對(duì)應(yīng)的位置包含組氨酸殘基。優(yōu)選的是，GDSX基序中的氨基酸殘基X是L。在SEQIDNo.26中，前18個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成信號(hào)序列。全長(zhǎng)序列即包含信號(hào)序列的蛋白質(zhì)中的His-309等同于蛋白質(zhì)成熟部分即不含信號(hào)序列的序列中的His-291。優(yōu)選的是，依照本發(fā)明的親本脂?；D(zhuǎn)移酶包含下列催化性三聯(lián)體：Ser-16、Asp-116、和His-209，或者在與圖2（SEQIDNo.2）所示嗜水氣單胞菌脂肪分解酶中Ser-16、Asp-116和His-209對(duì)應(yīng)的位置或者在與圖28（SEQIDNo.26）所示全長(zhǎng)序列中Ser-34、Asp-134和His-309對(duì)應(yīng)的位置分別包含絲氨酸殘基、天冬氨酸殘基和組氨酸殘基。如上所述，在SEQIDNo.26所示序列中，前18個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成信號(hào)序列。全長(zhǎng)序列即包含信號(hào)序列的蛋白質(zhì)中的Ser-34、Asp-134和His-309等同于蛋白質(zhì)成熟部分即不含信號(hào)序列的序列中的Ser-16、Asp-116和His-291。在pfam00657共有序列中，如圖1（SEQIDNo.1）所示，活性位點(diǎn)的殘基對(duì)應(yīng)于Ser-7、Asp-157和His-348。優(yōu)選的是，可以使用下列標(biāo)準(zhǔn)鑒定依照本發(fā)明的親本脂酰基轉(zhuǎn)移酶：(1)酶具有可以定義為酯轉(zhuǎn)移活性的?；D(zhuǎn)移酶活性，由此將第一種脂質(zhì)?；w的最初酯鍵的?；糠洲D(zhuǎn)移給?；荏w，從而形成新的酯；和(2)酶至少在與圖2（SEQIDNo.2）所示嗜水氣單胞菌酶對(duì)應(yīng)的位置包含Gly-14、Asp-15、Ser-16、Asp-116和His-191，它們又對(duì)應(yīng)于圖28（SEQIDNo.26）中的位置Gly-32、Asp-33、Ser-34、Asp-134、和His-309。合適的是，依照本發(fā)明的親本脂?；D(zhuǎn)移酶可以由一種或多種下列屬的生物體獲得，優(yōu)選就是這樣獲得的：氣單胞菌屬（Aeromonas）、棒桿菌屬（Corynebacterium）、Novosphingobium屬、喜熱裂孢菌屬(Termobifida)、鏈霉菌屬（Streptomyces）、糖酵母屬（Saccharomyces）、乳球菌屬（Lactococcus）、分支桿菌屬（Mycobacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、脫亞硫酸菌屬（Desulfitobacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、彎曲桿菌屬（Campylobacter）、弧菌科（Vibrionaceae）、木桿菌屬（Xylella）、硫化葉菌屬（Sulfolobus）、曲霉屬（Aspergillus）、裂殖糖酵母屬（Schizosaccharomyces）、利斯特氏菌屬（Listeria）、奈瑟氏球菌屬（Neisseria）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、雷爾氏菌屬（Ralstonia）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）和假絲酵母屬（Candida）。合適的是，依照本發(fā)明的親本脂?；D(zhuǎn)移酶可以由一種或多種下列生物體獲得，優(yōu)選就是這樣獲得的：嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila）、殺鮭氣單胞菌（Aeromonassalmonicida）、天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomycescoelicolor）、龜裂鏈霉菌（Streptomycesrimosus）、分支桿菌屬（Mycobacterium）、釀膿鏈球菌（Streptococcuspyogenes）、乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）、釀膿鏈球菌（Streptococcuspyogenes）、嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus）、瑞士乳桿菌（Lactobacillushelveticus）、脫鹵脫亞硫酸菌（Desulfitobacteriumdehalogenans）、芽孢桿菌（Bacillussp）、空腸彎曲桿菌（Campylobacterjejuni）、弧菌科（Vibrionaceae）、苛養(yǎng)木桿菌（Xylellafastidiosa）、硫磺礦硫化葉菌（Sulfolobussolfataricus）、啤酒糖酵母（Saccharomycescerevisiae）、土曲霉（Aspergillusterreus）、粟酒裂殖糖酵母（Schizosaccharomycespombe）、無(wú)害利斯特氏菌（Listeriainnocua）、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）、腦膜炎奈瑟氏球菌（Neisseriameningitidis）、百脈根中慢生根瘤菌（Mesorhizobiumloti）、茄青枯雷爾氏菌（Ralstoniasolanacearum）、野油菜黃單胞菌（Xanthomonascampestris）、地毯草黃單胞菌（Xanthomonasaxonopodis）、Corynebacteriumefficens、Novosphingobiumaromaticivorans、褐色喜熱裂孢菌(Termobifidafusca)、和近平滑假絲酵母（Candidaparapsilosis）。在一個(gè)方面，本發(fā)明的親本脂酰轉(zhuǎn)移酶是可獲得，優(yōu)選獲得自嗜水氣單胞菌或殺鮭氣單胞菌中的一種或多種。在一個(gè)方面，優(yōu)選的是，依照本發(fā)明的親本脂?；D(zhuǎn)移酶可以是卵磷脂:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（LCAT）或其變體（例如通過(guò)分子進(jìn)化構(gòu)建的變體）。合適的LCAT在本領(lǐng)域是已知的，而且可以由例如下列生物體中的一種或多種獲得：哺乳動(dòng)物、大鼠、小鼠、雞、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)、植物（包括擬南芥(Arabidopsis)和稻(Oryzasativa)）、線蟲、真菌、和酵母。優(yōu)選的是，在執(zhí)行依照本發(fā)明的方法時(shí)，在所生成的產(chǎn)品（即食品）中游離脂肪酸沒(méi)有增加或基本沒(méi)有增加。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)移酶”在用于本文時(shí)可以與術(shù)語(yǔ)“脂?；D(zhuǎn)移酶”互換使用。術(shù)語(yǔ)“半乳糖脂?；D(zhuǎn)移酶活性”在用于本文時(shí)指酶催化酰基由半乳糖脂供體轉(zhuǎn)移至（除水以外的）受體分子諸如例如甘油的能力。同樣，術(shù)語(yǔ)“磷脂轉(zhuǎn)移酶活性”在用于本文時(shí)指酶催化酰基由磷脂供體轉(zhuǎn)移至（除水以外的）受體分子諸如例如甘油的能力。術(shù)語(yǔ)“半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶活性與磷脂轉(zhuǎn)移酶活性比率升高”在用于本文時(shí)指與親本酶相比酶變體能夠以比磷脂轉(zhuǎn)移酶更高的比率催化半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶。這可能意味著半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶活性和磷脂轉(zhuǎn)移酶活性二者都比親本酶升高，或是與親本酶相比半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶活性升高而磷脂轉(zhuǎn)移酶活性降低。兩種活性之間的最終關(guān)系才是重要的。合適的是，脂?；D(zhuǎn)移酶如本文所定義的催化下列反應(yīng)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：酯交換、酯轉(zhuǎn)移、醇解、水解。術(shù)語(yǔ)“酯交換”指酶促催化的脂質(zhì)供體與脂質(zhì)受體之間的酰基轉(zhuǎn)移，其中脂質(zhì)供體不是游離的?；?。術(shù)語(yǔ)“酯轉(zhuǎn)移”在用于本文時(shí)指酶促催化的由（除游離脂肪酸以外的）脂質(zhì)供體至（除水以外的）?；荏w的?；D(zhuǎn)移。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“醇解”指通過(guò)與醇ROH反應(yīng)而酶促切割酸衍生物的共價(jià)鍵，使得一種產(chǎn)物與醇的H結(jié)合而另一種產(chǎn)物與醇的OR基團(tuán)結(jié)合。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“醇”指含有羥基的烷基化合物。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“水解”指酶促催化由脂質(zhì)至水分子OH基團(tuán)的?；D(zhuǎn)移。由水解引起的?；D(zhuǎn)移需要分離水分子。術(shù)語(yǔ)“半乳糖脂水解活性”在用于本文時(shí)指酶通過(guò)將?；砂肴樘侵D(zhuǎn)移給水分子OH基團(tuán)而催化半乳糖脂水解的能力。類似的，術(shù)語(yǔ)“磷脂水解活性”在用于本文時(shí)指酶通過(guò)將?；闪字D(zhuǎn)移給水分子OH基團(tuán)而催化磷脂水解的能力。術(shù)語(yǔ)“半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶活性與半乳糖脂水解活性比率”在用于本文時(shí)指與親本酶相比酶變體能夠以比半乳糖脂水解更高的比率催化半乳糖脂轉(zhuǎn)移。這可能意味著半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶活性和半乳糖水解活性二者都比親本酶升高，或是與親本酶相比半乳糖脂轉(zhuǎn)移酶活性升高而半乳糖脂水解活性降低。兩種活性之間的最終關(guān)系才是重要的。術(shù)語(yǔ)“游離脂肪酸沒(méi)有增加或基本沒(méi)有增加”在用于本文時(shí)指優(yōu)選的是依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶具有100％轉(zhuǎn)移酶活性（即100％將酰基由?；w轉(zhuǎn)移至酰基受體，而沒(méi)有水解活性）；然而，酶可能將脂質(zhì)?；w中存在的少于100％的?；D(zhuǎn)移給?；荏w。在這種情況中優(yōu)選的是，?；D(zhuǎn)移酶活性占到酶總活性的至少5％、更優(yōu)選至少10％、更優(yōu)選至少20％、更優(yōu)選至少30％、更優(yōu)選至少40％、更優(yōu)選至少50％、更優(yōu)選至少60％、更優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％、且更優(yōu)選至少98％。可以通過(guò)如下方案測(cè)定％轉(zhuǎn)移酶活性（即轉(zhuǎn)移酶活性占酶總活性的百分率）：用于測(cè)定％?；D(zhuǎn)移酶活性的方案可以在與CHCl3:CH3OH的酶促反應(yīng)后，對(duì)添加了依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶的食品進(jìn)行萃取，并分離含有脂質(zhì)物質(zhì)的有機(jī)相，通過(guò)依照下文詳述流程的GLC進(jìn)行分析。根據(jù)GLC分析（以及HPLC分析，如果必要的話），測(cè)定游離脂肪酸和一種或多種固醇/stanol酯；碳水化合物酯、蛋白質(zhì)酯；甘油二酯；或甘油一酯的數(shù)量。以相同方式對(duì)沒(méi)有添加依照本發(fā)明的酶的對(duì)照食品進(jìn)行分析。計(jì)算：根據(jù)GLC（以及任選的HPLC分析）的結(jié)果，可以計(jì)算游離脂肪酸和固醇/stanol酯和/或碳水化合物酯和/或蛋白質(zhì)酯和/或甘油二酯和/或甘油一酯的增量：Δ％脂肪酸=％脂肪酸（酶）-％脂肪酸（對(duì)照）；Mv脂肪酸=脂肪酸的平均分子量；A=Δ％固醇酯/Mv固醇酯（其中Δ％固醇酯=％固醇/stanol酯（酶）-％固醇/stanol酯（對(duì)照），而Mv固醇酯=固醇/stanol酯的平均分子量）－當(dāng)?；荏w是固醇和/或stanol時(shí)適用；B=Δ％碳水化合物酯/Mv碳水化合物酯（其中Δ％碳水化合物酯=％碳水化合物酯（酶）-％碳水化合物酯（對(duì)照），而Mv碳水化合物酯=碳水化合物酯的平均分子量）－當(dāng)?；荏w是碳水化合物時(shí)適用；C=Δ％蛋白質(zhì)酯/Mv蛋白質(zhì)酯（其中Δ％蛋白質(zhì)酯=％蛋白質(zhì)酯（酶）-％蛋白質(zhì)酯（對(duì)照），而Mv蛋白質(zhì)酯=蛋白質(zhì)酯的平均分子量）－當(dāng)?；荏w是蛋白質(zhì)時(shí)適用；D=甘油二酯和/或甘油一酯的絕對(duì)值/Mv甘油二/一酯（其中Δ％甘油二酯和/或甘油一酯=％甘油二酯和/或甘油一酯（酶）-％甘油二酯和/或甘油一酯（對(duì)照），而Mv甘油二/一酯=甘油二酯和/或甘油一酯的平均分子量）－當(dāng)酰基受體是甘油時(shí)適用。以總酶活性的百分率的形式來(lái)計(jì)算轉(zhuǎn)移酶活性：*－根據(jù)需要?jiǎng)h除。下表列出了屬于術(shù)語(yǔ)“非極性”、“極性-不帶電荷”、“極性-帶電荷）的氨基酸，以及屬于術(shù)語(yǔ)“脂肪族”和“芳香族”的氨基酸。術(shù)語(yǔ)“極性”指“極性-不帶電荷”和“極性-帶電荷”兩類氨基酸。GLC分析配備了WCOT熔融石英柱12.5mx0.25mmIDx0.1μ膜厚度5％苯基-甲基-硅樹(shù)脂（購(gòu)自Chrompack的CPSil8CB）的PerkinElmerAutosystem9000CapillaryGasChromatograph即毛細(xì)管氣相層析自動(dòng)系統(tǒng)運(yùn)載氣體：氦注射器：PSSI冷分流注射（初始溫度50℃，加熱至385℃），體積1.0μl檢測(cè)儀FID：395℃樣品制備：將30mg樣品溶于9ml含有內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物十七烷（0.5mg/ml）的庚烷:Pyridin（2:1）。將300μl樣品溶液轉(zhuǎn)移到曲頸瓶(crimpvial)中，添加300μlMSTFA（N-methyl-N-trimethylsilyl-trifluoraceamid），并于60℃反應(yīng)20分鐘。計(jì)算：由標(biāo)準(zhǔn)物2（甘油一/二/三酯）測(cè)定甘油一/二/三酯和游離脂肪酸的響應(yīng)因子(responsefactor)，由純的參比物質(zhì)（稱量10mg純的物質(zhì)）測(cè)定膽固醇、膽固醇棕櫚酸酯和膽固醇硬脂酸酯的響應(yīng)因子。技術(shù)效果本發(fā)明在蛋制品特別是蛋黃醬(mayonnaise)中可以提供下列意想不到的技術(shù)效果中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：在巴氏殺菌過(guò)程中改進(jìn)熱穩(wěn)定性；改進(jìn)感官特性；改進(jìn)稠度。磷脂轉(zhuǎn)移酶活性升高特別是磷脂與固醇和/或stanol諸如膽固醇之間的轉(zhuǎn)移酶活性升高的酶變體在用于生產(chǎn)溶血磷脂和/或食用油的酶促脫膠和/或生產(chǎn)乳化特性和/或健康利益改進(jìn)的蛋制品的方法中可能是特別有用的。對(duì)于在酶促脫膠方法中的用途，優(yōu)選對(duì)膽固醇的絕對(duì)磷脂轉(zhuǎn)移酶活性升高的變體。合適的是，本發(fā)明在蛋或蛋制品中可以提供下列意想不到的技術(shù)效果中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：乳液穩(wěn)定性改進(jìn)；乳液的熱穩(wěn)定性改進(jìn)；氣味改進(jìn)；臭味降低；增稠特性改進(jìn)；稠度改進(jìn)。本發(fā)明在生面團(tuán)和/或焙烤產(chǎn)品中可以提供下列意想不到的技術(shù)效果中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：生面團(tuán)或焙烤產(chǎn)品（例如面包和/或蛋糕）的比體積(specificvolume)改進(jìn)；生面團(tuán)穩(wěn)定性改進(jìn)；面包皮得分改進(jìn)(improvedcrustscore)（例如面包皮更薄和/或更脆）；面包屑得分改進(jìn)(improvedcrumbscore)（例如面包屑分布更加均勻和/或結(jié)構(gòu)更加精細(xì)和/或更加柔軟）；外觀改進(jìn)（例如表面光滑，沒(méi)有泡或洞，或者基本上沒(méi)有泡或洞）；陳舊變慢；軟度升高；氣味改進(jìn)；味道改進(jìn)。合適的是，本發(fā)明在食品中可以提供下列意想不到的技術(shù)效果中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：外觀改進(jìn)；口感改進(jìn)；穩(wěn)定性改進(jìn)，特別是熱穩(wěn)定性改進(jìn)；味道改進(jìn)；軟度改進(jìn)；彈性改進(jìn)；乳化改進(jìn)。合適的是，本發(fā)明在乳制品諸如例如冰激凌中可以提供下列意想不到的技術(shù)效果中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：口感改進(jìn)（優(yōu)選口感更像奶一樣）；味道改進(jìn)；融化改進(jìn)。下表列出了與在食品制作中使用本文定義的脂?；D(zhuǎn)移酶有關(guān)的具體技術(shù)效果：合適的是，本發(fā)明在干酪中可以提供下列意想不到的技術(shù)效果中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：干酪中的油失作用(oiling-offeffect)減少；干酪產(chǎn)量升高；氣味改進(jìn)；臭味降低；“滑膩的”味道降低。一方面，本發(fā)明部分基于通過(guò)使用脂?；D(zhuǎn)移酶可以提高食品諸如干酪的產(chǎn)量的認(rèn)識(shí)。另外/或者，還可以改進(jìn)食品的氣味、質(zhì)地、氧化穩(wěn)定性、和/或保存期。另外/或者，可以降低食品的膽固醇水平或提高植物甾醇/stanol酯的含量。一方面，本發(fā)明可以提供含有本文定義的脂酰基轉(zhuǎn)移酶的食品添加組合物。另一方面，本發(fā)明可以提供含有本文定義的脂?；D(zhuǎn)移酶的化妝品組合物。另外，本發(fā)明可以提供本文定義的?；D(zhuǎn)移酶用于生產(chǎn)化妝品組合物的。優(yōu)點(diǎn)與親本酶相比，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移酶變體具有下列有利特性中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：1)對(duì)極性脂質(zhì)的活性升高和/或與甘油三脂相比對(duì)極性脂質(zhì)的活性升高；2)對(duì)半乳糖脂（糖脂）的活性升高，諸如二半乳糖基甘油二酯（DGDG）和/或單半乳糖基甘油二酯（MGDG）中的一種或多種；3)對(duì)半乳糖脂（糖脂）的活性與磷脂和/或甘油三脂的活性之比率升高。優(yōu)選的是，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移酶變體對(duì)二半乳糖基甘油二酯（DGDG）和/或單半乳糖基甘油二酯（MGDG）的活性升高。優(yōu)選的是，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移酶變體對(duì)DGDG和/或MGDG的活性升高而對(duì)DGMG和/或MGMG的活性降低。本發(fā)明的轉(zhuǎn)移酶變體對(duì)甘油三脂的活性也可升高。本發(fā)明的轉(zhuǎn)移酶變體對(duì)磷脂（諸如卵磷脂，包括磷脂酰膽堿）的活性也可升高。本發(fā)明的轉(zhuǎn)移酶變體對(duì)甘油三脂和/或甘油一酯和/或甘油二酯的活性可降低。術(shù)語(yǔ)極性脂質(zhì)指通常在生面團(tuán)中發(fā)現(xiàn)的極性脂質(zhì)，優(yōu)選半乳糖脂和磷脂。在用于制作生面團(tuán)或焙烤產(chǎn)品時(shí)，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移酶變體在生面團(tuán)和/或焙烤產(chǎn)品中可能導(dǎo)致下列意想不到的技術(shù)效果中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：生面團(tuán)或焙烤產(chǎn)品（例如面包和/或蛋糕）的比體積改進(jìn)；生面團(tuán)穩(wěn)定性改進(jìn)；面包皮得分改進(jìn)（例如面包皮更薄和/或更脆）；面包屑得分改進(jìn)（例如面包屑分布更加均勻和/或結(jié)構(gòu)更加精細(xì)和/或更加柔軟）；外觀改進(jìn)（例如表面光滑，沒(méi)有泡或洞，或者基本上沒(méi)有泡或洞）；陳舊變慢；軟度升高；氣味改進(jìn)；味道改進(jìn)。分離的一方面，優(yōu)選的是，本發(fā)明所使用的多肽或蛋白質(zhì)是分離形式的。術(shù)語(yǔ)“分離的”指序列至少基本上不含至少一種序列在自然界中天然與之相連且在自然界中發(fā)現(xiàn)天然與之相連的其它成分。純化的一方面，優(yōu)選的是，本發(fā)明所使用的多肽或蛋白質(zhì)是純化形式的。術(shù)語(yǔ)“純化的”指序列處于相對(duì)較純的狀態(tài)－例如至少約51％純、或至少約75％純、或至少約80％純、或至少約90％純、或至少約95％純、或至少約98％純?？寺【幋a依照本發(fā)明的多肽的核苷酸序列可以由生成具有本文定義的具體特性之多肽或適于更改之多肽的任何細(xì)胞或生物體分離編碼所述多肽的核苷酸序列。本領(lǐng)域眾所周知用于分離核苷酸序列的多種方法。例如，可以使用來(lái)自生成多肽的生物體的染色體DNA或信使RNA來(lái)構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫(kù)。如果多肽的氨基酸序列是已知的，那么可以合成經(jīng)標(biāo)記寡核苷酸探針并用于由自生物體制備的基因組文庫(kù)鑒定編碼多肽的克隆?；蛘撸梢詫⒑信c另一種已知多肽基因同源的序列的經(jīng)標(biāo)記寡核苷酸探針用于鑒定編碼多肽的克隆。在后一種情況中，使用較低嚴(yán)謹(jǐn)度的雜交和清洗條件?；蛘?，可以如下鑒定編碼多肽的克?。簩⒒蚪MDNA片段插入表達(dá)載體（諸如質(zhì)粒），用由此得到的基因組DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化酶陰性細(xì)菌，然后將經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)菌涂布在含有受多肽抑制的酶的瓊脂上，從而容許表達(dá)多肽的克隆得到鑒定。又或者，可以通過(guò)已經(jīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)人工合成來(lái)制備編碼多肽的核苷酸序列，例如BeucageS.L.等人，1981，TetrahedronLetters22：1859-1869描述的磷脒(phosphoroamidite)法或Matthes等人，1984，EMBOJ.3：801-805描述的方法。在磷脒法中，對(duì)寡核苷酸進(jìn)行合成（例如在自動(dòng)化DNA合成儀中）、純化、退火、連接、并克隆到合適的載體中。核苷酸序列可以是混合的基因組與合成來(lái)源、混合的合成與cDNA來(lái)源、或混合的基因組與cDNA來(lái)源，它們是依照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)連接合成的、基因組的、或cDNA來(lái)源（根據(jù)需要）的片段而得到的。每一個(gè)連接片段對(duì)應(yīng)于完整核苷酸序列的各個(gè)部分。還可以使用特異引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）來(lái)制備DNA序列，例如US4,683,202或SaikiPK等人，Science1988，239：487-491所述。核苷酸序列本發(fā)明還涵蓋編碼具有本文定義的具體特性之多肽的核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”在用于本文時(shí)指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其變體、同系物、片段、和衍生物（諸如它的一部分）。核苷酸序列可以是基因組、合成、或重組來(lái)源的，可以是雙鏈，或是代表有義鏈或反義鏈的單鏈。術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”在涉及本發(fā)明時(shí)包括基因組DNA、cDNA、合成DNA、和RNA。優(yōu)選的是，它指DNA，更優(yōu)選編碼序列的cDNA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)本身編碼具有本文定義的具體特性之多肽的核苷酸序列在其天然環(huán)境中與其同樣處于天然環(huán)境的天然相關(guān)序列相連時(shí)，本發(fā)明不覆蓋這樣的天然核苷酸序列。為了便于提及，我們將此優(yōu)選實(shí)施方案稱為“非天然核苷酸序列”。在這個(gè)方面，術(shù)語(yǔ)“天然核苷酸序列”指處于其天然環(huán)境且與其同樣處于天然環(huán)境的天然相關(guān)完整啟動(dòng)子可操作連接時(shí)的完整核苷酸序列。由此，可以通過(guò)核苷酸序列在其天然生物體中表達(dá)本發(fā)明的多肽，但是其中核苷酸序列沒(méi)有處在生物體內(nèi)其天然相關(guān)啟動(dòng)子的控制之下。優(yōu)選的是，多肽不是天然多肽。在這個(gè)方面，術(shù)語(yǔ)“天然多肽”指處于其天然環(huán)境且通過(guò)其天然核苷酸序列表達(dá)時(shí)的完整多肽。通常，使用重組DNA技術(shù)來(lái)制備編碼具有本文定義的具體特性之多肽的核苷酸序列（即重組DNA）。然而，在本發(fā)明的一個(gè)備選實(shí)施方案中，可以使用本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)法合成整個(gè)或部分核苷酸序列（見(jiàn)CaruthersMH等人，1980，NucAcidsResSympSer215-23和HornT等人，1980，NucAcidsResSympSer225-232）。分子進(jìn)化一旦分離得到編碼酶的核苷酸序列，或者鑒定得出編碼酶的推定核苷酸序列，可能希望更改選擇的核苷酸序列，例如可能希望對(duì)序列進(jìn)行突變，從而制備依照本發(fā)明的酶?？梢允褂煤铣晒押塑账釋?dǎo)入突變。這些寡核苷酸含有期望突變位點(diǎn)側(cè)翼的核苷酸序列。Morinaga等人，Biotechnology，1984，2：646-649公開(kāi)了一種合適的方法。Nelson和Long，AnalyticalBiochemistry，1989，180：147-151描述了將突變導(dǎo)入編碼酶的核苷酸序列的另一種方法。除了定點(diǎn)誘變（諸如上文所述）以外，可以隨機(jī)導(dǎo)入突變，例如使用商品化試劑盒，諸如購(gòu)自Stratagene的GeneMorphPCR誘變?cè)噭┖谢蛸?gòu)自Clontech的DiversifyPCR隨機(jī)誘變?cè)噭┖小P0583265涉及優(yōu)化基于PCR的誘變的方法，它也可以聯(lián)合使用誘變性DNA類似物，諸如EP0866796所述。錯(cuò)誤傾向PCR技術(shù)適于生成具有優(yōu)選特征的脂?；D(zhuǎn)移酶變體。WO02/06457涉及脂肪酶的分子進(jìn)化。獲取新序列的第三種方法是使用任何數(shù)目的限制酶或諸如DNA酶I等酶將不同的核苷酸序列片段化，并重新裝配成編碼功能性蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)核苷酸序列?；蛘撸梢允褂靡环N或多種不同的核苷酸序列，并在重新裝配全長(zhǎng)核苷酸序列的過(guò)程中導(dǎo)入突變。DNA改組和家族改組技術(shù)適于生成具有優(yōu)選特征的脂?；D(zhuǎn)移酶變體。適于進(jìn)行“改組”的方法見(jiàn)EP0752008、EP1138763、EP1103606。改組還可以聯(lián)合其它DNA誘變形式，正如US6,180,406和WO01/34835中所述。由此，有可能在體內(nèi)或在體外在核苷酸序列中生成大量的定點(diǎn)或隨機(jī)誘變，并隨后通過(guò)多種手段對(duì)編碼的多肽篩選改進(jìn)的功能。可以使用例如insilico和exo介導(dǎo)的重組方法（見(jiàn)WO00/58517、US6,344,328、US6,361,974）來(lái)進(jìn)行分子進(jìn)化，其中所生成的變體保留與已知酶或蛋白質(zhì)的很低同源性。由此獲得的這些變體可能具有與已知轉(zhuǎn)移酶的顯著結(jié)構(gòu)類似性，但是它們具有很低的氨基酸序列同源性。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，還可以將多核苷酸序列的突變或天然變體與野生型或其它突變或天然變體重組，從而生成新的變體。也可以對(duì)這些新的變體篩選所編碼多肽的改進(jìn)的功能性。上述和類似分子進(jìn)化方法的應(yīng)用容許在沒(méi)有關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能的任何現(xiàn)有知識(shí)的條件下鑒定和選擇具有優(yōu)選特征的本發(fā)明酶變體，且容許生成不可預(yù)測(cè)的但有利的突變或變體。分子進(jìn)化在本領(lǐng)域中用于優(yōu)化或改變酶活性的應(yīng)用有許多例子，包括但不限于下列中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：優(yōu)化在宿主細(xì)胞或在體外的表達(dá)和/或活性、提高酶活性、改變底物和/或產(chǎn)物特異性、提高或降低酶或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、改變?cè)趦?yōu)選環(huán)境條件（例如溫度、pH、底物）中的酶活性/特異性。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚知道的，使用分子進(jìn)化工具，可以改變酶，從而改進(jìn)酶的功能。合適的是，本發(fā)明所使用的脂?；D(zhuǎn)移酶可以是變體，即與親本酶相比可以包含至少一處氨基酸替代、刪除或添加。酶變體保留與親本酶的至少25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％同源性。合適的親本酶可以包括具有酯酶或脂肪酶活性的任何酶。優(yōu)選的是，親本酶對(duì)應(yīng)于pfam00657共有序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂?；D(zhuǎn)移酶變體保留或摻入了至少一個(gè)或多個(gè)在GDSX、GANDY、和HPT模塊中發(fā)現(xiàn)的pfam00657共有序列氨基酸殘基?？梢允褂梅肿舆M(jìn)化工具對(duì)酶諸如在水性環(huán)境中具有或沒(méi)有脂?；D(zhuǎn)移酶活性的脂肪酶進(jìn)行突變以導(dǎo)入或增強(qiáng)轉(zhuǎn)移酶活性，由此生成適用于本發(fā)明組合物和方法的具有顯著轉(zhuǎn)移酶活性的脂?；D(zhuǎn)移酶。合適的是，本發(fā)明所使用的脂酰基轉(zhuǎn)移酶可以是對(duì)極性脂質(zhì)（優(yōu)選磷脂和/或糖脂）的酶活性比親本酶升高的變體。優(yōu)選的是，這些變體沒(méi)有或還具有對(duì)溶血極性脂質(zhì)的低活性。對(duì)極性脂質(zhì)、磷脂、和/或糖脂的活性升高可以是水解活性和/或轉(zhuǎn)移酶活性或二者組合的結(jié)果。本發(fā)明所使用的脂酰基轉(zhuǎn)移酶變體對(duì)甘油三脂、和/或甘油一酯和/或甘油二酯的活性可比親本酶降低。合適的是，酶變體可沒(méi)有對(duì)甘油三脂和/或甘油一酯和/或甘油二酯的活性?；蛘?，本發(fā)明所使用的酶變體對(duì)甘油三脂的活性可升高，和/或?qū)ο铝兄械囊环N或多種的活性也升高：極性脂質(zhì)、磷脂、卵磷脂、磷脂酰膽堿、糖脂、二半乳糖基甘油一酯、單半乳糖基甘油一酯。脂?；D(zhuǎn)移酶變體是已知的，而且這些變體中的一種或多種可適用于依照本發(fā)明的方法和用途和/或依照本發(fā)明的酶組合物。僅作為范例，下列參考文獻(xiàn)中描述的脂?；D(zhuǎn)移酶變體可以依照本發(fā)明使用：Hilton和Buckley，JBiol.Chem.1991年1月15日，266(2)：997-1000；Robertson等人，J.Biol.Chem.1994年1月21日，269(3)：2146-50；Brumlik等人，J.Bacteriol1996年4月，178(7)：2060-4；Peelman等人，ProteinSci.1998年3月，7(3)：587-99。氨基酸序列本發(fā)明還涵蓋具有本文定義的具體特性之多肽的氨基酸序列。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列”與術(shù)語(yǔ)“多肽”和/或術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”同義。在有些情況中，術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列”與術(shù)語(yǔ)“肽”同義。可以由合適的來(lái)源制備/分離氨基酸序列，或者可以人工合成，或是可以使用重組DNA技術(shù)來(lái)制備。合適的是，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)由本文講授的分離多肽獲得氨基酸序列。用于由分離多肽測(cè)定氨基酸序列的一種合適方法如下：可以將純化的多肽冷凍-干燥，并且可以將100μg冷凍-干燥的材料溶于50μl8M尿素與0.4M碳酸氫銨的混合液pH8.4。可以使溶解的蛋白質(zhì)于50℃變性并還原15分鐘，隨后覆蓋氮并添加5μl45mM二硫蘇糖醇。冷卻至室溫后，可以添加5μl100mM碘乙酰胺，使得半胱氨酸殘基于室溫在黑暗中在氮中衍生15分鐘?？梢韵蛏鲜龇磻?yīng)混合液中添加135μl水和溶于5μl水的5μg內(nèi)切蛋白酶Lys-C，并于37℃在氮中消化24小時(shí)?？梢酝ㄟ^(guò)反相HPLC在VYDACC18柱（0.46x14cm；10μl；TheSeparationGroup，California，USA）上分離由此產(chǎn)生的肽，使用溶劑A：0.1％溶于水的TFA和溶劑B：0.1％溶于乙腈的TFA。在N端測(cè)序前，可以將選擇的肽在DevelosilC18柱上使用相同的溶劑系統(tǒng)再次進(jìn)行層析?？梢允褂肁ppliedBiosystems476A測(cè)序儀依照制造商的指示（AppliedBiosystems，California，USA）使用脈沖液相快速循環(huán)進(jìn)行測(cè)序。序列同一性或序列同源性本發(fā)明還涵蓋與具有本文定義的具體特性之多肽的氨基酸序列或編碼這種多肽的任何核苷酸序列具有一定程度序列同一性或序列同源性的序列（下文稱為“同源序列”）的用途。在本文中，術(shù)語(yǔ)“同源”指某一實(shí)體與主題氨基酸序列和主題核苷酸序列具有一定同源性。在本文中，術(shù)語(yǔ)“同源性”可以等同于“同一性”。同源氨基酸序列和/或核苷酸序列應(yīng)當(dāng)提供和/或編碼保留酶的功能活性和/或提高酶活性的多肽。在本文中，認(rèn)為同源序列包括與主題序列可以是至少75、85、或90％相同、優(yōu)選至少95或98％相同的氨基酸序列。通常，同系物將包含與主題氨基酸序列相同的活性位點(diǎn)等。盡管同源性也可以看成是相似性（即具有相似化學(xué)特性/功能的氨基酸殘基），在本發(fā)明的內(nèi)容中優(yōu)選將同源性表述成序列同一性。在本文中，認(rèn)為同源序列包括與編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列（主題序列）可以是至少75、85、或90％相同、優(yōu)選至少95或98％相同的核苷酸序列。通常，同系物將包含與主題序列相同的編碼活性位點(diǎn)的序列等。盡管同源性也可以看成是相似性（即具有相似化學(xué)特性/功能的氨基酸殘基），在本發(fā)明的內(nèi)容中優(yōu)選將同源性表述成序列同一性?？梢阅繙y(cè)進(jìn)行同源性比較，或者更常用的是借助易于獲得的序列比較程序。這些商業(yè)性計(jì)算機(jī)程序能夠計(jì)算兩種或多種序列之間的％同源性?？梢詫?duì)毗鄰序列計(jì)算％同源性，即將一種序列與其它序列進(jìn)行對(duì)比，并將一種序列中的每一個(gè)氨基酸與其它序列中的相應(yīng)氨基酸直接進(jìn)行比較，每次一個(gè)殘基。這稱為“無(wú)缺口”對(duì)比。通常，只對(duì)較短數(shù)目的殘基進(jìn)行這種無(wú)缺口對(duì)比。盡管這是一種非常簡(jiǎn)單且可靠的方法，然而它未能考慮例如在其它方面相同的成對(duì)序列中一個(gè)插入或刪除將引起后面的氨基酸殘基無(wú)法進(jìn)行對(duì)比，由此可能導(dǎo)致在進(jìn)行整體對(duì)比時(shí)％同源性大大降低。因此，大多數(shù)序列比較方法設(shè)計(jì)成在考慮到可能的插入和刪除的情況下生成最佳對(duì)比，不過(guò)度處罰整體同源性得分。這是通過(guò)在序列對(duì)比中插入“缺口”以設(shè)法使局部同源性最大化而實(shí)現(xiàn)的。然而，這些更加復(fù)雜的方法給對(duì)比中發(fā)生的每個(gè)缺口賦予“缺口罰分”，使得對(duì)于相同數(shù)目的相同氨基酸而言，具有盡可能少的缺口的序列對(duì)比（反應(yīng)了兩種比較序列之間的較高相關(guān)性）將獲得比具有更多缺口的其它序列對(duì)比更高的得分。通常使用“仿射缺口代價(jià)(Affinegapcosts)”，即對(duì)缺口的存在處以較高代價(jià)，而對(duì)缺口中的每一個(gè)后續(xù)殘基處以較小罰分。這是最常用的缺口評(píng)分系統(tǒng)。高缺口罰分當(dāng)然將以較少缺口生成優(yōu)化對(duì)比。大多數(shù)對(duì)比程序容許更改缺口罰分。然而，在使用這種軟件進(jìn)行序列比較時(shí)，優(yōu)選使用缺省值(defaultvalue)。例如在使用GCGWisconsinBestfit軟件包時(shí)，氨基酸序列的缺省缺口罰分(defaultgappenalty)是缺口-12且每個(gè)延伸為-4。因此，最大％同源性的計(jì)算首先需要生成最佳對(duì)比，其中要考慮缺口罰分。適用于進(jìn)行這種對(duì)比的一種計(jì)算機(jī)程序是GCGWisconsinBestfit軟件包（Devereux等人，1984，Nuc.AcidsResearch，12：387）?？梢赃M(jìn)行序列比較的其它軟件的實(shí)例包括但不限于BLAST軟件包（見(jiàn)Ausubel等人，1999，ShortProtocolsinMolecularBiology，第4版，第18章）、FASTA（Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.403-410）、和GENEWORKS比較工具套。BLAST和FASTA都能進(jìn)行離線和在線搜索（見(jiàn)Ausubel等人，1999，7.58-7.60）。然而，對(duì)于有些應(yīng)用，優(yōu)選使用GCGBestfit程序。還可以使用稱為BLAST2Sequences的一種新工具來(lái)比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列（見(jiàn)FEMSMicrobiolLett1999，174(2)：247-50；FEMSMicrobiolLett1999，177(1)：187-8，及tatiana＠ncbi.nlm.nih.gov）。盡管最終的％同源性可以根據(jù)同一性進(jìn)行測(cè)量，然而對(duì)比過(guò)程自身通常不是基于“全是或全非”成對(duì)比較。而是，通常使用尺度相似性評(píng)分矩陣根據(jù)化學(xué)相似性或進(jìn)化距離給每對(duì)比較賦予得分。常用的這種矩陣的一個(gè)實(shí)例是BLOSUM62矩陣－BLAST程序套的缺省矩陣。GCGWisconsin程序通常使用公開(kāi)的缺省值或定制的符號(hào)比較表（如果提供的話）（進(jìn)一步的細(xì)節(jié)見(jiàn)用戶手冊(cè)）。對(duì)于有些應(yīng)用，優(yōu)選使用GCG軟件包的公開(kāi)缺省值，或者在其它軟件的情況中，使用缺省矩陣，諸如BLOSUM62?；蛘?，可以使用以與CLUSTAL（HigginsDG和SharpPM，1988，Gene73(1)：237-244）類似的算法為基礎(chǔ)的DNASISTM（HitachiSoftware）中的多重對(duì)比特征來(lái)計(jì)算％同源性。一旦軟件生成了最佳對(duì)比，就有可能計(jì)算％同源性，優(yōu)選％序列同一性。軟件通常作為序列比較的一部分來(lái)執(zhí)行它，并生成一個(gè)數(shù)值結(jié)果。序列還可以具有生成沉默改變并導(dǎo)致功能等同物的氨基酸殘基刪除、插入、或替代?？梢愿鶕?jù)殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性、和/或兩親性本質(zhì)進(jìn)行審慎的氨基酸替代，只要保留物質(zhì)的次要結(jié)合活性。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；而具有不帶電荷的極性頭基團(tuán)（具有相似親水值）的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、和酪氨酸?？梢赃M(jìn)行保守替代，例如依照下表。第二列同一塊中、優(yōu)選第三列同一行中的氨基酸可以互相替代。本發(fā)明還涵蓋可以發(fā)生的同源替代（替代和替換在本文中都用于指用備選氨基酸交換現(xiàn)有氨基酸），即相似替代，諸如堿性替代堿性、酸性替代酸性、極性替代極性等。也可以發(fā)生非同源替代，即由一類殘基變成另一類，或者牽涉非天然氨基酸，諸如鳥(niǎo)氨酸（下文稱為Z）、二氨基丁酸鳥(niǎo)氨酸（下文稱為B）、正亮氨酸鳥(niǎo)氨酸（下文稱為O）、吡啶丙氨酸(pyriylalanine)、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸、和苯甘氨酸。還可以用非天然氨基酸進(jìn)行替換。氨基酸序列變體可以包含合適的間隔基團(tuán)，它可以插入序列的任何兩個(gè)氨基酸殘基之間，除了氨基酸間隔物諸如甘氨酸或β-丙氨酸殘基以外，還包括烷基，諸如甲基、乙基、或丙基。變異的另一種形式牽涉類肽（peptoid）形式的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的存在，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員充分理解的。為了避免疑惑，“類肽形式”用于指氨基酸殘基變體，其中α-碳取代基位于殘基的氮原子上而非α-碳原子。用于制備類肽形式的肽的方法在本領(lǐng)域是已知的，例如SimonRJ等人，PNAS，1992，89(20)：9367-9371；以及HorwellDC，TrendsBiotechnol.1995，13(4)：132-134。本發(fā)明所使用的或編碼具有本文定義的具體特性之多肽的核苷酸序列可以在其中包含合成的或修飾的核苷酸。本領(lǐng)域知道許多對(duì)寡核苷酸的不同類型修飾。這些修飾包括甲基膦酸酯（methylphosphonate）和硫代磷酸酯（phosphorothioate）主鏈和/或在分子的3'和/或5'端添加吖啶或多賴氨酸鏈。出于本發(fā)明的目的，應(yīng)當(dāng)理解可以通過(guò)本領(lǐng)域可利用的任何方法修飾本文所述核苷酸序列。可以為了增強(qiáng)核苷酸序列的體內(nèi)活性或壽命而進(jìn)行這些修飾。本發(fā)明還涵蓋與本文所述序列或其任何衍生物、片段、或衍生物互補(bǔ)的核苷酸序列的用途。如果序列與其片段互補(bǔ)，那么該序列可用作探針，用于在其它生物體中鑒定相似編碼序列等?？梢砸远喾N方式獲得與本發(fā)明序列不是100％同源但屬于本發(fā)明范圍的多核苷酸。可以通過(guò)例如探查由一群個(gè)體例如來(lái)自不同人群的個(gè)體制備的DNA文庫(kù)來(lái)獲得本文所述序列的其它變體。另外，可以獲得其它病毒/細(xì)菌或細(xì)胞同系物，特別是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞（例如大鼠、小鼠、牛、和靈長(zhǎng)類細(xì)胞）中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞同系物，而且這些同系物及其片段一般能夠與本文序列表中所示序列發(fā)生選擇性雜交?？梢酝ㄟ^(guò)由其它動(dòng)物物種制備cDNA文庫(kù)或基因組DNA文庫(kù)并在中等至高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下用包含所附序列表中任一種序列的完整或部分序列的探針探查這些文庫(kù)來(lái)獲得這些序列。類似考慮應(yīng)用于獲得本發(fā)明多肽或核苷酸序列的物種同系物和等位基因變體。還可以使用簡(jiǎn)并PCR獲得變體和株系/物種同系物，其中所用引物的序列設(shè)計(jì)成靶向變體和同系物中編碼本發(fā)明序列中的保守氨基酸序列的序列。可以通過(guò)例如對(duì)比來(lái)自幾個(gè)變體/同系物的氨基酸序列來(lái)預(yù)測(cè)保守序列。可以使用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)軟件來(lái)進(jìn)行序列對(duì)比。例如廣泛使用GCGWisconsinPileUp程序。簡(jiǎn)并PCR所使用的引物將包含一個(gè)或多個(gè)簡(jiǎn)并位置，而且將用于比用針對(duì)已知序列的單一序列引物克隆序列時(shí)更低的嚴(yán)謹(jǐn)條件?；蛘?，可以通過(guò)已鑒定序列的定點(diǎn)誘變來(lái)獲得這些多核苷酸。這在例如為了多核苷酸序列將要在其中表達(dá)的特定宿主細(xì)胞而需要沉默密碼子序列改變來(lái)優(yōu)化密碼子偏愛(ài)性時(shí)可能是有用的。為了導(dǎo)入限制性多肽識(shí)別位點(diǎn)或改變由多核苷酸編碼的多肽的特性或功能，可能還需要其它序列改變。本發(fā)明的多核苷酸（核苷酸序列）可用于生成引物，例如PCR引物，用于進(jìn)行備選擴(kuò)增反應(yīng)的引物，探針，例如使用放射性或非放射性標(biāo)記物通過(guò)常規(guī)方法用顯現(xiàn)標(biāo)記物標(biāo)記的探針，或者可以將多核苷酸克隆到載體中。這些引物、探針、和其它片段的長(zhǎng)度將是至少15個(gè)、優(yōu)選至少20個(gè)、例如至少25個(gè)、30個(gè)、或40個(gè)核苷酸，而且同樣由本文所使用的本發(fā)明術(shù)語(yǔ)多核苷酸所涵蓋?？梢灾亟M、合成、或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的任何手段來(lái)生成依照本發(fā)明的多核苷酸，諸如DNA多核苷酸和探針。還可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)它們進(jìn)行克隆。一般而言，將通過(guò)合成手段來(lái)生成引物，牽涉逐步制造期望的核酸序列，每次一個(gè)核苷酸。使用自動(dòng)化技術(shù)實(shí)現(xiàn)這一目的的技術(shù)在本領(lǐng)域是易于獲得的。通常使用重組方法例如PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）克隆技術(shù)來(lái)生成較長(zhǎng)的多核苷酸。這將牽涉制造期望克隆的脂質(zhì)靶向序列區(qū)域側(cè)翼的一對(duì)引物（例如約15至30個(gè)核苷酸），使引物與由動(dòng)物或人類細(xì)胞獲得的mRNA或cDNA接觸，在擴(kuò)增期望區(qū)域的條件下進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，分離擴(kuò)增的片段（例如通過(guò)在瓊脂糖凝膠上純化反應(yīng)混合液），并回收擴(kuò)增的DNA。引物可以設(shè)計(jì)成包含合適的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，從而能夠?qū)U(kuò)增的DNA克隆到合適的克隆載體中。雜交本發(fā)明還涵蓋與本發(fā)明的序列互補(bǔ)的序列或是能夠與本發(fā)明的序列或其互補(bǔ)序列發(fā)生雜交的序列。術(shù)語(yǔ)“雜交”在用于本文時(shí)應(yīng)當(dāng)包括“一條核酸鏈與一條互補(bǔ)鏈通過(guò)堿基配對(duì)而結(jié)合的過(guò)程”，以及在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)中進(jìn)行的擴(kuò)增過(guò)程。本發(fā)明還涵蓋能夠與本文討論的主題序列或其任何衍生物、片段、或衍生物的互補(bǔ)序列發(fā)生雜交的核苷酸序列的用途。本發(fā)明還涵蓋能夠與本文討論的核苷酸序列發(fā)生雜交的序列的互補(bǔ)序列。雜交條件是以核苷酸結(jié)合復(fù)合物的溶化溫度（Tm）為基礎(chǔ)的，正如Berger和Kimmel（1987，GuidetoMolecularCloningTechniques，MethodsinEnzymology，Vol.152，AcademicPress，SanDiego，CA）中講授的，而且賦予限定的“嚴(yán)謹(jǐn)度”，正如下文所解釋的。最高嚴(yán)謹(jǐn)度通常發(fā)生于約Tm-5℃（比探針的Tm低5℃）；高嚴(yán)謹(jǐn)度發(fā)生于比Tm低約5℃至10℃；中等嚴(yán)謹(jǐn)度發(fā)生于比Tm低約10℃至20℃；而低嚴(yán)謹(jǐn)度發(fā)生于比Tm低約20℃至25℃。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，最高嚴(yán)謹(jǐn)度的雜交可用于鑒定或檢測(cè)相同核苷酸序列，而中等（或低）嚴(yán)謹(jǐn)度的雜交可用于鑒定或檢測(cè)相似或相關(guān)多核苷酸序列。優(yōu)選的是，本發(fā)明涵蓋能夠在高嚴(yán)謹(jǐn)度條件或中等嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與編碼多肽的核苷酸序列發(fā)生雜交的序列的互補(bǔ)序列，所述多肽具有本文定義的具體特性。更優(yōu)選的是，本發(fā)明涵蓋能夠在高嚴(yán)謹(jǐn)度條件（例如65℃和0.1xSSC{1xSSC=0.15MNaCl、0.015M檸檬酸鈉pH7.0}）下與編碼多肽的核苷酸序列發(fā)生雜交的序列的互補(bǔ)序列，所述多肽具有本文定義的具體特性。本發(fā)明還涉及能夠與本文討論的核苷酸序列（包括本文討論的那些序列的互補(bǔ)序列）發(fā)生雜交的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及能夠與本文討論的核苷酸序列（包括本文討論的那些序列的互補(bǔ)序列）發(fā)生雜交的序列的互補(bǔ)核苷酸序列。本發(fā)明的范圍還包括能夠在中等至最高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與本文討論的核苷酸序列發(fā)生雜交的多核苷酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明覆蓋能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件（例如50℃和0.2xSSC）下與本文討論的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列發(fā)生雜交的核苷酸序列。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，本發(fā)明覆蓋能夠在高嚴(yán)謹(jǐn)條件（例如65℃和0.1xSSC）下與本文討論的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列發(fā)生雜交的核苷酸序列。多肽的表達(dá)可以將本發(fā)明所使用的或用于編碼具有本文定義的具體特性之多肽的核苷酸序列摻入重組復(fù)制載體。載體可用于在相容宿主細(xì)胞中和/或由相容宿主細(xì)胞復(fù)制和表達(dá)所述核苷酸序列（以多肽的形式）。可以使用控制序列來(lái)控制表達(dá)，包括啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和其它表達(dá)調(diào)控信號(hào)。可以使用原核啟動(dòng)子和在真核細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子。可以使用組織特異的或刺激特異的啟動(dòng)子。還可以使用嵌合啟動(dòng)子，它包括來(lái)自兩種或更多上文所述不同啟動(dòng)子的序列元件。根據(jù)使用的序列和/或載體，由宿主重組細(xì)胞通過(guò)表達(dá)核苷酸序列而生成的多肽可以是分泌的，或者是包含在細(xì)胞內(nèi)的。編碼序列可以設(shè)計(jì)成含有信號(hào)序列，它指導(dǎo)實(shí)質(zhì)編碼序列分泌穿過(guò)特定原核或真核細(xì)胞膜。表達(dá)載體術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”指能夠在體內(nèi)或在體外進(jìn)行表達(dá)的構(gòu)建物。優(yōu)選的是，將表達(dá)載體摻入生物體的基因組。術(shù)語(yǔ)“摻入”優(yōu)選覆蓋穩(wěn)定的摻入基因組。本發(fā)明的或編碼具有本文定義的具體特性之多肽的核苷酸序列可以存在于載體中，其中核苷酸序列可操作連接調(diào)控序列，使得調(diào)控序列能夠通過(guò)合適的宿主生物體提供核苷酸序列的表達(dá)，即載體是表達(dá)載體。可以如下文所述將本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化到合適的宿主細(xì)胞中，從而提供具有本文定義的具體特性之多肽的表達(dá)。載體的選擇常常取決于它將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞，例如質(zhì)粒、粘粒、病毒、或噬菌體載體。載體可以含有一種或多種選擇標(biāo)記基因，諸如賦予抗生素抗性的基因，例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、或四環(huán)素抗性?；蛘?，可以通過(guò)共轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)行選擇（如WO91/17243中所述）?？梢栽隗w外使用載體，例如用于生成RNA或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。由此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將核苷酸序列導(dǎo)入復(fù)制載體，將載體導(dǎo)入相容宿主細(xì)胞，并在促使載體復(fù)制的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的核苷酸序列或編碼具有本文定義的具體特性之多肽的核苷酸序列的方法。載體還可以包含使得載體能夠在所討論宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的核苷酸序列。這些序列的實(shí)例有質(zhì)粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、和pIJ702的復(fù)制起點(diǎn)。調(diào)控序列在有些應(yīng)用中，本發(fā)明所使用的核苷酸序列或編碼具有本文定義的具體特性之多肽的核苷酸序列可以可操作連接調(diào)控序列，它能夠通過(guò)諸如選擇的宿主細(xì)胞提供核苷酸序列的表達(dá)。例如，本發(fā)明覆蓋包含本發(fā)明核苷酸序列且其與這種調(diào)控序列可操作連接的載體，即載體是表達(dá)載體。術(shù)語(yǔ)“可操作連接”指位置毗鄰，其中所述組件的相互關(guān)系容許它們以其計(jì)劃方式發(fā)揮功能。與編碼序列可操作連接的調(diào)控序列的連接方式使得能夠在與控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)編碼序列的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子和其它表達(dá)調(diào)控信號(hào)。術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”采用本領(lǐng)域常用含義，例如RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。還可以選擇異源調(diào)控區(qū)，例如啟動(dòng)子、分泌前導(dǎo)序列、和終止子區(qū)，從而實(shí)現(xiàn)編碼具有本文定義的具體特性之酶的核苷酸序列的表達(dá)提高。優(yōu)選的是，本發(fā)明的核苷酸序列可以可操作連接至少一個(gè)啟動(dòng)子。適于指導(dǎo)核苷酸序列在細(xì)菌、真菌、或酵母宿主中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的實(shí)例在本領(lǐng)域是眾所周知的。構(gòu)建物術(shù)語(yǔ)“構(gòu)建物”（與諸如“偶聯(lián)物”、“盒”、和“雜合物”等術(shù)語(yǔ)同義）包含依照本發(fā)明使用的編碼具有本文定義的具體特性之多肽的核苷酸序列且其直接或間接與啟動(dòng)子相連。間接相連的實(shí)例在本發(fā)明的啟動(dòng)子和核苷酸序列之間提供合適的間隔區(qū)，諸如內(nèi)含子序列，諸如Sh1內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子。術(shù)語(yǔ)“融合”在本發(fā)明中也是如此，包括直接或間接相連。在有些情況中，該術(shù)語(yǔ)不覆蓋編碼通常與野生型基因啟動(dòng)子相連的蛋白質(zhì)之核苷酸序列的天然組合，以及當(dāng)它們都處于其天然環(huán)境中時(shí)。構(gòu)建物甚至可以包含或表達(dá)容許選擇基因構(gòu)建物的標(biāo)記。對(duì)于有些應(yīng)用，優(yōu)選的是，構(gòu)建物包含至少一種本發(fā)明的核苷酸序列或編碼具有本文定義的具體特性之多肽的核苷酸序列且其可操作連接啟動(dòng)子。宿主細(xì)胞術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”在涉及本發(fā)明時(shí)包括包含編碼具有本文定義的具體特性之多肽的核苷酸序列或上文所述表達(dá)載體且用于重組生產(chǎn)具有本文定義的具體特性之多肽的任何細(xì)胞。由此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了經(jīng)本發(fā)明的核苷酸序列或表達(dá)具有本文定義的具體特性之多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。將要選擇與所述載體相容的細(xì)胞，可以是例如原核（例如細(xì)菌）、真菌、酵母、或植物細(xì)胞。優(yōu)選的是，宿主細(xì)胞不是人類細(xì)胞。合適的細(xì)菌宿主生物體的實(shí)例有革蘭氏陰性細(xì)菌或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。根據(jù)編碼具有本文定義的具體特性之多肽的核苷酸序列的本質(zhì)和/或進(jìn)一步加工所表達(dá)蛋白質(zhì)的愿望，真核宿主可能是優(yōu)選的，諸如酵母或其它真菌。一般而言，酵母細(xì)胞比真菌細(xì)胞更加優(yōu)選，因?yàn)樗鼈円子诓僮?。然而，有些蛋白質(zhì)或是難以由酵母細(xì)胞分泌，或是在有些情況中難以正確加工（例如在酵母中過(guò)度糖基化）。在這些情況中，應(yīng)當(dāng)選擇不同的真菌宿主生物體。使用合適的宿主細(xì)胞，諸如酵母、真菌、和植物宿主細(xì)胞，可以提供翻譯后修飾（例如肉豆蔻?；?、糖基化、截短、lapidation、以及酪氨酸、絲氨酸、或蘇氨酸磷酸化），這可能是賦予本發(fā)明重組表達(dá)產(chǎn)物以最佳生物學(xué)活性所需要的。宿主細(xì)胞可以是蛋白酶缺陷的或蛋白酶減除的菌株。生物體術(shù)語(yǔ)“生物體”在涉及本發(fā)明時(shí)包括能夠包含依照本發(fā)明的核苷酸序列或編碼具有本文定義的具體特性之多肽的核苷酸序列和/或由其獲得的產(chǎn)物的任何生物體。合適的生物體可以包括原核生物、真菌、酵母、或植物。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因生物體”在涉及本發(fā)明時(shí)包括包含編碼具有本文定義的具體特性之多肽的核苷酸序列和/或由其獲得的產(chǎn)物和/或其中啟動(dòng)子能夠容許編碼具有本文定義的具體特性之多肽的核苷酸序列在生物體內(nèi)表達(dá)的任何生物體。優(yōu)選的是，將核苷酸序列摻入生物體的基因組。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因生物體”不覆蓋處于其天然環(huán)境中的天然核苷酸編碼序列，此時(shí)它們處于其天然啟動(dòng)子的控制之下，而后者同樣處于其天然環(huán)境中。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物體包括包含編碼具有本文定義的具體特性之多肽的核苷酸序列、本文定義的構(gòu)建物、本文定義的載體、本文定義的質(zhì)粒、本文定義的細(xì)胞、或其產(chǎn)物中的任何一種或組合的生物體。例如，轉(zhuǎn)基因生物體還可以包含編碼具有本文定義的具體特性之多肽的核苷酸序列且其處于異源啟動(dòng)子的控制之下。宿主細(xì)胞/生物體的轉(zhuǎn)化如上所述，宿主生物體可以是原核或真核生物體。合適的原核宿主的實(shí)例包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。關(guān)于原核宿主轉(zhuǎn)化的講授在本領(lǐng)域有很好的記錄，例如見(jiàn)Sambrook等人（MolecularCloning:ALaboratoryManual，第2版，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress）。如果使用原核宿主，那么核苷酸序列可能需要在轉(zhuǎn)化前進(jìn)行合適的修改，諸如清除內(nèi)含子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因生物體可以是酵母?？梢允褂帽绢I(lǐng)域知道的多種方法轉(zhuǎn)化絲狀真菌細(xì)胞，諸如包括以已知方式形成原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，隨后再生細(xì)胞壁的過(guò)程。EP0238023描述了使用曲霉作為宿主微生物體。另一種宿主生物體可以是植物。關(guān)于轉(zhuǎn)化植物的一般技術(shù)的綜述見(jiàn)Potrykus（AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol1991，42：205-225）和Christou（Agro-Food-IndustryHi-Tech，1994年3月/4月，17-27）的論文。關(guān)于植物轉(zhuǎn)化的其它講授見(jiàn)EP-A-0449375。下面的部分介紹了關(guān)于轉(zhuǎn)化真菌、酵母、和植物的一般教導(dǎo)。經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌宿主生物體可以是細(xì)菌，諸如鏈霉菌、枯草芽孢桿菌、或大腸桿菌。WO04/064537中公開(kāi)了適于在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)的方法。WO02/214490中公開(kāi)了適于在芽孢桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)的方法。合適的細(xì)菌宿主生物體的實(shí)例是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌物種，諸如芽孢桿菌科（Bacillaceae），包括枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）、遲緩芽孢桿菌（Bacilluslentus）、短芽孢桿菌（Bacillusbrevis）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillusstearothermophilus）、嗜堿芽孢桿菌（Bacillusalkalophilus）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）、凝結(jié)芽孢桿菌（Bacilluscoagulans）、燦爛芽孢桿菌（Bacilluslautus）、巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）、和蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）；鏈霉菌屬物種，諸如鼠灰鏈霉菌（Streptomycesmurinus）；乳酸菌物種，包括乳球菌屬（Lactococcus）諸如乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）、乳桿菌屬（Lactobacillus）包括路氏乳桿菌（Lactobacillusreuteri）；明串珠菌屬（Leuconostoc）；片球菌屬（Pediococcus）；和鏈球菌屬（Streptococcus）。或者，可以選擇屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）包括大腸桿菌或假單胞菌科（Pseudomonadaceae）的革蘭氏陰性細(xì)菌物種的菌株作為宿主生物體。經(jīng)轉(zhuǎn)化的真菌宿主生物體可以是真菌，諸如絲狀真菌。合適的這種宿主的實(shí)例包括屬于Thermomyces屬、支頂孢屬（Acremonium）、曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、毛霉屬（Mucor）、鏈孢霉屬（Neurospora）、木霉屬（Trichoderma）、諸如此類的任何成員。講授絲狀真菌轉(zhuǎn)化的綜述見(jiàn)US-A-5741665，它聲明用于轉(zhuǎn)化絲狀真菌和培養(yǎng)真菌的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的。關(guān)于應(yīng)用于粗糙鏈孢霉（N.crassa）的技術(shù)的綜述見(jiàn)例如Davis和deSerres，MethodsEnzymol1971，17A：79-143。關(guān)于轉(zhuǎn)化絲狀真菌的其它技術(shù)的綜述見(jiàn)US-A-5674707。在一個(gè)方面，宿主生物體可以是曲霉屬的，諸如黑曲霉（Aspergillusniger）。還可以通過(guò)遵循例如MartinelliS.D.、KinghornJ.R.編的《Aspergillus:50yearson.Progressinindustrialmicrobiology》（vol29，ElsevierAmsterdam1944，p641-666）中TurnerG（1944）著的“Vectorsforgeneticmanipulation”的講授來(lái)制備依照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因曲霉。關(guān)于絲狀真菌中的基因表達(dá)的綜述見(jiàn)Punt等人，2002，TrendsBiotechnol2002年5月，20(5)：200-6；Archer和Peberdy，CritRevBiotechnol1997，17(4)：273-306。經(jīng)轉(zhuǎn)化的酵母在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因生物體可以是酵母。關(guān)于異源基因在酵母中表達(dá)的原理的綜述見(jiàn)例如MethodsMolBiol1995，49：341-54和CurrOpinBiotechnol1997年10月，8(5)：554-60。在這個(gè)方面，可以使用酵母作為異源基因表達(dá)的載體，諸如啤酒糖酵母或巴斯德畢赤酵母氏酵母（見(jiàn)FEMSMicrobiolRev2000，24(1)：45-66）。關(guān)于在啤酒糖酵母中表達(dá)異源基因和分泌基因產(chǎn)物的原理的綜述見(jiàn)EHinchcliffe和EKenny，1993，“Yeaseasavehiclefortheexpressionofheterologousgenes”，Yeast，Vol.5，AnthonyHRose和JStuartHarrison編，第2版，AcademicPress有限公司。關(guān)于酵母的轉(zhuǎn)化，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了數(shù)種轉(zhuǎn)化方案。例如，可以通過(guò)遵循Hinnen等人，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceoftheUSA，75：1929；Beggs,JD，1978，Nature，London，275：104；和Ito,I等人，1983，JBacteriology，153：163-168的講授來(lái)制備依照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因糖酵母?？梢允褂枚喾N選擇標(biāo)記來(lái)選擇經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞，諸如營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記和顯性抗生素抗性標(biāo)記。可以由生物技術(shù)相關(guān)酵母物種選擇合適的酵母宿主生物體，諸如但不限于選自畢赤氏酵母屬（Pichia）、漢遜氏酵母屬（Hansenula）、克魯維氏酵母屬（Kluyveromyces）、Yarrowinia、糖酵母屬（Saccharomyces）（包括啤酒糖酵母S.cerevisiae）、或裂殖糖酵母屬（Schizosaccharomyce）（包括粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycepombe)）的酵母物種?？梢允褂眉谆鶢I(yíng)養(yǎng)酵母物種巴斯德畢赤氏酵母（Pichiapastoris）作為宿主生物體。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主生物體可以是漢遜氏酵母屬的物種，諸如多形漢遜氏酵母（H.polymorpha）（如WO01/39544中所述）。經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物/植物細(xì)胞適于本發(fā)明的宿主生物體可以是植物。關(guān)于一般技術(shù)的綜述可以見(jiàn)Potrykus（AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol1991，42：205-225）和Christou（Agro-Food-IndustryHi-Tech，1994年3月/4月，17-27）的論文或WO01/16308。例如，轉(zhuǎn)基因植物可能以升高的水平生成植物甾醇酯和phytostanol酯。因此，本發(fā)明還涉及用于生成植物甾醇酯和phytostanol酯水平升高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括用本文定義的脂?；D(zhuǎn)移酶（特別是包含本文定義的脂酰基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)載體或構(gòu)建物）轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并由經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞培育植株的步驟。分泌通常希望表達(dá)宿主將多肽分泌到培養(yǎng)基中，由此可以更加容易地回收酶。依照本發(fā)明，可以根據(jù)期望的表達(dá)宿主來(lái)選擇分泌前導(dǎo)序列。雜合信號(hào)序列也可用于本發(fā)明的內(nèi)容。異源分泌前導(dǎo)序列的典型實(shí)例有來(lái)自真菌淀粉葡糖苷酶（AG）基因（glaA－18和24個(gè)氨基酸的兩種形式，例如來(lái)自曲霉屬）、α-因子基因（酵母，例如糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、和漢遜氏酵母）、或α-淀粉酶基因（芽孢桿菌屬）的分泌前導(dǎo)序列。檢測(cè)本領(lǐng)域已知用于檢測(cè)和測(cè)量氨基酸序列表達(dá)的多個(gè)方案。實(shí)例包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）、放射免疫測(cè)定法（RIA）、和熒光激活細(xì)胞分揀術(shù)（FACS）。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道多種標(biāo)記物和偶聯(lián)技術(shù)，它們可用于多種核酸和氨基酸測(cè)定法。許多公司，諸如PharmaciaBiotech（Piscataway，NJ）、Promega（Madison，WI）、和USBiochemicalCorp（Cleveland，OH），供應(yīng)這些流程的商品化試劑盒和方案。合適的報(bào)道分子或標(biāo)記物包括那些放射性核素、酶、熒光、化學(xué)發(fā)光、或顯色劑，以及底物、輔因子、抑制劑、磁性粒子、諸如此類。講授這些標(biāo)記物的用途的專利包括US-A-3,817,837、US-A-3,850,752、US-A-3,939,350、US-A-3,996,345、US-A-4,277,437、US-A-4,275,149、和US-A-4,366,241。同樣，可以如US-A-4,816,567中所述生成重組免疫球蛋白。融合蛋白可以以融合蛋白的形式生成具有本文定義的具體特性的多肽，例如以便于它的提取和純化。融合蛋白配偶體的實(shí)例包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、6xHis、GAL4（DNA結(jié)合和/或轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域）、和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶體與目的蛋白序列之間包含蛋白水解切割位點(diǎn)從而能夠切除融合蛋白序列也是方便的。優(yōu)選的是，融合蛋白將不會(huì)妨礙蛋白序列的活性。關(guān)于大腸桿菌中的基因融合表達(dá)系統(tǒng)的綜述見(jiàn)Curr.Opin.Biotechnol.1995，6(5)：501-6。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將具有本文定義的具體特性的多肽的氨基酸序列與異源序列相連，從而編碼融合蛋白。例如，為了對(duì)肽庫(kù)篩選能夠影響實(shí)質(zhì)活性的試劑，編碼這樣的嵌合物可能是有用的，即它表達(dá)受到商品化抗體識(shí)別的異源表位。下面將參考附圖和實(shí)施例描述本發(fā)明，僅作為范例。附圖描述圖1顯示了來(lái)自第6版數(shù)據(jù)庫(kù)的pfam00657共有序列（SEQIDNo.1）。圖2顯示了由生物體嗜水氣單胞菌獲得的氨基酸序列（SEQIDNo.2）（P10480；GI:121051）。此氨基酸序列是可以作為依照本發(fā)明的親本酶的參考酶。圖3顯示了由生物體殺鮭氣單胞菌獲得的氨基酸序列（SEQIDNo.3）（AAG098404；GI:9964017）。圖4顯示了由生物體天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)獲得的氨基酸序列（SEQIDNo.4）（基因庫(kù)編號(hào)：NP_631558）。圖5顯示了由生物體天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)獲得的氨基酸序列（SEQIDNo.5）（基因庫(kù)編號(hào)：CAC42140）。圖6顯示了由生物體啤酒糖酵母獲得的氨基酸序列（SEQIDNo.6）（基因庫(kù)編號(hào)：P41734）。圖7顯示了選定序列與pfam00657共有序列的對(duì)比。圖8顯示了SEQIDNo.3與SEQIDNo.2的成對(duì)對(duì)比，顯示93％的氨基酸序列同一性。信號(hào)序列標(biāo)以下劃線。+指示差異。標(biāo)出了含有活性位點(diǎn)絲氨酸16的GDSX基序以及活性位點(diǎn)天冬氨酸116和組氨酸291（見(jiàn)陰影區(qū)）。氨基酸后的編號(hào)已減去信號(hào)序列。圖9顯示了編碼由生物體嗜水氣單胞菌獲得的依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列（SEQIDNo.7）。圖10顯示了編碼由生物體殺鮭氣單胞菌獲得的依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列（SEQIDNo.8）。圖11顯示了編碼由生物體天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)獲得的依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶（基因庫(kù)編號(hào)NC_003888.1:8327480..8328367）的核苷酸序列（SEQIDNo.9）。圖12顯示了編碼由生物體天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)獲得的依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶（基因庫(kù)編號(hào)AL939131.1:265480..266367）的核苷酸序列（SEQIDNo.10）。圖13顯示了編碼由生物體啤酒糖酵母獲得的依照本發(fā)明的脂?；D(zhuǎn)移酶（基因庫(kù)編號(hào)Z75034）的核苷酸序列（SEQIDNo.11）。圖14顯示了由生物體雷爾氏菌獲得的氨基酸序列（SEQIDNo.12）（基因庫(kù)編號(hào)：AL646052）。圖15顯示了編碼由生物體雷爾氏菌獲得的依照本發(fā)明的脂酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列（SEQIDNo.13）。圖16顯示了氨基酸序列SEQIDNo.14。Scoe1NCBI蛋白質(zhì)編號(hào)CAB39707.1GI:4539178保守假定蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)]。圖17顯示了編碼Scoe1NCBI蛋白質(zhì)編號(hào)CAB39707.1GI:4539178保守假定蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)]的核苷酸序列SEQIDNo.15。圖18顯示了氨基酸序列SEQIDNo.16。Scoe2NCBI蛋白質(zhì)編號(hào)CAC01477.1GI:9716139保守假定蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)]。圖19顯示了編碼Scoe2NCBI蛋白質(zhì)編號(hào)CAC01477.1GI:9716139保守假定蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)]的核苷酸序列SEQIDNo.17。圖20顯示了氨基酸序列SEQIDNo.18。Scoe3NCBI蛋白質(zhì)編號(hào)CAB88833.1GI:7635996推定分泌蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)]。圖21顯示了編碼Scoe3NCBI蛋白質(zhì)編號(hào)CAB88833.1GI:7635996推定分泌蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)]的核苷酸序列SEQIDNo.19。圖22顯示了氨基酸序列SEQIDNo.20。Scoe4NCBI蛋白質(zhì)編號(hào)CAB89450.1GI:7672261推定分泌蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)]。圖23顯示了編碼Scoe4NCBI蛋白質(zhì)編號(hào)CAB89450.1GI:7672261推定分泌蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)]的核苷酸序列SEQIDNo.21。圖24顯示了氨基酸序列SEQIDNo.22。Scoe5NCBI蛋白質(zhì)編號(hào)CAB62724.1GI:6562793推定脂蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)]。圖25顯示了編碼Scoe5NCBI蛋白質(zhì)編號(hào)CAB62724.1GI:6562793推定脂蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)]的核苷酸序列SEQIDNo.23。圖26顯示了氨基酸序列SEQIDNo.24。Srim1NCBI蛋白質(zhì)編號(hào)AAK84028.1GI:15082088GDSL-脂肪酶[龜裂鏈霉菌]。圖27顯示了編碼Srim1NCBI蛋白質(zhì)編號(hào)AAK84028.1GI:15082088GDSL-脂肪酶[龜裂鏈霉菌]的核苷酸序列SEQIDNo.25。圖28顯示了氨基酸序列SEQIDNo.26－來(lái)自嗜水氣單胞菌的脂?；D(zhuǎn)移酶（ATCC＃7965）。圖29顯示了編碼來(lái)自嗜水氣單胞菌的脂?；D(zhuǎn)移酶（ATCC＃7965）的核苷酸序列SEQIDNo.27。圖30顯示了來(lái)自殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種（Aeromonassalmonicidasubsp.Salmonicida）的脂?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列SEQIDNo.28（ATCC＃14174）。圖31顯示了編碼來(lái)自殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種的脂?；D(zhuǎn)移酶（ATCC＃14174）的核苷酸序列SEQIDNo.29。圖32顯示了可以利用（美國(guó)）國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NIH，MD，USA）的基本局部對(duì)比搜索工具服務(wù)和完整的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)鑒定氣單胞菌基因的同系物。在數(shù)據(jù)庫(kù)搜索中使用GDSX基序，鑒定了可能編碼具有脂肪分解活性的酶的許多序列/基因。鑒定了來(lái)自鏈霉菌屬、黃單胞菌屬、和雷爾氏菌屬的基因。例如，將青枯病雷爾氏菌與殺鮭氣單胞菌（satA）基因進(jìn)行對(duì)比。成對(duì)對(duì)比顯示23％同一性?；钚晕稽c(diǎn)絲氨酸位于氨基末端，而催化殘基組氨酸和天冬氨酸能夠鑒定。圖33顯示了Pfam00657.11[00657家族，第11版數(shù)據(jù)庫(kù)]共有序列（下文稱為Pfam共有序列）及多種序列與Pfam共有序列的對(duì)比。箭頭指示活性位點(diǎn)殘基，下劃線指示[UptonC和BuckleyJT（1995）TrendsBiochemSci20:179-179]指出的三個(gè)同源盒。Pfam共有序列中的大寫字母指示許多家族成員中的保守殘基。-符號(hào)指示Pfam共有序列的隱藏Markov模型預(yù)計(jì)會(huì)發(fā)現(xiàn)插入殘基但是并非如此，而是缺口的位置。.符號(hào)指示在Pfam共有序列中沒(méi)有對(duì)應(yīng)殘基的殘基。所示序列是圖16、18、20、22、24、26、28、和30所示氨基酸序列。圖34顯示了Pfam00657.11[00657家族，第11版數(shù)據(jù)庫(kù)]共有序列（下文稱為Pfam共有序列）及多種序列與Pfam共有序列的對(duì)比。箭頭指示活性位點(diǎn)殘基，下劃線指示[UptonC和BuckleyJT（1995）TrendsBiochemSci20:179-179]指出的三個(gè)同源盒。Pfam共有序列中的大寫字母指示許多家族成員中的保守殘基。-符號(hào)指示Pfam共有序列的隱藏Markov模型預(yù)計(jì)會(huì)發(fā)現(xiàn)插入殘基但是并非如此，而是缺口的位置。.符號(hào)指示在Pfam共有序列中沒(méi)有對(duì)應(yīng)殘基的殘基。所示序列是圖2、16、18、20、26、28、和30所示氨基酸序列。發(fā)現(xiàn)所有這些蛋白質(zhì)對(duì)脂質(zhì)底物都有活性。圖35顯示了用于實(shí)施例7中的嗜水氣單胞菌脂?；D(zhuǎn)移酶基因誘變的融合構(gòu)建物的氨基酸序列SEQIDNo.30。標(biāo)有下劃線的氨基酸是木聚糖酶信號(hào)肽。圖36顯示了編碼包含木聚糖酶信號(hào)肽、來(lái)自嗜水氣單胞菌的脂?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列（SEQIDNo.31）。圖37顯示了編碼來(lái)自鏈霉菌的脂酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列（SEQIDNo.32）。圖38顯示了來(lái)自鏈霉菌的脂酰基轉(zhuǎn)移酶的多肽序列（SEQIDNo.33）。圖39顯示了來(lái)自喜熱裂孢菌屬(Termobifida)的脂酰基轉(zhuǎn)移酶的多肽序列（SEQIDNo.34）。圖40顯示了編碼來(lái)自喜熱裂孢菌屬的脂?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列（SEQIDNo.35）。圖41顯示了來(lái)自喜熱裂孢菌屬的脂?；D(zhuǎn)移酶的多肽序列（SEQIDNo.36）。圖42顯示了來(lái)自Corynebacteriumefficens的脂?；D(zhuǎn)移酶GDSx300aa的多肽序列（SEQIDNo.37）。圖43顯示了編碼來(lái)自Corynebacteriumefficens的脂?；D(zhuǎn)移酶GDSx300aa的核苷酸序列（SEQIDNo.38）。圖44顯示了來(lái)自Novosphingobiumaromaticivorans的脂?；D(zhuǎn)移酶GDSx284aa的多肽序列（SEQIDNo.39）。圖45顯示了編碼來(lái)自Novosphingobiumaromaticivorans的脂?；D(zhuǎn)移酶GDSx284aa的核苷酸序列（SEQIDNo.40）。圖46顯示了來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌的脂?；D(zhuǎn)移酶GDSx268aa的多肽序列（SEQIDNo.41）。圖47顯示了編碼來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌的脂?；D(zhuǎn)移酶GDSx268aa的核苷酸序列（SEQIDNo.42）。圖48顯示了來(lái)自除蟲鏈霉菌（Streptomycesavermitilis）的脂?；D(zhuǎn)移酶GDSX269aa的多肽序列（SEQIDNo.43）。圖49顯示了編碼來(lái)自除蟲鏈霉菌的脂?；D(zhuǎn)移酶GDSx269aa的核苷酸序列（SEQIDNo.44）。圖50顯示了來(lái)自鏈霉菌的脂?；D(zhuǎn)移酶的多肽序列（SEQIDNo.45）。圖51顯示了編碼來(lái)自鏈霉菌的脂?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列（SEQIDNo.46）。圖52顯示了活性位點(diǎn)含有甘油的1IVN.PDB晶體結(jié)構(gòu)的帶狀圖。該圖是使用DeepViewSwiss-PDB瀏覽器制作的。圖53顯示了使用DeepViewSwiss-PDB瀏覽器對(duì)活性位點(diǎn)含有甘油的1IVN.PDB晶體結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖－距離活性位點(diǎn)甘油10內(nèi)的殘基著黑色。圖54顯示了使用DeepViewSwiss-PDB瀏覽器對(duì)活性位點(diǎn)含有甘油的1IVN.PDB晶體結(jié)構(gòu)的頂視圖－距離活性位點(diǎn)甘油10內(nèi)的殘基著黑色。圖55顯示了對(duì)比1。圖56顯示了對(duì)比2。圖57和58顯示了1IVN與P10480的對(duì)比（P10480是嗜水氣單胞菌酶的數(shù)據(jù)庫(kù)序列），該對(duì)比是由PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的，且用于模型構(gòu)建過(guò)程。圖59顯示了一種對(duì)比，其中P10480是嗜水氣單胞菌的數(shù)據(jù)庫(kù)序列。該序列用于模型構(gòu)建和位點(diǎn)選擇。注意，描繪的是完整蛋白質(zhì)，成熟蛋白（等同于SEQIDNo.2）由第19位殘基開(kāi)始。A.sal指殺鮭氣單胞菌（SEQIDNo.28）GDSX脂肪酶、A.hyd指嗜水氣單胞菌（SEQIDNo.26）GDSX脂肪酶。共有序列在所列序列之間存在差異的位置含有*。圖60顯示了典型的一組384個(gè)克隆，野生型對(duì)照位于0.9PC與0.8DGDG的交叉點(diǎn)。圖61顯示了三個(gè)關(guān)注區(qū)域。第一個(gè)區(qū)域含有比率R升高但對(duì)DGDG的活性降低的突變體。第二個(gè)區(qū)域含有比率R升高且DGDG活性升高的突變體。第三個(gè)區(qū)域含有PC或DGDG活性升高但比率R沒(méi)有升高的克隆。實(shí)施例實(shí)施例1：嗜水氣單胞菌GDSx脂肪酶在1IVN上的建模以FASTA格式由PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)獲得嗜水氣單胞菌GDSX脂肪酶氨基酸序列（P10480）與大腸桿菌Tioesterase氨基酸序列（1IVN）和棘孢曲霉（Aspergillusaculeatus）鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶氨基酸序列（1DEO）的對(duì)比。將P10480與1IVN的對(duì)比連同1IVN.PDB晶體結(jié)構(gòu)坐標(biāo)文件輸入自動(dòng)化3D結(jié)構(gòu)建模器（位于www.expasy.org的SWISS-MODELLER服務(wù)器）（圖52）。使用（由www.expasy.org/spdbv/獲得的）DeepViewSwiss-PDB瀏覽器將為P10480得到的模型與1IVN.PDB和1DEO.PDB的晶體結(jié)構(gòu)坐標(biāo)進(jìn)行結(jié)構(gòu)對(duì)比（圖53）。根據(jù)1DEO.PDB和1IVN.PDB的結(jié)構(gòu)對(duì)比對(duì)由PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的氨基酸對(duì)比（對(duì)比1－（圖53））進(jìn)行修改。該備選氨基酸對(duì)比稱為對(duì)比2（圖56）。1IVN.PDB結(jié)構(gòu)含有甘油分子。認(rèn)為該分子位于活性位點(diǎn)中，因?yàn)樗咏呋瘹埢?。因此，可以選擇接近活性位點(diǎn)的殘基，它們由于接近活性位點(diǎn)因此很可能對(duì)底物結(jié)合、產(chǎn)物釋放、和/或催化作用產(chǎn)生影響。在1IVN.PDB結(jié)構(gòu)中，選擇活性位點(diǎn)中以甘油分子中央碳原子為中心的10范圍內(nèi)的所有氨基酸（第1組氨基酸）（見(jiàn)圖53和圖54）。由P10480序列選擇下列氨基酸：(1)P10480中與對(duì)比1的第1組氨基酸對(duì)應(yīng)的所有氨基酸；(2)P10480中與對(duì)比2的第1組氨基酸對(duì)應(yīng)的所有氨基酸；(3)由P10480與1IVN的交疊區(qū)選擇P10480模型中距離1IVN的甘油分子12內(nèi)的所有氨基酸。這三組結(jié)合起來(lái)構(gòu)成第2組氨基酸。將序列P10480與“AAG09804.1GI:9964017甘油磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶[殺鮭氣單胞菌]進(jìn)行對(duì)比，并選擇AAG09804中與第2組氨基酸對(duì)應(yīng)的殘基，產(chǎn)生第3組氨基酸。第1、2、和3組第1組氨基酸：（注意，這些是1IVN－圖57和圖58－中的氨基酸。）Gly8、Asp9、Ser10、Leu11、Ser12、Tyr15、Gly44、Asp45、Thr46、Glu69、Leu70、Gly71、Gly72、Asn73、Asp74、Gly75、Leu76、Gln106、Ile107、Arg108、Leu109、Pro110、Tyr113、Phe121、Phe139、Phe140、Met141、Tyr145、Met151、Asp154、His157、Gly155、Ile156、Pro158由第1組中清除高度保守的基序諸如GDSx和催化殘基（標(biāo)有下劃線的殘基）。為了避免疑惑，第1組限定1IVN模型活性位點(diǎn)中甘油中央碳原子10內(nèi)的氨基酸殘基。第2組氨基酸：（注意，氨基酸的編號(hào)指P10480成熟序列中的氨基酸。）Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289和Val290。第1組和第2組中所選殘基的比較表第3組氨基酸：第3組氨基酸與第2組相同，但是指殺鮭氣單胞菌（SEQIDNo.28）編碼序列，即第3組中的氨基酸殘基編號(hào)要大18，這反映了成熟蛋白質(zhì)（SEQIDNo.2）與包含信號(hào)序列的蛋白質(zhì)（SEQIDNo.28）中氨基酸編號(hào)之間的差異。殺鮭氣單胞菌GDSX（SEQIDNo.28）與嗜水氣單胞菌GDSX（SEQIDNo.26）的成熟蛋白有五個(gè)氨基酸不同。它們是Thr3Ser、Gln182Lys、Glu309Ala、Ser310Asn、Gly318-，其中殺鮭氣單胞菌的殘基列于前而嗜水氣單胞菌的殘基列于后（圖59）。嗜水氣單胞菌蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度只有317個(gè)氨基酸，缺少第318位的一個(gè)殘基。與嗜水氣單胞菌蛋白質(zhì)相比，殺鮭氣單胞菌GDSX具有相當(dāng)高的對(duì)極性脂質(zhì)的活性，諸如對(duì)半乳糖脂底物。對(duì)所有五個(gè)氨基酸位置進(jìn)行了位點(diǎn)掃描。第4組氨基酸：第4組氨基酸是S3、Q182、E309、S310和-318。第5組氨基酸：F13S、D15N、S18G、S18V、Y30F、D116N、D116E、D157N、Y226F、D228N、Y230F。第6組氨基酸：第6組氨基酸是Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、-318。第6組中氨基酸的編號(hào)指P10480（SEQIDNo.2）中的氨基酸殘基－可以通過(guò)與P10480和/或1IVN的同源對(duì)比和/或結(jié)構(gòu)對(duì)比來(lái)確定其它序列主鏈中的相應(yīng)氨基酸。第7組氨基酸：第7組氨基酸是Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、-318、Y30X（其中X選自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、Y226X（其中X選自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、Y230X（其中X選自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、S18X（其中X選自A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、或Y）、D157X（其中X選自A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y）。第7組中氨基酸的編號(hào)指P10480（SEQIDNo.2）中的氨基酸殘基－可以通過(guò)與P10480和/或1IVN的同源對(duì)比和/或結(jié)構(gòu)對(duì)比來(lái)確定其它序列主鏈中的相應(yīng)氨基酸。可以由晶體結(jié)構(gòu)獲得二級(jí)結(jié)構(gòu)分類。這意味著能夠?qū)⒚總€(gè)氨基酸歸入α-螺旋或β-折疊的一部分。圖57顯示了1DEO、1IVN、和P10480（嗜水氣單胞菌數(shù)據(jù)庫(kù)）的PFAM對(duì)比。每行序列下添加的是結(jié)構(gòu)分類。PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)包含低序列同一性的蛋白質(zhì)比對(duì)。因此，這些對(duì)比不是很好。盡管對(duì)比算法（HAMMER序型）非常適于識(shí)別保守基序，然而該算法在詳細(xì)水平上不是很好。因此，在PFAM對(duì)比與結(jié)構(gòu)對(duì)比之間發(fā)現(xiàn)差異也就不算意外了。正如技術(shù)人員容易知道的，可以在結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上修改PFAM對(duì)比。這意味著可以對(duì)交疊的那些結(jié)構(gòu)元件進(jìn)行對(duì)比。圖55顯示了1DEO、1IVN、和P10480的最初PFAM對(duì)比。向?qū)Ρ戎刑砑拥氖莵?lái)自1DEO和1IVN晶體結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息。圖56中的對(duì)比2顯示了手工修改的對(duì)比，其中二級(jí)結(jié)構(gòu)元件之間的匹配得到了改進(jìn)。根據(jù)1DEO與P10480之間或1IVN與P10480之間的保守殘基，還修改了P10480的對(duì)比。為了容易的區(qū)分序列模塊，對(duì)比2中的序列標(biāo)識(shí)符具有額外的m（1DEOm、1IVNm、P10480m）。對(duì)比3是1和2的混合，給出了每個(gè)模塊的對(duì)比。實(shí)施例2：位點(diǎn)掃描文庫(kù)的構(gòu)建依照制造商Stratagene的指示使用QuickChangeMultiSite-DirectedMutagenesisKit即快速改變多重定點(diǎn)誘變?cè)噭┖小?duì)于每個(gè)文庫(kù)，設(shè)計(jì)含有一個(gè)NNK或NNS（核苷酸縮寫）密碼子的簡(jiǎn)并引物。引物設(shè)計(jì)是使用可以由Stratagene網(wǎng)站獲得的工具進(jìn)行的。使用分析引物形成發(fā)卡或引物二聚體可能性的標(biāo)準(zhǔn)分析工具進(jìn)一步確認(rèn)了引物質(zhì)量控制。該方法的主要概念是：使用非鏈置換高保真DNA聚合酶諸如Pfu-Turbo和一條引物，線性擴(kuò)增DNA模板。這與PCR反應(yīng)中的常規(guī)指數(shù)擴(kuò)增過(guò)程是不同的。這種線性擴(kuò)增過(guò)程確保了低錯(cuò)誤頻率。產(chǎn)物是單鏈非甲基化DNA和雙鏈半甲基化DNA。如果模板是由合適的宿主生物體獲得的，那么模板是雙鏈甲基化DNA。這意味著可以用DpnI核酸內(nèi)切酶消化模板DNA，而不消化產(chǎn)物DNA。因此，在將DNA轉(zhuǎn)化到合適的宿主中后，含有非誘變質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子只有很低的頻率。實(shí)施例3：由位點(diǎn)掃描文庫(kù)選擇獲勝者描述了兩種備選方案：對(duì)文庫(kù)測(cè)序后分析獨(dú)特的氨基酸，或是分析文庫(kù)后對(duì)獲勝者測(cè)序。選擇獲勝者的第一種方法：對(duì)文庫(kù)測(cè)序后分析獨(dú)特的氨基酸。通過(guò)將選擇盒替換成卡那霉素選擇盒，由pDP66S（Penninaga等，Biochemistry，1995，3368-3376）衍生用于在大腸桿菌中生成位點(diǎn)掃描文庫(kù)/變體并在枯草芽孢桿菌中表達(dá)突變體的轉(zhuǎn)化/表達(dá)穿梭載體。通過(guò)替換P32啟動(dòng)子下游的cgt基因，在該載體中插入酰基轉(zhuǎn)移酶變體基因。該載體使用P32啟動(dòng)子在枯草芽孢桿菌中驅(qū)動(dòng)?；D(zhuǎn)移酶變體基因的表達(dá)。使用《MolecularBiologicalMethodsforBacillus》（C.R.Harwood和S.M.Cutting編，1990，JohnWiley&SonsLtd.，Chichester，UK）第3章描述的轉(zhuǎn)化方法，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到nprE-、aprA-枯草芽孢桿菌DB104（Kawamura和Doi，J.ofBacteriology，1984年10月，p442-444）。使用含有一個(gè)NNK密碼子的簡(jiǎn)并寡聚物構(gòu)建位點(diǎn)掃描文庫(kù)，其中K代表G或T，而N代表A、C、G、或T。這意味著通過(guò)使用NNK引物的擴(kuò)增反應(yīng)而構(gòu)建的一組克?。ㄒ卜Q為“位點(diǎn)掃描文庫(kù)”）原則上含有32種獨(dú)特的密碼子（4x4x2=32種組合選項(xiàng)）。假設(shè)不存在偏倚，那么以95％的可能性32種密碼子中的每一種至少挑到一次所需的克隆數(shù)目是95。這可以使用下面的公式來(lái)計(jì)算。公式1：n={log(1-c)}/{log(1-f)}其中n指克隆數(shù)目，c指置信區(qū)間的小數(shù)數(shù)值，例如95％置信區(qū)間的小數(shù)數(shù)值是0.95而99％置信區(qū)間的小數(shù)數(shù)值是0.99，f指每一種個(gè)體密碼子發(fā)生的頻率，對(duì)于NNK引物就是1/32或0.03125。解答n的公式得出94.36或95個(gè)克隆。如果認(rèn)為95％置信區(qū)間太低，或是在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程的一個(gè)或多個(gè)步驟中不能避免偏倚，那么可以決定對(duì)更多的克隆進(jìn)行檢測(cè)或測(cè)序。例如，在公式1中，如果n設(shè)為384，f設(shè)為1/32或0.03125，那么置信區(qū)間c就比99％大得多。甚至如果60％的克隆含有相同的突變或野生型密碼子，那么363個(gè)克隆將以99％的置信度獲得所有32種密碼子。由此，可以得出結(jié)論，384個(gè)克隆將以99％的置信度含有所有32種密碼子，每種密碼子至少出現(xiàn)一次。進(jìn)行菌落PCR（即對(duì)細(xì)菌菌落或細(xì)菌液體培養(yǎng)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而由細(xì)菌內(nèi)的質(zhì)粒擴(kuò)增片段，隨后對(duì)片段中已經(jīng)誘變的部分進(jìn)行測(cè)序，這是一種已經(jīng)建立的流程）。因?yàn)榭梢垣@得菌落PCR、測(cè)序、和序列純化的預(yù)制材料（也稱為試劑盒），所以可以對(duì)96個(gè)一組的菌落日常進(jìn)行菌落PCR。幾個(gè)商業(yè)公司提供這整個(gè)流程的服務(wù)，諸如AGOWAGmbH（Glienickerweg185，D-12489，Berlin，Germany）。在分析了96個(gè)測(cè)序反應(yīng)后，為這組96個(gè)序列中可以找到的每一種密碼子選擇一個(gè)代表性的個(gè)體克隆。隨后，對(duì)于代表突變體的每一種克隆，接種5ml添加50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基（酪蛋白酶促消化產(chǎn)物，10g/L；低鈉酵母提取物，5g/L；氯化鈉，5g/L；惰性成片助劑(tabletingaid)，2g/L），并于33℃以205rpm培養(yǎng)6小時(shí)。將0.7ml此培養(yǎng)物用于接種50ml添加50mg/L卡那霉素和高麥芽糖淀粉水解產(chǎn)物溶液（60g/L）的SAS培養(yǎng)基（K2HPO4，10g/L；MOPS（3-嗎啉代丙烷磺酸），40g/L；氯化鈉，5g/L；防沫劑（Sin260），5滴/L；脫脂大豆粉，20g/L；Biospringer106（100%dwYE），20g/L）。于33℃以180rpm繼續(xù)培養(yǎng)40小時(shí)后，通過(guò)以19000rpm離心30分鐘分離培養(yǎng)物上清液。將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的管中，并直接用于檢測(cè)。選擇獲勝者的第二種方法：篩選文庫(kù)后對(duì)獲勝者進(jìn)行測(cè)序。盡管可以選擇對(duì)384個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，然而也可以在測(cè)序前對(duì)它們進(jìn)行檢驗(yàn)并選擇改良的變體。在篩選如此多的樣品時(shí)，應(yīng)當(dāng)考慮許多問(wèn)題。雖不詳盡，盡管有可能選擇對(duì)一種底物的活性有所改變的變體，然而384份培養(yǎng)物之間表達(dá)水平的差異可能是巨大的，甚至在使用384孔微量滴定板的情況中，導(dǎo)致背景較高。因此，測(cè)量?jī)煞N活性并根據(jù)比率變化選擇獲勝者是一種優(yōu)選的方法。例如，如果兩種活性具有一定比率R，那么不管酶存在的絕對(duì)數(shù)量，兩種活性之間的比率將始終是R。R值的變化指示相對(duì)于一種活性，發(fā)生了改變另一種活性的突變。圖60顯示了由位點(diǎn)掃描文庫(kù)獲得的數(shù)據(jù)集。對(duì)所有克隆測(cè)試了對(duì)磷脂酰膽堿（PC）和二半乳糖基甘油二酯（DGDG）的活性。展示R值沒(méi)有變化的所有克?。赡苁且淹蛔兊幕蚴俏赐蛔兊模⒁砸欢ǖ恼`差幅度位于一條直線上。不管這些克隆，圖61顯示了三個(gè)關(guān)注組。圖61的第一個(gè)區(qū)域含有R顯著高于野生型（未突變）但總體DGDG活性較低的所有克隆。第二個(gè)區(qū)域含有R值和DGDG活性都比野生型高的突變體。第三個(gè)區(qū)域含有R值沒(méi)有升高但DGDG或PC活性顯著升高的克隆。如果關(guān)注對(duì)DGDG的活性升高的變體，那么第二個(gè)區(qū)域含有最感興趣的變體，而第三個(gè)區(qū)域也含有感興趣的變體。顯示水解活性大大升高的第三個(gè)區(qū)域的變體可能伴隨著轉(zhuǎn)移酶活性降低。有一件事值得注意，如果命中了一個(gè)決定特異性的殘基，那么20種可能氨基酸中的大部分能夠產(chǎn)生非常不同的R值。然而，如果文庫(kù)具有針對(duì)某一個(gè)氨基酸的很大偏倚（例如60％是酪氨酸），那么所有那些變體仍將位于一條直線上。實(shí)施例4：384孔微量滴定板中對(duì)PC和DGDG活性的測(cè)定法起始材料●EM培養(yǎng)基●含轉(zhuǎn)化子的平板●含野生型的平板●384孔板●菌落挑取器●WacoNEFA-C試劑盒●384孔板中的PC和DGDG溶液第1部分－挑取菌落●將菌落挑到裝有EM培養(yǎng)基的384孔板中●跳過(guò)4個(gè)孔并接種含有非突變主鏈的菌落●于30℃以200rpm的搖動(dòng)速率培養(yǎng)過(guò)夜第2部分－在底物上保溫●將過(guò)夜培養(yǎng)平板以2500rpm離心20分鐘●由每個(gè)孔取10μl上清液轉(zhuǎn)移到2個(gè)空的384孔板中●向一個(gè)板中加入5μl12.5mMDGDG，向另一個(gè)板中加入5μl12.5mMPC●將兩塊板于37℃保溫2小時(shí)，開(kāi)始時(shí)搖動(dòng)以混勻，然后停止搖動(dòng)●繼以NEFAC流程第3部分－NEFA-C流程●加入10μlA溶液●于37℃以300rpm保溫10分鐘●加入20μlB溶液●于37℃以300rpm保溫10分鐘●于550nm讀板底物組成－單位mM25mMPC或DGDG10mMCaCl260mMTritonX10015mMNaN320mMBritonRobinsonpH5.0實(shí)施例5：選擇的變體酶活性的測(cè)定為了測(cè)定對(duì)各種底物的酶活性，將4μl酶溶液與11μl底物于37℃保溫60分鐘。隨后使用WACONEFA-C試劑盒測(cè)定游離脂肪酸的含量。向15μl酶+底物混合液中添加75μlNEFA溶液A，并于37℃保溫15分鐘。隨后添加150μlNEFA溶液B并保溫15分鐘。隨后于550nm測(cè)量樣品的光密度（OD）。作為對(duì)照，由每種變體取4μl酶溶液與11μlHEPES緩沖液于37℃保溫60分鐘。隨后如上所述測(cè)定游離脂肪酸的含量。由每種底物的觀測(cè)值扣除該對(duì)照樣品的OD值，得到經(jīng)過(guò)校正的活性。使用了四種不同的底物，其組成一般是30mg脂質(zhì)、4.75ml50mMHEPES緩沖液pH7、42.5μl0.6MCaCl2、200μl10％不含H2O2的TritionX-100。30mg脂質(zhì)是磷脂酰膽堿（PC）、PC與膽固醇的9:1混合物、二半乳糖基甘油二酯（DGDG）、或DGDG與膽固醇的9:1混合物。改良變體的選擇對(duì)PC的活性改良的變體選擇在與PC保溫后顯示OD相對(duì)于野生型酶升高的那些變體作為具有改良磷脂酶活性的變體。對(duì)DGDG的活性改良的變體選擇在與DGDG保溫后顯示OD相對(duì)于野生型酶升高的那些變體作為對(duì)DGDG的活性改良的變體。對(duì)DGDG的特異性改良的變體對(duì)DGDG的特異性即對(duì)DGDG的活性與對(duì)磷脂酰膽堿（PC）的活性之間的比率。選擇顯示DGDG與PC比率比野生型高的那些變體作為對(duì)DGDG的特異性改良的變體。以PC作為?；w的轉(zhuǎn)移酶活性改良的變體將酶與PC或PC與膽固醇混合物保溫后形成的游離脂肪酸的數(shù)量差異指示相對(duì)于水解活性數(shù)量的轉(zhuǎn)移酶活性數(shù)量。轉(zhuǎn)移酶活性不會(huì)引起游離脂肪酸的形成。轉(zhuǎn)移酶偏愛(ài)性即使用PC作為底物時(shí)形成的游離脂肪酸與使用PC與膽固醇混合物作為底物時(shí)形成的游離脂肪酸的比率。選擇顯示轉(zhuǎn)移酶偏愛(ài)性升高且顯示對(duì)PC的活性比野生型高的那些變體作為具有改良轉(zhuǎn)移酶活性的變體。以DGDG作為?；w的轉(zhuǎn)移酶活性改良的變體將酶與DGDG或DGDG與膽固醇混合物保溫后形成的游離脂肪酸的數(shù)量差異指示相對(duì)于水解活性數(shù)量的轉(zhuǎn)移酶活性數(shù)量。轉(zhuǎn)移酶活性不會(huì)引起游離脂肪酸的形成。轉(zhuǎn)移酶偏愛(ài)性即使用DGDG作為底物時(shí)形成的游離脂肪酸與使用DGDG與膽固醇混合物作為底物時(shí)形成的游離脂肪酸的比率。選擇顯示轉(zhuǎn)移酶偏愛(ài)性升高且顯示對(duì)DGDG的活性比野生型高的那些變體作為具有改良轉(zhuǎn)移酶活性的變體。選擇的變體對(duì)于上述四種選擇標(biāo)準(zhǔn)中的每一種，選擇了許多變體。此實(shí)施例中的“野生型”酶指殺鮭氣單胞菌（SEQIDNo.28）。對(duì)PC的活性改良的變體PCThr3Asn158.0Thr3Gln151.5Thr3Lys141.5Thr3Arg133.0Glu309Ala106.0Thr3Pro101.5Thr3Met96.0野生型86.5對(duì)DGDG的活性改良的變體DGDGGln182Asp66.5Glu309Ala60Tyr230Thr59Tyr230Gly57.5Tyr230Gly51Thr3Gln44.5野生型43.5對(duì)DGDG的特異性改良的變體RDGDG/PCPCDGDGGln182Asp1.0265.566.5Tyr230Gly0.7972.557.5Tyr230Gly0.7865.051.0Tyr230Thr0.7578.559.0Tyr230Val0.7158.041.0Asp157Cys0.6948.033.0Glu309Pro0.5873.542.5Glu309Ala0.57106.060.0Gly318Ile0.5369.536.5Tyr230Arg0.5063.532.0Tyr230Met0.5064.532.5野生型0.5086.543.5以PC作為?；w的轉(zhuǎn)移酶活性改良的變體以DGDG作為?；w的轉(zhuǎn)移酶活性改良的變體RDGDG+Cho/DGDGDGDGTyr230Thr1.1059Gln182Asp1.3967Tyr230Gly1.5558Glu309Ala1.7860野生型1.7844實(shí)施例6：轉(zhuǎn)移酶測(cè)定法磷脂:膽固醇可以用DGDG取代磷脂，從而提供針對(duì)半乳糖脂的轉(zhuǎn)移酶測(cè)定法。也可以在同一測(cè)定法中使用其它受體，例如甘油、葡萄糖、羥酸、蛋白質(zhì)、或麥芽糖。在Wheaton玻璃杯中稱量300mg磷脂酰膽堿（Avanti＃441601）:膽固醇（SigamC8503）9:1混合物。添加10ml50mMHEPES緩沖液pH7.0，并于40℃攪動(dòng)，使底物分散。將0.5ml底物轉(zhuǎn)移到4ml瓶中，并置于40℃加熱模塊中。添加0.050ml轉(zhuǎn)移酶溶液，還以相同方式分析0.050ml水作為對(duì)照。將反應(yīng)混合液于40℃搖動(dòng)4小時(shí)。然后將樣品凍干，并通過(guò)GLC進(jìn)行分析。計(jì)算：根據(jù)GLC分析計(jì)算游離脂肪酸和膽固醇酯的含量。如下計(jì)算酶活性：轉(zhuǎn)移酶/水解比率=％轉(zhuǎn)移酶活性/％水解活性其中：Δ％膽固醇酯=％膽固醇酯(樣品)-％膽固醇酯(對(duì)照)Δ％脂肪酸=％脂肪酸(樣品)-％脂肪酸(對(duì)照)轉(zhuǎn)移酶測(cè)定法半乳糖脂:膽固醇在Wheaton玻璃杯中稱量300mg二半乳糖基甘油二酯（DGDG）（純度>95％半乳糖脂，所用DGDG是由小麥脂質(zhì)純化得到的。購(gòu)自SigmaD4651的DGDG也適于使用）:膽固醇（Sigam）9:1混合物。添加10ml50mMHEPES緩沖液pH7.0，并于40℃攪動(dòng)，使底物分散。將0.5ml底物轉(zhuǎn)移到4ml瓶中，并置于40℃加熱模塊中。添加0.050ml轉(zhuǎn)移酶溶液，還以相同方式分析0.050ml水作為對(duì)照。將反應(yīng)混合液于40℃搖動(dòng)4小時(shí)。然后將樣品凍干，并通過(guò)GLC進(jìn)行分析。計(jì)算：根據(jù)GLC分析計(jì)算游離脂肪酸和膽固醇酯的含量。如下計(jì)算酶活性：轉(zhuǎn)移酶/水解比率=％轉(zhuǎn)移酶活性/％水解活性其中：Δ％膽固醇酯=％膽固醇酯(樣品)-％膽固醇酯(對(duì)照)Δ％脂肪酸=％脂肪酸(樣品)-％脂肪酸(對(duì)照)實(shí)施例7：嗜水氣單胞菌脂?；D(zhuǎn)移酶（SEQIDNo.26）的變體使用購(gòu)自Stratagene（LaJolla，CA92037，USA）的QuickChangeTMMulti-SiteDirectedMutagenesiskit試劑盒遵循Stratagene提供的指示導(dǎo)入突變。位于Tyr256的變體顯示對(duì)磷脂的活性升高。位于Tyr256和Tyr260的變體顯示對(duì)半乳糖脂的活性升高。位于Tyr265的變體顯示以半乳糖脂作為?；w的轉(zhuǎn)移酶活性升高。上述編號(hào)指示在如下序列中的位置：來(lái)自嗜水氣單胞菌的酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.26所示。核苷酸序列如SEQIDNo.27所示。實(shí)施例8：篩選來(lái)自殺鮭氣單胞菌的甘油磷脂:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶GCAT的突變體使用磷脂酰膽堿或二半乳糖基甘油二酯作為供體且使用膽固醇作為受體，對(duì)來(lái)自殺鮭氣單胞菌甘油磷脂:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶GCAT點(diǎn)突變的突變體篩選轉(zhuǎn)移酶活性，其目的是選擇對(duì)二半乳糖基甘油二酯的活性比磷脂酰膽堿更好的突變體。使用二半乳糖基甘油二酯（DG）和磷脂酰膽堿（PC）作為供體且使用膽固醇作為受體，對(duì)GCAT突變體篩選轉(zhuǎn)移酶活性。以9:1的比例稱量DG（純度大于95％二半乳糖基甘油二酯，所用DGDG是由小麥脂質(zhì)純化得到的。購(gòu)自SigmaD4651的DGDG也適于使用）和膽固醇（SigmaC8503），溶于氯仿，并蒸干。為了制備底物，將3％DG:膽固醇散布于50mMHEPES緩沖液pH7。將0.250ml底物轉(zhuǎn)移到帶有螺口蓋的3ml玻璃瓶中。添加0.025ml來(lái)自突變型GCAT培養(yǎng)物的上清液，并于40℃保溫2小時(shí)。還制備了用水代替酶的參考樣品。將反應(yīng)混合液在沸水浴中加熱10分鐘以終止酶反應(yīng)。添加2ml99％乙醇，并進(jìn)行膽固醇分析和游離脂肪酸分析。膽固醇測(cè)定法將100μl在0.1MTRIS-HCl緩沖液pH6.6+0.5％TritonX100（SigmaX-100）中含有1.4U/ml膽固醇氧化酶（SERVAElectrophoresisGmbH產(chǎn)品目錄編號(hào)17109）、0.4mg/mlABTS（SigmaA-1888）、6U/ml過(guò)氧化物酶（Sigma6782）的底物于37℃保溫5分鐘。添加5μl膽固醇樣品并混勻。將反應(yīng)混合液繼續(xù)保溫5分鐘，并于405nm測(cè)量OD。根據(jù)對(duì)0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml、和0mg/ml膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析，計(jì)算膽固醇含量。游離脂肪酸測(cè)定法使用NEFAC試劑盒（WAKOChemicalsGmbH）測(cè)量樣品中的游離脂肪酸。將75μlNEFA試劑A于37℃保溫10分鐘。添加15μl酶樣品并混勻。將反應(yīng)混合液保溫10分鐘。添加150μlNEFA試劑B，混勻，繼續(xù)保溫10分鐘，并于540nm測(cè)量OD。由0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、和0mM脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液計(jì)算游離脂肪酸。以相同方式測(cè)量使用磷脂酰膽堿作為供體的轉(zhuǎn)移酶測(cè)定法，但是使用磷脂酰膽堿（Avanti＃441601）代替DG（DGDG）。轉(zhuǎn)移酶活性表述為％酯化的膽固醇，它是由參考樣品中的游離膽固醇與酶樣品中的游離膽固醇之間的差異計(jì)算的。水解活性表述為％生成的游離脂肪酸，它是由酶樣品中的游離脂肪酸與參考樣品中的游離脂肪酸之間的差異計(jì)算的。對(duì)DG與PC的相對(duì)轉(zhuǎn)移酶活性以％TDG/TPC計(jì)算。突變體對(duì)DG的轉(zhuǎn)移酶活性TDG與水解活性HDG比率如下計(jì)算：其中386是膽固醇的分子量，而280是脂肪酸的分子量。突變體?？梢酝ㄟ^(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)來(lái)分析由上述實(shí)施例得到的數(shù)據(jù)，從而鑒定關(guān)鍵位點(diǎn)和/或提供期望活性特征（諸如TDG與TPC比率升高）的具體氨基酸替代并排序。例如，提出了如下穩(wěn)固建模(robustmodeling)：用經(jīng)過(guò)檢查的響應(yīng)最大值（0，TPC）和最大值（0，TDG）執(zhí)行關(guān)于TPC和TDG的信息。此項(xiàng)研究的目的是根據(jù)ln(1+TDG)-ln(1+TPC)得分（優(yōu)選正的數(shù)值），既包括絕對(duì)數(shù)值范圍又包括與對(duì)照（天然的）相比的相對(duì)數(shù)值范圍，確定用于鑒定TDG≥TPC的設(shè)置。優(yōu)選設(shè)置是根據(jù)二元響應(yīng)（事件、無(wú)事件）確定的，其中事件定義為關(guān)于得分的優(yōu)選響應(yīng)。使用以不含先前信息的經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的具有補(bǔ)充log-log鏈環(huán)的二項(xiàng)式GLIM模型分析二元響應(yīng)。關(guān)于如何進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的細(xì)節(jié)見(jiàn)如下參考文獻(xiàn)：SASInstitute公司的User'sGuide，Version6，4.Ed，Vol.2（Cary,NC，SASInstitute公司，1989）中的procLOGISTIC。實(shí)施例9：殺鮭氣單胞菌甘油磷脂:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶GCAT改良突變體的選擇此實(shí)施例中的“親本”酶是殺鮭氣單胞菌（SEQIDNo.28）。依照實(shí)施例8中略述的實(shí)驗(yàn)，在來(lái)自殺鮭氣單胞菌的GCAT中篩選得出32個(gè)位置（230Tyr、182Lys、3Thr、157Asp、310Thr、318Gly、309Glu、17Leu、111Trp、117Tyr、179Tyr、118Leu、215Asn、22Lys、290Val、289Gln、285Met、18Ser、23Met、180His、284Lys、181Asn、209Met、210Leu、211Arg、40Gly、81Pro、112Val、80Asn、82Lys、88Asn、87Asn）。根據(jù)篩選結(jié)果和三條選擇標(biāo)準(zhǔn)，選擇了表1所列的下列突變體。表1實(shí)施例10：用于突變殺鮭氣單胞菌甘油磷脂:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶GCAT的具體目的氨基酸區(qū)域的選擇根據(jù)pfam對(duì)比（對(duì)比2；圖56）和P10480模型與1IVN的交疊，選擇圍繞1IVN活性位點(diǎn)中甘油分子的區(qū)域中的所有氨基酸，并用于定義具體目的區(qū)域（環(huán)）。（編號(hào)指P10480成熟序列（SEQIDNo.2）中的氨基酸）：Thr20-Arg41（環(huán)1，L1）Ile77-Leu89（環(huán)2，L2）Leu118-Asp127（環(huán)3，L3）Gly146-Val176（環(huán)4，L4）Glu208-Trp287（環(huán)5，L5）相應(yīng)的命名了中間區(qū)（IVR）：Ala1-Asp19（IVR1）Phe42-Lys76（IVR2）Asp90-Tyr117（IVR3）Ala128-Asn145（IVR4）Ser177-Ala207（IVR5）Asp288-His317（IVR6）下表概括了優(yōu)選用于突變殺鮭氣單胞菌的甘油磷脂:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶GCAT的位置的定位。此結(jié)果是以實(shí)施例8-10中略述的實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的。將上述說(shuō)明書中提及的所有發(fā)表物收入本文作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的知道本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的各種修改和變體，且不違背本發(fā)明的范圍和精神。盡管已經(jīng)聯(lián)系具體的優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解所主張的發(fā)明不應(yīng)當(dāng)過(guò)度限制于這些具體實(shí)施方案。事實(shí)上，對(duì)于生物化學(xué)和生物技術(shù)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的用于執(zhí)行本發(fā)明的所述模式的各種修改意圖屬于下列權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3