基于pI的蛋白質(zhì)分級的制作方法
【專利摘要】提供了用于基于pI分級檢測并收集分析物，通過電泳和pI分離分析物，和使用pI聚焦和后續(xù)的結(jié)晶純化目標分子的方法和裝置。
【專利說明】基于Pl的蛋白質(zhì)分級
[0001]相關(guān)專利申請的交叉引用
[0002]本申請請求美國臨時專利申請編號61/555，564,61/555, 592和61/555，674的優(yōu)先權(quán)，全部于2011年11月4日遞交，且均通過引用全文納入本文用于全部目的。
【背景技術(shù)】
[0003]目前基于等電聚焦的蛋白質(zhì)/肽分級技術(shù)有至少兩種缺陷。首先，樣品在固定或有限的PH范圍內(nèi)分離，導致各樣品的分級效果未能達到最優(yōu)。其次，樣品分級所需的pH梯度是由化學品(兩性電解質(zhì))建立的，導致經(jīng)分離的樣品受到化學品污染和(潛在的)對下游分析的干擾。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]在一些實施方式中，本發(fā)明提供了一種分離和檢測樣品中分析物的裝置，所述裝置包括用于沿一條軸線盛放含多種分子分析物的溶液的腔室，在腔室的軸線的第一末端有樣品注射端口且在軸線的第二末端有出口 ；用于在腔室內(nèi)沿軸線施加電場的電源；通過雙極膜與所述腔室分離的一個或多個離子源，用于通過注射離子流在所述腔室中沿所述軸線建立pH梯度,能夠在pH梯度中形成一級或多級pH ;操縱所述一個或多個離子源以調(diào)節(jié)pH梯度來使得所述分子分析物沿軸線分別遷移的控制器；以及一個或多個出口，以允許通過所述出口將一種或多種分析物收集至容器或分析儀器(如質(zhì)譜儀或其他檢測系統(tǒng))內(nèi)。在一些實施方式中，所述一個或多個離子源是質(zhì)子注射器或氫氧根注射器。
[0005]在一些實施方式中，本發(fā)明提供了 一種從樣品中分離一種或多種目標蛋白質(zhì)的方法。在一些實施方式中，所述方法包括向腔室中加入樣品，所述樣品含有包含一種或多種目標蛋白質(zhì)(或其他目標分子，包括但不限于核酸)的蛋白質(zhì)混合物，其中所述腔室包含第一和第二電極以及至少一個位于腔室壁上電極之間的質(zhì)子注射器或氫氧根注射器，通過雙極膜與腔室中的樣品分離；使用質(zhì)子注射器或氫氧根注射器在腔室內(nèi)產(chǎn)生PH梯度，并施加跨電極的電壓，從而基于蛋白質(zhì)等電點(Pi)對腔室內(nèi)的蛋白質(zhì)進行定位；通過與通道流體連通的端口捕獲一種或多種蛋白質(zhì)；并且對一種或多種捕獲的蛋白質(zhì)進行凝膠電泳。
[0006]在一些實施方式中，所述電泳為聚丙烯酰胺凝膠電泳。在一些實施方式中，所述方法進一步包括從電泳凝膠中收集一種或多種蛋白質(zhì)。
[0007]在一些實施方式中，本發(fā)明提供了一種從樣品中分離一種或多種目標蛋白質(zhì)(或其他目標分子，包括但不限于核酸)的方法，所述方法包括，向腔室中加入樣品，所述樣品含有包含一種或多種目標蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)混合物，其中所述腔室與一個或多個離子源相連，所述離子源通過雙極膜與所述腔室分隔，用于通過注射離子流在所述腔室內(nèi)沿所述軸線建立pH梯度，能夠在pH梯度中形成一級或多級pH ;對腔室內(nèi)蛋白質(zhì)進行電泳；并且隨后使用質(zhì)子和/或氫氧根注射器在腔室內(nèi)建立PH梯度，從而基于蛋白質(zhì)等電點(pi)對腔室內(nèi)的蛋白質(zhì)進行定位。
[0008]在一些實施方式中，在產(chǎn)生pH梯度期間繼續(xù)進行電泳。在一些實施方式中，所述從樣品中分離一種或多種目標蛋白質(zhì)的方法也包括收集一種或多種目標蛋白質(zhì)。
[0009]在一些實施方式中，本發(fā)明提供了一種同時根據(jù)等電點和電泳遷移率分離多種分子分析物的裝置，所述裝置包括，用于沿一條軸線盛放含多種分子分析物的溶液的腔室，其中所述腔室包含一個或多個與腔室流體連通的端口，端口可位于腔室內(nèi)以根據(jù)分析物的Pl捕獲所需的分析物，或者能夠移動以將一個或多個端口定位在一個或多個所需的位置處；用于在腔室內(nèi)沿軸線施加電場的電源；通過注射離子流在所述腔室內(nèi)沿所述軸線建立PH梯度、且能夠在PH梯度中形成一級或多級pH的一個或多個質(zhì)子/氫氧根源；操縱所述一個或多個離子源以調(diào)節(jié)PH梯度來使得所述分子分析物沿軸線分別遷移的控制器；以及一個或多個與所述一個或多個端口流體連通的電泳通道，從而允許對所述一個或多個端口中捕獲的分析物進行電泳。在一些實施方式中，所述質(zhì)子或氫氧根源是通過雙極膜與腔室分隔的質(zhì)子注射器或氫氧根注射器。
[0010]在一些實施方式中，本發(fā)明提供了一種同時根據(jù)等電點和電泳遷移率分離多種分子分析物的裝置，所述裝置包括，用于沿一條軸線盛放含多種分子分析物的溶液的腔室；用于在腔室內(nèi)沿軸線施加電場的電源；通過注射離子流在所述腔室內(nèi)沿所述軸線建立pH梯度、且能夠在pH梯度中形成一級或多級pH的一個或多個質(zhì)子/氫氧根源；操縱所述一個或多個離子源以調(diào)節(jié)PH梯度來沿軸線分別遷移和捕獲所述分子分析物的控制器。在一些實施方式中，所述質(zhì)子或氫氧根源是通過雙極膜與腔室分隔的質(zhì)子注射器或氫氧根注射器。
[0011]在一些實施方式中，所述腔室包含適用于電泳的篩分介質(zhì)。在一些實施方式中，所述腔室包含一個或多個與腔室流體連通的端口并且端口位于腔室中以根據(jù)分析物的Pl捕獲所需的分析物，或者端口能夠移動以將一個或多個端口定位在一個或多個所需的位置處。
[0012]在一些實施方式中，本發(fā)明提供了一種從樣品中純化目標蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括，向腔室中加入樣品，所述樣品含有包含所述目標蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)混合物；使用質(zhì)子和/或氫氧根注射器在腔室中產(chǎn)生PH梯度，從而基于蛋白質(zhì)等電點(pi)對腔室內(nèi)的蛋白質(zhì)進行定位；收集所述目標蛋白質(zhì)，從而從混合物的其他組分中純化所述目標蛋白質(zhì)；以及捕獲后對所述蛋白質(zhì)進行結(jié)晶。
[0013]在一些實施方式中，通過與通道流體連通的端口收集所述目標蛋白質(zhì)。在一些實施方式中，通過與通道流體連通的多個端口收集多種目標蛋白質(zhì)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1A和IB分別顯示了質(zhì)子和氫氧根注射器，包含與通道/腔室相鄰的一個小隔室，其中浸有Pt電極，以及將隔室與通道/腔室分隔的雙極膜。
[0015]圖2顯示了可能的電解質(zhì)及其與質(zhì)子注射器的相互作用。應當意識到，使用氫氧根注射器可提供類似的相互作用。
[0016]圖3就質(zhì)子/氫氧根注射器裝置顯示了一種實施方式。
[0017]圖4顯示了在質(zhì)子注射器或氫氧根注射器裝置中使用的集成式一次性通道的實施方式。可按需要設(shè)置用于使流體接觸質(zhì)子/氫氧根注射器隔室的狹縫。例如，在一些實施方式中，腔室中的狹縫為1-1000微米，在一些實施方式中約100微米?？砂葱枰O(shè)計狹縫的數(shù)量和大小以建立多級PH梯度。如圖4所示，任選例如纖維素或其他親水膜，作用是覆蓋未使用的狹縫和/或可任選覆蓋雙極膜，覆蓋程度是使得樣品組分與雙極膜之間存在親和力。在一些實施方式中，可使用親水涂料代替親水膜覆蓋雙極膜并阻止樣品組分與之結(jié)合。此外，還有狹縫可用于將樣品提取出或注射入通道。
[0018]圖5A-C顯示了 pH分級梯度的產(chǎn)生和使用該梯度分離目標分子。圖中，雙極膜(2)產(chǎn)生了一個大的PH差異，從而使樣品中不需要的組分(I)遠離目標分析物聚焦。第二雙極膜(4)以目標分析物(3)的pi為中心建立了較小的pH差異?？扇芜x地在腔室中的通道
(5)內(nèi)收集目標分析物(3)。
[0019]圖6顯示了 pH分級梯度的產(chǎn)生和使用該梯度分離多種目標分子。該實施方式可用于后續(xù)應用，進行電泳或其他應用。
[0020]圖7顯示了 pH分級梯度的產(chǎn)生和使用該梯度分離目標分子。這可用于例如蛋白質(zhì)清除、捕獲和直接注射入質(zhì)譜(MS)或其他檢測方法。
[0021]圖8A-D顯示了使用PH梯度分離和收集目標分子。
[0022]圖9顯示的實施方式中，本文所述腔室或通道適用于將分析物輸送至質(zhì)譜(圖9A)或光源(圖9B)。
[0023]圖10A-C顯示了對目標分子進行的數(shù)字pH分析分離。
[0024]圖11顯示了在一個維度中基于兩種分離標準對分子進行分離的實施方式。圖11顯示了圖中從頂部至底部運行的同一通道在四個時間點(a)、(b)、(c)和⑷的情況。通道左側(cè)的數(shù)字表示PH，在沿通道每個顯示有pH的位置都有一個質(zhì)子或氫氧根注射器。圖中顯示了樣品組分(111、112、113、114、115)在各時間點((a)、(b)、(c)和⑷)的電泳移動的情況。
[0025]圖12顯示了基于pi和另一維度的第二個分離標準對分子進行分離。
[0026]圖13顯示了一個實施方式，其中基于pi從污染物中分離目標蛋白質(zhì)并隨后進行結(jié)晶。從污染物中分離蛋白質(zhì)，移至腔室內(nèi)，可任選地使用集成回路，并進行結(jié)晶、快速冷凍和/或成像。
[0027]圖14A顯示了在緩沖液中電泳并在同一充有緩沖液的腔室內(nèi)通過H+注射進行“捕捉”的綠色熒光蛋白(GFP)信號。圖14B顯示了 GFP沉淀/ “捕捉”且加入CY5標記的抗GFP抗體后的CY5信號。所用緩沖液為4mM檸檬酸鈉、4mM磷酸鈉(磷酸氫二鈉)、4mM焦磷酸鈉和13mM硫酸鈉、pH8.5。
[0028]圖15A顯示了在緩沖液中電泳并在同一充有緩沖液的腔室內(nèi)通過H+注射進行“捕捉”的綠色熒光蛋白(GFP)信號。圖15B顯示了 GFP沉淀/ “捕捉”且加入CY5標記的抗兔(非特異性)抗體后的CY5信號。所用緩沖液為4mM檸檬酸鈉、4mM磷酸鈉(磷酸氫二鈉)、4mM焦磷酸鈉和13mM硫酸鈉、pH8.5。
【具體實施方式】
[0029]如此處所詳述，提供的方法和裝置允許在裝置的腔室內(nèi)從樣品中檢測、純化和/或分離目標分子(如蛋白質(zhì)、肽、核酸等)，可任選地使用I)電場以移動目標物，連同2)使用質(zhì)子或氫氧根注射器電子控制腔室分區(qū)中的溶液PH值。所述方法利用目標物電荷的pH依賴性，例如通過將接近分區(qū)的溶液pH值設(shè)置為等于或接近感興趣目標物的pi的特定pH，使得帶電的目標物定位在特定分區(qū)中。在目標物的Pl處，目標物變?yōu)椴粠щ姀亩陔妶鲋胁辉僖苿?。下文敘述了多個使用這一方面的數(shù)種實施方式。
[0030]所述裝置可具有多種配置。在一些方面，所述裝置包含至少一個含有第一和第二電極的腔室，用于在電場中移動帶電目標物。腔室可包含一個或多個(如1、2、3、4、5或更多個)通過雙極膜與腔室分隔的質(zhì)子或氫氧根注射器，其中所述注射器包含一個電極，從而能夠?qū)λ肿舆M行電水解。參見圖2。術(shù)語“腔室”和“通道”在本文中同義使用。這些術(shù)語包括長度遠大于寬度(如10x、100x、1000x)的容器，允許沿腔室的長軸放置多個注射器。
[0031]在不限制本發(fā)明范圍的前提下，這里指出已構(gòu)建以下尺寸的腔室。
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一種從樣品中分離一種或多種目標蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括， 向腔室中加入樣品，所述樣品含有包含一種或多種目標蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)混合物，其特征在于，所述腔室包含第一和第二電極和位于所述腔室壁上所述電極之間并通過雙極膜與所述腔室中的所述樣品分離的至少一個質(zhì)子注射器或氫氧根注射器； 使用所述質(zhì)子注射器或氫氧根注射器在所述腔室內(nèi)產(chǎn)生pH梯度，并跨越所述電極施加電壓，從而使所述腔室內(nèi)的蛋白質(zhì)基于所述蛋白質(zhì)的等電點(Pi)來定位； 在與通道流體連通的端口捕獲一種或多種蛋白質(zhì)；以及 對所述一種或多種捕獲的蛋白質(zhì)進行凝膠電泳。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述電泳為聚丙烯酰胺凝膠電泳。
3.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述方法還包括從所述電泳凝膠中收集所述一種或多種蛋白質(zhì)。
4.一種分離并檢測樣品中分析物的裝置，所述裝置包括， 用于沿一條軸線盛放含多種分子分析物的溶液的腔室，在所述腔室的軸線的第一末端含有一個樣品注射端口且在所述軸線的第二末端含有一個出口 ； 用于在所述腔室內(nèi) 沿所述軸線施加電場的電源； 通過雙極膜與所述腔室分離的一個或多個離子源，用于通過注射離子流在所述腔室中沿所述軸線建立pH梯度,能夠在一個pH梯度中形成一級或多級pH ； 操縱所述一個或多個離子源以調(diào)節(jié)所述pH梯度來引起所述分子分析物沿軸線分別遷移的控制器；以及 一個或多個出口，允許通過所述出口將一種或多種分析物收集至容器或分析儀器如質(zhì)譜或其他檢測系統(tǒng)內(nèi)。
5.一種從樣品中分離一種或多種目標蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括， 向腔室中加入樣品，所述樣品含有包含一種或多種目標蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)混合物，其特征在于，所述腔室連有通過雙極膜與所述腔室分隔的一個或多個離子源，用于通過注射離子流在所述腔室內(nèi)沿軸線建立pH梯度,能夠在pH梯度中形成一級或多級pH ； 對所述腔室內(nèi)的蛋白質(zhì)進行電泳；以及 隨后使用質(zhì)子和/或氫氧根注射器在所述腔室內(nèi)產(chǎn)生PH梯度，從而使所述腔室內(nèi)的蛋白質(zhì)基于所述蛋白質(zhì)的等電點(Pl)來定位。
6.如權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，在所述pH梯度建立期間繼續(xù)進行所述電泳。
7.如權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述方法還包括收集所述一種或多種目標蛋白質(zhì)。
8.一種同時根據(jù)等電點和電泳遷移率分離多種分子分析物的裝置，所述裝置包括， 用于沿一條軸線盛放含有多種分子分析物的溶液的腔室，其中所述腔室包含與所述腔室流體連通的一個或多個端口，所述端口位于腔室中以根據(jù)分析物的Pl捕獲所需的分析物，或者能夠移動以將所述一個或多個端口定位在一個或多個所需的位置處； 用于在所述腔室內(nèi)沿所述軸線施加電場的電源； 通過注射離子流在所述腔室內(nèi)沿所述軸線建立PH梯度，能夠在pH梯度中形成一級或多級PH的一個或多個質(zhì)子/氫氧根源； 操縱所述一個或多個離子源以調(diào)節(jié)所述PH梯度來引起所述分子分析物沿所述軸線分別遷移的控制器；以及 與所述一個或多個端口流體連通的一個或多個電泳通道，從而允許對所述一個或多個端口中捕獲的一種分析物進行電泳。
9.一種同時根據(jù)等電點和電泳遷移率分離多種分子分析物的裝置，所述裝置包括， 用于沿一條軸線盛放含多種分子分析物的溶液的腔室； 用于在所述腔室內(nèi)沿軸線施加電場的電源； 通過注射離子流在所述腔室內(nèi)沿所述軸線建立PH梯度，能夠在pH梯度中形成一級或多級PH的一個或多個質(zhì)子/氫氧根源； 操縱所述一個或多個離子源以調(diào)節(jié)所述PH梯度來引起所述分子分析物沿軸線分別遷移并捕獲的控制器。
10.如權(quán)利要求9所述裝置，其特征在于，所述腔室包含適用于電泳的篩分介質(zhì)。
11.如權(quán)利要求9或10所述裝置，其特征在于，所述腔室包含與所述腔室流體連通的一個或多個端口，并且所述端口位于所述腔室中以根據(jù)分析物的Pl捕獲所需的分析物，或者能夠移動以將所述一個或多個端口定位在一個或多個所需的位置處。
12.—種從樣品中純化目標蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括， 向腔室中加入樣品，所述樣品含有包含所述目標蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)混合物； 使用質(zhì)子和/或氫氧根注射器在所述腔室中產(chǎn)生PH梯度，從而使所述腔室內(nèi)的蛋白質(zhì)基于所述蛋白質(zhì)的等電點(Pl)來定位； 收集所述目標蛋白質(zhì)，從而從所述混合物的其他組分中純化所述目標蛋白質(zhì)；以及 捕獲后對所述蛋白質(zhì)進行結(jié)晶。
13.如權(quán)利要求12所述方法，其特征在于，通過與所述通道流體連通的端口收集所述目標蛋白質(zhì)。
14.如權(quán)利要求12所述方法，其特征在于，通過與所述通道流體連通的多個端口收集多種目標蛋白質(zhì)。
【文檔編號】G01N33/559GK104024856SQ201280065639
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月4日
【發(fā)明者】A·保勒斯, C·迪吉斯, R·保格弗, S·班德卡維, A·哈恩-溫德加森, A·珀什, E·布羅德, U·司旺 申請人:生物輻射實驗室股份有限公司, 泰克尼翁研究發(fā)展基金有限公司