專利名稱：siRNA綴合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種綴合物、制備該綴合物的方法以及利用該綴合物傳遞SiRNA的方法，其中，在癌癥和其它傳染性疾病的基因療法中用于促進siRNA傳遞的聚合物通過可降解鍵(degradable bond)或不可降解鍵綴合到siRNA。
背景技術(shù)：
RNA干擾是指這樣一種機制，其為在基因表達過程中，雙鏈RNA(dsRNA)通過核苷酸序列特異性方式啟動基因轉(zhuǎn)錄后沉 默，并且這種機制首先在線蟲(C.elegans)中被發(fā)現(xiàn)，并常見于植物、果蠅和脊椎動物(Fire等，自然(Nature), 391:806-811, 1998 ；；Novina&Sharp,自然(Nature)，430:161-164，2004)。已知以如下方式發(fā)生RNA干擾:進入到細胞內(nèi)的19 25bp的dsRNA與RISC(RNA_誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)結(jié)合，且僅反義(向?qū)?鏈與mRNA結(jié)合而與mRNA的核苷酸序列互補，從而通過存在于RISC的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域降解革巴 mRNA(Rana, T.M.，Nat.Rev.Mol.Cell Biol., 8:23-36, 2007 ;Tomari, Y.和 Zamore, P.D., Genes Dev.,19:517-529，2005)。當dsRNA被傳遞到細胞中，它特異性地結(jié)合靶基因序列以降解mRNA，因此，它被認為是一種可調(diào)控基因表達的新型工具。然而，對于人類來說，由于向人體細胞引入dsRNA會誘導(dǎo)抗病毒干擾素途徑，因此難以獲得RNAi效果。在2001年，Elbashir和Tuschl等發(fā)現(xiàn)向人體細胞導(dǎo)入21nt長度(核苷酸長度)的小dsRNA不會引起干擾素途徑，但特異性地降解靶mRNA (Elbashir, S.M., Harborth, J., Lendeckel, ff., Yalcin, A., Weber, K., Tuschl, T.,自然(Nature), 411, 494-498, 2001 ； ；Elbashir, S.Μ., Lendeckel, ff., Tuschl, Τ.,基因(Genes)& Dev.,15,188-200, 2001 ； ；Elbashir, S.Μ., Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel，ff.，Tuschl, T.，EMBO J.，20，6877-6888，2001)。因此，21nt 長度的 dsRNA 已經(jīng)作為一種新型的功能基因組工具引起了公眾的注意，并命名為小干擾RNA (siRNA)。自從siRNA被報道在動物細胞中抑制特定基因表達上具有極好的效果，siRNA作為一種基因治療的藥物引起了廣泛關(guān)注。實際上，由于它的高活性和精確的基因選擇性，根據(jù)20年的研究結(jié)果，siRNA有望成為一種目前用作治療藥物的反義寡核苷酸(ODN)的替代治療藥物(Dana J.Gary等，控釋雜志(Journal of ControlledRelease) 121:64-73，2007)。用于治療的siRNA技術(shù)具有顯著的優(yōu)勢，與其它藥物相比，它易于設(shè)計并具有高目標選擇性和抑制特定基因表達的性能。此外，由于RNA干擾利用生命系統(tǒng)中天然存在的機制抑制基因表達，所以它毒性較低。目前0ΡΚ0 Inc.開發(fā)的濕性老年黃斑變性病的治療藥物“貝伐西尼(Bevasiranib) ”為一種siRNA，其可選擇性地作用于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，誘導(dǎo)新血管形成以抑制VEGF的表達，并通過了三期臨床試驗(Dejneka NS 等，Mol Vis.，28 (14):997-1005，2008)。此外，目前正在研發(fā)含有祀向多種基因的siRNA的治療藥物(Ryan P.Million, Nature Reviews DrugDiscovery7:115-116，2008)。盡管各種結(jié)果表明體內(nèi)通過RNA干擾誘導(dǎo)特異性的表達抑制，但siRNA在體內(nèi)的傳遞還有許多問題需要解決，如在血液中被酶降解、與血液中組分的相互作用以及非特異性地傳遞給細胞(Shigeru Kawakami 和 Mitsuru Hashida, Drug Metab.Pharmacokinet.22
(3): 142-151，2007)。正在通過部分地利用抗核酸酶的核苷酸類似物或改良傳遞技術(shù)，嘗試克服這些問題。改良的傳遞技術(shù)的實例包括:利用病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等的基因傳遞技術(shù)，以及利用脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)和陽離子聚合物的非病毒載體的基因傳遞技術(shù)。然而，由于傳遞的基因有可能整合到宿主的染色體中，從而誘導(dǎo)宿主基因的正常功能發(fā)生異常并激活致癌基因，因此病毒載體存在安全性方面的問題，此外，即使以較小的量連續(xù)表達病毒基因也可能引起自身免疫性疾病，或在由病毒載體誘導(dǎo)的修飾的病毒感染情況下，可能不會引起有效的保護性免疫。同時，非病毒載體的有效性低于病毒載體，但考慮到體內(nèi)安全性和經(jīng)濟可行性，其具有副作用低和生產(chǎn)成本低的優(yōu)勢(Lehrman S.，自然(Nature).401 (6753): 517-518，1999)。此外，非病毒傳遞方法要求有效地保護酶或非酶的降解，以便傳遞包括siRNA的RNA分子，其中一種方法為利用編碼短發(fā)夾RNA (shRNA)的DNA表達質(zhì)粒。通過DNA的系統(tǒng)的優(yōu)勢在于，僅當表達載體存在時進行siRNA表達。此外，目前siRNA化學修飾的研究提出一種用于改良針對核酸酶的穩(wěn)定性以及低胞內(nèi)攝取的方法(Shigery Kawakami和MitsuruHashida.Drug Metab.Parmacokinet.22(3):142-151，2007)。在一種siRNA的化學修飾中，作為被核酸酶降解部位的磷酸二酯鍵用硫代磷酸連接進行修飾，或戊糖的2’位被2’ -0-meRNA、2’ -脫氧-2’ -氟尿嘧啶核苷或通過2’位和4’位連接形成的鎖核酸(LNA) 修飾,結(jié)果提高了血清中的穩(wěn)定性((Braasch D.A.等,Bioorg.Med.Chem.Lett.14:1139-1143，2003 ； ；Chiu Y.L.和 Rana Τ.Μ.，RNA, 9:1034-1048，2003 ；；Amarzguioui Μ.等，Nucleic Acid Res.31:589-595，2003)。在另一種化學修飾中，官能團連接到正義(反向?qū)?鏈的3’端區(qū)域，結(jié)果與對照相比，藥動力學特性得到了改良，體內(nèi)通過siRNA的親水性和疏水性的平衡在施用時誘導(dǎo)出較高的效率(Soutschek J.等，Nature432:173-1782004)。然而，上述方法在保護SiRNA免于核酸酶的消化以及改良細胞膜透性效率上仍然有許多有待改進之處?；谶@一原因，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種綴合物，其中親水性或疏水性聚合物通過可降解或不可降解鍵綴合到siRNA，改良了 siRNA的體內(nèi)穩(wěn)定性，并基于此完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的一個目的在于提供一種綴合物，其中作為生物相容性聚合物的親水性或疏水性聚合物通過可降解或不可降解鍵綴合到SiRNA的正義鏈或反義鏈的末端，以提高siRNA在細胞內(nèi)傳遞的效率。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種含有聚合物的固相支持物，具體地，施用到人體時穩(wěn)定性得到證實的聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，以及提供一種有效地制備包括RNA、DNA,RNA-DNA嵌合體及其類似物的寡核苷酸的方法，其中，通過支持物將PEG結(jié)合到它的3’端。本發(fā)明又一目的在于提供制備siRNA綴合物的方法，以及利用siRNA綴合物傳遞siRNA的方法。技術(shù)方案為實現(xiàn)上述的目的，首先，本發(fā)明提供一種siRNA-聚合物綴合物，其結(jié)構(gòu)如下:A-X-R-Y-B(其中，A和B獨立地為親水性聚合物或疏水性聚合物；X和Y獨立地為簡單的共價鍵或接頭介導(dǎo)的(linker-mediated)共價鍵；且R為siRNA)。其次，本發(fā)明提供一種siRNA-聚合物綴合物，其結(jié)構(gòu)如下:A-X-R(其中，A為疏水性聚合物；X為簡單的共價鍵或接頭介導(dǎo)的共價鍵；R為siRNA)第三，本發(fā)明 提供一種綴合物，其中SiRNA(R)的單鏈含有19 31個核苷酸。第四，本發(fā)明提供一種綴合物，其中疏水性聚合物(A)的分子量為250 1，000。第五，本發(fā)明提供一種綴合物，其中疏水性聚合物(A)為C16 C50烴或膽固醇。第六，本發(fā)明提供一種綴合物，其中共價鍵(X，Y)為不可降解鍵或可降解鍵。第七，本發(fā)明提供一 種綴合物，其中不可降解鍵為酰胺鍵或磷酸鍵。第八，本發(fā)明提供一種綴合物，其中可降解鍵選自二硫鍵、酸裂解鍵、酯鍵、酸酐鍵、生物降解鍵和酶裂解鍵。第九，本發(fā)明提供一種綴合物，其中親水性聚合物(Α或B)為分子量為1，000 10,000的非離子聚合物。第十，本發(fā)明提供一種綴合物，其中親水性聚合物選自下組:聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮和聚噁唑啉。第十一，本發(fā)明提供一種結(jié)合聚乙二醇的固相支持物，其結(jié)構(gòu)如下:
權(quán)利要求
1.結(jié)合有聚乙二醇的固相支持物，其具有以下結(jié)構(gòu):
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合有聚乙二醇的固相支持物，其中所述固相支持物為可控孔度玻璃(CPG)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)合有聚乙二醇的固相支持物，其中所述CPG的直徑為40 180 μ m，且孔徑為 500 A- 3000 A,
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合有聚乙二醇的固相支持物，其中所述結(jié)合有聚乙二醇的固相支持物是具有以下結(jié)構(gòu)式的3’ -PEG(聚乙二醇)-CPG: [結(jié)構(gòu)式IV]
5.制備具有以下結(jié)構(gòu)式IV的3’-PEG-CPG的方法，所述方法包括: 1)使CPG與3-氨丙基三乙氧基硅烷反應(yīng)，以形成長鏈烷基胺可控孔度玻璃(LCAA-CPG)； 2)使聚乙二醇與4，4’- 二甲氧基三苯甲基氯化物反應(yīng)，以形成2-[雙-(4- 二甲氧基三苯甲基)-聚(乙二醇)]； 3)使步驟2)中形成的化合物與具有下式I的化合物反應(yīng)，以形成具有以下結(jié)構(gòu)式I的化合物； 4)使形成的具有以下結(jié)構(gòu)式I的化合物與4-硝基苯基氯甲酸酯反應(yīng)，以形成具有下式II的化合物； 5)使步驟3)中形成的具有以下結(jié)構(gòu)式I的化合物與N-琥珀酰亞胺基三氟乙酸反應(yīng)，以形成具有以下結(jié)構(gòu)式III的化合物；以及 6)使步驟I)中形成的LCAA-CPG化合物分別與步驟3)至5)中形成的具有以下結(jié)構(gòu)式.1、II和III的化合物反應(yīng) [式I]
全文摘要
本發(fā)明提供一種siRNA-聚合物綴合物及其制備方法，更具體地，涉及一種通過siRNA和用于提高siRNA生物穩(wěn)定性的聚合物的共價結(jié)合而形成的雜合綴合物，以及制備該雜合綴合物的方法。本發(fā)明的綴合物能提高siRNA的生物穩(wěn)定性，從而實現(xiàn)治療性siRNA向細胞的有效傳遞，且即使相對低濃度的小劑量也具有siRNA的活性。因此，該綴合物不僅可有利地用作癌癥和其它傳染性疾病的siRNA治療工具，也可用作一種新型的siRNA傳遞系統(tǒng)。
文檔編號C08G65/48GK103233003SQ201310147988
公開日2013年8月7日 申請日期2010年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月14日
發(fā)明者韓寶藍, 樸翰浯, 申美湜, 李三用 申請人:株式會社百奧尼