核酸的檢測本申請是申請日為2007年6月1日、申請?zhí)枮?00780027007.0、發(fā)明名稱為“核酸的檢測”的發(fā)明專利申請的分案申請。技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于檢測和表征核酸分子（例如，RNA（例如，小RNA例如微RNA（miRNA）和小干擾RNA（siRNA））和其他短核酸分子）的組合物和方法。更具體而言，本發(fā)明涉及用于檢測和定量RNA表達(dá)的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了miRNA和siRNA的突變體（例如,缺失突變體）和變體的檢測。發(fā)明背景微RNA（miRNA）是新的一類非編碼RNA，其在無脊椎動物和脊椎動物基因組中編碼為短的反向重復(fù)（Ambros,(2001)Cell107,823-826;Moss(2002)Curr.Biol.12,R138-R140）。miRNA是靶mRNA翻譯和穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)劑，雖然大多數(shù)靶mRNA仍未鑒定。miRNA通過結(jié)合至在3'非翻譯區(qū)（UTRs）中的反義互補(bǔ)位點而以序列特異性的方式來控制靶mRNA的翻譯（Ambros,同上;Moss,同上;Lagos-Quintana等人,(2001)Science294,853-858;Lau等人,(2001)Science294,858-862;Lee等人,(2001)Science294,862-864）。miRNA還可以通過其他機(jī)制來抑制基因表達(dá)（參見，例如Pillai等人,Science309,1573-1576(2005);Humphreys等人,ProcNatlAcadSciUSA102,16961-16966(2005)）。在無脊椎動物和脊椎動物之間，幾種miRNA，例如let-7RNA、miR-1、miR-34、miR-60和miR-87是高度保守的，這暗示它們可以識別具有可能保守的功能的多個位點和/或多個靶（Lagos-Quintana等人,同上;Lau等人,同上;Lee等人,同上;Pasquinelli等人,(2000)Nature408:86）。小時序RNA（stRNA）lin-4和let-7代表了一亞類通過在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans）中的遺傳分析而鑒定出的miRNA，它們在發(fā)育上受到調(diào)控并且它們本身控制發(fā)育進(jìn)程，例如神經(jīng)元重新布線（neuronalrewiring）的時機(jī)、持久幼蟲的形成、陰門的形成以及皮下細(xì)胞的終末分化。miRNA通常從60至70個核苷酸的折回RNA前體結(jié)構(gòu)中切出，所述折回RNA前體結(jié)構(gòu)有時在miRNA前體表達(dá)開始時（Grishok等人,(2001)Cell106,23-34;Hutvagner等人(2001)Science93,834-838;Ketting等人,(2001)GenesDev.15,2654-2659）或在非常豐富的miRNA的表達(dá)過程中被檢測出（Lagos-Quintana等人,同上;Lau等人,同上;Lee等人,同上）。一般地，發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體分子的僅一條鏈被切除并積累，這可能是由于其受到相關(guān)蛋白質(zhì)的保護(hù)而免于RNA降解。這些假定的蛋白質(zhì)可能介導(dǎo)了翻譯抑制。miRNA前體加工反應(yīng)需要DicerRNaseIII和Argonaute家族成員（Grishok等人,同上;Hutvagner等人,同上;Ketting等人,同上）。除了它們對于基因表達(dá)的影響外，小RNA（例如，具有18-25個核苷酸的siRNA或miRNA）還可以用于治療和藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域（例如，藥品靶或藥劑）。因此，在某些情況下，重要的是大概知道在細(xì)胞中每種miRNA存在的量（例如，在治療前、在治療過程中或在治療后）。此外，miRNA基因的缺失和下調(diào)與癌癥（例如，B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL））相關(guān)，從而在本領(lǐng)域中產(chǎn)生了對于能夠檢測和表征miRNA表達(dá)的需要（參見，例如Calin等人,ProcNatlAcadSciUSA,99,15524-15529(2002)）。在某些情況下，也重要的是，比較miRNA在不同組織類型中的水平，或者比較在施加刺激（例如化學(xué)或物理干預(yù)）之前和之后miRNA的水平。由于相關(guān)的siRNA和miRNA可能在細(xì)胞中以少量存在，所以希望檢測方法是靈敏的和特異的。此外，對于某些應(yīng)用而言，可能有利的是，鑒定出適用于高通量篩選的方法，例如均相（homogeneous）方法，多重（multiplexed）方法，或適用于高度平行的自動化操作和有限的溫度變化的方法。雖然miRNA在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中起著重要作用，但是缺少用于檢測和定量miRNA表達(dá)的有效技術(shù)。用于定量miRNA的方法基于凝膠電泳。通過Northern印跡法或者通過放射性的RNA酶抗性雙鏈體的存在來檢測miRNA。Northern印跡法和芯片雜交方法具有相對較低的分析靈敏度（Krichevsky等人2003），因此需要微克量的RNA來用于分析；此外，小RNA向過濾器的轉(zhuǎn)移可引起與定量的再現(xiàn)性有關(guān)的問題，并且通常不能修正成高通量。而且，基于RNA酶抗性的檢測方法需要高放射性的探針。此外，僅僅基于探針雜交的測定法可能不提供在序列方面密切相關(guān)的同種型之間的足夠的區(qū)分。備選的方法包括克隆miRNA，然后對插入片段進(jìn)行測序。盡管該方法可適用于區(qū)分在密切相關(guān)的miRNA種類之間的單堿基差異，但是這種方法是耗時且費力的。與miRNA相似，小干擾RNA（siRNA）是通過稱為RNA干擾（RNAi）的應(yīng)答而參與細(xì)胞防御（例如，針對病毒RNA）的小RNA分子（Cullen,B.R.,NatureImmunology,3:597-599(2002)）。通過作為針對細(xì)胞中存在雙鏈RNA的RNAi應(yīng)答的一部分的Dicer酶和RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）蛋白質(zhì)復(fù)合體的作用，產(chǎn)生出一類siRNA（Khvorova,A.等人,Cell115:209-216(2003)）。另一類siRNA是合成的，并且包括通常21-23nt的短雙鏈體，其具有特征性的二核苷酸突出端（Elbashir,S.M.等人,EMBOJ.20:6877-6888(2001)），其通過所引入的載體的轉(zhuǎn)染或表達(dá)而被直接引入到細(xì)胞中（Paul,C.P.等人,NatureBiotechnology20:505-508(2002),美國專利申請公開號2003/0148519A1,通過提及而以其整體合并入本文以用于所有目的）。在某些情況下，siRNA似乎堅持作為確定的序列，這使得它們在功能和組成方面與miRNA相似（Elbashir,S.M.等人,同上）。需要用于檢測和表征（例如定量）miRNA和siRNA水平的有效且精確的方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于檢測和表征核酸分子（例如，RNA（例如，小RNA例如微RNA（miRNA）和小干擾RNA（siRNA））和其他短核酸分子）的組合物和方法。更具體而言，本發(fā)明涉及改進(jìn)的用于檢測和表征（例如定量）RNA表達(dá)的方法。例如，本發(fā)明提供了一種方法，其包括：使至少一種核酸（例如，其包含不與干擾RNA互補(bǔ)的序列）與干擾RNA靶雜交從而產(chǎn)生檢測結(jié)構(gòu)，并檢測該檢測結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，干擾RNA靶為miRNA。在其他實施方案中，干擾RNA靶為siRNA。在一些實施方案中，siRNA是雙鏈的。在一些實施方案中，所述檢測結(jié)構(gòu)包括侵入性切割結(jié)構(gòu)（invasivecleavagestructure）。例如，在一些實施方案中，所述核酸包含第一種和第二種寡核苷酸，它們被構(gòu)造成與miRNA相組合地形成侵入性切割結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，所述核酸包含第一種寡核苷酸，該寡核苷酸被構(gòu)造成與所述miRNA相組合地形成侵入性切割結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，所述第一種寡核苷酸包含5'部分和3'部分，其中所述3'部分被構(gòu)造成與所述靶序列雜交，和其中所述5'部分被構(gòu)造成不與所述靶序列雜交。在使用第二種寡核苷酸的一些實施方案中，所述第二種寡核苷酸包含5'部分和3'部分，其中所述5'部分被構(gòu)造成與所述靶序列雜交，和其中所述3'部分被構(gòu)造成不與所述靶序列雜交。在一些實施方案中，所述檢測步驟包括使用INVADER測定法。在一些實施方案中，所述檢測結(jié)構(gòu)包含環(huán)狀寡核苷酸，其與所述小RNA雜交從而產(chǎn)生環(huán)狀檢測結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，所述檢測步驟包括使用滾環(huán)復(fù)制測定法。在一些實施方案中，所述檢測結(jié)構(gòu)包含具有通過聚合酶進(jìn)行延伸（例如，模板依賴性的延伸）的游離3'-OH基團(tuán)的核酸分子，并且直接或間接檢測經(jīng)延伸的序列。在一些實施方案中，所述檢測步驟包括使用檢測測定法，包括但不限于：測序測定法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測定法、雜交測定法、使用與突變互補(bǔ)的探針的雜交測定法、微陣列測定法、珠陣列測定法、引物延伸測定法、酶錯配切割測定法、分支雜交測定法（branchedhybridizationassays）、NASBA測定法、分子信標(biāo)測定法、循環(huán)探針測定法、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測定法、侵入性切割結(jié)構(gòu)測定法、ARMS測定法以及夾心式雜交測定法。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述檢測步驟是在細(xì)胞裂解物中進(jìn)行的。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括檢測第二種核酸靶。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述第二種核酸靶為RNA。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，所述第二種核酸靶為U6RNA或GAPDHmRNA。在一些實施方案中，用于形成檢測結(jié)構(gòu)的核酸包括模板，其具有一個或多個與小RNA充分互補(bǔ)的位點，從而使得所述RNA與所述模板雜交并且在延伸反應(yīng)中被延伸。在一些實施方案中，所述延伸反應(yīng)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中一種或多種RNA在所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中用作引物。在一些此類實施方案中，單種類型的RNA與所述模板上的兩個位置結(jié)合，從而提供了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物。在其他實施方案中，兩種或更多種RNA被用作引物。在此類實施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測表明樣品中存在所述兩種或更多種RNA（即，miRNA多重（multiplex）測定法）。在連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，可以采用類似的方法，其中miRNA用作連接的寡核苷酸。在一些實施方案中，將RNA用作模板，以用于通過跨越該RNA模板的至少一部分的引物延伸來對檢測復(fù)合物進(jìn)行修飾。在一些實施方案中，所述方法包括檢測多種miRNA。在一些此類實施方案中，所述多種miRNA包括同一miRNA的多態(tài)性。在其他實施方案中，所述多種miRNA包括不同的miRNA（例如，Let-7、miR-1、miR-1d、miR-135、miR-15、miR-16、miR-124a或miR125b）。本發(fā)明還提供了用于實施上述方法中的任一種方法的試劑盒。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含核酸的試劑盒，所述核酸被構(gòu)造成當(dāng)與RNA靶序列雜交時形成檢測結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，所述試劑盒被構(gòu)造成用于檢測miRNA。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒被構(gòu)造成用于檢測Let-7、miR-1、miR-135、miR-15、miR-16、miR-1b、miR-124a或miR125bmiRNA。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒被構(gòu)造成用于共同檢測第二種RNA靶以及miRNA靶。本發(fā)明還提供了用于檢測miRNA靶的方法，其包括下列步驟：提供(i)miRNA靶，(ii)第一種未標(biāo)記的寡核苷酸，(iii)第二種未標(biāo)記的寡核苷酸，(iv)逆轉(zhuǎn)錄酶，(v)聚合酶，和(vi)探針寡核苷酸；在使得檢測結(jié)構(gòu)能夠形成的條件下溫育(i)至(vi)；以及檢測所述檢測結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，所述第一種未標(biāo)記的寡核苷酸包含與所述miRNA靶互補(bǔ)的第一區(qū)域以及與所述miRNA靶不互補(bǔ)的第二區(qū)域。在一些實施方案中，所述第二種未標(biāo)記的寡核苷酸包含與所述miRNA靶的第二區(qū)域互補(bǔ)的第一區(qū)域以及與所述miRNA靶的第二區(qū)域不互補(bǔ)的第二區(qū)域。在一些實施方案中，所述檢測包括：形成侵入性切割結(jié)構(gòu)，切割所述侵入性切割結(jié)構(gòu)，并檢測所述侵入性切割結(jié)構(gòu)的切割。在一些實施方案中，所述溫育進(jìn)一步包括使用能夠切割檢測結(jié)構(gòu)但不具有聚合酶活性的酶進(jìn)行溫育。在一些實施方案中，所述酶為5'核酸酶，而在一些實施方案中，所述酶包括FEN-1核酸酶。在一些實施方案中，切割侵入性切割結(jié)構(gòu)的過程在45℃至60℃的溫度下進(jìn)行。在一些實施方案中，切割侵入性切割結(jié)構(gòu)的過程在大約50℃的溫度下進(jìn)行。在一些實施方案中，所述第一種未標(biāo)記的寡核苷酸用作用于反轉(zhuǎn)錄的引物。在一些實施方案中，所述第一種未標(biāo)記的寡核苷酸在侵入性切割反應(yīng)中用作INVADER寡核苷酸。在一些實施方案中，(i)至(vi)存在于同一個反應(yīng)容器內(nèi)。在一些實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括提供(vii)第二種探針寡核苷酸。在一些實施方案中，所述第一種未標(biāo)記的寡核苷酸和所述逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄miRNA靶。在一些實施方案中，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中通過所述第一種未標(biāo)記的寡核苷酸和所述第二種未標(biāo)記的寡核苷酸和所述DNA聚合酶來擴(kuò)增經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的miRNA靶（即，miRNAcDNA靶）。在一些實施方案中，該經(jīng)擴(kuò)增的、經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的miRNA靶在所述探針寡核苷酸存在下形成檢測結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，所述第一種未標(biāo)記的寡核苷酸包含這樣的核酸序列，即使得在所述寡核苷酸和所述miRNA靶之間形成大約6-7個堿基對的雙鏈體。本發(fā)明能夠檢測以非常少的拷貝數(shù)存在的miRNA。例如，在一些實施方案中，檢測了樣品中少于200個拷貝的miRNA。在一些實施方案中，檢測了樣品中少于100個拷貝的miRNA。在一些實施方案中，所述第二種未標(biāo)記的寡核苷酸包含這樣的核酸序列，即使得在所述寡核苷酸和所述miRNA靶之間形成大約9個堿基對的雙鏈體。在一些實施方案中，所述探針寡核苷酸包含這樣的核酸序列，即使得在所述寡核苷酸和所述miRNA靶或所述miRNA靶的經(jīng)擴(kuò)增的拷貝之間形成大約8-10個堿基對的雙鏈體。在一些實施方案中，所述第一種未標(biāo)記的寡核苷酸探針的第二區(qū)域包含第一部分和第二部分，其中所述第一部分和所述第二部分可以彼此雜交。在一些實施方案中，當(dāng)所述第一部分和所述第二部分彼此雜交時，在所述第一種未標(biāo)記的寡核苷酸探針中形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，所述第二種未標(biāo)記的寡核苷酸探針的第二區(qū)域包含第一部分和第二部分，其中所述第一部分和所述第二部分可以彼此雜交。在一些實施方案中，當(dāng)所述第一部分和所述第二部分彼此雜交時，在所述第二種未標(biāo)記的寡核苷酸探針中形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括提供(vii)與所述第一種未標(biāo)記的寡核苷酸探針的區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸。在一些實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括提供(vii)與所述第二種未標(biāo)記的寡核苷酸探針的區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸。在一些實施方案中，在大約50℃的溫度下切割侵入性切割結(jié)構(gòu)使得能夠以高保真度來區(qū)分靶序列，雖然可以基于序列、緩沖液成分等來選擇其他溫度以達(dá)到最佳性能。在一些實施方案中，所述靶序列包括單一種類的變體miRNA。在一些實施方案中，增加探針寡核苷酸的濃度會增加檢測miRNA靶的靈敏度。在一些實施方案中，檢測了兩種或更多種miRNA。在一些實施方案中，所述檢測包括使用經(jīng)標(biāo)記的探針。在一些實施方案中，所述經(jīng)標(biāo)記的探針是經(jīng)熒光標(biāo)記的。在一些實施方案中，所述經(jīng)標(biāo)記的探針被構(gòu)造成用于FRET檢測。在一些實施方案中，所述經(jīng)標(biāo)記的探針當(dāng)未在雙鏈體中雜交時具有第一構(gòu)象，和當(dāng)在雙鏈體中雜交時具有第二構(gòu)象。在一些實施方案中，當(dāng)在雙鏈體中雜交時，所述經(jīng)標(biāo)記的探針展現(xiàn)出增強(qiáng)的熒光。本發(fā)明并不受到所檢測的miRNA的限制。事實上，可以使用本發(fā)明的組合物和方法來檢測各種miRNA，包括但不限于Let-7、miR-1、miR-135、miR-15、miR-16、miR125b、miR-1d和miR124a。本發(fā)明還提供了試劑盒，其包含下列中的一種或多種：第一種未標(biāo)記的寡核苷酸，其包含與miRNA靶互補(bǔ)的第一區(qū)域以及與所述miRNA靶不互補(bǔ)的第二區(qū)域；第二種未標(biāo)記的寡核苷酸，其包含與所述miRNA靶的第二區(qū)域互補(bǔ)的第一區(qū)域以及與所述miRNA靶的所述第二區(qū)域不互補(bǔ)的第二區(qū)域；逆轉(zhuǎn)錄酶；DNA聚合酶；探針寡核苷酸；以及能夠切割檢測結(jié)構(gòu)的酶。在一些實施方案中，所述檢測結(jié)構(gòu)包括侵入性切割結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，所述試劑盒被構(gòu)造成用于檢測miRNA靶以及至少一種其他RNA靶。在一些實施方案中，所述試劑盒被構(gòu)造成用于檢測細(xì)胞裂解物中的miRNA靶序列。附圖說明圖1顯示了用于在單個反應(yīng)中檢測兩個不同的等位基因（例如，區(qū)別在于單個核苷酸）的INVADER（侵入者）寡核苷酸、探針寡核苷酸和FRET盒的示意圖。圖2顯示了在本發(fā)明的一些實施方案中使用的示例性檢測結(jié)構(gòu)。圖3顯示了在本發(fā)明的一些實施方案中使用的第二種示例性檢測結(jié)構(gòu)。圖4顯示了在本發(fā)明的一些實施方案中使用的第三種示例性檢測結(jié)構(gòu)。圖5顯示了本發(fā)明所使用的示例性寡核苷酸。靶miRNA的堿基為小寫字體并帶有下劃線。探針或INVADER寡核苷酸中的DNA殘基為規(guī)則字體。小寫字體表示2'-O-甲基殘基。圖6顯示了關(guān)于let-7的溫度最佳化實驗的結(jié)果。圖7顯示了關(guān)于let-7的溫度最佳化實驗的結(jié)果。圖8顯示了關(guān)于let-7的檢測極限（LOD）實驗的結(jié)果。圖9顯示了使用let-7miRNA的交叉反應(yīng)性實驗的結(jié)果。圖10顯示了關(guān)于miR-1的LOD實驗的結(jié)果。圖11顯示了使用let-7miRNA的CLEAVASE酶IX和XII比較的結(jié)果。圖12顯示了來自各種生物的U6RNA序列的部分序列比對。圖13顯示了關(guān)于mir-135的溫度最佳化實驗的結(jié)果。圖14顯示了關(guān)于mir-135的LOD實驗的結(jié)果。圖15包含了關(guān)于檢測細(xì)胞裂解物中的let-7所獲得的平均計數(shù)的圖形表示。圖16顯示了在使用和未使用RNA酶A處理的細(xì)胞裂解物中miRNA和mRNA的結(jié)果。圖17顯示了侵入性切割測定法的結(jié)果，其比較了包括全長ARRESTOR（阻止者）寡核苷酸的效果與包括縮短的ARRESTOR寡核苷酸的效果。圖18顯示了溫度最佳化實驗的結(jié)果，其使用在圖16中所描述的測定法設(shè)計。圖19顯示了溫度最佳化實驗的結(jié)果，其使用10聚體探針和12聚體INVADER寡核苷酸設(shè)計。圖20顯示了比較兩種備選的寡核苷酸設(shè)計的LOD的實驗結(jié)果。圖21顯示了結(jié)果，其比較了用2’-脫氧殘基替代探針和INVADER寡核苷酸中的一些或全部2’-O-甲基殘基的效果。圖22顯示了用于檢測miR-124a的侵入性切割測定法的結(jié)果。圖23顯示了用于在從20種不同組織類型中分離得到的總RNA中檢測五種不同的miRNA種類的實驗結(jié)果。圖24顯示了實驗結(jié)果，所述實驗測試了改變探針和寡核苷酸長度對于miRNA檢測的影響。圖25顯示了用于檢測siRNA的示例性的侵入性切割寡核苷酸設(shè)計。小寫字母表示2’-O-甲基。圖26顯示了具有相同的let-7a雜交區(qū)域、但具有不同的5'-翼片（flap）“臂”序列的兩種探針。圖27顯示了圖表，其描繪了對于分別以1μM和10nM（混合物vii）以及1μM和4nM（混合物ix）進(jìn)行混合的探針1544-82-01和2343-25-01而言，拷貝數(shù)對凈信號的圖。圖28顯示了具有相同的U6RNA雜交區(qū)域、但具有不同的5'-翼片“臂”序列的兩種寡核苷酸探針。圖29顯示了圖表，其描繪了對于分別以1μM和4nM混合物進(jìn)行混合的探針1796-53-01和2343-30-01而言，拷貝數(shù)對凈信號的圖。圖30顯示了圖表，其描繪了對于雙重U6和Let-7a檢測而言，拷貝數(shù)對凈信號的圖。圖31顯示了在用于檢測和表征與癌癥相關(guān)的miRNA的本發(fā)明開發(fā)過程中所產(chǎn)生的各種寡核苷酸。圖32描述了用于使用包括反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和侵入性切割測定法反應(yīng)的測定法來檢測miRNA的總體設(shè)計。圖33顯示了凈信號對Let-7a拷貝數(shù)/反應(yīng)的圖。圖34顯示了作為溫度的函數(shù)的凈信號。圖35顯示了作為let-7a拷貝數(shù)的函數(shù)進(jìn)行作圖的let-7a反應(yīng)的原始信號（rawsignal）。圖36顯示了作為let-7aRNA拷貝數(shù)的函數(shù)進(jìn)行作圖的let-7a堆疊者（stacker）和發(fā)夾測定法的原始信號。圖37顯示了作為let-7a拷貝數(shù)的函數(shù)的通過一步和兩步let-7a測定法所產(chǎn)生的凈信號。圖38顯示了作為let-7a拷貝數(shù)的函數(shù)的通過使用探針1716-94-1、1717-94-10或1716-94-11的let-7a測定法所產(chǎn)生的凈信號。圖39顯示了作為let-7a拷貝數(shù)的函數(shù)的通過使用不同比率的探針1716-94-1和1717-94-11的let-7a測定法所產(chǎn)生的凈信號。圖40顯示了作為let-7a、let-7c、let-7e或let-7f拷貝數(shù)的函數(shù)的通過let-7a測定法所產(chǎn)生的凈信號。圖41顯示了根據(jù)實施例19（M）中所列出的指導(dǎo)方針而設(shè)計的、用于檢測與癌癥相關(guān)的miRNA而產(chǎn)生的寡核苷酸。圖42顯示了具有變化長度的初級探針（primaryprobe）和PCR引物雜交區(qū)域的用于let-7a和miR-16的另外設(shè)計。圖43提供了表格，其列出了在實施例19中使用的所有寡核苷酸，分別為SEQIDNO:144-285。定義為了幫助理解本發(fā)明，下面定義了許多術(shù)語和短語：如本文所使用的，術(shù)語“miRNA”是指微RNA。如本文所使用的，術(shù)語“miRNA靶序列”是指待檢測（例如在其他核酸存在下）的miRNA。在一些實施方案中，miRNA靶序列為miRNA的變體。如本文所使用的，術(shù)語“RNA檢測結(jié)構(gòu)”和“檢測結(jié)構(gòu)”是指通過使核酸（例如寡核苷酸）與RNA靶（例如miRNA或siRNA）雜交而形成的結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，所述核酸為單種核酸（例如，其一個或多個小區(qū)域與miRNA具有同源性的較大核酸）。在其他實施方案中，所述核酸包括兩種核酸（例如，它們與miRNA雜交從而形成發(fā)夾（例如單個或兩個發(fā)夾）結(jié)構(gòu)）。在優(yōu)選的實施方案中，miRNA檢測結(jié)構(gòu)能夠采用已知的核酸檢測方法（包括但不限于本文所公開的那些）來檢測。在一些實施方案中，在雜交步驟之后，進(jìn)一步修飾RNA檢測結(jié)構(gòu)。例如，在一些實施方案中，所述檢測結(jié)構(gòu)的一個或多個組分提供了用于通過核酸聚合酶進(jìn)行延伸的模板。在其他實施方案中，所述檢測結(jié)構(gòu)的一個或多個組分與連接酶相接觸，并被連接至另外的核酸。術(shù)語“siRNA”是指短干擾RNA。在一些實施方案中，siRNA包含雙鏈體或雙鏈區(qū)域，其中所述雙鏈區(qū)域的每條鏈的長度為大約18至25個核苷酸；所述雙鏈區(qū)域的長度可以短至16個堿基和長至29個堿基對，其中該長度由反義鏈決定。通常，siRNA在每條鏈的3'末端包含大約2至4個未配對的核苷酸。在無脊椎動物和脊椎動物中引發(fā)RNA干擾方面，以及在植物中在轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程中引發(fā)序列特異性RNA降解方面，siRNA似乎起著關(guān)鍵的中間物的作用。siRNA的雙鏈體或雙鏈區(qū)域中的至少一條鏈與靶RNA分子基本上同源或者基本上互補(bǔ)。與靶RNA分子互補(bǔ)的鏈為“反義”鏈；與靶RNA分子同源的鏈為“正義”鏈，并且該鏈還與siRNA反義鏈互補(bǔ)。雙鏈區(qū)域中的一條鏈不必具有相反鏈的確切長度，因此，一條鏈可以比相反的互補(bǔ)鏈少至少一個核苷酸，從而導(dǎo)致在相反鏈中形成“泡”或至少一個未匹配的堿基。雙鏈區(qū)域的一條鏈不必與相反鏈精確互補(bǔ)；因此，所述鏈（優(yōu)選為正義鏈）可以具有至少一個錯配的堿基對。siRNA還可以包含另外的序列；此類序列的非限定性實例包括，連接序列，或環(huán)，其連接了雙鏈體區(qū)域的兩條鏈。這種形式的siRNA可以被稱為“si-樣RNA”、“短發(fā)夾siRNA”（其中短涉及siRNA的雙鏈體區(qū)域）或“發(fā)夾siRNA”。在siRNA中存在的另外序列的另外非限定性實例包括莖和其他折疊結(jié)構(gòu)。所述另外的序列可以具有或不具有已知的功能；此類功能的非限定性實例包括增加siRNA分子的穩(wěn)定性或提供細(xì)胞目的信號（cellulardestinationsignal）。如本文所使用的，術(shù)語“受試者”和“患者”是指任何生物，包括植物、微生物和動物（例如，哺乳動物例如狗、貓、家畜和人）。如本文所使用的，術(shù)語“INVADER測定法試劑”或“侵入性切割測定法試劑”是指一種或多種用于檢測靶序列的試劑，所述試劑包括能夠在靶序列存在下形成侵入性切割結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。在一些實施方案中，INVADER測定法試劑進(jìn)一步包括用于檢測侵入性切割結(jié)構(gòu)的存在的試劑（例如切割試劑）。在一些實施方案中，所述寡核苷酸包括第一種寡核苷酸和第二種寡核苷酸，所述第一種寡核苷酸包含與靶核酸的第一區(qū)域互補(bǔ)的5'部分，和所述第二種寡核苷酸包含3'部分和5'部分，其中所述5'部分與位于所述第一部分下游并與之鄰接的靶核酸的第二區(qū)域互補(bǔ)。在一些實施方案中，所述第二種寡核苷酸的3'部分包含與靶核酸不互補(bǔ)的3'末端核苷酸。在優(yōu)選的實施方案中，所述第二種寡核苷酸的3'部分由與靶核苷酸不互補(bǔ)的單個核苷酸組成。在一些實施方案中，所述第一種寡核苷酸和第二種寡核苷酸彼此共價偶聯(lián)（例如，通過連接體）。在一些實施方案中，INVADER測定法試劑進(jìn)一步包括固體支持物。例如，在一些實施方案中，測定法試劑的所述一種或多種寡核苷酸（例如，第一種和/或第二種寡核苷酸，不論橋接還是非橋接）被附著在固體支持物上。在一些實施方案中，INVADER測定法試劑進(jìn)一步包括緩沖液。在優(yōu)選的實施方案中，所述緩沖液包含二價陽離子（例如Mn2+和/或Mg2+離子）源。共同構(gòu)成INVADER測定法試劑的獨個成分（例如，寡核苷酸、酶、緩沖劑、靶核酸）被稱為“INVADER測定法試劑組分”。在一些實施方案中，INVADER測定法試劑進(jìn)一步包括第三種寡核苷酸，其與位于所述第一種靶核酸的第一部分上游的靶核酸的第三部分互補(bǔ)。在其他實施方案中，INVADER測定法試劑進(jìn)一步包括靶核酸。在一些實施方案中，INVADER測定法試劑進(jìn)一步包括第二種靶核酸。在其他實施方案中，INVADER測定法試劑進(jìn)一步包括第三種寡核苷酸，該寡核苷酸包含與所述第二種靶核酸的第一區(qū)域互補(bǔ)的5'部分。在一些具體的實施方案中，所述第三種寡核苷酸的3'部分與所述第二種靶核酸共價連接。在其他具體的實施方案中，所述第二種靶核酸進(jìn)一步包含5'部分，其中所述第二種靶核酸的所述5'部分為第三種寡核苷酸。在其他實施方案中，INVADER測定法試劑進(jìn)一步包括ARRESTOR分子（例如ARRESTOR寡核苷酸）。包括2'O-甲基化的ARRESTOR寡核苷酸（其與每種探針的靶特異性區(qū)域完全堿基配對，并且與該探針的5'-翼片區(qū)域部分堿基配對）會隔離未切割的探針并防止在次級反應(yīng)（secondaryreaction）中X結(jié)構(gòu)的形成，如Eis等人,NatureBiotechnology,19:673-676(2001)所述，該文獻(xiàn)通過提及而以其整體合并入本文以用于所有目的。在一些優(yōu)選的實施方案中，INVADER測定法試劑進(jìn)一步包括用于檢測核酸切割產(chǎn)物的試劑。在一些實施方案中，在INVADER測定法試劑中的一種或多種寡核苷酸包含標(biāo)記物。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述第一種寡核苷酸包含標(biāo)記物。在其他優(yōu)選的實施方案中，所述第三種寡核苷酸包含標(biāo)記物。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述試劑包括用能夠產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）效應(yīng)的部分進(jìn)行標(biāo)記的第一種和/或第三種寡核苷酸。在一些實施方案中，可以以預(yù)調(diào)配（predispensed）形式提供一種或多種INVADER測定法試劑（即，進(jìn)行預(yù)測量以在該操作過程的步驟中使用，而無需再測量或再調(diào)配）。在一些實施方案中，將所選的INVADER測定法試劑組分混合和預(yù)調(diào)配在一起。在優(yōu)選的實施方案中，將經(jīng)預(yù)調(diào)配的測定法試劑組分進(jìn)行預(yù)調(diào)配，并提供在反應(yīng)容器（包括但不限于反應(yīng)管或孔（例如微量滴定板中的孔））中。在特別優(yōu)選的實施方案中，經(jīng)預(yù)調(diào)配的INVADER測定法試劑組分在反應(yīng)容器中干燥（例如，烘干或凍干）。在一些實施方案中，INVADER測定法試劑以試劑盒的形式提供。如本文所使用的，術(shù)語“試劑盒”是指用于遞送材料的任何遞送系統(tǒng)。在反應(yīng)測定法的情況下，這樣的遞送系統(tǒng)包括允許從一個地方至另一個地方貯存、運輸或遞送反應(yīng)試劑（例如，在合適的容器中的寡核苷酸、酶等）和/或支持材料（例如，緩沖液、施行該測定法的書面說明書等）的系統(tǒng)。例如，試劑盒包含一個或多個裝有相關(guān)反應(yīng)試劑和/或支持材料的封圍物（例如，盒子）。如本文所使用的，術(shù)語“分部式試劑盒（fragmentedkit）”是指包含兩個或更多個分開的容器的遞送系統(tǒng)，所述容器各裝有全部試劑盒組分的亞部分（subportion）?？梢黄鸹蚍珠_地將所述容器遞送至想要的接受者。例如，第一個容器可裝有用于測定法的酶，而第二個容器裝有寡核苷酸。術(shù)語“分部式試劑盒”意在涵蓋裝有在聯(lián)邦食品、藥品和化妝品法案（FederalFood,Drug,andCosmeticAct）的條款520(e)的管制之下的分析物特異性試劑（Analytespecificreagents，ASR’s）的試劑盒，但并不局限于此。事實上，在術(shù)語“分部式試劑盒”中包括任何包含兩個或更多個分開的容器的遞送系統(tǒng)，所述容器各裝有全部試劑盒組分的亞部分。相反地，“組合式試劑盒（combinedkit）”是指在單個容器中（例如，在裝有各想要的組分的單個盒子中）裝有反應(yīng)測定法的所有組分的遞送系統(tǒng)。術(shù)語“試劑盒”包括分部式試劑盒和組合式試劑盒。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含一種或多種對于實施本發(fā)明所必需的組分的INVADER測定法試劑盒。例如，本發(fā)明提供了用于貯存或遞送對于實施INVADER測定法所必需的酶和/或反應(yīng)組分的試劑盒。該試劑盒可包含對于測定法所必需的或所希望的任何和所有組分，包括但不限于試劑本身、緩沖液、對照試劑（例如，組織樣品、正和負(fù)對照靶寡核苷酸等）、固體支持物、標(biāo)簽、文字和/或圖示的說明書和產(chǎn)品信息、抑制劑、標(biāo)記和/或檢測試劑、包裝環(huán)境控制物(例如，冰、干燥劑等)，等等。在一些實施方案中，試劑盒提供所需組分的亞組，其中期望用戶可提供其余的組分。在一些實施方案中，試劑盒包含兩個或更多個分開的容器，其中每個容器裝有待遞送的組分的亞組。例如，第一個容器（例如，盒子）可包含酶（例如，在合適的貯存緩沖液和容器中的結(jié)構(gòu)特異性切割酶），而第二個盒子可包含寡核苷酸（例如，INVADER寡核苷酸、探針寡核苷酸、對照靶寡核苷酸等）。如本文所使用的，術(shù)語“標(biāo)記物”是指可用于提供可檢測的（優(yōu)選地可定量的）效果且可附著至核酸或蛋白質(zhì)的任何原子或分子。標(biāo)記物包括但不限于：染料；放射性標(biāo)記物例如32P；結(jié)合部分例如生物素；半抗原例如洋地黃毒苷；發(fā)光的、發(fā)磷光的或發(fā)熒光的部分；質(zhì)量標(biāo)簽；以及熒光染料，其是單獨的或者與可通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）抑制或移動發(fā)射光譜的部分相組合。標(biāo)記物可提供能夠通過熒光、放射性、比色法、重量分析法、X射線衍射或吸收、磁力、酶活性、質(zhì)量特征或受質(zhì)量影響的行為（例如，MALDI飛行時間質(zhì)譜法；熒光偏振）等進(jìn)行檢測的信號。標(biāo)記物可以是帶電荷的部分（正或負(fù)電荷），或者備選地，可以是電中性的。標(biāo)記物可包括或由核酸或蛋白質(zhì)序列組成，只要包含該標(biāo)記物的序列是可檢測的。如本文所使用的，當(dāng)涉及信號時，術(shù)語“不同的”是指可以相互區(qū)分開的信號，例如，通過光譜的性質(zhì)例如熒光發(fā)射波長、顏色、吸光度、質(zhì)量、大小、熒光偏振性質(zhì)、電荷等，或者通過與另一部分（例如，與化學(xué)試劑、酶、抗體等）相互作用的能力。如本文所使用的，術(shù)語“互補(bǔ)”或“互補(bǔ)性”用于涉及通過堿基配對法則建立聯(lián)系的多核苷酸（即，核苷酸例如寡核苷酸或靶核酸的序列）。例如，序列“5'-A-G-T-3'”與序列“3'-T-C-A-5'”互補(bǔ)?；パa(bǔ)性可以是“部分的”，其中核酸的堿基中只有一些按照堿基配對法則相匹配。或者，核酸之間可存在“完全”或“全部”互補(bǔ)性。核酸鏈之間的互補(bǔ)性程度對于核酸鏈之間的雜交效率和強(qiáng)度具有重大影響。這在擴(kuò)增反應(yīng)以及依賴于核酸之間的結(jié)合的檢測方法中是特別重要的。上述術(shù)語中的任何一個還可以用于涉及獨個核苷酸，特別是在多核苷酸的情況下。例如，寡核苷酸內(nèi)的特定核苷酸可以就其與另一核酸鏈內(nèi)的核苷酸具有互補(bǔ)性或缺乏互補(bǔ)性進(jìn)行標(biāo)注，與所述寡核苷酸的其余部分與所述核酸鏈之間的互補(bǔ)性相比對或相比較。術(shù)語“同源性”和“同源的”是指同一性的程度?？梢源嬖诓糠滞葱曰蛲耆葱?。部分同源的序列是與另一序列的同一性小于100%的序列。如本文所使用的，術(shù)語“雜交”用于涉及互補(bǔ)核酸的配對。雜交和雜交強(qiáng)度（即，核酸之間結(jié)合的強(qiáng)度）受到例如下列因素的影響：核酸之間的互補(bǔ)程度，所涉及的條件的嚴(yán)格性，和所形成的雜交物的Tm?！半s交”方法涉及使一個核酸與另一個互補(bǔ)的核酸（即，具有互補(bǔ)的核苷酸序列的核酸）退火。兩個包含互補(bǔ)序列的核酸聚合物彼此發(fā)現(xiàn)并通過堿基配對相互作用進(jìn)行退火的能力是得到充分認(rèn)識的現(xiàn)象。Marmur和Lane,Proc.Natl.Acad.Sci.USA46:453(1960)以及Doty等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA46:461(1960)對“雜交”過程進(jìn)行了最初的觀察，在這之后該過程被改進(jìn)成現(xiàn)代生物學(xué)的必要工具。如本文所使用的，核酸序列的互補(bǔ)物是指這樣的寡核苷酸，所述寡核苷酸當(dāng)以使得一個序列的5'末端與另一序列的3'末端配對的方式與所述核酸序列進(jìn)行比對時，處于“抗平行聯(lián)系”之中。在本發(fā)明的核酸中可以包括通常在天然核酸中無法找到的某些堿基，包括例如肌苷和7-脫氮鳥嘌呤。互補(bǔ)性不必是完全的；穩(wěn)定的雙鏈體可以包含錯配的堿基對或未匹配的堿基。核酸技術(shù)領(lǐng)域中的技術(shù)人員可以通過考慮許多變量來憑經(jīng)驗確定雙鏈體的穩(wěn)定性，所述變量包括例如寡核苷酸的長度、寡核苷酸的堿基組成和序列、離子強(qiáng)度以及錯配的堿基對的發(fā)生率。如本文所使用的，術(shù)語“Tm”用于表示“解鏈溫度”。解鏈溫度是一群雙鏈核酸分子有一半解離成單鏈時所處的溫度。用于計算核酸的Tm的幾種公式在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。如由標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)所指出的，當(dāng)核酸在1MNaCl的水溶液中時，可通過公式：Tm=81.5+0.41(%G+C)來簡單地估算Tm值（參見，例如Anderson和Young,QuantitativeFilterHybridization,inNucleicAcidHybridization(1985)）。其他文獻(xiàn)（例如Allawi和SantaLucia,Biochemistry36:10581-94(1997)）包括考慮結(jié)構(gòu)和環(huán)境以及序列特征來計算Tm的更復(fù)雜的計算方法。術(shù)語“基因”是指這樣的DNA序列，所述DNA序列包含對于產(chǎn)生具有非編碼功能的RNA（例如核糖體RNA或轉(zhuǎn)移RNA）、多肽或前體所必需的控制和編碼序列。所述RNA或多肽可以由全長編碼序列或者由編碼序列的任何部分來編碼，只要所需的活性或功能得到保留。術(shù)語“野生型”是指這樣的基因或基因產(chǎn)物，所述基因或基因產(chǎn)物具有當(dāng)從天然發(fā)生的來源分離時的該基因或基因產(chǎn)物的特征。野生型基因是在群體中最常觀察到的從而被專斷地設(shè)定為該基因的“正常”或“野生型”形式的基因。相反地，術(shù)語“經(jīng)修飾的”、“突變體”或“多態(tài)的”是指當(dāng)與野生型基因或基因產(chǎn)物相比較時，展示出在序列和/或功能特性方面的修飾（即，改變的特征）的基因或基因產(chǎn)物。要指出的是，可分離天然發(fā)生的突變體；通過當(dāng)與野生型基因或基因產(chǎn)物相比較時，它們具有改變的特征這樣的事實來鑒定這些突變體。如本文所使用的，術(shù)語“重組DNA載體”是指包含所需異源序列的DNA序列。例如，雖然該術(shù)語不限于使用所表達(dá)的序列或編碼表達(dá)產(chǎn)物的序列，但是在一些實施方案中，所述異源序列為這樣的編碼序列和合適的DNA序列，所述編碼序列和合適的DNA序列對于在宿主生物體中復(fù)制編碼序列或者在特定宿主生物體中表達(dá)有效連接的編碼序列而言是必需的。對于在原核生物中進(jìn)行表達(dá)而言所必需的DNA序列包括啟動子、可任選地操縱子序列、核糖體結(jié)合位點以及可能地其他序列。已知，真核細(xì)胞使用了啟動子、聚腺苷酸化信號和增強(qiáng)子。如本文所使用的，術(shù)語“寡核苷酸”被定義為包含2個或更多個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、優(yōu)選至少5個核苷酸、更優(yōu)選至少大約10-15個核苷酸、和更優(yōu)選至少大約15-30個核苷酸的分子。確切大小將取決于許多因素，這些因素反過來取決于該寡核苷酸的最終的功能或用途?？梢砸匀魏畏绞疆a(chǎn)生寡核苷酸，所述方式包括化學(xué)合成、DNA復(fù)制、反轉(zhuǎn)錄、PCR或其組合。因為以使得一個單核苷酸戊糖環(huán)的5'磷酸通過磷酸二酯鍵在一個方向上附著至其相鄰者的3'氧這樣的方式使單核苷酸進(jìn)行反應(yīng)從而制備寡核苷酸，所以如果其5'磷酸不連接至單核苷酸戊糖環(huán)的3'氧，則寡核苷酸的末端被稱為“5'末端”，并且如果其3'氧不連接至隨后的單核苷酸戊糖環(huán)的5'磷酸，則被稱為“3'末端”。如本文所使用的，核酸序列，即使位于更大的寡核苷酸的內(nèi)部，也可被認(rèn)為具有5'和3'末端。當(dāng)以5'至3'的方向沿著核酸鏈移動時，如果第一區(qū)域的3'末端在第二區(qū)域的5'末端前面，則沿著核酸鏈的第一區(qū)域被稱為在另一區(qū)域的上游。當(dāng)兩個不同的非重疊的寡核苷酸與相同的線性互補(bǔ)核酸序列的不同區(qū)域退火，并且一個寡核苷酸的3'末端指向另一個寡核苷酸的5'末端時，可以將前者稱為“上游”寡核苷酸，和將后者稱為“下游”寡核苷酸。類似地，當(dāng)兩個重疊的寡核苷酸與相同的線性互補(bǔ)核酸序列雜交，并且以使得第一個寡核苷酸的5'末端位于第二個寡核苷酸的5'末端的上游而且第一個寡核苷酸的3'末端位于第二個寡核苷酸的3'末端的上游這樣的方式對第一個寡核苷酸進(jìn)行定位時，可以將第一個寡核苷酸稱為“上游”寡核苷酸，和可以將第二個寡核苷酸稱為“下游”寡核苷酸。術(shù)語“引物”是指這樣的寡核苷酸，當(dāng)被置于起始引物延伸的條件下時，所述寡核苷酸能夠用作合成的起始點。寡核苷酸“引物”可以天然地發(fā)生，如在經(jīng)純化的限制性消化物中，或者可以合成產(chǎn)生。選擇引物，以使其“基本上”與模板的特異性序列的鏈互補(bǔ)。引物必須具有足夠的互補(bǔ)性，以便與模板鏈雜交，從而發(fā)生引物的延伸。引物序列不必反映模板的精確序列。例如，非互補(bǔ)的核苷酸片段可以附著至引物的5'末端，而引物序列的其余部分與該鏈基本上互補(bǔ)?？梢詫⒎腔パa(bǔ)的堿基或更長的序列散置在引物中，條件是引物序列與模板序列具有足夠的互補(bǔ)性，以便進(jìn)行雜交并由此形成模板引物復(fù)合物以用于合成引物的延伸產(chǎn)物。如本文所使用的，術(shù)語“切割結(jié)構(gòu)”是指通過以下過程形成的結(jié)構(gòu)：使至少一種探針寡核苷酸與靶核酸相互作用，從而形成包含雙鏈體的結(jié)構(gòu)，所得到的結(jié)構(gòu)是可以通過切割手段（包括但不限于酶）進(jìn)行切割的。切割結(jié)構(gòu)是用于通過切割手段進(jìn)行特異性切割的底物，這與作為用于通過諸如磷酸二酯酶的試劑進(jìn)行非特異性切割的底物的核酸分子不同，所述諸如磷酸二酯酶的試劑切割核酸分子而不管二級結(jié)構(gòu)（即，無需形成雙鏈體結(jié)構(gòu)）。如本文所使用的，術(shù)語“切割手段”或“切割試劑”是指能夠?qū)η懈罱Y(jié)構(gòu)進(jìn)行切割的任何手段，包括但不限于酶?！敖Y(jié)構(gòu)特異性核酸酶”或“結(jié)構(gòu)特異性酶”是識別核酸分子中的特異性二級結(jié)構(gòu)并切割這些結(jié)構(gòu)的酶。本發(fā)明的切割手段響應(yīng)于切割結(jié)構(gòu)的形成而切割核酸分子；切割手段并不必需在切割結(jié)構(gòu)內(nèi)的任何特定位置處切割所述切割結(jié)構(gòu)。切割手段可以包括由各種來源提供的核酸酶活性，所述來源包括CLEAVASE酶（ThirdWaveTechnologies,Madison,WI）、FEN-1核酸內(nèi)切酶（包括RAD2和XPG蛋白，以及FEN-1核酸內(nèi)切酶，其源自古細(xì)菌）、TaqDNA聚合酶和大腸桿菌（E.coli）DNA聚合酶I。切割手段可以包括具有5'核酸酶活性的酶（例如，TaqDNA聚合酶（DNAP）、大腸桿菌DNA聚合酶I）。切割手段還可以包括具有5'核酸酶活性但缺乏合成活性的經(jīng)修飾的DNA聚合酶。適于在本發(fā)明的方法和試劑盒中使用的切割手段的實例在美國專利號5,614,402、5,795,763和5,843,669以及PCT申請?zhí)朩O98/23774、WO02/070755A2和WO0190337A2中提供，所述文獻(xiàn)中的每一個都通過提及而以其整體合并入本文。當(dāng)涉及酶（例如5'核酸酶）進(jìn)行使用時，術(shù)語“熱穩(wěn)定的”表明，該酶在升高的溫度下，即在大約55℃或更高的溫度（例如，包括但不限于60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃）下是有功能的或有活性的（即，可以實施催化）。如本文所使用的，術(shù)語“切割產(chǎn)物”是指通過切割手段與切割結(jié)構(gòu)的反應(yīng)（即，用切割手段處理切割結(jié)構(gòu)）而產(chǎn)生的產(chǎn)物。術(shù)語“非靶切割產(chǎn)物”是指并非來源于靶核酸的切割反應(yīng)的產(chǎn)物。如上文所述，在本發(fā)明的一些方法中，切割結(jié)構(gòu)的切割通常在探針寡核苷酸內(nèi)發(fā)生。通過這種靶核酸依賴性切割所產(chǎn)生的探針寡核苷酸的片段為“非靶切割產(chǎn)物”。在INVADER測定法反應(yīng)的情況下，術(shù)語“探針寡核苷酸”是指在INVADER寡核苷酸存在或不存在下與靶核酸相互作用從而形成切割結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。當(dāng)與靶核酸進(jìn)行退火時，探針寡核苷酸與靶形成切割結(jié)構(gòu)，并且在探針寡核苷酸內(nèi)發(fā)生切割。術(shù)語“INVADER寡核苷酸”是指在探針和靶核酸之間的雜交區(qū)域附近的位置處與靶核酸雜交的寡核苷酸，其中INVADER寡核苷酸包含與在探針和靶之間的雜交區(qū)域相重疊的部分（例如，化學(xué)部分，或核苷酸，無論其是否與該靶互補(bǔ)）。在一些實施方案中，INVADER寡核苷酸在其3'末端包含與位于探針寡核苷酸的5'末端的序列基本上相同的序列。術(shù)語“ARRESTOR分子”是指被加入或包括在侵入性切割反應(yīng)中以停止一種或多種反應(yīng)組分參與到隨后的作用或反應(yīng)中的試劑。這可以通過下列方式來進(jìn)行：隔離一些反應(yīng)組分或使其失活（例如，通過與核酸組分結(jié)合或與其發(fā)生堿基配對，或者通過與蛋白質(zhì)組分結(jié)合）。術(shù)語“ARRESTOR寡核苷酸”是指被包括在侵入性切割反應(yīng)中以停止或阻止任何反應(yīng)（例如第一反應(yīng)和/或任何隨后的反應(yīng)或作用；不希望將ARRESTOR寡核苷酸局限于任何特定的反應(yīng)或反應(yīng)步驟）的一個或多個方面的寡核苷酸。這可以通過下列方式來進(jìn)行：隔離一些反應(yīng)組分（例如，通過與另一核酸發(fā)生堿基配對，或者與蛋白質(zhì)組分結(jié)合）。但是，不希望將該術(shù)語僅局限于其中反應(yīng)組分被隔離的情況。如本文所使用的，術(shù)語“盒”是指這樣的寡核苷酸或寡核苷酸的組合，其被構(gòu)造成在INVADER測定法中響應(yīng)于探針寡核苷酸的切割而產(chǎn)生可檢測的信號。在優(yōu)選的實施方案中，所述盒與來自探針寡核苷酸的切割過程的非靶切割產(chǎn)物雜交，從而形成第二個侵入性切割結(jié)構(gòu)，這樣所述盒隨后可以被切割。在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施方案中，次級切割反應(yīng)（secondarycleavagereaction）包括使用FRET盒。這樣的分子提供了次級靶（次級反應(yīng)靶（SecondaryReactionTarget）或SRT）以及FRET標(biāo)記的可切割序列，從而允許進(jìn)行相續(xù)的侵入性切割反應(yīng)的均相檢測（即，在反應(yīng)后無需進(jìn)行產(chǎn)物分離或其他操作）。其他優(yōu)選的實施方案使用了次級反應(yīng)系統(tǒng)，其中FRET探針和合成靶以分開的寡核苷酸形式提供。來自初級反應(yīng)的經(jīng)切割的5’-翼片（flap）在次級反應(yīng)中用作侵入性寡核苷酸，其中它們與合適的次級反應(yīng)靶（SRT）結(jié)合。在一些實施方案中，所述盒為包含發(fā)夾部分（即，這樣的區(qū)域，在所述區(qū)域中所述盒寡核苷酸的一個部分在反應(yīng)條件下與同一個寡核苷酸的第二個部分雜交從而形成雙鏈體）的單個寡核苷酸。在其他實施方案中，盒包含至少兩個寡核苷酸，所述寡核苷酸包含可以在反應(yīng)條件下形成雙鏈體的互補(bǔ)部分。在優(yōu)選的實施方案中，所述盒包含標(biāo)記物。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述盒包含產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）效應(yīng)的經(jīng)標(biāo)記的部分。當(dāng)涉及核酸底物進(jìn)行使用時，術(shù)語“基本上單鏈的”表示，底物分子主要以核酸的單鏈的形式存在，這不同于雙鏈底物，其以核酸的兩條鏈的形式存在，這兩條鏈通過鏈內(nèi)堿基配對作用而保持在一起。如本文所使用的，短語“未擴(kuò)增的寡核苷酸檢測測定法（non-amplifiedoligonucleotidedetectionassay）”是指這樣的檢測測定法，該檢測測定法被構(gòu)造成用于檢測未經(jīng)擴(kuò)增（例如通過PCR）的特定靶序列（例如，miRNA、SNP、重復(fù)序列等）存在與否，而不形成該靶序列的拷貝?！拔磾U(kuò)增的寡核苷酸檢測測定法”可以例如放大用于指示特定靶序列或者靶序列內(nèi)的多態(tài)性存在與否的信號，只要該靶序列沒有被拷貝。如本文所使用的，短語“非擴(kuò)增性寡核苷酸檢測測定法（non-amplifyingoligonucleotidedetectionassay）”是指這樣的檢測測定法，該檢測測定法被構(gòu)造成用于檢測靶序列（例如，miRNA、SNP、重復(fù)序列等）存在與否，而不形成該靶序列的拷貝?！胺菙U(kuò)增性寡核苷酸檢測測定法”可以例如放大用于指示特定靶序列或者靶序列中的多態(tài)性存在與否的信號，只要該靶序列沒有被拷貝。如本文所使用的，術(shù)語“序列變異（sequencevariation）”是指兩個核酸之間在核酸序列方面的差異。例如，野生型結(jié)構(gòu)基因與該野生型結(jié)構(gòu)基因的突變體形式可以通過存在單個堿基置換和/或一個或多個核苷酸的缺失或插入而在序列方面發(fā)生變化。據(jù)信，這兩種形式的結(jié)構(gòu)基因在序列方面彼此不同?？梢源嬖诮Y(jié)構(gòu)基因的第二種突變體形式。據(jù)信，該第二種突變體形式在序列方面不同于野生型基因和該基因的第一種突變體形式。如本文所使用的，術(shù)語“釋出”是指通過例如5'核酸酶的作用從更大的核酸片段（例如寡核苷酸）中釋放出核酸片段，從而使得所釋放的片段不再與所述寡核苷酸的其余部分共價連接。如本文所使用的，術(shù)語“Km”是指酶的米-曼（Michaelis-Menten）常數(shù)，其被定義為在酶催化的反應(yīng)中在給定的酶達(dá)到其最大速度的一半時特異底物的濃度。如本文所使用的，術(shù)語“核苷酸類似物”是指經(jīng)修飾的或非天然存在的核苷酸，其包括但不限于：具有改變的堆疊相互作用的類似物，例如7-脫氮嘌呤（即，7-脫氮-dATP和7-脫氮-dGTP）；具有備選的氫鍵鍵合構(gòu)型的堿基類似物（例如，Iso-C和Iso-G，以及在屬于S.Benner的美國專利號6,001,983中所描述的其他非標(biāo)準(zhǔn)堿基對，該文獻(xiàn)通過提及而合并入本文）；非氫鍵鍵合類似物（例如非極性的芳香族核苷酸類似物，如2,4-二氟甲苯，其在B.A.Schweitzer和E.T.Kool,J.Org.Chem.,1994,59,7238-7242,B.A.Schweitzer和E.T.Kool,J.Am.Chem.Soc.,1995,117,1863-1872中有所描述，所述文獻(xiàn)中的每一個均通過提及而合并入本文）；“通用（universal）”堿基，例如5-硝基吲哚和3-硝基吡咯；以及通用嘌呤和嘧啶（例如，分別為“K”和“P”核苷酸；P.Kong等人,NucleicAcidsRes.,1989,17,10373-10383,P.Kong等人,NucleicAcidsRes.,1992,20,5149-5152）。核苷酸類似物包括在糖部分具有修飾的核苷酸，例如二脫氧核苷酸和2'-O-甲基核苷酸。核苷酸類似物包括脫氧核糖核苷酸以及核糖核苷酸的修飾形式。術(shù)語“多態(tài)基因座”是在種群中存在的基因座，其在該種群的成員之間顯示出變異（例如，最普遍的等位基因具有小于0.95的頻率）。相反地，“單態(tài)基因座”是在種群的成員之間具有很少或沒有可見的變異的基因座位（通常為這樣的基因座，在該基因座處，在該種群的基因庫中，最普遍的等位基因超過0.95的頻率）。如本文所使用的，術(shù)語“微生物”是指太小以致不能用肉眼觀察到的生物體，其包括但不限于細(xì)菌、病毒、原生動物、真菌和纖毛蟲。術(shù)語“微生物基因序列”是指來源于微生物的基因序列。術(shù)語“細(xì)菌”是指任何細(xì)菌物種，包括真細(xì)菌和古細(xì)菌物種。術(shù)語“病毒”是指不能自主復(fù)制的（即，復(fù)制過程需要利用宿主細(xì)胞的機(jī)構(gòu)）、專性的、超顯微的細(xì)胞內(nèi)寄生物。在本說明書和權(quán)利要求書中，術(shù)語“樣品”以其最廣泛的意義進(jìn)行使用。一方面其表示包括樣本或培養(yǎng)物（例如，微生物培養(yǎng)物）。另一方面，其表示包括生物和環(huán)境樣品。樣品可以包括合成來源的樣本。生物樣品可以為：動物，包括人，流體，固體（例如糞便）或組織，以及液體和固體食物和飼料產(chǎn)品和配料例如奶制品、蔬菜、肉和肉的副產(chǎn)品，和廢物。生物樣品可以獲自所有的各科家畜以及未馴化的或野生的動物（包括但不限于，諸如有蹄類動物、熊、魚、兔類動物、嚙齒動物等的動物）。環(huán)境樣品包括：環(huán)境材料，例如表面物質(zhì)、土壤、水和工業(yè)樣品，以及從食物和奶制品加工設(shè)備、裝置、器材、器具、一次性和非一次性制品中獲得的樣品。這些實例不應(yīng)被解釋為限制了可用于本發(fā)明的樣品類型。術(shù)語“靶核酸的來源”是指含有核酸（RNA（例如miRNA）或DNA）的任何樣品。靶核酸的特別優(yōu)選的來源為生物樣品，包括但不限于血液、唾液、腦脊液、胸膜液、乳、淋巴、痰和精液。如果一種寡核苷酸以比另一種寡核苷酸（或靶核酸序列）更高的摩爾濃度存在，則認(rèn)為這種寡核苷酸相對于另一種寡核苷酸（或靶核酸序列）而言“過量”存在。當(dāng)寡核苷酸例如探針寡核苷酸在切割反應(yīng)中相對于互補(bǔ)靶核酸序列的濃度而言過量存在時，則該反應(yīng)可以用于指示所存在的靶核酸的量。通常，當(dāng)過量存在時，探針寡核苷酸將以至少100倍摩爾過量存在；當(dāng)靶核酸序列以大約10飛摩爾或更少的量存在時，所使用的每種探針寡核苷酸的量通常為至少1皮摩爾。“懷疑包含”第一種和第二種靶核酸的樣品，可以包含這兩種靶核酸分子之一，或者包含這兩種靶核酸分子，或者這兩種靶核酸分子都不包含。術(shù)語“反應(yīng)物”在本文中以其最廣泛的意義進(jìn)行使用。反應(yīng)物可以包括例如酶反應(yīng)物、化學(xué)反應(yīng)物或光（例如紫外光，已知波長特別短的紫外光可以打斷寡核苷酸鏈）。能夠與寡核苷酸反應(yīng)從而縮短（例如切割）或延長該寡核苷酸的任何試劑都被涵蓋在術(shù)語“反應(yīng)物”之內(nèi)。如本文所使用的，術(shù)語“純化的”或“純化”是指從樣品中除去污染物。例如，在一些實施方案中，在細(xì)菌宿主細(xì)胞中表達(dá)重組CLEAVASE核酸酶，并通過除去宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)而純化出所述核酸酶；由此增加了這些重組核酸酶在所述樣品中的百分比。如本文所使用的，當(dāng)涉及蛋白質(zhì)（如在“給定的蛋白的部分”中）時，術(shù)語“部分”是指該蛋白質(zhì)的片段。所述片段可在大小上在從4個氨基酸殘基至整個氨基酸序列減去一個氨基酸的范圍內(nèi)變化（例如，4、5、6、……、n-1）。如本文所使用的，術(shù)語“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸以及它們的片段或部分，以及是指基因組或合成來源的DNA或RNA，它們可以是單鏈或雙鏈的，并且代表了正義或反義鏈。類似地，如本文所使用的，“氨基酸序列”是指肽或蛋白質(zhì)序列。如本文所使用的，術(shù)語“純化的”或“基本上純化的“是指這樣的分子（核酸或氨基酸序列），它們被從其天然環(huán)境中取出、分離或分開，并且至少60%地不含、優(yōu)選地75%地不含和最優(yōu)選地90%地不含天然地與其相聯(lián)合的其他組分。因此，“分離的多核苷酸”或“分離的寡核苷酸”是基本上純化的多核苷酸。如本文所使用的，術(shù)語“連續(xù)的核酸鏈”是指具有連續(xù)的、共價連接的主鏈結(jié)構(gòu)，但沒有切口或其他中斷的核酸鏈。無論是堿基配對的、單鏈的還是錯配的，每個核苷酸的堿基部分的布置并不是在連續(xù)鏈的定義中的要素。連續(xù)鏈的主鏈不限于在天然存在的、未修飾的核酸中發(fā)現(xiàn)的核糖-磷酸或脫氧核糖-磷酸組成。本發(fā)明的核酸可以包含在主鏈結(jié)構(gòu)中的修飾，包括但不限于硫代磷酸酯殘基、膦酸酯殘基、2'取代的核糖殘基（例如，2'-O-甲基核糖）以及含有備選的糖（例如阿拉伯糖）的殘基。如本文所使用的，術(shù)語“連續(xù)的雙鏈體”是指這樣的雙鏈核酸的區(qū)域，在該區(qū)域中在雙鏈體內(nèi)的堿基對進(jìn)程沒有中斷（即，在連續(xù)的雙鏈體的區(qū)域范圍內(nèi)，沿著該雙鏈體的堿基對沒有被扭曲而提供了缺口、凸起或錯配）。如本文所使用的，該術(shù)語僅是指雙鏈體內(nèi)的堿基對排列，而不涉及核酸鏈的主鏈部分中的連續(xù)性。具有未間斷的堿基配對，但在一條或兩條鏈中具有切口的雙鏈體核酸也在“連續(xù)的雙鏈體”的定義范圍之內(nèi)。術(shù)語“雙鏈體”是指核酸的狀態(tài)，在該狀態(tài)下，一條鏈上的核苷酸的堿基部分通過與排列在第二條鏈上的其互補(bǔ)堿基發(fā)生氫鍵鍵合而被結(jié)合。形成雙鏈體形式的條件反映了核酸的堿基的狀態(tài)。借助于堿基配對，核酸鏈還經(jīng)常呈現(xiàn)出雙螺旋的三級結(jié)構(gòu)，該三級結(jié)構(gòu)具有大溝和小溝。螺旋形式的呈現(xiàn)在變成雙鏈體的行為中是固有的。術(shù)語“模板”是指這樣的核酸鏈，在該核酸鏈上，通過模板依賴性核酸聚合酶的活性從核苷三磷酸形成互補(bǔ)的拷貝。在雙鏈體內(nèi)，模板鏈按照慣例被描繪和描述為“底部”鏈。類似地，非模板鏈常常被描繪和描述為“頂部”鏈。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于檢測和表征核酸分子（例如，RNA（例如，小RNA例如微RNA（miRNA）和小干擾RNA（siRNA））和其他短核酸分子）的組合物和方法。本發(fā)明提供了用于檢測、表征和定量miRNA表達(dá)的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測miRNA表達(dá)的方法，該方法包括將核酸加入到miRNA中以幫助檢測。然后，采用任何合適的方法來檢測所得到的“miRNA檢測結(jié)構(gòu)”，所述方法包括但不限于在本文中公開的那些。盡管以下描述集中于miRNA的檢測和定量，但是應(yīng)該理解，本發(fā)明還可用于其他短核酸分子（例如，長度小于例如50、40、30或20個核苷酸的DNA和RNA）。下文使用miRNA作為例子來舉例說明各種實施方案。但是，應(yīng)該理解，所述方法可應(yīng)用于其他小核酸分子。I.miRNA檢測結(jié)構(gòu)的形成在一些實施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生miRNA檢測結(jié)構(gòu)以幫助檢測miRNA的方法。miRNA的大小是小的（大約21個核苷酸（例如大約18-25個核苷酸）），因此miRNA難以采用標(biāo)準(zhǔn)化的雜交方法來進(jìn)行檢測。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括將核酸分子加入到miRNA（例如，通過雜交、延伸或連接）中以產(chǎn)生檢測結(jié)構(gòu)。然后，可以采用任何合適的方法來檢測這樣的檢測結(jié)構(gòu)。在一個具體的實施方案中，產(chǎn)生圖2中所示的檢測結(jié)構(gòu)以用于檢測miRNA。在該實施方案中，兩個寡核苷酸與miRNA退火，從而形成雙環(huán)或“啞鈴”狀結(jié)構(gòu)。通過延伸具有寡核苷酸雙鏈區(qū)域的miRNA的末端，該啞鈴結(jié)構(gòu)形成更大區(qū)域的雙鏈核酸。在一些實施方案中，將miRNA的每個末端延伸2至5個核苷酸。在一些實施方案中，所述寡核苷酸的末端包含不與miRNA雜交的額外的核酸序列。在一些實施方案中，這些額外的序列形成侵入性切割結(jié)構(gòu)（例如，INVADER測定法侵入性切割結(jié)構(gòu)）。在一些實施方案中，侵入性切割結(jié)構(gòu)通過INVADER測定法來進(jìn)行檢測（參見，例如以下描述）。例如，在一些實施方案中，將在實施例18中所描述的寡核苷酸（參見，例如圖31）用于檢測與癌癥相關(guān)的miRNA（例如，其形成可以通過INVADER測定法來檢測的侵入性切割結(jié)構(gòu)）。在其他實施方案中，產(chǎn)生圖3中所示的檢測結(jié)構(gòu)以用于檢測miRNA。在該實施方案中，一個寡核苷酸與miRNA退火，從而形成弓形結(jié)構(gòu)。miRNA使寡核苷酸的末端靠在一起，其效率比當(dāng)miRNA不存在時更高。在一些實施方案中，寡核苷酸的末端包含額外的序列，該序列延伸到miRNA外，并且不與miRNA雜交。在一些實施方案中，這些額外的序列形成侵入性切割結(jié)構(gòu)（例如，INVADER測定法侵入性切割結(jié)構(gòu)）。在一些實施方案中，侵入性切割結(jié)構(gòu)通過INVADER測定法來進(jìn)行檢測（參見，例如以下描述）。在其他實施方案中，在切割I(lǐng)NVADER測定法侵入性切割結(jié)構(gòu)之后，使所得到的末端進(jìn)行連接，從而形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在其他實施方案中，一個寡核苷酸與miRNA雜交，使得該寡核苷酸的末端緊密接近（例如，與miRNA的鄰近核苷酸雜交），然后進(jìn)行連接。在其他實施方案中，產(chǎn)生圖24和25中所示的檢測結(jié)構(gòu)。在該實施方案中，延伸探針或INVADER寡核苷酸，以產(chǎn)生單個發(fā)夾環(huán)或“半啞鈴”結(jié)構(gòu)。例如，在一些實施方案中，將在實施例18中所描述的寡核苷酸（參見，例如圖31）用于檢測與癌癥相關(guān)的miRNA（例如，其形成可以通過INVADER測定法來檢測的侵入性切割結(jié)構(gòu)）。在一些實施方案中，所述寡核苷酸的末端包含不與miRNA雜交的額外的核酸序列（參見，例如實施例19G和19H）。在一些實施方案中，這些額外的序列形成侵入性切割結(jié)構(gòu)（例如，INVADER測定法侵入性切割結(jié)構(gòu)）。在一些實施方案中，侵入性切割結(jié)構(gòu)通過INVADER測定法來進(jìn)行檢測（參見，例如以下描述）。在其他實施方案中，這些額外的序列與被加入到反應(yīng)混合物中的另外的寡核苷酸是互補(bǔ)的，從而穩(wěn)定切割結(jié)構(gòu)，例如INVADER測定法侵入性切割結(jié)構(gòu)（圖4）。在一些實施方案中，使用滾環(huán)復(fù)制測定法來檢測如上文所述產(chǎn)生的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（參見，例如以下關(guān)于滾環(huán)復(fù)制的描述）。在其他實施方案中，由帶有與miRNA具有同源性的短區(qū)域的長寡核苷酸（例如，多于50、100、1000個或更多個核苷酸）產(chǎn)生檢測結(jié)構(gòu)。使一個或多個miRNA與所述寡核苷酸雜交，從而產(chǎn)生檢測結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，這些檢測結(jié)構(gòu)通過延伸（例如，通過連接或聚合反應(yīng)，如RT-PCR）miRNA來進(jìn)行檢測。在一些實施方案中，這些檢測結(jié)構(gòu)進(jìn)一步通過與綴合至固體支持物（例如，微球體，或者其他表面或結(jié)構(gòu)）的寡核苷酸雜交來進(jìn)行檢測。在一些實施方案中，延伸非miRNA組分，或者將其連接至另一核酸，并直接或間接進(jìn)行檢測。在一些實施方案中，用于形成檢測結(jié)構(gòu)的寡核苷酸包含一個或多個核苷酸類似物。例如，在一些實施方案中，使用了2'-O-甲基核苷酸。本發(fā)明不限于特定的機(jī)制。事實上，理解所述機(jī)制不是實施本發(fā)明所必需的。但是，考慮了2'-O-甲基堿基的存在增加了經(jīng)雜交的檢測結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性并為進(jìn)一步的檢測方法提供幫助。II.核酸（例如，干擾RNA）的檢測在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測miRNA的方法。本發(fā)明不限于具體的檢測測定法?？梢允褂萌魏魏线m的方法，包括但不限于本文所公開的那些。在本發(fā)明一些優(yōu)選的實施方案中，miRNA檢測方法是定量的。本發(fā)明不限于特定的機(jī)制。事實上，理解所述機(jī)制不是實施本發(fā)明所必需的。但是，考慮了特定miRNA在體內(nèi)的水平與來自其同族（cognate）基因的基因表達(dá)水平有關(guān)。因此，本發(fā)明提供了使miRNA與特定基因（例如，參與疾病狀態(tài)（例如癌癥）或代謝的基因）的基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)的方法。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法用于確定異常（例如，高或低）水平的特定miRNA的存在（例如，與癌癥有關(guān)的miRNA表達(dá)（參見，例如Calin等人,ProcNatlAcadSciUSA,99,15524-15529(2002)），例如通過使用實施例18和圖31中所描述的寡核苷酸），或者確定對于miRNA表達(dá)的干預(yù)（例如，藥物）的效果。在其他實施方案中，檢測異源miRNA（例如，來自表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體、轉(zhuǎn)染等）以表征miRNA表達(dá)系統(tǒng)的效能。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測特定miRNA（例如，miRNA，如mir-1或mir-135）的方法。在其他實施方案中，使用本發(fā)明的方法來區(qū)別特定miRNA中的變體（例如，多態(tài)性或突變）。在其他實施方案中，本發(fā)明提供了裂解待就miRNA的存在進(jìn)行測試的細(xì)胞。A.INVADER測定法在一些實施方案中，采用INVADER測定法來檢測miRNA。在一些實施方案中，INVADER測定法包括：形成核酸切割結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)依賴于靶核酸的存在；以及切割所述核酸切割結(jié)構(gòu)以釋放獨特的切割產(chǎn)物。例如，利用5'核酸酶活性來切割靶依賴性切割結(jié)構(gòu)，并且所得到的切割產(chǎn)物或者所述切割結(jié)構(gòu)的切割指示了樣品中特定靶核酸序列的存在。當(dāng)核酸或寡核苷酸的一條或兩條（或更多條）鏈都與靶核酸雜交從而使得它們形成重疊的侵入性切割結(jié)構(gòu)（如下文所述）時，可以發(fā)生侵入性切割。通過切割試劑（例如，5'核酸酶）與上游寡核苷酸的相互作用，可以使得切割試劑以產(chǎn)生獨特片段的方式在內(nèi)部位點處切割下游寡核苷酸。這樣的實施方案被稱為INVADER測定法（ThirdWaveTechnologies），并且描述于美國專利號5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567、6,090,543、6,348,314和6,458,535，WO97/27214，WO98/42873，以及Lyamichev等人,Nat.Biotech.,17:292(1999),Hall等人,PNAS,USA,97:8272(2000)中，每篇文獻(xiàn)通過提及而以其整體合并入本文以用于所有目的）。INVADER測定法通過用結(jié)構(gòu)特異性酶對特異性結(jié)構(gòu)進(jìn)行酶切來檢測探針與靶的雜交（參見，INVADER測定法，ThirdWaveTechnologies；參見例如美國專利號5,846,717；6,090,543；6,001,567；5,985,557；5,994,069；6,090,543；6,348,314；6,458,535；美國專利申請?zhí)?0030186238(系列號10/084839)；20030104378A1(系列號09/864636)；Lyamichev等人,Nat.Biotech.,17:292(1999)；Hall等人,PNAS,USA,97:8272(2000)；WO97/27214；和WO98/42873，所述文獻(xiàn)中的每一個都通過提及而以其整體合并入本文以用于所有目的）。INVADER測定法通過下列方式來檢測特異性的DNA和RNA序列：使用結(jié)構(gòu)特異性酶（例如，F(xiàn)EN核酸內(nèi)切酶）來切割通過重疊的寡核苷酸探針的雜交而形成的復(fù)合物（參見，例如圖1）。升高的溫度以及過量的所述探針之一使得對于每種靶序列能夠存在多個待切割的探針而無需溫度循環(huán)。在一些實施方案中，這些被切割的探針隨后指導(dǎo)第二中經(jīng)標(biāo)記的探針的切割。可以使用被內(nèi)部染料猝滅的熒光素對次級探針（secondaryprobe）寡核苷酸的5’-末端進(jìn)行標(biāo)記。在切割之后，可以使用標(biāo)準(zhǔn)熒光平板讀取器來檢測去猝滅的經(jīng)熒光素標(biāo)記的產(chǎn)物。INVADER測定法檢測在未擴(kuò)增的以及擴(kuò)增的（參見，例如實施例19，圖32）RNA和DNA（包括基因組DNA）中的特異性序列、突變和SNP。在圖1中示意性地顯示的實施方案中，INVADER測定法采用了兩個級聯(lián)步驟（初級（primary）和次級（secondary）反應(yīng)），這兩個反應(yīng)步驟都產(chǎn)生并隨后擴(kuò)增靶特異性的信號。為了方便起見，在下面的討論中，將等位基因描述為野生型（WT）和突變體（MT），盡管該術(shù)語并不應(yīng)用于所有的基因變異。在初級反應(yīng)中（圖1，圖版A），WT初級探針和INVADER寡核苷酸以串聯(lián)方式與靶核酸雜交，從而形成重疊結(jié)構(gòu)。未配對的“翼片”被包括在WT初級探針的5'末端上。結(jié)構(gòu)特異性酶（例如CLEAVASE酶，ThirdWaveTechnologies）識別該重疊區(qū)，并切掉未配對的翼片，從而將翼片作為靶特異性產(chǎn)物釋放出來。在次級反應(yīng)中，這種切割的產(chǎn)物用作在WT熒光共振能量轉(zhuǎn)移（WT-FRET）探針上的INVADER寡核苷酸，從而再次形成被結(jié)構(gòu)特異性酶所識別的結(jié)構(gòu)（圖版A）。當(dāng)在單個FRET探針上的兩種染料通過切割而分開時（如在圖1中由箭頭所示），在上述背景熒光之上產(chǎn)生了可檢測的熒光信號。因此，該次級結(jié)構(gòu)的切割導(dǎo)致信號增強(qiáng)，由此表明了WT等位基因（或者突變體基因，如果所述測定法被構(gòu)造成對于突變體等位基因而產(chǎn)生可檢測的信號）的存在。在一些實施方案中，對于待檢測的每個等位基因或基因座，提供了具有不同標(biāo)記物（例如，可通過發(fā)射或激發(fā)波長的差異來分辨的，或者可通過時間分辨熒光檢測（time-resolvedfluorescencedetection）來分辨的）的FRET探針，從而使得可以在單個反應(yīng)中檢測不同的等位基因或基因座。在這樣的實施方案中，初級探針組和不同的FRET探針可以組合在在單個測定法中，從而允許比較同一個樣品中來自每個等位基因或基因座的信號。如果初級探針寡核苷酸和靶核苷酸序列在切割位點處不完全匹配（例如，如使用MT初級探針和WT靶，圖1，圖版B），則不形成重疊的結(jié)構(gòu)，并且切割受到抑制。與非重疊的結(jié)構(gòu)相比較，所使用的結(jié)構(gòu)特異性酶（例如，CLEAVASEVIII酶，ThirdWaveTechnologies）更高效地切割重疊的結(jié)構(gòu)（例如，至少340倍），從而允許極好地區(qū)分等位基因。探針無需溫度循環(huán)地進(jìn)行周轉(zhuǎn)，從而產(chǎn)生許多信號/靶（即，線性信號擴(kuò)增）。類似地，每個靶特異性產(chǎn)物可以使得能夠?qū)υS多FRET探針進(jìn)行切割。初級INVADER測定法反應(yīng)針對所檢測的靶DNA（或RNA）。在第一個侵入性切割中，靶DNA為限制性組分，這是因為INVADER和初級探針是以摩爾過量來提供的。在第二個侵入性切割中，釋放的翼片為限制性的。當(dāng)順次進(jìn)行這兩個切割反應(yīng)時，來自該復(fù)合反應(yīng)的熒光信號相對于靶DNA的量而言線性地積累。在某些實施方案中，使用經(jīng)可接近位點設(shè)計的寡核苷酸和/或橋接寡核苷酸來施行INVADER測定法或其他核苷酸檢測測定法。此類方法、操作程序和組合物描述于美國專利號6,194,149、6,358,691、6355,437，美國專利申請系列號09/882,945，以及PCT申請WO9850403和WO0198537中，所有這些文獻(xiàn)均通過提及而明確地以其整體合并入本文。在一些優(yōu)選的實施方案中，將樣品（例如，核酸序列（例如，干擾RNA（例如，miRNA或siRNA）））暴露于所述寡核苷酸和所述試劑包括將樣品在以下條件下將樣品暴露于所述寡核苷酸和所述試劑：如果所述樣品中存在靶序列，則在所述靶序列和所述寡核苷酸之間形成侵入性切割結(jié)構(gòu)，其中所述侵入性切割結(jié)構(gòu)被所述切割試劑切割，從而形成切割產(chǎn)物。在一些實施方案中，所述靶序列（例如，miRNA）包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第二區(qū)域位于所述第一區(qū)域的下游并與之鄰接；并且所述寡核苷酸包括第一種寡核苷酸和第二種寡核苷酸，其中所述第一種寡核苷酸的至少一部分與所述靶序列的所述第一部分完全互補(bǔ)，并且其中所述第二種寡核苷酸包含3'部分和5'部分，其中所述5'部分與所述靶核酸的所述第二部分完全互補(bǔ)。在一些優(yōu)選的實施方案中，將樣品暴露于所述寡核苷酸和所述試劑包括將樣品在以下條件下將樣品暴露于所述寡核苷酸和所述試劑：如果所述樣品中存在靶序列，則在所述靶序列和所述寡核苷酸之間形成侵入性切割結(jié)構(gòu)，其中所述侵入性切割結(jié)構(gòu)被所述切割試劑切割，從而形成切割產(chǎn)物。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，所述靶序列包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第二區(qū)域位于所述第一區(qū)域的下游并與之鄰接；并且所述寡核苷酸包括第一種寡核苷酸和第二種寡核苷酸，其中所述第一種寡核苷酸的至少一部分與所述靶序列的所述第一部分完全互補(bǔ)，并且其中所述第二種寡核苷酸包含3'部分和5'部分，其中所述5'部分與所述靶核酸的所述第二部分完全互補(bǔ)。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于使用INVADER檢測試劑（例如，初級探針、INVADER探針和FRET盒）來分析匯集的樣品（例如，匯集的血液樣品或匯集的細(xì)胞裂解物）的試劑盒。在優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含關(guān)于如何施行INVADER檢測測定法的說明書，并且在一些實施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含關(guān)于如何將INVADER檢測測定法應(yīng)用于來自許多個體的匯集的樣品或者應(yīng)用于來自單個受試者的許多細(xì)胞（例如，來自活組織檢查樣品）的“匯集的”樣品的說明書。本發(fā)明進(jìn)一步提供了測定法，其中在多輪與寡核苷酸探針雜交并切割探針的過程中靶核酸被再使用或再利用，而無需使用溫度循環(huán)（即，用于靶核酸鏈的周期的變性）或核酸合成（即，用于靶或探針核酸鏈的基于聚合的置換）。當(dāng)在靶鏈上探針被連續(xù)地替代（例如，通過探針-探針置換，或者通過在探針/靶的締合和解離之間的平衡，或者通過包括這些機(jī)制的組合（Reynaldo等人,J.Mol.Biol.97:511-520(2000)））的條件下運行切割反應(yīng)時，多個探針可以與同一個靶雜交，從而允許多次切割并產(chǎn)生多個切割產(chǎn)物。INVADER測定法反應(yīng)在INVADERDNA測定法的優(yōu)選的實施方案中，兩種寡核苷酸（有區(qū)分能力的初級探針和INVADER寡核苷酸）以串聯(lián)方式與靶DNA雜交，從而形成重疊結(jié)構(gòu)。初級探針的5'-末端包含不與靶DNA雜交的5'-翼片（圖1）。結(jié)合的INVADER寡核苷酸的3'-核苷酸與初級探針重疊，但不必與靶DNA雜交（參見，例如實施例15和16）。CLEAVASE酶識別該重疊結(jié)構(gòu)并切掉初級探針的未配對的5'-翼片，從而將其作為靶特異性產(chǎn)物釋放出來。初級探針被設(shè)計成具有與反應(yīng)溫度接近的解鏈溫度。因此，在等溫測定法條件下，以過量方式提供的初級探針在靶DNA上循環(huán)。這使得對于每個靶DNA可以進(jìn)行多輪的初級探針切割，并且擴(kuò)增被釋放的5'-翼片的數(shù)目。在次級反應(yīng)中，酶個被釋放的5'-翼片可以在熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）盒上用作INVADER寡核苷酸，從而形成另一個被CLEAVASE酶識別和切割的重疊結(jié)構(gòu)（圖1）。當(dāng)FRET盒被切割時，熒光團(tuán)（F）與猝滅劑（Q）被分開，從而產(chǎn)生可檢測的熒光信號。類似于初始反應(yīng)，被釋放的5'-翼片和FRET盒進(jìn)行循環(huán)，從而導(dǎo)致擴(kuò)增的熒光信號。初始反應(yīng)和次級反應(yīng)在同一個孔中同時進(jìn)行。雙重形式的INVADERDNA測定法使得能夠在單個孔中同時檢測兩種DNA序列（參見，例如實施例17和19（L））。最通常地，這涉及檢測特定多態(tài)性的兩種變體（例如，在miRNA中）。所述雙重形式使用兩種不同的有區(qū)分能力的初級探針，每種探針具有獨特的5'-翼片；和兩種不同的FRET盒，每種FRET盒具有在光譜上不同的熒光團(tuán)。通過設(shè)計，被釋放的5'-翼片將只與它們各自的FRET盒結(jié)合，從而產(chǎn)生靶特異性信號。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含對于實施本發(fā)明而言所必需的組分中的一種或多種。例如，本發(fā)明提供了用于貯存或遞送對于實施切割測定法（例如，INVADER測定法）而言所必需的本發(fā)明的酶和/或反應(yīng)組分的試劑盒。通過舉例的方式而無意于將本發(fā)明的試劑盒限定于任何特定的配置或組分組合，以下部分描述了用于實施本發(fā)明的試劑盒的一個實施方案：在一些實施方案中，本發(fā)明的試劑盒提供了以下試劑：CLEAVASE酶初級探針OligosDNA反應(yīng)緩沖液1INVADEROligoFRET盒1（例如，F(xiàn)）FRET盒2（例如，R）突變體DNA對照野生型DNA對照"非靶"空白對照在其他實施方案中，本發(fā)明的試劑盒被構(gòu)造成用于直接檢測RNA。這些試劑盒可以提供以下試劑：CLEAVASE酶初級探針寡核苷酸DNA反應(yīng)緩沖液1INVADEROligoFRET探針1（例如，F(xiàn)）FRET探針2（例如，R）次級反應(yīng)靶1次級反應(yīng)靶2ARRESTOR寡核苷酸1ARRESTOR寡核苷酸2突變體DNA對照野生型DNA對照"非靶"空白對照必須額外考慮，在單個反應(yīng)中，由于寡核苷酸的特定組合而導(dǎo)致的不希望的效應(yīng)。一個此類效應(yīng)是靶依賴性地產(chǎn)生背景信號。在INVADER測定法中，某些寡核苷酸與其他寡核苷酸相組合可能會在不存在待檢測的特定靶的情況下產(chǎn)生信號。將這些寡核苷酸組合分開成不同的匯集物可以用于減輕這種效應(yīng)。類似地，某些寡核苷酸組合可以人為地壓制來自所希望的靶的信號產(chǎn)生。再次地，將這些寡核苷酸組合分開成不同的匯集物可以用于減輕這種效應(yīng)。采用本文所提供的關(guān)于反應(yīng)設(shè)計和最佳化的指導(dǎo)方針（參見，例如試驗部分），對探針組（例如，寡核苷酸和/或它們的序列）的設(shè)計進(jìn)行調(diào)整以適合于在miRNA檢測測定法中使用。例如，在一些實施方案中，降低反應(yīng)溫度（例如，至50-60℃），以解決較小的雜交區(qū)域。在一些實施方案中，本發(fā)明的試劑盒提供了由用戶提供的為了實施本發(fā)明方法的額外組分（例如，試劑、供給品和/或設(shè)備）的列表。例如，并且無意于將這些額外組分的列表限定于任何特定的組分，此類列表的一個實施方案包括以下方面：·澄清的CHILLOUT-14液體蠟（MJResearch）或者不含RNA酶的光學(xué)級礦物油（Sigma,Cat.No.M-5904）·96孔聚丙烯微量培養(yǎng)板（MJResearch,Cat.No.MSP-9601）·無菌的1.5-ml或2.0-ml微量離心管·無菌的不含DNA酶/RNA酶的一次性氣溶膠屏障移液器槍頭（aerosolbarrierpipettip）·多道移液器（0.5－10μl,2.5－20μl）·熱循環(huán)儀或其他熱源（例如，實驗室烘箱或加熱器）·其他實驗室設(shè)備（試管架、微量移液器、多道吸移器、微量離心機(jī)、漩渦混合器）·熒光微量培養(yǎng)板讀取器，優(yōu)選的微量培養(yǎng)板讀取器為上方讀取的，并且裝備有光濾波器，該濾波器具有以下特征：激發(fā)（波長/帶寬）發(fā)射（波長/帶寬）485nm/20nm530nm/25nm560nm/20nm620nm/40nm在一些實施方案中，本發(fā)明的試劑盒提供了由用戶提供的有助于實施本發(fā)明方法的可選組分（例如，試劑、供給品和/或設(shè)備）的列表。例如，并且無意于將這些可選組分的列表限定于任何特定的組分，此類列表的一個實施方案包括以下方面：·無菌的8聯(lián)管（8-tubestrip）或微量培養(yǎng)板（可選的）·一次性塑料槽（可選的）·平板密封帶（可選的）。在一些實施方案中，本發(fā)明的試劑盒提供了由用戶提供的有助于實施本發(fā)明方法的所需成分的列表（對此，多種備選形式是可接受的（例如，樣品制備試劑盒））。例如，并且無意于將這些可選組分的列表限定于任何特定的組分，此類列表的一個實施方案包括以下方面：·QIAGENQIAAMPBloodKit·GentraSystemsPUREGENEKit·GentraSystemsGENERATIONProducts。在試劑盒的一些實施方案中，提供了詳細(xì)的操作方案。在優(yōu)選的實施方案中，提供了關(guān)于INVADER測定法反應(yīng)的裝配（例如，制劑以及用于制備反應(yīng)混合物的優(yōu)選操作程序）的操作方案。在特別優(yōu)選的實施方案中，關(guān)于反應(yīng)混合物的裝配的操作方案包括計算或繪圖輔助，以減小在實施本發(fā)明方法中的錯誤風(fēng)險（例如，表格，以有助于計算對于多個反應(yīng)而言所需的試劑的體積；以及平板布局指導(dǎo)，從而幫助構(gòu)造多孔測定法平板以包含許多測定法反應(yīng)）。在一些實施方案中，提供了補(bǔ)充文件資料，例如用于輔助操作程序（例如，用于制備額外的試劑，或用于制備在本發(fā)明的方法中使用的樣品）的操作方案。在優(yōu)選的實施方案中，補(bǔ)充文件資料包括指導(dǎo)和注意事項列表，它們被提供用于有助于未經(jīng)訓(xùn)練的或沒有經(jīng)驗的用戶能夠成功地使用所述方法和試劑盒。在特別優(yōu)選的實施方案中，補(bǔ)充文件資料包括發(fā)現(xiàn)并解決問題的指導(dǎo)，例如描述了用戶可能會遇到的可能的問題、并且提供了旨在幫助用戶解決或避免此類問題的建議性的解決方案或改正方法的指導(dǎo)。在優(yōu)選的實施方案中，將樣品稀釋至相當(dāng)于10-μl添加/反應(yīng)的濃度。100-ng樣品的濃度應(yīng)該為15ng/μl。B.滾環(huán)復(fù)制（RollingCircleReplication）在其他實施方案中，利用滾環(huán)復(fù)制方法（AmershamBiosciences,Piscataway,NJ）來檢測miRNA檢測結(jié)構(gòu)（參見，例如美國專利號6,344,329；6,143,495；6,316,229；6,210,884；6,183,960和6,235,502，所述文獻(xiàn)中的每一個都通過提及而以其整體合并入本文）。在一些實施方案中，采用滾環(huán)復(fù)制來檢測由與miRNA退火的單個寡核苷酸的末端的退火而產(chǎn)生的環(huán)狀miRNA檢測結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，所述寡核苷酸的末端與沒有重疊的miRNA雜交。這種寡核苷酸可以在miRNA存在或不存在下進(jìn)行連接。但是，在miRNA存在下，連接反應(yīng)更有效。在此類實施方案中，將在一定時間內(nèi)檢測到的環(huán)狀分子的水平與缺少miRNA的對照反應(yīng)相比較。在其他實施方案中，所述寡核苷酸的末端與具有重疊末端的miRNA雜交，從而形成侵入性切割結(jié)構(gòu)。此類結(jié)構(gòu)在連接之前被切割，由此提高了產(chǎn)生環(huán)狀檢測結(jié)構(gòu)的特異性。滾環(huán)擴(kuò)增（rollingcircleamplification，RCA）涉及環(huán)狀單鏈DNA分子的復(fù)制。在RCA中，滾環(huán)復(fù)制引物與環(huán)狀核酸分子雜交，然后使用鏈置換DNA聚合酶（strand-displacingDNApolymerase）來進(jìn)行核酸分子的滾環(huán)復(fù)制。在單個反應(yīng)循環(huán)中，在滾環(huán)復(fù)制過程中發(fā)生擴(kuò)增。滾環(huán)復(fù)制導(dǎo)致形成大的DNA分子，其包含串聯(lián)重復(fù)的核酸序列。這種DNA分子被稱為串聯(lián)序列DNA（tandemsequenceDNA，TS-DNA）。在一些實施方案中，采用連接介導(dǎo)的滾環(huán)擴(kuò)增（ligation-mediatedrollingcircleamplification，LM-RCA），其涉及在復(fù)制之前的連接操作。在所述連接操作中，探針與其同族靶核酸序列（如果存在的話）雜交，然后經(jīng)雜交的探針的末端進(jìn)行連接，從而形成共價閉合的單鏈核酸。在連接后，滾環(huán)復(fù)制引物與探針分子雜交，然后使用鏈置換DNA聚合酶來進(jìn)行環(huán)狀分子的滾環(huán)復(fù)制。一般地，LM-RCA方法包括：將開放的環(huán)狀探針與靶樣品相混合，導(dǎo)致形成探針-靶樣品混合物；并在促進(jìn)開放的環(huán)狀探針與靶序列雜交的條件下溫育所述探針-靶樣品混合物；將連接酶與所探針-靶樣品混合物相混合；導(dǎo)致形成連接混合物，并在促進(jìn)開放的環(huán)狀探針進(jìn)行連接從而形成擴(kuò)增靶環(huán)（amplificationtargetcircle，ATC）的條件下溫育所述連接混合物；將滾環(huán)復(fù)制引物（rollingcirclereplicationprimer，RCRP）與所述連接混合物相混合；導(dǎo)致形成引物-ATC混合物，并在促進(jìn)擴(kuò)增靶環(huán)與滾環(huán)復(fù)制引物之間的雜交的條件下溫育所述引物-ATC混合物；將DNA聚合酶與所述引物-ATC混合物相混合；導(dǎo)致形成聚合酶-ATC混合物，并在促進(jìn)擴(kuò)增靶環(huán)復(fù)制的條件下溫育所述聚合酶-ATC混合物，其中擴(kuò)增靶環(huán)的復(fù)制導(dǎo)致形成串聯(lián)序列DNA（TS-DNA）。C.另外的檢測方法本發(fā)明不限于INVADER測定法或滾環(huán)測定法檢測?？梢允褂萌魏卧试S檢測miRNA檢測結(jié)構(gòu)的方法。下文描述了可在本發(fā)明的方法中使用的示例性的、非限定性的檢測測定法。1.雜交測定法在本發(fā)明的一些實施方案中，采用雜交測定法來檢測檢測結(jié)構(gòu)。在雜交測定法中，基于來自樣品的DNA與互補(bǔ)DNA分子（例如，寡核苷酸探針）雜交的能力來確定給定的核酸序列的存在與否。使用了各種關(guān)于雜交和檢測的技術(shù)的各種雜交測定法是可用的。下面提供了測定法的選擇的描述。a.使用“DNA芯片”測定法進(jìn)行的雜交的檢測在本發(fā)明的一些實施方案中，使用DNA芯片雜交測定法來檢測序列。在該測定法中，將一系列寡核苷酸探針固定于固體支持物上。將寡核苷酸探針設(shè)計成對于給定的靶序列（例如，檢測復(fù)合物的組分）是獨特的。將目的樣品與DNA“芯片”接觸并檢測雜交。在一些實施方案中，所述DNA芯片測定法是GeneChip（Affymetrix,SantaClara,CA;參見，例如美國專利號6,045,996、5,925,525和5,858,659；所述文獻(xiàn)中的每一個都通過提及而合并入本文）測定法。GeneChip技術(shù)使用小型化、高密度的固定在“芯片”上的寡核苷酸探針陣列。通過Affymetrix的光引導(dǎo)化學(xué)合成（light-directedchemicalsynthesis）方法來制備探針陣列，該方法將固相化學(xué)合成與在半導(dǎo)體工業(yè)中所使用的光刻蝕制造技術(shù)（photolithographicfabricationtechniques）相結(jié)合。通過使用一系列光刻蝕掩膜來確定芯片暴露位點，然后進(jìn)行特異的化學(xué)合成步驟，該方法構(gòu)建出高密度的寡核苷酸陣列，其中每個探針位于陣列中預(yù)先確定的位置中。在大的玻璃薄片上同時合成多個探針陣列。然后將薄片切成小片，并將獨個的探針陣列包裝入注塑成型的塑料吸納盒（cartridge）中，該吸納盒保護(hù)探針陣列免受環(huán)境的破壞和用作雜交室。分離待分析的核酸，通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，并用熒光報告基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。然后使用全自動洗滌工作站（fluidicsstation），將經(jīng)標(biāo)記的DNA與該陣列一起進(jìn)行溫育。然后將陣列插入掃描儀，在掃描儀中檢測雜交圖式。作為從已摻入靶的熒光報告基團(tuán)發(fā)射出的光，收集雜交數(shù)據(jù)，所述靶已被結(jié)合至該探針陣列。完全匹配靶的探針通常產(chǎn)生比具有錯配的探針更強(qiáng)的信號。因為陣列上每個探針的序列和位置是已知的，所以通過互補(bǔ)性，可確定施加于探針陣列上的靶核酸的身份。在其他實施方案中，使用包含電子捕獲探針（electronicallycapturedprobes）（Nanogen,SanDiego,CA）的DNA微芯片（參見，例如美國專利號6,017,696、6,068,818和6,051,380；所述文獻(xiàn)中的每一個都通過提及而合并入本文）。通過使用微電子學(xué)，Nanogen的技術(shù)使得帶電分子能夠在其半導(dǎo)體微芯片上主動運動和濃集至指定的測試位點和從指定的測試位點移開。將對于給定的靶序列來說獨特的DNA捕獲探針通過電子作用置于或“送”至微芯片上的特定位點。因為DNA具有強(qiáng)負(fù)電荷，所以其可通過電子作用移動至正電荷區(qū)域。首先，用正電荷電子地激活微芯片上的測試位點或成排的測試位點。然后，將含有DNA探針的溶液導(dǎo)至微芯片上。帶負(fù)電荷的探針快速地移動至帶正電荷的位點，在那里它們濃集并化學(xué)地結(jié)合至微芯片上的位點。然后洗滌該微芯片并加入另一種不同DNA探針的溶液直至完成經(jīng)特異性結(jié)合的DNA探針的陣列。然后通過確定哪些DNA捕獲探針與靶序列雜交，而就靶序列的存在來分析受試樣品。電子電荷也用于將靶分子移動和濃集至微芯片上的一個或多個測試位點。樣品DNA在每個測試位點處的電子濃集促進(jìn)了樣品DNA與互補(bǔ)的捕獲探針的快速雜交（雜交可在數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生）。為了從每個位點除...