一種棉花鋅指蛋白(Czf6)及其編碼基因與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及植物蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一個(gè)來(lái)源于棉花的鋅指蛋白(Czf6)及其編碼基因，以及其在培育抗旱性提高的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
非生物脅迫，如干旱、鹽漬、極端溫度、化學(xué)污染和氧損傷等能夠?qū)χ参锏纳L(zhǎng)發(fā)育造成嚴(yán)重的危害，對(duì)作物產(chǎn)量造成極大損失。其中干旱對(duì)作物產(chǎn)量的影響，在諸多自然逆境中占首位，其危害相當(dāng)于其它災(zāi)害之和，是許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界干旱、半干旱地區(qū)占陸地面積的34％；我國(guó)干旱、半干旱地區(qū)約占國(guó)土面積的52％，年受旱面積達(dá)200-270萬(wàn)公頃，全國(guó)灌溉區(qū)每年缺水約30億立方米，因缺水而少收糧食350-400億公斤；特別是我國(guó)主要產(chǎn)糧區(qū)如華北、東北和西北，是我國(guó)缺水最嚴(yán)重的地區(qū)，春旱頻繁達(dá)到十年九遇。由于植物的耐脅迫性大多屬于數(shù)量性狀，現(xiàn)有可利用的種質(zhì)資源匱乏，采用常規(guī)育種技術(shù)改良植物脅迫耐性的難度相當(dāng)大，培育出真正的耐脅迫品種就尤為困難。近年來(lái)，隨著對(duì)植物抗逆分子機(jī)理研究的不斷深入和分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，抗逆研究已經(jīng)從生理水平深入到分子水平，促進(jìn)了植物抗逆基因工程的發(fā)展。當(dāng)植物在受到脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng)，來(lái)降低或消除給植株帶來(lái)的危害。植物的這種應(yīng)答反應(yīng)是一個(gè)涉及多基因、多信號(hào)途徑、多基因產(chǎn)物的復(fù)雜過(guò)程。這些基因及其表達(dá)產(chǎn)物可以分為3類(lèi)：(1)參與信號(hào)級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)和轉(zhuǎn)錄控制的基因及產(chǎn)物；(2)直接對(duì)保護(hù)生物膜和蛋白質(zhì)起作用的基因及其表達(dá)產(chǎn)物；(3)與水和離子的攝入和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)。近年來(lái)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物對(duì)脅迫耐受能力的研究，以及對(duì)脅迫具有耐受能力的農(nóng)作物、旱生植物和鹽生植物的研究都取得了顯著的成果，對(duì)脅迫相關(guān)基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)也有了更進(jìn)一步的了解(LiuQ.1998.Twotranscriptionfactors，DREB1andDREB2，withanEREBP/AP2DNAbindingdomain，separatetwocellularsignaltransductionpathwaysindrought-andlowtemperature-responsivegeneexpression，respectively，inArabidopsis.PlantCell，10：1391-1406；KANGJY.2002.Arabidopsisbasicleucinezipperproteinsthatmediatestress-responsiveabscisicacidsignaling.PlantCell，14：343-357；ABEH.2003.ArabidopsisAtMYC2(bHLH)andAtMYB2(MYB)functionastranscriptionalactivatorsinabscisicacidsignaling.PlantCell，15：63-78.)。但就目前的研究狀況而言，由于其機(jī)制十分復(fù)雜，許多植物對(duì)逆境下的生物化學(xué)和生理學(xué)上的響應(yīng)機(jī)制仍有待深入研究。在抗逆應(yīng)答基因的功能及表達(dá)調(diào)控方面的研究將對(duì)植物抗逆相關(guān)的信號(hào)傳遞途徑及信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的研究提供重要的基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明人利用SSH(抑制差減雜交)與RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增)相結(jié)合的方法克隆出了棉花的一個(gè)鋅指蛋白(本文命名為Czf6)的編碼基因，并測(cè)定了其DNA序列。并且發(fā)現(xiàn)通過(guò)轉(zhuǎn)基因?qū)⑵鋵?dǎo)入植株后，可明顯改善轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性，而且這些性狀可穩(wěn)定遺傳。本發(fā)明第一方面提供棉花的一個(gè)鋅指蛋白Czf6的編碼基因(本文命名為GhCzf6)，其序列為SEQIDNO：2。本發(fā)明第二方面提供一種重組表達(dá)載體，其含有本發(fā)明第一方面所述的基因并且所述基因的核苷酸序列與所述表達(dá)載體的表達(dá)控制序列可操作地連接；優(yōu)選地，所述載體為附圖2所示的rd29A-GhCzf6-2300載體。本發(fā)明第三方面提供一種重組細(xì)胞，其含有本發(fā)明第一方面所述的基因或者本發(fā)明第二方面所述的重組表達(dá)載體；優(yōu)選地，所述重組細(xì)胞為重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。本發(fā)明第四方面提供一種改善植物抗旱性的方法，包括：將本發(fā)明第一方面所述基因或者本發(fā)明第二方面所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物或植物組織并使所述基因表達(dá)；優(yōu)選地，所述植物是煙草。本發(fā)明第五方面提供一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括：在有效產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)含有本發(fā)明第一方面所述基因或者本發(fā)明第二方面所述的重組表達(dá)載體的植物或植物組織；優(yōu)選地，所述植物是煙草。本發(fā)明第六方面提供本發(fā)明第一方面所述的基因、本發(fā)明第二方面所述的重組表達(dá)載體或者本發(fā)明第三方面所述的重組細(xì)胞用于改善植物抗旱性以及用于植物育種的用途；優(yōu)選地，所述植物是煙草。本發(fā)明第七方面提供本發(fā)明第一方面所述的基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。附圖說(shuō)明圖1是GhCzf6的植物表達(dá)載體(rd29A-GhCzf6-2300)的構(gòu)建流程。圖2是GhCzf6的植物表達(dá)載體(rd29A-GhCzf6-2300)的質(zhì)粒圖。圖3是對(duì)照煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性生長(zhǎng)情況；CK(左)：對(duì)照煙草；T1F9(中)和T1F12(右)：轉(zhuǎn)基因煙草株系。圖4是耐干旱和不耐干旱T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株在轉(zhuǎn)錄水平上的驗(yàn)證結(jié)果。M為Marker，1-8為耐干旱的T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株，9-12為不耐干旱的T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株。具體實(shí)施方式提供以下實(shí)施例，以方便本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明。所述實(shí)施例僅出于示例性目的，并非意在限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1干旱脅迫下棉花SSH文庫(kù)構(gòu)建：具體方法為：利用Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit所示的方法通過(guò)抑制差減雜交方法構(gòu)建差減文庫(kù)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以干旱處理的棉花幼苗的葉片中提取的mRNA作為樣本(tester)，以未處理的棉花幼苗的葉片中提取的mRNA作為對(duì)照(driver)。具體步驟簡(jiǎn)述如下：(1)供試材料：非洲棉(國(guó)家棉花中期庫(kù)，獲取單位中國(guó)棉花研究所，統(tǒng)一編號(hào)：ZM-06838)播種到滅過(guò)菌的蛭石上，在25℃、光周期16h/8h(光強(qiáng)2000-3000Lx)條件下培養(yǎng)，每周澆1/2MS培養(yǎng)基(含有9.39mMKNO3，0.625mMKH2PO4，10.3mMNH4NO3，0.75mMMgSO4，1.5mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNa2EDTA，100μMFeSO4)一次。當(dāng)苗株高達(dá)25-30cm時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。(2)材料處理：將供試幼苗分為2組，每組4盆，每盆1株。第一組為對(duì)照組，在25℃、光周期16h/8h(光強(qiáng)2000-3000Lx)條件下培養(yǎng)，正常澆灌。第二組為干旱處理組，25℃、光周期16h/8h(光強(qiáng)2000-3000Lx)條件下培養(yǎng)，停止?jié)补?，處?0天，處理完畢后及時(shí)剪取兩組幼苗頂端1/3的葉片，用液氮迅速冷凍后，于-70℃冰箱中保存。(3)總RNA提?。悍謩e取對(duì)照組和干旱處理組的棉花葉片0.5g，用植物RNA提取試劑盒(購(gòu)自invitrogen)提取棉花葉片的總RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度計(jì)U-2001測(cè)定總RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值為1.8-2.0，表明總RNA純度較高，用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍，表明RNA的完整性良好。使用Qiagen公司的OligotexmRNA純化試劑盒(purificationofpolyA+RNAfromtotalRNA)分離mRNA。(4)抑制差減雜交：按Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit試劑盒所示的方法進(jìn)行抑制差減雜交。應(yīng)用Clontech的PCR-SelectcDNASubtractionKits差減雜交試劑盒，先將DrivermRNA和TestermRNA分別反轉(zhuǎn)錄，得到雙鏈cDNA，再以2μgTestercDNA和2μgDrivercDNA作為起始材料進(jìn)行差減雜交。在37℃水浴下分別將TestercDNA和DrivercDNA用RsaI酶切1.5h，然后將酶切后的TestercDNA分成兩等份，連接上不同的接頭，而DrivercDNA不連接頭。兩種連有不同接頭的TestercDNA分別與過(guò)量的Driver混合，進(jìn)行第一次正向差減雜交。將兩種第一次差減雜交的產(chǎn)物混合，再與新鮮變性的DrivercDNA進(jìn)行第二次正向差減雜交，通過(guò)兩次抑制性PCR擴(kuò)增差異表達(dá)的片段，使其得到富集。(5)cDNA差減文庫(kù)的構(gòu)建與初步篩選、克隆、鑒定依照pGEM-TEasy試劑盒的程序，將所述正向差減雜交cDNA片段的第二次PCR產(chǎn)物(使用QIAquickPCRPurificationKit純化，購(gòu)自Qiagen)與pGEM-TEasy(購(gòu)自Promega試劑盒)載體連接，其具體步驟如下：用200μlPCR管依次加入下列成分：純化的正向差減雜交cDNA片段的第二次PCR產(chǎn)物3μl，2×T4連接酶緩沖液5μl，pGEM-TEasy載體1μl，T4DNA連接酶1μl，于4℃連接過(guò)夜。取10μl連接反應(yīng)產(chǎn)物，加入到100μl感受態(tài)大腸桿菌JM109(購(gòu)自TAKARA)中，冰浴30min、熱休克60秒、冰浴2min，另加250μlLB培養(yǎng)液(含有1％Tryptone(購(gòu)自O(shè)XOID)，0.5％YeastExtract(購(gòu)自O(shè)XOID)，1％NaCl(購(gòu)自國(guó)藥))置37℃水浴中，以225rpm振蕩培養(yǎng)30min，取200μl菌液接種于含50μg/ml氨芐青霉素的LB(同上)/X-gal/IPTG(X-gal/IPTG購(gòu)自TAKARA)培養(yǎng)板上，37℃培育18h。計(jì)數(shù)培養(yǎng)板中直徑＞1mm的清晰白色及藍(lán)色菌落數(shù)，隨機(jī)挑取540個(gè)白色菌落(編號(hào)：Gh-D2-001至Gh-D2-540)。將所有白色克隆接種于含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(CORNING)中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后加甘油至終濃度20％，于-80℃保存?zhèn)溆?。以巢式PCR引物Primer1和Primer2R(Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit試劑盒自帶)進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，得到452個(gè)陽(yáng)性克隆，然后將所有陽(yáng)性克隆送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序。(6)差異克隆的cDNA測(cè)序分析：將DNA測(cè)序結(jié)果去除載體和不明確序列及冗余的cDNA后，共得到405個(gè)有效EST(unigene)。實(shí)施例2棉花鋅指蛋白基因GhCzf6的克隆克隆子Gh-D2-153去掉冗余DNA后，序列為SEQIDNo：3，序列分析表明該序列編碼的蛋白屬于鋅指蛋白，本文將SEQIDNo：3序列對(duì)應(yīng)的全長(zhǎng)編碼基因命名為GhCzf6，對(duì)應(yīng)的蛋白命名為Czf6。SEQIDNo：3GhCzf6全長(zhǎng)編碼基因的克隆根據(jù)已經(jīng)獲得的SEQIDNo：3序列，設(shè)計(jì)如下三條特異性引物，作為5’RACE的3’端特異性引物。GhCzf6GSP3：SEQIDNO：4：TCACGATCTTCTCTGCTTTGACGhCzf6GSP4：SEQIDNO：5：CACGGGATTGGCACGTGCAATCGhCzf6GSP5：SEQIDNO：6：CCCAATCTTCTTGAAATCGAAC實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作(5’RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds試劑盒購(gòu)自invitrogen公司)。用SEQIDNO：5與5’通用引物AAP(試劑盒自帶)，以mRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA(反轉(zhuǎn)錄引物SEQIDNO：4)為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，具體步驟如下：50μlPCR反應(yīng)體系：5μl10×ExBuffer、3μl2.5mM的dNTP、2.0μlmRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA、1.0μlExTaq(購(gòu)自TAKARA)、10μM的引物SEQIDNO：5和AAP各2.0μl、以及35μl雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，33個(gè)循環(huán)(94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min)，72℃延伸10min。所得的PCR產(chǎn)物用雙蒸水稀釋50倍后取2.0μl作為模板，用SEQIDNO：8與3’端引物AUAP進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，具體步驟如下：50μlPCR反應(yīng)體系：5μl10×ExBuffer、3μl2.5mM的dNTP、2.0μl稀釋的第一輪PCR產(chǎn)物、1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO：6和AUAP各2.0μl、以及35μl雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，33個(gè)循環(huán)(94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min)，72℃延伸10min?；厥盏诙蜳CR產(chǎn)物中片段約為500bp的條帶(GelExtractionKit購(gòu)自O(shè)MEGA)，并將其連接于pGEM-TEasyVector，然后轉(zhuǎn)化到JM109(具體方法同上)，隨機(jī)挑取10個(gè)白色菌落接種于含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后加甘油至終濃度20％，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肧EQIDNO：8與3’端引物AUAP進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增(反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同上)，得到7個(gè)陽(yáng)性克隆，選取其中4個(gè)克隆送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序測(cè)序，獲得該基因的cDNA的5’端。所得的5’RACE產(chǎn)物克隆測(cè)序后，將其與SEQIDNo：3序列拼接。獲得GhCzf6全長(zhǎng)cDNA序列SEQIDNo：7：根據(jù)SEQIDNO：7序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物如下：GhCzf6：SEQIDNO：8：ATGGCGGAGGAACATAAATGCCGhCzf6：SEQIDNO：9：TCAAATCCTCACGATCTTCTCT通過(guò)SEQIDNO：8和SEQIDNO：9來(lái)克隆GhCzf6全長(zhǎng)編碼基因。采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶，以棉花的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。50μlPCR反應(yīng)體系：10μl5×PSBuffer、3μl2.5mM的dNTP、2.0μlcDNA、1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQIDNO：8和SEQIDNO：9各2.0μl、以及30μl雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，33個(gè)循環(huán)(94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min)，72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加A尾：PCR產(chǎn)物中加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃放置10分鐘，離心，去上清，晾干，然后用21μl雙蒸水溶解。然后向其中加入2.5μl10×ExBuffer、0.5μl5mM的dATP、2.5μl10×ExTaq。反應(yīng)條件：70℃反應(yīng)30分鐘。將得到的約540bp的DNA片段回收(Omega回收試劑盒)，并將其連接至pGEMT-easy載體上，然后轉(zhuǎn)化JM109(方法同上)，隨機(jī)挑取10個(gè)白色菌落接種于含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后加甘油至終濃度20％，-80℃保存?zhèn)溆?。用SEQIDNO：8與SEQIDNO：9進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增(反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同上)，得到7個(gè)陽(yáng)性克隆，選取其中4個(gè)陽(yáng)性克隆送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序，序列為SEQIDNO：2，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQIDNO：1。Czf6蛋白的氨基酸序列：SEQIDNO：1GhCzf6編碼基因的核苷酸序列：SEQIDNO：2實(shí)施例3GhCzf6基因植物表達(dá)載體構(gòu)建選擇植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA2300(購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)作為植物表達(dá)載體，用Pnos啟動(dòng)子替換NPTII基因含雙增強(qiáng)子的35S啟動(dòng)子，以降低NPTII蛋白在植物中的表達(dá)。選擇誘導(dǎo)型的rd29A啟動(dòng)子及終止子Tnos分別作為GhCzf6基因的啟動(dòng)子和終止子。用引物SEQIDNO：10和SEQIDNO：11以植物表達(dá)載體pBI121(購(gòu)自北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司)為模板擴(kuò)增Pnos，采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶。50μlPCR反應(yīng)體系：10μl5×PSBuffer、3μl2.5mM的dNTP、1.0μlpBI121、1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQIDNO：10和SEQIDNO：11各2.0μl、以及31μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，33個(gè)循環(huán)(94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃延伸10min。通過(guò)EcoRI、BglII酶切將所得的PCR產(chǎn)物連接(promega，T4連接酶盒)到pCAMBIA2300獲得pCAMBIA2300-1。SEQIDNO：10：GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGATSEQIDNO：11：ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG用引物SEQIDNO：12和SEQIDNO：13以pBI121為模板擴(kuò)增Tnos，采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶。50μlPCR反應(yīng)體系：10μl5×PSBuffer、3μl2.5mM的dNTP、1.0μlpBI121、1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQIDNO：12和SEQIDNO：13各2.0μl、以及31μl雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，33個(gè)循環(huán)(94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃延伸10min。通過(guò)SacI、EcoRI酶切將所得的PCR產(chǎn)物連接(promegaT4連接酶盒)到pCAMBIA2300-1獲得pCAMBIA2300-2。SEQIDNO：12：AAGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAASEQIDNO：13：TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA用引物SEQIDNO：14和SEQIDNO：15以擬南芥(哥倫比亞型，購(gòu)自www.arabidopsis.org)DNA為模板擴(kuò)增擬南芥rd29A啟動(dòng)子(參考ZengJ.，etal.2002，PreparationoftotalDNAfrom“recalcitrantplanttaxa”，ActaBot.Sin.，44(6)：694-697中的方法提取擬南芥DNA)。采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶。50μlPCR反應(yīng)體系：10μl5×PSBuffer、3μl2.5mM的dNTP、1.0μl擬南芥DNA、1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQIDNO：14和SEQIDNO：15各2.0μl、以及31μl雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，33個(gè)循環(huán)(94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃延伸10min。通過(guò)HindIII、PstI酶切將所得的PCR產(chǎn)物連接(連接方法同上)到pCAMBIA2300-2獲得pCAMBIA2300-3。SEQIDNO：14：ACTAAGCTTCCTTCTTGACATCATTCAATTTTASEQIDNO：15：TGACTGCAGTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAATAG用引物SEQIDNO：16和SEQIDNO：17擴(kuò)增GhCzf6編碼基因的全長(zhǎng)序列(模板是實(shí)施例2所獲得GhCzf6全長(zhǎng)編碼基因)，采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶。50μlPCR反應(yīng)體系：10μl5×PSBuffer、3μl2.5mM的dNTP、1.0μlGhCzf6-pGEM、1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQIDNO：16和SEQIDNO：17各2.0μl、以及31μl雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，33個(gè)循環(huán)(94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min)，72℃延伸10min。通過(guò)PstI、SacI酶切將所得的PCR產(chǎn)物連接(連接方法同上)到pCAMBIA2300-3，獲得植物表達(dá)載體rd29A-GhCzf6-2300。SEQIDNO：16：TGACTGCAGATGGCGGAGGAACATAAATGCCSEQIDNO：17：AAGGAGCTCTCAAATCCTCACGATCTTCTCT實(shí)施例4rd29A-GhCzf6-2300表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌LBA4404(購(gòu)自BiovectorScienceLab，Inc)感受態(tài)細(xì)胞的制備：提前1-2天將農(nóng)桿菌LBA4404在含50μg/ml利福平和50μg/ml鏈霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃單斑接種，28℃培養(yǎng)1至2天。挑取單菌落接種于5ml含50μg/ml利福平和50μg/ml鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜(約12-16h)至OD600值為0.4，形成種子菌液。取5ml活化后的菌液(1∶20的比例)接種于100ml含50μg/ml利福平和50μg/ml鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃搖動(dòng)培養(yǎng)2-2.5h至OD600＝0.8。冰浴菌液10min，每隔3min搖勻一次，令所述細(xì)菌均勻進(jìn)入休眠狀態(tài)。于4℃下4000g離心10min，棄上清液；加入一定量冰預(yù)冷的10％甘油重懸浮菌體，4℃下4000g離心10min，收集沉淀；用冰預(yù)冷的10％甘油重復(fù)洗3-4次；然后加入適量冰浴預(yù)冷的10％甘油重新懸浮細(xì)菌沉淀，以40μl/管將其分裝，于-70℃保存?zhèn)溆?。轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌：在冰上融化所述的感受態(tài)細(xì)胞，往40μl的感受態(tài)細(xì)胞中加入1μl的質(zhì)粒，混勻后冰浴約10min。將感受態(tài)細(xì)胞和DNA的混合物用移液槍轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的電擊杯(購(gòu)自bio-rad)中，輕敲使懸浮液到達(dá)電擊杯底部，注意不要有氣泡。將所述電擊杯放到電擊室的滑道上，推動(dòng)滑道將電擊杯放至電擊室基座電極處。使用0.1em規(guī)格的電擊杯的時(shí)候，MicroPulser(購(gòu)自bio-rad)的程序設(shè)置為“Agr”，電擊一次。立即取出電擊杯，加入28℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基?？焖俣p柔的用移液槍將細(xì)胞打勻。將懸浮液轉(zhuǎn)入1.5ml的離心管，在28℃225rpm搖動(dòng)培養(yǎng)1h。取100-200μl的菌液涂布于相應(yīng)的抗性篩選培養(yǎng)基平板上(LB固體培養(yǎng)基，含50μg/ml利福平、50μg/ml鏈霉素、50μg/ml卡那霉素)，28℃培養(yǎng)。實(shí)施例5利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因煙草用75％酒精浸泡煙草種子(國(guó)家煙草中期庫(kù)，獲取單位：中國(guó)農(nóng)科院煙草所，庫(kù)編號(hào)I5A00660)30s，然后用滅菌雙蒸水洗兩次。再用0.1％升汞浸泡8min，然后用滅菌雙蒸水洗兩次，完成表面滅菌。將表面滅菌的煙草種子置于MS固體培養(yǎng)基(含有18.78mMKNO3、1.25mMKH2PO4、20.6mMNH4NO3、1.5mMMgSO4、3.0mMCaCl2、50μMKI、100μMH3BO3、100μMMnSO4、30μMZnSO4、1μMNa2MoO4、0.1μMCoCl2、100μMNa2EDTA、100μMFeSO4、7.4g/l瓊脂、30g/l蔗糖)上于無(wú)菌條件下發(fā)芽，制備無(wú)菌苗。取無(wú)菌苗葉片剪成5mm×5mm大小的葉盤(pán)，用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的含表達(dá)載體rd29A-GhCzf6-2300的農(nóng)桿菌浸染葉盤(pán)10min，吸干菌液，在黑暗條件下共培養(yǎng)2天(MS固體培養(yǎng)基)。將葉片轉(zhuǎn)到分化固體培養(yǎng)基(MS+1mg/l細(xì)胞分裂素(BA)+0.1mg/l萘乙酸(NAA)+50mg/l卡那霉素+500mg/l頭孢霉素)上，光周期16h/8h(光強(qiáng)2000-3000Lx)條件下培養(yǎng)45天左右，待芽長(zhǎng)大后切下轉(zhuǎn)移到生根固體培養(yǎng)基(MS+50mg/l卡那霉素+500mg/l頭孢霉素)中培養(yǎng)30天左右，待根系發(fā)達(dá)后將小苗轉(zhuǎn)入僅加有500mg/L頭孢霉素的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行編號(hào)保存。剪取獲得的轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉片，提取DNA(同實(shí)施例3中擬南芥DNA提取方法)，用SEQIDNO：8和SEQIDNO：9行PCR擴(kuò)增鑒定(50μlPCR反應(yīng)體系：5μl10×ExBuffer、3μl2.5mM的dNTP、2.0μlDNA、1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO：8和SEQIDNO：9各2.0μl、以及35μl雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，33個(gè)循環(huán)(94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min)，72℃延伸10min)，將PCR鑒定為陽(yáng)性植株編號(hào)為T(mén)OF1-TOF20。實(shí)施例6過(guò)表達(dá)GhCzf6轉(zhuǎn)基因煙草T1代植株的抗旱模擬實(shí)驗(yàn)滅過(guò)菌的蛭石用1/2MS培養(yǎng)基浸透。TOF1-TOF20轉(zhuǎn)基因煙草及對(duì)照煙草的種子分別播種在蛭石上，每盆播種15顆種子，25℃、10小時(shí)光培養(yǎng)/14小時(shí)暗培養(yǎng)循環(huán)。每5天澆一次1/2MS，培養(yǎng)25天之后，每盆保留大小較一致的4-5棵苗用于干旱實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)基因煙草、對(duì)照煙草干旱14天(不澆水)，25℃、10小時(shí)光培養(yǎng)/14小時(shí)暗培養(yǎng)循環(huán)。T1代轉(zhuǎn)基因植株(TO代轉(zhuǎn)基因植株的種子長(zhǎng)成的植株)的抗旱性鑒定表明，對(duì)照植株都萎蔫嚴(yán)重，而T1F5、T1F7、T1F9、T1F12、T1F15、T1F16、T1F19七個(gè)株系共35棵煙草中有24棵能夠正常生長(zhǎng)，表現(xiàn)出明顯的抗旱性(見(jiàn)圖3，以T1F9、T1F12為例，T1F5、T1F7、T1F15、T1F16、T1F19的結(jié)果與T1F9、T1F12類(lèi)似，在此未示出)。實(shí)施例7在轉(zhuǎn)錄水平上驗(yàn)i正Czf6蛋白表達(dá)實(shí)施例6中24棵能夠在干旱條件下正常生長(zhǎng)的T1代轉(zhuǎn)基因植株中隨機(jī)選取8棵，實(shí)施例6中11棵不能在干旱條件下正常生長(zhǎng)的T1代轉(zhuǎn)基因植株中隨機(jī)選取4棵，各剪取干旱14天的葉片0.05g，用植物RNA提取試劑盒(invitrogen)提取總RNA。紫外分光光度測(cè)定總RNA在260nm和280nm的吸光度值，計(jì)算各個(gè)RNA濃度。依照invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScriptIIIReverseTranscriptase所示方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(1μg總RNA作為模板，反轉(zhuǎn)錄引物SEQIDNO：9)。通過(guò)SEQIDNO：8和SEQIDNO：9擴(kuò)增GhCzf6，檢測(cè)Czf6蛋白相對(duì)表達(dá)情況。采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。50μlPCR反應(yīng)體系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlcDNA，1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQIDNO：10和SEQIDNO：11各2.0μl，以及30μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，29個(gè)循環(huán)(94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min)，72℃延伸10min。產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖4所示：M為DNALadderMarker(DL2000，購(gòu)自深圳瑞真生物技術(shù)有限公司)，1-8為正常生長(zhǎng)植株，9-12為不能正常生長(zhǎng)植株。圖中所示條帶大小與GhCzf6的大小一致。結(jié)果表明正常生長(zhǎng)植株中GhCzf6的轉(zhuǎn)錄較強(qiáng)，不能正常生長(zhǎng)植株中沒(méi)有GhCzf6轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄很弱。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是本發(fā)明也適用于特定描述之外的變化和調(diào)整，并且本發(fā)明包括所有的這種變化和調(diào)整。發(fā)明人要求落入下文權(quán)利要求范圍和精神內(nèi)的修改和改變的權(quán)利。