一種用于測定亞精胺/精胺N1-乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性的方法相關(guān)申請的交叉引用本申請要求在美國專利商標局2012年11月16日提交的臨時申請的權(quán)益，其公開的內(nèi)容通過引用的方式并入本申請，并且本申請要求該專利的優(yōu)先權(quán)。

背景技術(shù)：
技術(shù)領域美國專利號6,811,967于2004年11月4日頒發(fā)給SITAR等人，其全部公開的內(nèi)容通過引用合并于此。該專利公開了一種利用亞精胺/精胺N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(SSAT)的底物，通過檢測SSAT底物的乙?；问絹頊y定SSAT的活性的方法。SSAT的底物可能包括金剛胺，其中金剛胺產(chǎn)生乙酰化代謝產(chǎn)物N-乙?；饎偘返拇x的發(fā)生在一定程度上由可誘導的酶SSAT的行為引起。還公開了SSAT的活性與病理狀況的相關(guān)性。SSAT普遍分布在哺乳動物組織中，并在細胞中聚胺的分解代謝和消除中起作用。SSAT是一種催化乙?；鶑囊阴］o酶A轉(zhuǎn)移到聚胺的氨丙基部分的誘導酶。SSAT的這一行為促進了聚胺的降解、排泄以及循環(huán)和/或細胞內(nèi)循環(huán)。SSAT以這種方式參與維持哺乳動物細胞內(nèi)聚胺的動態(tài)平衡。然而，在正常的或未經(jīng)誘導的哺乳動物組織中SSAT以非常低的水平存在?？梢酝ㄟ^不同的藥物、生長因子、聚胺、聚胺類似物、有毒物質(zhì)、激素和生理刺激誘導SSAT的表達。雖然所有上述化合物可以誘導SSAT的表達，但是對于每個單獨的化合物,誘導發(fā)生的時間不同。SSAT表達的調(diào)節(jié)在轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定、mRNA翻譯和蛋白質(zhì)穩(wěn)定的水平發(fā)生。體外實驗能成功地進行前，為使細胞中存在足夠的SSAT酶通常需要SSAT的誘導或過表達或有100,000×g離心的上清液。目前的文獻教導SSAT是一種對包括精胺和亞精胺或其類似物在內(nèi)的底物特異性乙?；?，然而SSAT作用于非精胺/亞精胺底物的SSAT活性、SSAT的酶動力學以及測定方法還是沒有被理解?，F(xiàn)有量化SSAT活性的方法。然而，這些技術(shù)都依賴于技術(shù)高度熟練的人員和復雜的實驗方法。更具體地說，一直存在對一種測定方法的需求，這種測定方法通過檢測SSAT的非精胺/亞精胺底物的乙?；问絹砹炕疭SAT的活性，該方法可用于檢測各種病理狀況。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種確定哺乳動物中精胺/亞精胺N1-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(SSAT)活性的方法，包括步驟：測定來自哺乳動物的樣本中一種非精胺/亞精胺或其類似物、SSAT底物的乙?；问降乃?。在該方法的第一個實施例中，SSAT底物是金剛乙胺，SSAT底物的乙?；问绞且阴；?金剛乙胺。該方法可以包括在1-10mg/kg，或者可選擇地在3-6mg/kg范圍內(nèi)的特定SSAT底物劑量水平，將SSAT底物和哺乳動物的組織或細胞一起孵育。供測定的樣本可以是來自于哺乳動物的尿液、血液和/或唾液，樣本在底物孵育后的2-24小時采集，可選擇地在孵育后的2-4小時。在該方法的第二個實施例中，SSAT底物是妥卡尼，SSAT底物的乙?；问绞且阴；?妥卡尼。該方法可以包括在1-10mg/kg，或者可選擇地在3-6mg/kg范圍的內(nèi)的特定SSAT底物劑量水平，將SSAT底物和哺乳動物的組織或細胞一起孵育。供測定的樣本可以是來自于哺乳動物的尿液、血液和/或唾液，樣本在底物孵育后的2-24小時采集，可選擇地在孵育后的2-4小時。在該方法的第三個實施例中，SSAT的活性在肝細胞中檢測，所述方法包括以下步驟：a.獲得肝細胞并在合適的培養(yǎng)物中孵育該肝細胞；以及b.用一種非精胺/亞精胺SSAT底物孵育該肝細胞；c.檢測從該培養(yǎng)物中獲得的樣本中的一種乙?；x產(chǎn)物；以及d.將該乙?；x產(chǎn)物的存在量與SSAT活性相關(guān)聯(lián)，其中該樣本中的乙?；x產(chǎn)物的存在量是哺乳動物體內(nèi)SSAT活性的表征。藥物可以是0-220μΜ濃度范圍內(nèi)的金剛乙胺。將該乙?；x產(chǎn)物的存在量與SSAT活性相關(guān)聯(lián)的步驟包括將該乙?；x產(chǎn)物的量關(guān)聯(lián)至一條標準曲線來確定在哺乳動物體內(nèi)的SSAT活性水平。在該方法的第四個實施例中，SSAT活性在哺乳動物的細胞內(nèi)測定。SSAT底物是金剛乙胺，SSAT底物的乙?；问绞且阴；?金剛乙胺。該方法包括以下步驟：a.將從細胞培養(yǎng)物中獲得的測試樣本與金剛乙胺接觸；b.測量產(chǎn)生的乙?；x產(chǎn)物的量；以及c.將產(chǎn)生的乙?；x產(chǎn)物的量與SSAT的活性水平相關(guān)聯(lián)。該細胞培養(yǎng)物可以是哺乳動物細胞培養(yǎng)物，測試樣本可以是肝細胞。將從細胞培養(yǎng)物中獲得的測試樣本與藥物接觸的步驟可以包括用底物孵育樣本大約24小時。在該方法的第五個實施例中，SSAT活性在哺乳動物中檢測。該方法包括以下步驟：a.向哺乳動物體內(nèi)引入金剛乙胺b.采集來自哺乳動物的生物體液樣本c.檢測該樣本中的一種乙?；x產(chǎn)物；以及d.將該乙?；x產(chǎn)物的存在量與SSAT活性相關(guān)聯(lián)，其中該樣本中的乙?；x產(chǎn)物的存在量是哺乳動物中SSAT活性的表征。該生物體液樣本可以是，但不限于，血液、唾液和尿液。在該方法的第六個實施例中，SSAT活性在哺乳動物中檢測。該方法包括以下步驟：a.向哺乳動物體內(nèi)引入金剛乙胺b.采集來自哺乳動物的生物體液樣本c.檢測該樣本中的一種乙?；x產(chǎn)物；以及d.將該乙?；x產(chǎn)物的存在量與SSAT活性相關(guān)聯(lián)，其中該樣本中的乙?；x產(chǎn)物的存在水平是哺乳動物體內(nèi)的癌細胞的表征。該生物體液樣本可以是，但不限于，血液、唾液和尿液。在該方法的各實施例中，樣本中非精胺/亞精胺底物的相對水平可以被關(guān)聯(lián)至一條代表已知活性水平的標準曲線，并且可以通過多種技術(shù)測定，包括但不限于氣相色譜、放射性標記、高壓液相色譜(HPLC)、薄層色譜；質(zhì)譜可以和具有特異性抗體或多種抗體的色譜以及親和色譜聯(lián)用。本文中公開的測定方法可用于將SSAT活性與哺乳動物體內(nèi)的病理狀況相關(guān)聯(lián)，病理狀況包括但不限于肺癌、胃癌、卵巢癌、急性髓細胞性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、腎癌、結(jié)直腸癌和/或前列腺癌。附圖說明通過以下給出的對具體實施方式的描述，僅以實施例的方式，并參照附圖，本發(fā)明將更容易理解，其中：圖1的表格顯示了可接種的凍存原代大鼠肝細胞中SSAT介導的金剛胺、金剛乙胺、妥卡尼和亞精胺的N-乙?；膮?shù)(Km和Vmax)；圖2的表格顯示了金剛胺被SSATN-乙酰化的酶動力學數(shù)據(jù)；圖3的表格顯示了金剛乙胺被SSATN-乙?；拿竸恿W數(shù)據(jù)；圖4的表格顯示了妥卡尼被SSATN-乙?；拿竸恿W數(shù)據(jù)；圖5的表格顯示了亞精胺被SSATN-乙酰化的酶動力學數(shù)據(jù)；圖6的表格顯示了預實驗中(二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-溴代四唑或MTT法測定的結(jié)果；圖7的表格顯示了驗證實驗中MTT法測定的結(jié)果；圖8顯示了金剛胺被SSATN-乙?；拇x產(chǎn)物的形成和Lineweaver-Burk曲線圖；圖9顯示了金剛乙胺被SSATN-乙?；拇x產(chǎn)物的形成和Lineweaver-Burk曲線圖；圖10顯示了妥卡尼被SSATN-乙酰化的代謝產(chǎn)物的形成和Lineweaver-Burk曲線圖；圖11顯示了亞精胺被SSATN-乙酰化的代謝產(chǎn)物的形成和Lineweaver-Burk曲線圖；圖12顯示了預實驗中一次MTT測定的結(jié)果；圖13顯示了驗證實驗中一次MTT測定的結(jié)果；圖14顯示了定量孵育樣本中N-乙酰金剛胺的代表性LC/MS/MS測定校準標準曲線；圖15顯示了定量孵育樣本中N-乙酰金剛乙胺的代表性LC/MS/MS測定校準標準曲線；圖16顯示了定量孵育樣本中N-乙酰妥卡尼的代表性LC/MS/MS測定校準標準曲線；圖17顯示了定量孵育樣本中N-乙酰亞精胺的代表性LC/MS/MS測定校準標準曲線；圖18顯示了孵育樣本中N-乙酰金剛胺的代表性LC/MS/MS色譜圖；圖19顯示了孵育樣本中N-乙酰金剛乙胺的代表性LC/MS/MS色譜圖；圖20顯示了孵育樣本中N-乙酰妥卡尼的代表性LC/MS/MS色譜圖；圖21顯示了孵育樣本中N-乙酰亞精胺的代表性LC/MS/MS色譜圖；圖22是一個流程圖，它顯示了一種利用本文所公開的測定SSAT的方法的診斷方法。具體實施方式本文描述了一種用于在體外和體內(nèi)模型中測定亞精胺/精胺N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(SSAT)活性的方法。SSAT是聚胺代謝中的重要酶。SSAT被高度調(diào)節(jié)，已被提出其在調(diào)節(jié)腫瘤生長、肥胖、應激反應和氧平衡中起作用。SSAT利用N1–乙酰精胺作為底物形成N1，N12-二乙酰精胺。在體內(nèi)，SSAT是一種胞質(zhì)酶，而N1–乙酰精胺相對于精胺是首選的底物，雖然精胺的Km值實際上比N1–乙酰精胺的低。除了SSAT，芳基胺N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(NATs)也是藥物和含有芳香胺和肼基團的外源性化學物質(zhì)的N-乙?；兄匾陌|(zhì)酶。在人類中，已經(jīng)鑒定了兩種功能性NAT的同工酶(NAT1和NAT2)以及該兩種NAT同工酶超過25個的等位基因?；趤碜赃^表達SSAT的CD2F1轉(zhuǎn)基因小鼠的肝勻漿評估SSAT的活性的體外和體內(nèi)測定法已經(jīng)公開。同樣地，基于人類肝細胞溶質(zhì)和人重組NAT1和NAT2同工酶的NAT1和NAT2活性的體外測定法也已經(jīng)被闡述。在體外SSAT和NAT測定中，需要乙酰輔酶A(輔助因子)提供激活的乙?；鶊F乙酰化活性。大鼠和人原代肝細胞體外測定法也在SSAT和NAT活性的研究中被闡述。由于完整的原代肝細胞具有所有必需的天然藥物的代謝輔助因子，一種完整的原代肝細胞測定法的利用與另一種基于微粒體或亞細胞胞漿酶組分的體外模型相比，往往能提供更高水平的體外對應體內(nèi)藥物代謝相關(guān)性。凍存的原代大鼠肝細胞本研究使用以下可接種的原代凍存大鼠肝細胞：名稱：凍存雌性斯普拉-道來氏大鼠肝細胞BRIVAL參考號：STM-1351(TSY)供應商：Celsis批號：ASM名稱：凍存雌性斯普拉-道來氏大鼠肝細胞BRIVAL參考號：STM-1352(TSY)和STM-1407(TSY)供應商：Celsis批號：SKN兩個批次都被用了在預實驗中。驗證實驗只用到了批號SKN。實驗方法先進行預實驗用來篩選底物濃度的合適測試范圍，并確定可能導致顯著的細胞毒性(相對存活率<50％)的濃度。在這些初步的結(jié)果的基礎上，用調(diào)整后的底物濃度進行驗證實驗。有顯著細胞毒性的底物濃度產(chǎn)生的數(shù)據(jù)不參與酶動力學分析。請參考下表中的測試濃度。從孵育反應物中采集代謝產(chǎn)物用LC/MS/MS進行分析。1預實驗中沒有測試總體來說，預實驗方法和驗證實驗方法是一致的。底物溶液的制備精確稱量底物，用合適的溶劑(妥卡尼用10％的二甲亞砜蒸餾水溶液(預實驗)或100％的二甲亞砜(驗證實驗)；金剛胺、金剛乙胺和亞精胺用去離子水)溶解并進一步稀釋到上表中所列測試濃度的100倍的一系列溶液。大鼠肝細胞的制備預實驗中用到了兩個批次的雌性大鼠肝細胞(批號ASM和SKN；對應BRIVAL編號分別為：STM-1351(TSY)和STM-1352(TSY))。驗證實驗中只用到了貨號SKN(對應BRIVAL編號：STM-1407(TSY))。預實驗和驗證實驗均采用了下文所述的制備過程。即將使用前，將凍存的原代大鼠肝細胞在37℃水浴中解凍，并在預熱的InVitroGROTMCP大鼠培養(yǎng)基中重懸。肝細胞的存活率用臺盼藍排斥法確認為在70％以上。添加InVitroGROTMCP大鼠培養(yǎng)基調(diào)節(jié)肝細胞的濃度，使之達到0.70×106個細胞/mL的目標接種濃度。肝細胞的等分試樣接種于(0.5毫升/孔)24孔CellAffix培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板放置于95％空氣和5％二氧化碳的高濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中37℃恒溫孵育4小時，以使肝細胞在用所選的底物溶液劑量處理前貼壁。處理和孵育細胞貼壁以后，將培養(yǎng)基從各孔中吸出，并替換以預熱的InVitroGROTMHI大鼠培養(yǎng)基(在驗證實驗中添加Torpedo抗生素混合物)和適當濃度的底物溶液。經(jīng)處理的細胞再放回孵育24小時。孵育結(jié)束后，各孔中的培養(yǎng)基都被收集到含有冰冷甲醇的1.7毫升的小瓶中并在標稱-80℃(-72℃至-88℃)貯存直至進行LC/MS/MS分析。對留在孔中的肝細胞進行MTT測定來評估測試濃度的底物潛在的細胞毒性。MTT細胞毒性測定收集反應培養(yǎng)基后，立即向每孔剩余的肝細胞中加入等量的0.5毫克/毫升的MTT的KHB溶液，然后孵育約30分鐘。孵育后，用二甲亞砜(DMSO)替代培養(yǎng)基以溶解甲瓚。用酶標儀測定96孔平底板每個孔的等分試樣在540nm處的吸光度，并用DMSO作為校正的背景吸光度。穩(wěn)定性對照測試了穩(wěn)定性對照以監(jiān)測在所采用的實驗條件下任何底物的非酶N-乙?；?。平行于肝細胞的樣本，一組在InVitroGROTMHI大鼠培養(yǎng)基中僅包括測試濃度的底物溶液而沒有肝細胞的穩(wěn)定性對照，在和肝細胞樣本相同的條件下孵育24小時。孵育結(jié)束后，收集穩(wěn)定性對照樣本用于LC/MS/MS分析，分析方法與肝細胞樣本相同。LC/MS/MS分析采用四種LC/MS/MS測定法來分別定量孵育樣本中的四種代謝產(chǎn)物。用于每種代謝產(chǎn)物的測定參考標準品請參見下表。參考標準儲備液用于制備校準標準品和質(zhì)量控制樣品。*一些代謝產(chǎn)物的參考標準品不市售；因此，它們相應的底物被作為參考標準品來校準孵育樣本中代謝產(chǎn)物的測定。加入氘代N-乙?；?d3金剛胺作為所有測定的內(nèi)標?？偟膩碚f，不同的代謝產(chǎn)物的測定采用相同的下述制備步驟：校準標準品和質(zhì)量控制樣品：稀釋參考標準儲備液并和等分試樣的甲醇測定基質(zhì)一起加入空白孵育反應緩沖液(1：1v/v)和內(nèi)標中，得到一系列進行LC/MS/MS分析的校準標準品和質(zhì)量控制樣品。孵育樣品：在進行LC/MS/MS分析以前，向每個解凍的孵育樣本的上清液中加入等分試樣的測定基質(zhì)和等分試樣的內(nèi)標。例外：用于N-乙酰妥卡尼和N-乙酰亞精胺測定的解凍的孵育樣本在按上述方法進一步制備前用甲酸(甲酸終濃度在0.5％v/v)酸化。此外，在制備校準標準品、質(zhì)量控制樣品和孵育樣本時，還要使用酸化的測定基質(zhì)。這是為了最小化代謝產(chǎn)物結(jié)合到制備容器上的可能性。用于N-乙酰亞精胺定量的校準標準品、質(zhì)量控制樣品和孵育樣本在加內(nèi)標和進行LC/MS/MS分析前用含0.1％甲酸的去離子水稀釋10倍。分析儀器參數(shù)N-乙酰金剛胺、N-乙酰金剛乙胺和N-乙酰妥卡尼儀器：WatersAcquityTMUPLC系統(tǒng)和MicromassTMUltima采集軟件：MassLynxTM4.1版流動相A：含0.1％甲酸的去離子水流動相B：含0.1％甲酸的甲醇柱：SYNERGITM4μHydro-RP(BRIVAL編號：LC-270)進樣量：10μL質(zhì)譜模式：ESI正離子MRM模式N-乙酰亞精胺儀器：WatersAcquityTMUPLC系統(tǒng)和MicromassTMUltima采集軟件：MassLynxTM4.1版流動相A：含5mM甲酸銨和0.1％甲酸的去離子水流動相B：含5mM甲酸銨和0.1％甲酸的乙腈：去離子水(9:1v/v)柱：KinexTM2.6μHILIC(BRIVAL編號：LC-309)進樣量：1μL質(zhì)譜模式：ESI正離子MRM模式數(shù)據(jù)分析軟件MassLynxTM4.1版和微軟Excel2007用于數(shù)據(jù)分析。分析數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)打印在硬拷貝上并根據(jù)BRIVAL標準操作規(guī)程處理。電子數(shù)據(jù)備份根據(jù)BRIVAL標準操作規(guī)程，用BRIPHARMWindowsServer2008進行處理。數(shù)據(jù)歸檔所有的實驗原始數(shù)據(jù)、相關(guān)文件和研究報告將按BRIVAL標準操作規(guī)程的規(guī)定在BRIVAL的檔案庫(加拿大不列顛哥倫比亞省溫哥華市Heather街103-8898)存檔至少五年。結(jié)果與討論在可接種的凍存原代大鼠肝細胞上SSAT介導的金剛胺、金剛乙胺、妥卡尼和亞精胺的N-乙?；南鄬γ竸恿W參數(shù)(Km和Vmax)的匯總?cè)鐖D1所示?；跍y試濃度范圍的底物經(jīng)24小時孵育反應過程轉(zhuǎn)變?yōu)镹-乙?；x產(chǎn)物的酶轉(zhuǎn)化率評估酶動力學。從不同的測試底物濃度孵育后形成的代謝產(chǎn)物用LC/MS/MS測定，結(jié)果數(shù)據(jù)構(gòu)建入反應速率對應底物濃度的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖，以估計SSAT介導的各測試底物的N-乙?；腒m和Vmax值。從驗證實驗中估計的亞精胺乙?；腒m值為287μΜ，可堪比來源于的轉(zhuǎn)基因小鼠的胞質(zhì)肝組分中的SSAT的文獻參考值267±46μΜ。Vmax無法與文獻值相比較，因為這些值用不同的單元表示。從全部的穩(wěn)定性對照來看，只觀察到極少量的N-乙?；x產(chǎn)物，這表明非酶N-乙?；ǔ２话l(fā)生于該實驗條件下。驗證實驗中每一種底物的結(jié)果都匯總在圖2至圖5中。圖1至圖4顯示了代謝產(chǎn)物的形成對應底物濃度的曲線圖以及相應的Lineweaver-Burk曲線圖。觀察到亞精胺乙?；淖畹蚄m值和最高Vmax值分別為287μΜ和7.21pmol/min/百萬個細胞。因此，在所有測試的底物中，它具有最高的相對最大反應速率。測試的其它底物的Km值，按升序排列分別為金剛胺1659μΜ；金剛乙胺1835μΜ；以及與妥卡尼5033μΜ。測試底物的Vmax值，按降序排列(對應于相對最大反應速率的降序排列)為妥卡尼0.617pmol/min/百萬個細胞；金剛乙胺0.364pmol/min/百萬個細胞和金剛胺0.00197pmol/min/百萬個細胞。底物對大鼠肝細胞的潛在細胞毒性用MTT細胞毒性測定法進行評估。該測定在預實驗和驗證實驗中都進行。預實驗的結(jié)果匯總于圖6和圖12中。顯著細胞毒性(相對存活率<50％)在較高濃度的金剛胺和金剛乙胺處理后被觀察到。觀察到的導致廣泛細胞毒性的底物濃度，金剛胺約為1170μΜ和金剛乙約為胺280μΜ。沒有觀察到妥卡尼的細胞毒性?；谶@些結(jié)果，對后續(xù)驗證實驗的測試濃度做了相應調(diào)整。驗證實驗的MTT測定結(jié)果顯示于圖7和圖13。觀察到的導致廣泛的細胞毒性的底物濃度，金剛胺約為1140μΜ和金剛乙胺約為220μΜ，驗證了預實驗的初步結(jié)果。在測試的范圍內(nèi)沒有觀察到妥卡尼和亞精胺的細胞毒性。會導致顯著細胞毒性的底物濃度產(chǎn)生的數(shù)據(jù)被排除在酶動力學分析以外。所有的校準標準品和質(zhì)量控制樣品的結(jié)果滿足了按BRIVALSOP-GP-011(7.0版)和SOP-QA-025(l.0版)的一般批量接受標準，該標準根據(jù)FDA生物分析方法驗證指導原則的建立。例如參見“行業(yè)指南：生物分析方法驗證”，美國健康和人類服務部、食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)、藥品審評及研究中心(CDER)和獸藥中心(CVM)，2001年5月，其全部公開內(nèi)容通過引用合并于此。所有測定都用內(nèi)標法進行定量，除了N-乙酰妥卡，其定量沒有使用內(nèi)標物。代表性的校正曲線和LC/MS/MS色譜圖顯示于圖7至圖14中。對亞精胺/精胺N1-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(SSAT)介導的金剛胺、金剛乙胺、妥卡尼和亞精胺N-乙?；拿竸恿W參數(shù)(Km和Vmax)進行了表征。在受測的底物中，觀察到亞精胺的乙酰化具有最低的Km值和最高的Vmax值，分別在287μΜ和7.21pmol/min/百萬個細胞。因此，它具有最高的相對最大反應速率。其它受測底物的Km值，按升序排列為金剛胺1659μΜ；金剛乙胺1835μΜ；和妥卡尼5033μΜ。其他受測底物的Vmax值，按降序排列(對應于相對最大反應速率的降序排列)為妥卡尼0.617pmol/min/百萬個細胞；金剛乙胺0.364pmol/min/百萬個細胞和金剛胺0.00197pmol/min/百萬個細胞?？偨Y(jié)如下，如圖22所示，通過測定來自于哺乳動物的樣本中的一種非精胺/亞精胺SSAT底物的乙酰化形式的水平來確定哺乳動物中精胺/亞精胺N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(SSAT)的活性可以被用于將SSAT活性與哺乳動物體中的病理狀況相關(guān)聯(lián)。本領域技術(shù)人員應當理解，上述提供的諸多細節(jié)僅作為示例，而不旨在限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將由權(quán)利要求來確定。