專利名稱：一種包封多酚類活性物質(zhì)的納米粒子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種包封多酚類活性物質(zhì)的蛋白-多糖納米粒子及其制備方法，屬于高分子化學(xué)和功能食品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多酚類化合物是一類在自然界廣泛分布的物質(zhì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種不同類型的多酚化合物具有廣泛的生物活性和藥理活性。大量研究表明，多酚類化合物具有清除自由基、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫、防治血管硬化、降血糖等功能。盡管多酚類化合物具有多種優(yōu)異的生物功能，但是容易被體內(nèi)消化系統(tǒng)分解破壞而失去活性，例如在強(qiáng)酸強(qiáng)堿及較高溫度下容易被氧化，因此有必要發(fā)展一種多酚載體，對多酚類物質(zhì)進(jìn)行包封，以保持其生物活性。
目前已有文獻(xiàn)報(bào)道以合成高分子PLGA-PEG納米膠束作為載體，將EGCG包埋其中，與自由EGCG相比，納米EGCG在稀釋10倍后仍能保持活性，可有效殺死前列腺癌細(xì)胞{Journal of Medicinal Chemistry2011, 54(5):1321-1332. };將多酚類物質(zhì)EGCG包裹在乳球蛋白納米粒子中，可降低EGCG的氧化降解速度{FoodHydrocolloids2012, 29(1) :57-67. };包裹兒茶素的殼聚糖納米粒子可增強(qiáng)腸道對兒茶素的吸收{(diào)Food Chemistr2010, 122(3) :662-667. }。這些研究表明，包裹多酚類物質(zhì)的納米粒子不僅增強(qiáng)了多酚的穩(wěn)定性與抗氧化能力，而且提高了多酚在體內(nèi)的生物利用度和生物相容性。但這些文獻(xiàn)報(bào)道的技術(shù)方法仍然存在一些局限性。第一，納米粒子的分散性和穩(wěn)定性不好，難以調(diào)控納米粒子的粒徑分布；第二，納米粒子的負(fù)載量、包封率較低；第三，納米粒子的制備提純過程復(fù)雜，合成過程涉及有機(jī)溶劑和有毒化學(xué)試劑的使用。蛋白(如明膠、谷蛋白、麥醇溶蛋白等)具有良好的生物相容性、可生物降解性以及優(yōu)良的粘性、膠凝性、成膜性等，被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥工業(yè)中。多糖作為自然界中含量最豐富的生物聚合物，幾乎存在于所有的生物中，是生物體維持正常生命活動的必需物質(zhì)，并具有如免疫調(diào)節(jié)功能、抗感染、抗腫瘤、抗凝血、降血糖和抗病毒等多種多樣的生物學(xué)功能。多糖作為生物醫(yī)用材料在固定化酶、絮凝劑、人工透析膜、吸收縫合線、傷口涂敷料以及人造皮膚等諸多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。Maillard反應(yīng)是食品加工和儲藏過程中氨基化合物(氨基酸、多肽和蛋白質(zhì))和羰基化合物(還原糖類)之間自然發(fā)生的反應(yīng)。關(guān)于蛋白質(zhì)和多糖之間的Maillard反應(yīng)現(xiàn)已有很成熟的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，Maillard反應(yīng)一般在干熱條件下進(jìn)行，不添加其他化學(xué)試劑，條件溫和，對人體安全無毒。利用Maillard反應(yīng)將葡聚糖、普魯蘭多糖或半乳甘露聚糖對蛋白進(jìn)行親水改性，并對蛋白進(jìn)行加熱交聯(lián)，可以制備出所需的蛋白-多糖藥物載體{公告號100503705C和公開號CN102010513A}。該載體具有優(yōu)異的親水性能、良好的生物可降解性與生物相容性，并且可以延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。但在已公開的蛋白-多糖藥物載體專利文獻(xiàn)中，由于蛋白和多糖本身具有很好的親水性，需要采用蛋白加熱交聯(lián)技術(shù)對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行變性，才可能組裝發(fā)生并得到單分散的納米粒子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種可有效提高多酚的生物利用度和保持多酚的活性，克服現(xiàn)有多酚載體技術(shù)方法中的包封率低、穩(wěn)定性差，具有良好緩慢釋放和保護(hù)氧化降解作用的包封多酚類化合物的多酚類化合物-蛋白-多糖納米粒子。本發(fā)明的目的之二是提供一種制備上述具有核殼結(jié)構(gòu)的多酚-蛋白-多糖納米粒子的簡單、高效、安全、環(huán)保的制備方法。本發(fā)明的一種包封多酚類化合物的納米粒子，是以多酚類化合物與蛋白為核，多糖為殼的多酚類化合物-蛋白-多糖納米粒子；所述多糖為葡聚糖、普魯蘭多糖或半乳甘露聚糖，或者是不帶電荷的具有還原性羥基的多糖或該多糖的衍生物。所述的多酚類活性物質(zhì)包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯、茶多酚、單寧、姜黃素或白藜蘆醇；所述的蛋白包為酸法明膠、堿法明膠、谷蛋白或麥醇溶蛋白。本發(fā)明的制備方法是以多酚類化合物、蛋白、多糖為原料，包括以下制備步驟為
(I)經(jīng)Maillard反應(yīng)制備蛋白-多糖共價(jià)結(jié)合物；(2)在室溫下，水溶液中直接混合多酚類化合物與蛋白-多糖共價(jià)結(jié)合物并調(diào)節(jié)溶液PH值為3-8使得多酚類化合物與蛋白-多糖共價(jià)結(jié)合物通過非共價(jià)作用力進(jìn)行自組裝形成以多酚類化合物-蛋白-多糖納米粒子。本發(fā)明的制備方法簡單，不需要使用有毒的化學(xué)試劑，不需要高溫高壓，不需要對蛋白進(jìn)行加熱交聯(lián)，所采用的技術(shù)都在水相中進(jìn)行，符合綠色環(huán)保要求?！?br> 一般情況下，利用蛋白納米粒子包裹多酚類物質(zhì)難以得到單分散的納米顆粒，主要原因是蛋白和多酚存在較強(qiáng)的非共價(jià)相互作用力，蛋白/多酚體系自發(fā)產(chǎn)生凝聚反應(yīng)，不穩(wěn)定的凝聚進(jìn)一步導(dǎo)致宏觀沉淀的發(fā)生。而在已公開的蛋白-多糖藥物載體專利文獻(xiàn)中，由于蛋白和多糖本身具有很好的親水性，如果不采用蛋白加熱交聯(lián)技術(shù)對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行變性，一般難以使組裝發(fā)生并得到單分散的納米粒子。在本發(fā)明中，發(fā)明人通過研究意外的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明在制備過程完全不需加熱或是加入交聯(lián)劑等額外的控制條件，就制得具有良好單分散效果的多酚-蛋白-多糖納米粒子。發(fā)明人通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這是由于在本發(fā)明中，一方面利用Mai Ilard反應(yīng)使蛋白分子共價(jià)連接親水性的多糖分子，共價(jià)的親水多糖鏈段可以為蛋白/多酚的凝聚反應(yīng)提供額外的立體穩(wěn)定作用，阻止沉淀的發(fā)生；另一方面，充分利用多酚這類物質(zhì)既是需要被保護(hù)的活性物質(zhì)，同時(shí)又可充當(dāng)橋接蛋白分子的“交聯(lián)劑”。通過以上三種成分的相互作用從而最終實(shí)現(xiàn)載體對多酚類物質(zhì)的有效包封，將有利于提高多酚在體內(nèi)的生物利用度，同時(shí)為保護(hù)多酚的活性提供了新的有效途徑。目前，這方面的研究還沒有文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明制備納米粒子方法簡單，即包括以下兩步1、蛋白和多糖在干熱條件下發(fā)生Maillard反應(yīng)生成蛋白-多糖共價(jià)結(jié)合物；2、直接混合多酚與蛋白-多糖共價(jià)結(jié)合物，調(diào)節(jié)溶液的PH值，即可獲得具有多酚與蛋白核-多糖殼結(jié)構(gòu)的納米粒子。其制備原理滿足以下兩點(diǎn)第一，蛋白與多糖形成共價(jià)結(jié)合物；第二，多酚與蛋白-多糖共價(jià)結(jié)合物通過非共價(jià)作用力進(jìn)行自組裝。本發(fā)明使用天然來源的蛋白、多糖為原料，不使用任何有機(jī)溶劑，通過兩個(gè)步驟即可制備得到穩(wěn)定和單分散的納米粒子。本發(fā)明的第一步，通過Maillard反應(yīng)將多糖共價(jià)偶聯(lián)到蛋白上，形成蛋白-多糖共價(jià)結(jié)合物。蛋白和多糖的Maillard反應(yīng)條件,現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)技術(shù)即能實(shí)現(xiàn)，本文不另加討論。較優(yōu)化的Maillard反應(yīng)條件溫度為30_120°C，時(shí)間為30s-300h, pH為3-12，反應(yīng)可以在固相進(jìn)行，也可以在液相進(jìn)行。上述反應(yīng)條件溫和易控，反應(yīng)產(chǎn)物一般不表現(xiàn)明顯的褐色反應(yīng)，水溶性較好。一般而言，當(dāng)反應(yīng)在較高溫度進(jìn)行時(shí)，所需時(shí)間大大縮短；當(dāng)反應(yīng)在較高PH進(jìn)行時(shí)，所需時(shí)間也將大大縮短。另外，通過控制多糖、蛋白的投料比以及多糖鏈長，可以調(diào)節(jié)蛋白-多糖共價(jià)結(jié)合物中多糖的含量。蛋白與多糖的投料質(zhì)量比值在1:50到50:1之間，多糖分子量在IK到1000K之間所制備的蛋白-多糖共價(jià)結(jié)合物可以形成納米粒子。本發(fā)明的Maillard反應(yīng)產(chǎn)物不需要進(jìn)一步分離,可以直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。本發(fā)明的第二步，將第一步制備得到的Maillard反應(yīng)產(chǎn)物加水溶解后，然后加入多酚溶液，調(diào)節(jié)混合溶液的PH值到，多酚和蛋白存在非共價(jià)作用力而傾向于發(fā)生自組裝自動生成納米粒子。本發(fā)明中，蛋白為明膠、谷蛋白、麥醇溶蛋白，或其他具有良好生物特性的蛋白。多 糖為含有還原性端羥基的多糖，可以是直鏈型多糖和支鏈型多糖，例如葡聚糖、普魯蘭多糖和半乳甘露聚糖。多酚為茶多酚、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、單寧、白藜蘆醇或姜黃素，也可以是其它多酚類化合物或衍生物。蛋白分子鏈中含多種疏水和帶電荷氨基酸殘基，可以與多酚分子上的大量酚羥基發(fā)生氫鍵、疏水相互作用等非共價(jià)作用力。通過控制溶液PH值、多酚濃度、蛋白濃度可以調(diào)節(jié)納米粒子的尺寸在50-1000nm之間變化，將多酚負(fù)載到蛋白-多糖納米粒子中，達(dá)到高負(fù)載量和高包封率的目的，為降低多酚易降解性和不穩(wěn)定性提供一種新的有效保護(hù)途徑。將所得的多酚類化合物-蛋白-多糖納米粒子通過加入交聯(lián)劑戊二醛或京尼平將納米粒子進(jìn)行進(jìn)一步交聯(lián)。圖I為所發(fā)明茶多酚-堿法明膠-葡聚糖納米粒子的透射電子顯微鏡(TEM)圖，該圖顯示了該納米粒子呈現(xiàn)球形，粒徑均勻。該圖還說明納米粒子具有以多酚與蛋白為核、多糖為殼的結(jié)構(gòu)，即多酚與蛋白分子主要位于納米粒子的內(nèi)部，而親水性的多糖位于納米粒子的外部，起著穩(wěn)定界面的作用。圖2顯示了利用本發(fā)明獲得的茶多酚-堿法明膠-葡聚糖納米粒子的粒徑分布，具有很好的單分散性，用動態(tài)光散射測定流體力學(xué)直徑大約在40-300nm之間。圖2還顯示了戊二醛和京尼平交聯(lián)后的納米粒子的粒徑分布情況。交聯(lián)的納米粒子稀釋時(shí)，粒徑分布改變很小，從而可以顯著降低納米粒子的臨界膠束濃度值，達(dá)到生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的濃度要求。圖3為EGCG-酸法明膠-葡聚糖納米粒子中EGCG在不同pH條件下的體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在兩種PH5. O和pH7. 4介質(zhì)中，包封后的EGCG釋放速率都要比自由EGCG釋放速率緩慢，說明包封EGCG的酸法明膠-葡聚糖載體對EGCG具有良好的緩釋性能，將有效提高多酚類活性藥物在體內(nèi)的生物利用度。圖4為酸法明膠-葡聚糖納米粒子對EGCG的抗降解保護(hù)作用結(jié)果。根據(jù)文獻(xiàn){Food Hydrocolloids 24(2010) :735-743. }中的研究報(bào)道，EGCG 的降解產(chǎn)物在 425nm 處有吸收，因此可以通過測試425nm處吸光度的變化值來確定EGCG的降解程度。本發(fā)明跟蹤測試了不同PH值下的自由EGCG和經(jīng)過酸法明膠-葡聚糖載體包封后的EGCG在425nm處吸光度隨時(shí)間的變化值，結(jié)果顯示了酸法明膠-葡聚糖載體對EGCG具有良好的保護(hù)作用。圖5中對比了自由EGCG、酸法明膠-葡聚糖共價(jià)結(jié)合物載體以及經(jīng)載體包封后的EGCG對人類乳腺癌MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示了酸法明膠_葡聚糖共價(jià)結(jié)合物載體對細(xì)胞的毒性影響相對較小，而自由EGCG和經(jīng)載體包封后的EGCG在殺死腫瘤細(xì)胞過程中均顯示出了時(shí)間的依賴性，隨著作用時(shí)間的延長，EGCG逐漸發(fā)揮作用?？傊?，本發(fā)明方法簡單易行，避·免使用對人體和環(huán)境有害的化學(xué)試劑，綠色環(huán)保，安全無毒，產(chǎn)物無需分離。同時(shí)，本發(fā)明內(nèi)容可以提高和保護(hù)多酚類活性物質(zhì)的緩釋和抗降解性能，為多酚在食品、生物醫(yī)藥以及化妝品等領(lǐng)域的活性和作用范圍顯示了重要的應(yīng)用價(jià)值和良好的應(yīng)用前景。


圖I.包封多酚類活性物質(zhì)的茶多酚-堿法明膠-葡聚糖納米粒子的透射電鏡 Μ圖；圖2.包封多酚類活性物質(zhì)的茶多酚-堿法明膠-葡聚糖納米粒子，以及經(jīng)戊二醛和京尼平交聯(lián)后的納米粒子的粒徑分布圖；圖3. EGCG-酸法明膠-葡聚糖納米粒子的緩釋性能；圖4.酸法明膠-葡聚糖納米粒子對EGCG的抗降解保護(hù)作用；圖5. EGCG-酸法明膠-葡聚糖納米粒子對人類乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞毒性。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例旨在說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的進(jìn)一步限定。實(shí)施例I.茶多酚-堿法明膠-葡聚糖納米粒子分別將堿法明膠與不同分子量的葡聚糖進(jìn)行Maillard反應(yīng)合成堿法明膠-葡聚糖共價(jià)結(jié)合物，方法如下將堿法明膠溶于去離子水中，配成20mg/mL的蛋白質(zhì)溶液后分別加入分子量為10K、40K、70K和500Κ的葡聚糖到上述溶液中配制成不同分子量的葡聚糖和堿法明膠的混合溶液。攪拌混合后調(diào)節(jié)溶液的PH值為7-9，并將溶液冷凍干燥。將冷凍干燥后的固體置于裝有KBr飽和溶液的密閉容器中，保持相對濕度為79%,置于60°C下進(jìn)行Maillard反應(yīng)12_36h得到反應(yīng)產(chǎn)物堿法明膠-葡聚糖共價(jià)結(jié)合物。將Maillard反應(yīng)產(chǎn)物用去離子水溶解后，混合茶多酚溶液與堿法明膠-葡聚糖共價(jià)結(jié)合物溶液，使茶多酚與共價(jià)結(jié)合物的最終濃度均為1.0mg/mL，并調(diào)節(jié)溶液pH分別為3_8，得到不同組裝條件下的茶多酚-堿法明膠-葡聚糖納米粒子溶液。表I.不同分子量的葡聚糖與堿法明膠形成的共價(jià)結(jié)合物與茶多酚自組裝制備得到的納米粒子的光散射分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種包封多酚類化合物的納米粒子，其特征為以多酚類化合物與蛋白為核，多糖為殼的多酚類化合物-蛋白-多糖納米粒子；所述多糖為葡聚糖、普魯蘭多糖或半乳甘露聚糖，或者是不帶電荷的具有還原性羥基的多糖或該多糖的衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的納米粒子，其特征在于，所述的多酚類活性物質(zhì)包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯、茶多酚、單寧、姜黃素或白藜蘆醇；所述的蛋白包為酸法明膠、堿法明膠、谷蛋白或麥醇溶蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的納米粒子，其特征在于，蛋白與多糖的投料質(zhì)量比值在1:50到50:1之間，多糖分子量在IK到1000K之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的納米粒子，其特征在于，將所述的納米粒子通過加入交聯(lián)劑進(jìn)行進(jìn)一步交聯(lián)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的納米粒子，其特征在于，所述的交聯(lián)劑為戊二醛或京尼平。
6.一種包封多酚類化合物的納米粒子的制備方法，其特征在于以多酚類化合物、蛋白、多糖為原料，包括以下制備步驟為(I)經(jīng)Maillard反應(yīng)制備蛋白-多糖共價(jià)結(jié)合物；(2)在室溫下，水溶液中直接混合多酚類化合物與蛋白-多糖共價(jià)結(jié)合物并調(diào)節(jié)溶液pH值為3-8使得多酚類化合物與蛋白-多糖共價(jià)結(jié)合物通過非共價(jià)作用力進(jìn)行自組裝形成以多酚類化合物-蛋白-多糖納米粒子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的多酚類活性物質(zhì)包括EGCG、茶多酚、單寧、姜黃素或白藜蘆醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，，其特征在于，將所得的多酚類化合物-蛋白-多糖納米粒子通過加入交聯(lián)劑戊二醛或京尼平將納米粒子進(jìn)行進(jìn)一步交聯(lián)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的Maillard反應(yīng)條件是 (1)反應(yīng)溫度是30-120。。； (2)反應(yīng)時(shí)間是30s-300h； (3)反應(yīng)pH值為3-12； (4)反應(yīng)在固相或者液相中進(jìn)行。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征是多糖的分子量在If1000K之間；蛋白與多糖的質(zhì)量比值在1:50-50:1之間。
全文摘要
一種包封多酚類活性物質(zhì)的納米粒子及其制備方法，本發(fā)明屬于高分子化學(xué)，功能食品技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用蛋白與多糖的Maillard反應(yīng)、多酚與蛋白-多糖共價(jià)結(jié)合物的自組裝即可獲得包封多酚類活性物質(zhì)的蛋白-多糖納米粒子。該納米粒子對多酚類活性物質(zhì)具有高包封率、高負(fù)載量、良好保護(hù)活性等優(yōu)異性能。通過戊二醛、京尼平等交聯(lián)劑對這種納米粒子進(jìn)行交聯(lián)，可以進(jìn)一步提高納米粒子的穩(wěn)定性和緩釋性能。制備過程在全水相環(huán)境中進(jìn)行，不使用有機(jī)試劑、表面活性劑以及其他有毒試劑，載體的原材料屬于天然高分子，具有優(yōu)異的生物相容性、生物可降解性，符合綠色化學(xué)的要求。
文檔編號C08J3/24GK102924929SQ201210375599
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月3日
發(fā)明者李娟 , 劉又年, 張麗麗, 孫曉毅, 周輝輝, 林慶斌 申請人:中南大學(xué)