專利名稱：一種生物大分子水凝膠及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種由酶催化和離子交聯(lián)的高強(qiáng)度生物大分子水凝膠及其制備方法，涉及ー種互穿網(wǎng)絡(luò)生物大分子水凝膠 及其制備方法，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物大分子水凝膠是ー類主要由蛋白質(zhì)和多糖分子等天然物質(zhì)構(gòu)成的能在水中溶脹并保持大量水分的三維交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。由于生物大分子水凝膠擁有豐富的水環(huán)境、良好的生物相容性、與生物組織結(jié)構(gòu)相類似的粘弾性，井能為營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)的擴(kuò)散提供良好的傳輸通道，其優(yōu)異的吸水、保水及仿生特性使得生物大分子水凝膠被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)用材料和組織工程，可作為組織填充材料、藥物控釋載體、人造皮膚、人工軟骨、組織工程支架材料等。然而，水凝膠特別是生物大分子水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度通常較低，使其在人造皮膚、人造軟骨和組織工程支架材料等方面的實(shí)際應(yīng)用受到嚴(yán)重制約?；ゴ┚W(wǎng)絡(luò)水凝膠是由兩種或兩種以上聚合物通過物理或化學(xué)方式交聯(lián)纏結(jié)而形成的ー類獨(dú)特的網(wǎng)絡(luò)互穿聚合物。通過網(wǎng)絡(luò)互穿的形式能使兩種具有不同功能的聚合物形成穩(wěn)定的結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)組分之間性能的互補(bǔ)；其界面互穿、雙向連續(xù)等結(jié)構(gòu)特征，又使得他們在性能或功能上產(chǎn)生特殊的協(xié)同作用。同嵌段共聚物相比，這些體系的相形態(tài)相對環(huán)境的變化比較穩(wěn)定，因為它是通過交聯(lián)作用而固定的。因此制備互穿網(wǎng)絡(luò)是提高水凝膠強(qiáng)度的最有效方法之一。廣泛用于合成生物大分子水凝膠的蛋白質(zhì)和多糖物質(zhì)包括膠原、明膠、纖維蛋白，和殼聚糖、透明質(zhì)酸、海藻酸鈉、肝素、硫酸軟骨素等。常用的交聯(lián)方式有物理交聯(lián)，如疏水相互作用、氫鍵作用等；化學(xué)交聯(lián)常使用交聯(lián)劑聚合，如戊ニ醛、環(huán)氧氯丙烷、ニ異氰酸酷、碳化ニ亞胺等；或結(jié)合熱引發(fā)、輻射引發(fā)手段使用化學(xué)引發(fā)劑，如偶氮ニ異丁腈等。然而，化學(xué)交聯(lián)劑或引發(fā)劑在體系中的殘留往往造成材料存在細(xì)胞毒性、生物相容性低的缺點(diǎn)，限制了其應(yīng)用。明膠是用酸或堿處理膠原蛋白得到的變性產(chǎn)物，是多種氨基酸的縮聚物。明膠作為組織工程材料有很多優(yōu)點(diǎn)，如明膠是ー種非抗原天然大分子，生物相容性好，在體內(nèi)可以完全吸收等。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是ー類酰基轉(zhuǎn)移酶，它催化蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)形成共價鍵，使蛋白質(zhì)、多肽分子內(nèi)或分子之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。催化反應(yīng)的?；w一般為蛋白質(zhì)或多肽鏈上谷氨酰胺殘基的Y-酰胺基，受體可以為蛋白質(zhì)賴氨酸殘基的ε-氨基，α-氨基，游離氨基酸的α-氨基、ε -氨基、伯氨或Η20。國內(nèi)外許多研究人員都利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)改性明膠，提高明膠蛋白的強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性，用于食品加工業(yè)(JP04249954，JP08177514)、止血創(chuàng)傷敷料(ΕΡ20070867783，CN200780051215. 4, JP01316647)、生物醫(yī)用材料等。酶催化交聯(lián)制備水凝膠材料是ー種最新方法，因為采用酶催化交聯(lián)，不使用化學(xué)交聯(lián)劑，得到的水凝膠生物材料具有優(yōu)異的生物相容性，但是通常得到的生物分子水凝膠強(qiáng)度非常差，通常只能作為注射材料。海藻酸鹽是由褐藻中提取的ー種天然線性多糖，是由β-D-甘露糖醛酸(Μ単元)和α-L-古洛糖醛酸(G単元)通過1，4_糖苷鍵連接，并由不同GG、GM或匪片段以一定比例構(gòu)成的無規(guī)嵌段共聚物。ニ價陽離子如Ca2+、Ba2+、Sr2+極易與海藻酸古洛糖醛酸上的多個氧原子發(fā)生螯合作用，使得海藻酸鏈間緊密結(jié)合，協(xié)同作用增強(qiáng)，鏈鏈間的相互作用最終導(dǎo)致三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，即水凝膠的形成。該水凝膠生物相容性好，凝膠時間快。同濟(jì)大學(xué)任天斌等人用鈣離子交聯(lián)含有羥基磷灰石的海藻酸鈉，形成生物大分子水凝膠，用于藥物控釋可注射型支架材料(CN201010563043. 2)。由化學(xué)交聯(lián)劑制備的生物分子水凝膠對細(xì)胞或組織有潛在的毒性，而生物大分子水凝膠力學(xué)強(qiáng)度低，至今幾乎沒有生物大分子水凝膠能夠承受高溫蒸汽消毒。因此，有必要發(fā)明ー種結(jié)構(gòu)特殊的高強(qiáng)度的生物大分子水凝膠及其制備方法，不使用化學(xué)交聯(lián)劑，無任何毒性，用作組織修復(fù)或組織工程支架，乃至可以采用高溫蒸汽消毒。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種高強(qiáng)度生物大分子水凝膠及其制備方法，該水凝膠具有優(yōu)異的力學(xué)性能、生物相容性。 技術(shù)方案為了克服生物大分子水凝膠力學(xué)強(qiáng)度差以及常用化學(xué)交聯(lián)劑或弓I發(fā)劑殘留于體系中引起的細(xì)胞毒性、生物相容性降低的不足，本發(fā)明ー種酶催化和離子交聯(lián)的互穿網(wǎng)絡(luò)生物大分子水凝膠，該水凝膠具有良好的生物相容性和較高的力學(xué)強(qiáng)度，可用于細(xì)胞、組織培養(yǎng)，作為組織修復(fù)或組織工程支架材料，可以制成膜狀或多孔狀或管狀等。本發(fā)明生物大分子水凝膠，其特征在于這種生物大分子水凝膠由(I)蛋白或多肽或含有氨基酸殘基的分子通過酶催化交聯(lián)而成的蛋白或多肽生物大分子網(wǎng)絡(luò)，和(2)多糖大分子通過ニ價離子交聯(lián)而成的多糖生物大分子網(wǎng)絡(luò)組成，兩個網(wǎng)絡(luò)之間相互貫穿，沒有化學(xué)鍵結(jié)合，其中蛋白或多肽生物大分子網(wǎng)絡(luò)含量為水凝膠干重總質(zhì)量的1%_99%，多糖大分子構(gòu)成的大分子網(wǎng)絡(luò)含量為水凝膠干重總質(zhì)量的I%_99%。生物大分子水凝膠中蛋白是膠原、明膠、絲素蛋白、玉米蛋白、弾性蛋白、纖維蛋白原、糖蛋白、層粘蛋白纖連蛋白中的ー種或多種。多肽或含有氨基酸殘基的分子是含有賴氨酸、谷氨酰胺或酪氨酸的ー種或多種。催化酶是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶同エ酶，賴氨?；趸?，酪氨酸酶，過氧化物酶，辣根過氧化物酶，嗜熱菌蛋白酶，磷酸酯酶，內(nèi)酰胺酶，血漿胺氧化酶。蛋白或多肽生物大分子網(wǎng)絡(luò)是蛋白或多肽或含有氨基酸殘基的分子通過酶催化通過肽鍵交聯(lián)或通過席夫堿(Schiff base)交聯(lián)或酚羥基氧化交聯(lián)或輔酶A的磷酸基團(tuán)與蛋白的絲氨酸殘基結(jié)合交聯(lián)而成，或是蛋白或多肽通過酶催化反應(yīng)引起的生物大分子親水性改變導(dǎo)致的生物大分子自組裝物理交聯(lián)而成。多糖生物大分子網(wǎng)絡(luò)是由多糖大分子是海藻酸鹽、結(jié)冷膠、瓜爾膠中的一種或多種通過ニ價鈣離子或鎂離子交聯(lián)而成。這種生物大分子水凝膠中可以含有添加劑是酶、細(xì)胞生長因子、骨形成蛋白、維生素、胰島素、地塞米松、藥物、無機(jī)鹽的ー種或多種的混合物，添加劑的含量為水凝膠總質(zhì)量的 O.001%-10%。
本發(fā)明的生物大分子水凝膠的制備方法將多糖大分子溶解在去離子水中得到多糖大分子水溶液，將蛋白或多肽溶解在上述多糖大分子水溶液中，或加入添加剤，得到大分子混合溶液。加入酶催化劑，均勻混合，于Oで-50で下催化交聯(lián)反應(yīng)O. 5 - 24小時，使蛋白或多肽交聯(lián)得到半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。將半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠進(jìn)ー步通過ニ價離子使多糖大分子交聯(lián)，得到具有互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的高強(qiáng)度生物大分子水凝膠。其中蛋白是膠原、明膠、絲素蛋白、玉米蛋白、弾性蛋白、纖連蛋白中的ー種或多種；多肽或含有氨基酸殘基的分子是含有賴氨酸和谷氨酰胺的小分子肽或低聚物的ー種或多種；多糖大分子是海藻酸鹽、結(jié)冷膠、瓜爾膠中的ー種或多種；酶是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，賴氨?；趸?，酪氨酸酶，過氧化物酶，辣根過氧化物酶，包括植物、動物或微生物來源的酶；ニ價離子是鈣離子，鎂離子。添加劑是細(xì)胞生長因子、骨形成蛋白、維生素、胰島素、地塞米松、藥物的一種或多種的混合物。本發(fā)明的生物大分子水凝膠可以加工成濕態(tài)或干態(tài)的膜狀、多孔海綿狀管狀、顆粒狀，可以用作組織修復(fù)材料或組織工程支架，可以用于藥物釋放載體。 有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)
(I)本發(fā)明通過蛋白或多肽的酶催化交聯(lián)和多糖大分子的離子交聯(lián)構(gòu)成互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠，兩個網(wǎng)絡(luò)協(xié)同提高生物大分子水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度，良好的力學(xué)強(qiáng)度在人造皮膚、人工軟骨、組織工程支架材料等方面的應(yīng)用中至關(guān)重要。(2)本發(fā)明以生物相容性優(yōu)異的蛋白或多肽分子或含氨基酸殘基的分子和多糖大分子通過酶催化交聯(lián)和ニ價鈣離子或鎂離子交聯(lián)劑，不含任何有毒化學(xué)交聯(lián)劑，生物相容性好，制備方法簡單。(3)本發(fā)明生物大分子水凝膠可以通過控制酶催化交聯(lián)或離子交聯(lián)程度控制生物降解性能。(4)本發(fā)明的生物大分子水凝膠可以耐受121° C高溫消毒，保持良好的力學(xué)性能，顯著優(yōu)于單個交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的生物大分子水凝膠。(5)本發(fā)明的生物大分子水凝膠可以含有酶、細(xì)胞生長因子、骨形成蛋白、維生素、胰島素、地塞米松、藥物、無機(jī)鹽的ー種或多種的混合物作為添加剤，賦予水凝膠各種生物學(xué)功能。(6)本發(fā)明的生物大分子水凝膠可以加工成濕態(tài)或干態(tài)的多孔海綿狀、膜狀、管狀、顆粒狀，可以用作組織修復(fù)材料或組織工程支架，可以用于藥物釋放載體。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明生物大分子水凝膠由(I)蛋白或多肽或含有氨基酸殘基的分子通過酶催化交聯(lián)而成的蛋白或多肽生物大分子網(wǎng)絡(luò)，和(2)多糖大分子通過ニ價離子交聯(lián)而成的多糖生物大分子網(wǎng)絡(luò)組成，兩個網(wǎng)絡(luò)之間相互貫穿，沒有化學(xué)鍵結(jié)合，其中蛋白生物大分子網(wǎng)絡(luò)含量為水凝膠干重總質(zhì)量的1%-99%，多糖大分子構(gòu)成的大分子網(wǎng)絡(luò)含量為水凝膠干重總質(zhì)量的 1%-99%。生物大分子水凝膠中蛋白是膠原、明膠、絲素蛋白、玉米蛋白、弾性蛋白、纖維蛋白原、糖蛋白、層粘蛋白纖連蛋白中的ー種或多種。多肽或含有氨基酸殘基的分子是含有賴氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或酚羥基的小分子肽或低聚物的ー種或多種。催化酶是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶同エ酶，賴氨?；趸?，酪氨酸酶，過氧化物酶，辣根過氧化物酶，嗜熱菌蛋白酶，磷酸酯酶，β-內(nèi)酰胺酶，血漿胺氧化酶。蛋白或多肽生物大分子網(wǎng)絡(luò)是蛋白或多肽或含有氨基酸殘基的分子通過酶催化通過肽鍵交聯(lián)或通過席夫堿(Schiff base)交聯(lián)或酚羥基氧化交聯(lián)或輔酶A的磷酸基團(tuán)與蛋白的絲氨酸殘基結(jié)合交聯(lián)而成，或是蛋白或多肽通過酶催化反應(yīng)引起的生物大分子親水性改變導(dǎo)致的生物大分子自組裝物理交聯(lián)而成。多糖生物大分子網(wǎng)絡(luò)是由多糖大分子是海藻酸鹽、結(jié)冷膠、瓜爾膠中的一種或多種通過ニ價鈣離子或鎂離子交聯(lián)而成。這種生物大分子水凝膠中可以含有添加劑是酶、細(xì)胞生長因子、骨形成蛋白、維生素、胰島素、地塞米松、藥物、無機(jī)鹽的ー種或多種的混合物，添加劑的含量為水凝膠總質(zhì)量的 O.001%-10%。
本發(fā)明的生物大分子水凝膠的制備方法將多糖大分子溶解在去離子水中得到多糖大分子水溶液，將蛋白或多肽溶解在上述多糖大分子水溶液中，或加入添加剤，得到大分子混合溶液。加入酶催化劑，均勻混合，于Oで-50で下催化交聯(lián)反應(yīng)O. 5 - 24小時，使蛋白或多肽交聯(lián)得到半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。將半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠進(jìn)ー步通過ニ價離子使多糖大分子交聯(lián)，得到具有互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的高強(qiáng)度生物大分子水凝膠。其中蛋白是膠原、明膠、絲素蛋白、玉米蛋白、弾性蛋白、纖連蛋白中的ー種或多種；多肽或含有氨基酸殘基的分子是含有賴氨酸和谷氨酰胺的小分子肽或低聚物的ー種或多種；多糖大分子是海藻酸鹽、結(jié)冷膠、瓜爾膠中的ー種或多種；酶是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，賴氨?；趸?，酪氨酸酶，過氧化物酶，辣根過氧化物酶，包括植物、動物或微生物來源的酶；ニ價離子是鈣離子，鎂離子。添加劑是細(xì)胞生長因子、骨形成蛋白、維生素、胰島素、地塞米松、藥物的一種或多種的混合物。本發(fā)明的生物大分子水凝膠可以加工成濕態(tài)或干態(tài)的膜狀、多孔海綿狀、管狀、顆粒狀，可以用作組織修復(fù)材料或組織工程支架，可以用于藥物釋放載體。實(shí)施例I
稱取O. 6g海藻酸鈉攪拌溶解在20ml去離子水中得到質(zhì)量濃度為3%的海藻酸鈉水溶液，稱取3g明膠加入到上述海藻酸鈉水溶液中，50°C水浴加熱溶解，靜置脫泡，得到均勻混合的明膠和海藻酸鈉大分子水溶液。加入O. 5ml濃度為100 U/ml的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液，快速均勻混合，置于平板或柱狀模具中，于40°C下反應(yīng)交聯(lián)I小時，得到明膠通過肽鍵交聯(lián)的蛋白半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠，其中含有海藻酸鈉大分子。將所得的半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠從模具中取出，浸泡在摩爾濃度為5mol/L的氯化鈣溶液中I小時，得到膜狀或塊狀互穿網(wǎng)絡(luò)生物大分子水凝膠。水凝膠反復(fù)水洗、去除殘留鈣離子后，將其保存在去離子水溶液中，即可得酶催化和離子交聯(lián)的生物大分子水凝膠。將互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠置于121で高壓釜中消毒半小時，得到明膠/海藻酸互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠膜，一個網(wǎng)絡(luò)是明膠通過肽鍵交聯(lián)，另ー個網(wǎng)絡(luò)是海藻酸通過鈣離子交聯(lián)。實(shí)施例2
稱取O. Ig瓜爾膠攪拌溶解在IOml去離子水中得到質(zhì)量濃度為1%的瓜爾膠水溶液，稱取Ig明膠加入到上述海藻酸鈉水溶液中，50°C水浴加熱溶解，靜置脫泡，得到均勻混合的瓜爾膠和明膠大分子水溶液。加入O. 5ml濃度為50U/ml的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液，快速均勻混合，置于管狀或柱狀模具中，于40°C下反應(yīng)交聯(lián)I小吋。將所得的半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠從模具中取出，浸泡在摩爾濃度為10mol/L的CaHP04溶液中I小時，得到管狀或塊狀互穿網(wǎng)絡(luò)生物大分子水凝膠。所得的水凝膠反復(fù)水洗、去除殘留鈣離子后，將其保存在去離子水溶液中。進(jìn)ー步經(jīng)_80°C冷凍干燥，得到多孔海綿狀酶催化和離子交聯(lián)的互穿網(wǎng)絡(luò)生物大分子交聯(lián)多孔材料。將村里置于121で高壓釜中消毒半小時，得到明膠/瓜爾膠互穿網(wǎng)絡(luò)多孔材料，一個網(wǎng)絡(luò)是明膠通過肽鍵交聯(lián)，另ー個網(wǎng)絡(luò)是瓜爾膠通過鈣離子交聯(lián)。實(shí)施例3 稱取O. 2g海藻酸鈉攪拌溶解在IOml去離子水中得到質(zhì)量濃度為2%的海藻酸鈉水溶液，稱取2g明膠加入到上述海藻酸鈉水溶液中，50°C水浴加熱溶解后，另加入1.5mL0.05mg/mL骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)溶液，攪拌均勻，靜置脫泡，得到含有骨生長因子的明膠和海藻酸鈉大分子水溶液。加入O. 5ml濃度為200U/ml的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液，快速均勻混合，置于平板或柱狀模具中，于40°C下反應(yīng)交聯(lián)I小吋。將所得的半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠從模具中取出，浸泡在摩爾濃度為5mol/L的氯化鈣溶液中I小時，得到膜狀或塊狀互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。所得的水凝膠反復(fù)水洗、去除殘留鈣離子后，將其保存在去離子水溶液中，即可得酶催化和離子交聯(lián)的生物大分子水凝膠。進(jìn)ー步經(jīng)氣體發(fā)泡，冷凍干燥，得到得到明膠/海藻酸互穿網(wǎng)絡(luò)多孔材料，一個網(wǎng)絡(luò)是明膠通過肽鍵交聯(lián)，另ー個網(wǎng)絡(luò)是瓜爾膠通過鈣離子交聯(lián)。實(shí)施例4
稱取O. 2g海藻酸鈉攪拌溶解在IOml去離子水中得到質(zhì)量濃度為2%的海藻酸鈉水溶液，稱取2g明膠加入到上述海藻酸鈉水溶液中，50°C水浴加熱溶解后，另加入I. 5mL IOU/mL胰島素溶液，攪拌均勻，靜置脫泡，得到含有胰島素的明膠和海藻酸鈉大分子水溶液。加入O. 5ml濃度為200U/ml的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液，快速均勻混合，置于平板或柱狀模具中，于40°C下反應(yīng)交聯(lián)I小吋。所得的半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠從模具中取出，浸泡在摩爾濃度為5mol/L的氯化鈣溶液中I小時，得到膜狀或塊狀互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。所得的水凝膠反復(fù)水洗、去除殘留鈣離子后，將其保存在去離子水溶液中，即可得酶催化和離子交聯(lián)的生物大分子水凝膠。將上述酶催化和離子交聯(lián)的生物大分子水凝膠冷凍干燥，得到多孔狀組織修復(fù)材料。實(shí)施例5
稱取O. 2g海藻酸鈉攪拌溶解在IOml去離子水中得到質(zhì)量濃度為2%的海藻酸鈉水溶液，稱取2g明膠加入到上述海藻酸鈉水溶液中，50°C水浴加熱溶解后，另加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子，攪拌均勻，靜置脫泡，得到含有生長因子的明膠和海藻酸鈉大分子水溶液。加入O. 5ml濃度為200U/ml的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液，快速均勻混合，置于平板或柱狀模具中，于40°C下反應(yīng)交聯(lián)I小吋。所得的半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠從模具中取出，浸泡在摩爾濃度為5mol/L的氯化鈣溶液中I小時，得到膜狀或塊狀互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。所得的水凝膠反復(fù)水洗、去除殘留鈣離子后，將其保存在去離子水溶液中，即可得酶催化和離子交聯(lián)的生物大分子水凝膠。將上述酶催化和離子交聯(lián)的生物大分子水凝膠冷凍干燥，得到多孔狀組織修復(fù)材料。實(shí)施例6
稱取O. Ig海藻酸鈉攪拌溶解在IOml去離子水中得到質(zhì)量濃度為1%的海藻酸鈉水溶液，稱取O. 5g含有賴氨酸和谷氨酰胺小分子肽加入到上述海藻酸鈉水溶液中，50°C水浴加熱溶解后，攪拌均勻，靜置脫泡。加入0.2ml濃度為50 U/ml的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液，快速均勻混合，置于平板或柱狀模具中，于40°C下反應(yīng)交聯(lián)I小吋。所得的半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠從模具中取出，浸泡在摩爾濃度為5mol/L的氯化鈣溶液中I小時，得到膜狀或塊狀互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。所得的水凝膠反復(fù)水洗、去除殘留鈣離子后，將其保存在去離子水溶液中，即可得酶催化和離子交聯(lián)的多肽/海藻酸生物大分子水凝膠，小分子肽通過肽鍵交聯(lián)得到多肽大分子網(wǎng)絡(luò)，海藻酸通過鈣離子交聯(lián)得到多糖大分子網(wǎng)絡(luò)。
實(shí)施例7
稱取O. Ig海藻酸鈉攪拌溶解在IOml去離子水中得到質(zhì)量濃度為1%的海藻酸鈉水溶液，稱取O. 5g含有四個酪氨酸殘基的聚氧こ烯低聚物(分子量4000)加入到上述海藻酸鈉水溶液中，50°C水浴加熱溶解后，攪拌均勻，靜置脫泡，得到水溶液。加入O. 2ml辣根過氧化物酶，快速均勻混合，置于平板或柱狀模具中，于25°C下反應(yīng)交聯(lián)I小吋。所得的半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠從模具中取出，浸泡在摩爾濃度為5mol/L的氯化鈣溶液中I小時，得到膜狀或塊狀互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。所得的水凝膠反復(fù)水洗、去除殘留鈣離子后，將其保存在去離子水溶液中，即可得酶催化交聯(lián)和離子交聯(lián)的聚氧こ烯/海藻酸生物大分子水凝膠，聚氧こ烯通過酚羥基交聯(lián)得到聚氧こ烯網(wǎng)絡(luò)，海藻酸通過鈣離子交聯(lián)得到多糖大分子網(wǎng)絡(luò)。實(shí)施例8
稱取O. Ig海藻酸鈉攪拌溶解在IOml去離子水中得到質(zhì)量濃度為1%的海藻酸鈉水溶液，稱取2g明膠加入到上述海藻酸鈉水溶液中，50°C水浴加熱溶解后，攪拌均勻，靜置脫泡，得到明膠和海藻酸鈉大分子水溶液。加入O. 2ml賴氨?；趸福?，快速均勻混合，置于平板或柱狀模具中，于35°C下反應(yīng)交聯(lián)I小吋。所得的半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠從模具中取出，浸泡在摩爾濃度為5mol/L的氯化鈣溶液中I小時，得到膜狀或塊狀互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。所得的水凝膠反復(fù)水洗、去除殘留鈣離子后，將其保存在去離子水溶液中，即可得酶催化交聯(lián)和離子交聯(lián)的明膠/海藻酸生物大分子水凝膠，明膠通過席夫堿(Schiffbase)交聯(lián)得到蛋白大分子網(wǎng)絡(luò)，海藻酸通過鈣離子交聯(lián)得到多糖大分子網(wǎng)絡(luò)。實(shí)施例9
稱取O. 2g海藻酸鈉攪拌溶解在IOml去離子水中得到質(zhì)量濃度為2%的海藻酸鈉水溶液，稱取2g明膠加入到上述海藻酸鈉水溶液中，50°C水浴加熱溶解后，攪拌均勻，靜置脫泡，得到明膠和海藻酸鈉大分子水溶液。加入O. 2ml血漿胺氧化酶，，快速均勻混合，置于平板或柱狀模具中，于35°C下反應(yīng)交聯(lián)I小吋。所得的半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠從模具中取出，浸泡在摩爾濃度為5mol/L的氯化鈣溶液中I小時，得到膜狀或塊狀互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。所得的水凝膠反復(fù)水洗、去除殘留鈣離子后，將其保存在去離子水溶液中，即可得酶催化交聯(lián)和離子交聯(lián)的明膠/海藻酸生物大分子水凝膠，明膠通過席夫堿(Schiffbase)交聯(lián)得到蛋白大分子網(wǎng)絡(luò)，海藻酸通過鈣離子交聯(lián)得到多糖大分子網(wǎng)絡(luò)。實(shí)施例10
制備明膠濃度為15%，海藻酸鈉含量分別為1%，2%, 3%的明膠/海藻酸混合溶液，加入TG酶使?jié)舛冗_(dá)到10U/ml。按表I中的組成混合加入模具中，在40° C下交聯(lián)30 min，取出明膠交聯(lián)、海藻酸未交聯(lián)的膜得到半互穿網(wǎng)絡(luò)(IPN)水凝膠。再將半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠浸泡在O. 6% CaC12水溶液中交聯(lián)lh，水漂洗除去過量鈣離子，得到明膠/海藻酸互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。交聯(lián)過程中，明膠/海藻酸互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠尺寸無明顯變化，形貌均勻，而海藻酸鈣水凝膠明顯收縮。
權(quán)利要求
1.ー種生物大分子水凝膠，其特征在于該生物大分子水凝膠包括 .1)蛋白或多肽或含有氨基酸殘基的分子通過酶催化交聯(lián)而成的蛋白或多肽生物大分子網(wǎng)絡(luò)， .2)多糖大分子通過ニ價離子交聯(lián)而成的多糖生物大分子網(wǎng)絡(luò)； 上述兩個網(wǎng)絡(luò)之間相互貫穿，沒有化學(xué)鍵結(jié)合，其中蛋白或多肽生物大分子網(wǎng)絡(luò)的含量為水凝膠干重總質(zhì)量的1%_99%，多糖大分子構(gòu)成的大分子網(wǎng)絡(luò)含量為水凝膠干重總質(zhì)量的 1%-99%。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物大分子水凝膠，其特征在于所述蛋白是膠原、明膠、絲素蛋白、玉米蛋白、弾性蛋白、纖維蛋白原、糖蛋白、層粘蛋白或纖連蛋白中的ー種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物大分子水凝膠，其特征在于多肽或含有氨基酸殘基的分子是含有賴氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或酚羥基的ー種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物大分子水凝膠，其特征在于所述的酶是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶同エ酶、賴氨?；趸?、酪氨酸酶、過氧化物酶、辣根過氧化物酶、嗜熱菌蛋白酶、磷酸酯酶、內(nèi)酰胺酶或血漿胺氧化酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物大分子水凝膠，其特征在于蛋白或多肽生物大分子網(wǎng)絡(luò)是蛋白、多肽或含有氨基酸殘基的分子通過酶催化的肽鍵交聯(lián)，或通過席夫堿Schiff base交聯(lián)、酚羥基氧化交聯(lián)或輔酶A的磷酸基團(tuán)與蛋白的絲氨酸殘基結(jié)合交聯(lián)而成，或是蛋白或多肽通過酶催化反應(yīng)引起的生物大分子親水性改變導(dǎo)致的生物大分子自組裝物理交聯(lián) 。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物大分子水凝膠，其特征在于所述的多糖生物大分子網(wǎng)絡(luò)是由大分子海藻酸鹽、結(jié)冷膠、瓜爾膠中的一種或多種通過ニ價鈣離子或鎂離子交聯(lián)而成。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物大分子水凝膠，其特征在于所述的生物大分子水凝膠中還含有添加剤，該添加劑是酶、細(xì)胞生長因子、骨形成蛋白、維生素、胰島素、地塞米松、藥物或無機(jī)鹽的ー種或多種的混合物，添加劑的含量為水凝膠總質(zhì)量的O. 001%-10%。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物大分子水凝膠，其特征在于所述的ニ價離子是鈣離子或鎂離子。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、8所述的生物大分子水凝膠，其特征在于所述生物大分子水凝膠是濕態(tài)或干態(tài)的膜狀、多孔海綿狀、管狀或顆粒狀，用作組織修復(fù)材料、組織工程支架或藥物釋放載體。
10.一種如權(quán)利要求I所述的生物大分子水凝膠的制備方法，其特征在于該制備方法包括以下步驟 .1.)將多糖大分子溶解在去離子水中得到多糖大分子水溶液，將蛋白或多肽溶解在上述多糖大分子水溶液中，或加入添加剤，得到大分子混合溶液； .2.)將步驟I得到的大分子混合溶液加入酶催化劑，均勻混合，于Oで-50で下催化交聯(lián)反應(yīng)O. 5 - 24小時，使蛋白或多肽交聯(lián)得到含有未交聯(lián)的多糖大分子的半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠； .3.)將含有未交聯(lián)的多糖大分子的半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠進(jìn)ー步通過ニ價離子使多糖大分子交聯(lián)，得到具有互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的高強(qiáng)度生物大分子水凝膠。
全文摘要
本發(fā)明是一種酶催化和離子交聯(lián)的生物大分子水凝膠及其制備方法，該生物大分子水凝膠包括蛋白或多肽或含有氨基酸殘基的分子通過酶催化交聯(lián)而成的蛋白或多肽生物大分子網(wǎng)絡(luò)，多糖大分子通過二價離子交聯(lián)而成的多糖生物大分子網(wǎng)絡(luò)；上述兩個網(wǎng)絡(luò)之間相互貫穿，沒有化學(xué)鍵結(jié)合，其中蛋白或多肽生物大分子含量為水凝膠干重總質(zhì)量的1%-99%，多糖大分子構(gòu)成的大分子網(wǎng)絡(luò)含量為水凝膠干重總質(zhì)量的1%-99%。該水凝膠具有優(yōu)異的力學(xué)性能，不使用化學(xué)交聯(lián)劑，制備方法簡單高效，水凝膠具有良好的生物相容性和力學(xué)強(qiáng)度，可以蒸汽消毒，可以是濕態(tài)或干態(tài)的膜狀、多孔海綿狀、管狀、顆粒狀，用于細(xì)胞、組織培養(yǎng)，作為組織修復(fù)材料、組織工程支架或藥物釋放載體。
文檔編號C08J3/075GK102688525SQ201210137940
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月7日
發(fā)明者文采, 方碩, 李新松 申請人:東南大學(xué)