新的抗DR5抗體[技術(shù)領(lǐng)域]本發(fā)明涉及與參與細胞凋亡誘導(dǎo)的細胞表面受體結(jié)合并可用作腫瘤治療劑和/或預(yù)防劑的抗體，并且還涉及使用抗體治療和/或預(yù)防癌癥、自身免疫病或炎性疾病的方法。[

背景技術(shù)：
]細胞凋亡是體內(nèi)除去不必要的細胞或受損細胞并保持正常細胞數(shù)的生理過程所必不可少的一種現(xiàn)象。由于對細胞凋亡的調(diào)節(jié)機制在癌癥或免疫性疾病中常常受損的事實的闡述，及同樣對細胞凋亡的調(diào)節(jié)途徑的闡述的進展，因此可用于治療癌癥或免疫性疾病的新的細胞凋亡誘導(dǎo)劑的開發(fā)也受到促進。特別預(yù)期對參與細胞凋亡誘導(dǎo)(特征在于死亡受體)的細胞表面受體的配體有結(jié)合親和力的抗體或?qū)λ鏊劳鍪荏w有結(jié)合親和力的抗體對這些疾病具有治療作用(參見例如非專利文獻1)。已知作為死亡受體之一的死亡受體5(DR5)(有時亦稱KILLER、TRICK2A、TRAIL-R2、TRICKB或CD262)和眾多在細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡的激動性抗體(參見例如非專利文獻2或3，或?qū)＠墨I1-6)。在臨床試驗中作為候選治療劑的一些抗體目前正在開發(fā)中，并預(yù)期具有治療作用使得抗體以激動性方式特異性地作用于表達所述受體的細胞(癌細胞或免疫性疾病相關(guān)細胞)以殺死該細胞。為了使這類抗體具有抗腫瘤作用，必要的是細胞表達DR5，然而，已經(jīng)揭示在臨床前試驗中，所述作用與DR5表達水平之間沒有相關(guān)性(非專利文獻4)。這被認為是因為細胞反應(yīng)受許多因素調(diào)節(jié)，例如參與細胞凋亡途徑的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(例如胱天蛋白酶-8或Bcl-2)的表達水平(非專利文獻5)。[現(xiàn)有技術(shù)文獻][專利文獻1]：WO98/51793[專利文獻2]：WO2001/83560[專利文獻3]：WO2002/94880[專利文獻4]：WO2003/54216[專利文獻5]：WO2006/83971[專利文獻6]：WO2007/22157[非專利文獻1]：CellDeathandDifferentiation,10:66-75(2003)[非專利文獻2]：JournalofImmunology，162:2597-2605(1999)[非專利文獻3]：NatureMedicine，7(8):954-960(2001)[非專利文獻4]：CellDeathandDifferentiation,10:66-75(2003)[非專利文獻5]：JournalofClinicalOncology，26:3621-3630(2008)[發(fā)明概述][發(fā)明要解決的問題]本發(fā)明的目的是提供抗體或該抗體的功能性片段以用于對癌癥具有治療作用的藥物中，以及編碼抗體或該抗體的功能性片段的多核苷酸。[解決問題的方法]本發(fā)明人為了實現(xiàn)上述目的進行了深入研究，結(jié)果他們發(fā)現(xiàn)了在細胞中顯示有效細胞凋亡誘導(dǎo)活性的抗體，從而完成了本發(fā)明。這亦在現(xiàn)有可獲得的抗體對其無法實現(xiàn)有效治療作用的患者中產(chǎn)生有效的治療作用。即本發(fā)明包括以下發(fā)明。(1)抗體或抗體的功能性片段，其特征在于：重鏈序列含有具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可變區(qū)，且CDRH1包含SEQIDNO:82所示氨基酸序列，CDRH2包含SEQIDNO:83和89所示氨基酸序列的任一個，CDRH3包含SEQIDNO:84所示氨基酸序列；和輕鏈序列含有具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可變區(qū)，且CDRL1包含SEQIDNO:79、85、86、87和88所示氨基酸序列的任一個，CDRL2包含SEQIDNO:80所示氨基酸序列，CDRL3包含SEQIDNO:81所示氨基酸序列。(2)(1)的抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于含有包含SEQIDNO:20所示氨基酸序列的氨基酸殘基20-141的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:16所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-134的輕鏈可變序列。(3)(1)或(2)的抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于抗體是嵌合抗體。(4)(3)的抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于含有包含SEQIDNO:20所示氨基酸序列的氨基酸殘基20-471的重鏈序列和包含SEQIDNO:16所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-239的輕鏈序列。(5)(1)的抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于抗體是人源化的。(6)(5)的抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于含有：(a)選自以下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)序列：a1)包含SEQIDNO:42所示氨基酸序列的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列；a2)包含SEQIDNO:70所示氨基酸序列的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列；a3)與選自a1)和a2)的氨基酸序列具有至少95%同源性的氨基酸序列；a4)與選自a1)和a2)的氨基酸序列具有至少99%同源性的氨基酸序列；和a5)在選自a1)和a2)的氨基酸序列的任一個中包括一個至幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加的氨基酸序列；和(b)選自以下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)序列：b1)包含SEQIDNO:28所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列；b2)包含SEQIDNO:52所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列；b3)包含SEQIDNO:58所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列；b4)包含SEQIDNO:62所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列；b5)包含SEQIDNO:66所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列；b6)與選自b1)-b5)的氨基酸序列的任一個具有至少95%同源性的氨基酸序列；b7)與選自b1)-b5)的氨基酸序列的任一個具有至少99%同源性的氨基酸序列；和b8)在選自b1)-b5)的氨基酸序列的任一個中包括一個至幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加的氨基酸序列。(7)(6)的抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于含有包含SEQIDNO:42所示氨基酸序列的氨基酸殘基20-141的重鏈可變區(qū)序列和包含SEQIDNO:28所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-134的輕鏈可變區(qū)序列。(8)(6)的抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于含有包含SEQIDNO:70所示氨基酸序列的氨基酸殘基20-141的重鏈可變區(qū)序列和包含SEQIDNO:52所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-134的輕鏈可變區(qū)序列。(9)(6)的抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于含有包含SEQIDNO:70所示氨基酸序列的氨基酸殘基20-141的重鏈可變區(qū)序列和包含SEQIDNO:58所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-134的輕鏈可變區(qū)序列。(10)(6)的抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于含有包含SEQIDNO:70所示氨基酸序列的氨基酸殘基20-141的重鏈可變區(qū)序列和包含SEQIDNO:62所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-134的輕鏈可變區(qū)序列。(11)(6)的抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于含有包含SEQIDNO:70所示氨基酸序列的氨基酸殘基20-141的重鏈可變區(qū)序列和包含SEQIDNO:66所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-134的輕鏈可變區(qū)序列。(12)(6)的抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于含有包含SEQIDNO:42所示氨基酸序列的氨基酸殘基20-471的重鏈序列和包含SEQIDNO:28所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-239的輕鏈序列。(13)(6)的抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于含有包含SEQIDNO:70所示氨基酸序列的氨基酸殘基20-471的重鏈序列和包含SEQIDNO:52所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-239的輕鏈序列。(14)(6)的抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于含有包含SEQIDNO:70所示氨基酸序列的氨基酸殘基20-471的重鏈序列和包含SEQIDNO:58所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-239的輕鏈序列。(15)(6)的抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于含有包含SEQIDNO:70所示氨基酸序列的氨基酸殘基20-471的重鏈序列和包含SEQIDNO:62所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-239的輕鏈序列。(16)(6)的抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于含有包含SEQIDNO:70所示氨基酸序列的氨基酸殘基20-471的重鏈序列和包含SEQIDNO:66所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-239的輕鏈序列。(17)(1)-(16)任一個的抗體的功能性片段，其選自Fab、F(ab’)2、Fab’和Fv。(18)一種藥物組合物，其特征在于包含(1)-(17)的至少一種抗體或所述抗體的功能性片段。(19)(18)的藥物組合物，其特征在于是用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物。(20)一種用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物，其特征在于包含(1)-(17)的至少一種抗體或所述抗體的功能性片段和選自紫杉醇、卡鉑、CPT-11和長春堿的至少一個成員。(21)(19)或(20)的藥物組合物，其中癌癥選自肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌、腎癌、子宮癌、黑素瘤、纖維肉瘤、成膠質(zhì)細胞瘤和血細胞癌。(22)一種治療和/或預(yù)防癌癥的方法，其特征在于給予(1)-(17)的至少一種抗體或所述抗體的功能性片段。(23)一種治療和/或預(yù)防癌癥的方法，其特征在于同時或序貫給予(1)-(17)的至少一種抗體或所述抗體的功能性片段和選自紫杉醇、卡鉑、CPT-11、長春堿和5-FU的至少一個成員。(24)(22)或(23)的治療和/或預(yù)防方法，其中癌癥選自肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌、子宮癌、黑素瘤、成膠質(zhì)細胞瘤和血細胞癌。(25)一種多核苷酸，其編碼(2)、(4)和(6)-(16)中任一個的抗體。(26)(25)的多核苷酸，其特征在于含有包含SEQIDNO:19所示核苷酸序列的核苷酸58-423的核苷酸序列和包含SEQIDNO:15所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列。(27)(25)的多核苷酸，其特征在于含有包含SEQIDNO:19所示核苷酸序列的核苷酸58-1413的核苷酸序列和包含SEQIDNO:15所示核苷酸序列的核苷酸61-717的核苷酸序列。(28)(25)的多核苷酸，其特征在于含有：(a)選自以下核苷酸序列的多核苷酸：a1)包含SEQIDNO:41所示核苷酸序列的核苷酸58-423的核苷酸序列；a2)包含SEQIDNO:69所示核苷酸序列的核苷酸58-423的核苷酸序列；a3)與包含與選自a1)和a2)的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸的核苷酸序列；和a4)在選自a1)和a2)的核苷酸序列中包括一個至幾個核苷酸的取代、缺失或添加的核苷酸序列；和(b)選自以下核苷酸序列的多核苷酸：b1)包含SEQIDNO:27所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列；b2)包含SEQIDNO:51所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列；b3)包含SEQIDNO:57所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列；b4)包含SEQIDNO:61所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列；b5)包含SEQIDNO:65所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列；b6)與包含與選自b1)-a5)的核苷酸序列的任一個互補的核苷酸序列的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸的核苷酸序列；和b7)在選自b1)-b5)的核苷酸序列的任一個中包括一個至幾個核苷酸的取代、缺失或添加的核苷酸序列。(29)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有SEQIDNO:41所示核苷酸序列的核苷酸58-423的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有SEQIDNO:27所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列的多核苷酸。(30)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有SEQIDNO:69所示核苷酸序列的核苷酸58-423的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有SEQIDNO:51所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列的多核苷酸。(31)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有SEQIDNO:69所示核苷酸序列的核苷酸58-423的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有SEQIDNO:57所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列的多核苷酸。(32)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有SEQIDNO:69所示核苷酸序列的核苷酸58-423的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有SEQIDNO:61所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列的多核苷酸。(33)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有SEQIDNO:69所示核苷酸序列的核苷酸58-423的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有SEQIDNO:65所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列的多核苷酸。(34)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有SEQIDNO:41所示核苷酸序列的核苷酸58-1413的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有SEQIDNO:27所示核苷酸序列的核苷酸61-717的核苷酸序列的多核苷酸。(35)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有SEQIDNO:69所示核苷酸序列的核苷酸58-1413的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有SEQIDNO:51所示核苷酸序列的核苷酸61-717的核苷酸序列的多核苷酸。(36)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有SEQIDNO:69所示核苷酸序列的核苷酸58-1413的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有SEQIDNO:57所示核苷酸序列的核苷酸61-717的核苷酸序列的多核苷酸。(37)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有SEQIDNO:69所示核苷酸序列的核苷酸58-1413的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有SEQIDNO:61所示核苷酸序列的核苷酸61-717的核苷酸序列的多核苷酸。(38)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有SEQIDNO:69所示核苷酸序列的核苷酸58-1413的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有SEQIDNO:65所示核苷酸序列的核苷酸61-717的核苷酸序列的多核苷酸。(39)一種載體，其包含(25)-(38)的多核苷酸的任一種。(40)一種轉(zhuǎn)化宿主細胞，其包含(25)-(38)的多核苷酸的任一種。(41)一種轉(zhuǎn)化宿主細胞，其包含(39)的載體。(42)一種產(chǎn)生(2)、(4)和(6)-(16)中任一個的抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)(40)或(41)的宿主細胞和從所得培養(yǎng)產(chǎn)物中純化抗體的步驟。(43)一種抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于與含有包含SEQIDNO:20所示氨基酸序列的氨基酸殘基20-471的重鏈序列和包含SEQIDNO:16所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-239的輕鏈序列的抗體相同的表位結(jié)合。(44)一種抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于與含有包含SEQIDNO:20所示氨基酸序列的氨基酸殘基20-471的重鏈序列和包含SEQIDNO:16所示氨基酸序列的氨基酸殘基21-239的輕鏈序列的抗體競爭。(45)(43)或(44)的抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于通過木瓜蛋白酶消化制備的抗體的Fab片段，當結(jié)合SEQIDNO:23所示重組蛋白時，以4?或更小的距離位于SEQIDNO:23所示重組蛋白的以下殘基附近：26位的甘氨酸殘基、34位的異亮氨酸殘基、36位的谷氨酸殘基、37位的天冬氨酸殘基、38位的甘氨酸殘基、56位的天冬氨酸殘基、57位的亮氨酸殘基、58位的亮氨酸殘基、59位的苯丙氨酸殘基、61位的亮氨酸殘基和62位的精氨酸殘基。(46)(45)的抗體或所述抗體的功能性片段，其特征在于利用X射線衍射數(shù)據(jù)，通過復(fù)合體結(jié)構(gòu)分析來確定構(gòu)成SEQIDNO:23所示重組蛋白的各個氨基酸殘基與Fab片段之間的距離。[發(fā)明益處]按照本發(fā)明，可獲得用于癌癥的治療劑，其作用機制主要通過細胞中的細胞凋亡誘導(dǎo)。附圖簡述[圖1]圖1是顯示小鼠B273抗體的殺細胞作用的圖示。[圖2]圖2是顯示cB273抗體和sTRAIL與DR5胞外域蛋白質(zhì)的結(jié)合活性的圖示。[圖3]圖3是顯示采用Biacore的cB273抗體與人DR5的結(jié)合活性的圖示。上邊的圖顯示測量圖，其中縱坐標表示共振單位(RU)，橫坐標表示時間(秒)。下邊的圖顯示利用分析軟件計算的cB273抗體的Kon、Koff和KD值。[圖4]圖4是顯示cB273抗體對人癌細胞系的體外殺細胞作用的圖示。A)顯示人卵巢癌細胞系的結(jié)果，B)顯示人結(jié)腸癌細胞系的結(jié)果，C)顯示人肺癌細胞系的結(jié)果，和D)顯示人乳腺癌細胞系的結(jié)果。[圖5]圖5是顯示cB273抗體對人癌細胞系的體外殺細胞作用的圖示。A)顯示人胰腺癌細胞系的結(jié)果，B)顯示人黑素瘤細胞系的結(jié)果，C)顯示人成膠質(zhì)細胞瘤細胞系的結(jié)果，和D)顯示人子宮內(nèi)膜癌細胞系的結(jié)果。[圖6]圖6是顯示DR5-cB273Fab復(fù)合體結(jié)構(gòu)的視圖。[圖7]圖7是顯示DR5和CB273Fab的H鏈或L鏈之間相互作用的視圖。A)是說明作為棒狀模型位于距DR5為4?或更小距離的cB273Fab的H鏈氨基酸殘基和反之亦然的視圖。圖左側(cè)所示Ile34、Glu36、Asp37、Gly38、Asp56、Leu57、Leu58、Phe59、Leu61和Arg62是來源于DR5的氨基酸殘基，相應(yīng)的氨基酸殘基編號對應(yīng)于序列表中SEQIDNO:23所示氨基酸序列的編號。此外，圖右側(cè)的Phe33、Arg50、Asn52、Tyr54、Asn55、Phe59、Tyr101、Tyr102、Phe103和Asp104是來源于cB273重鏈的氨基酸殘基，相應(yīng)的氨基酸殘基編號通過使用序列表中SEQIDNO:20的20位谷氨酸殘基作為起始點給出。B)是說明位于距DR5為4?或更小距離的cB273Fab的L鏈氨基酸殘基和反之亦然的視圖，其中一些為棒狀模型，其它作為帶狀模型。圖左側(cè)的Gly26、Glu36、Asp37和Gly38是來源于DR5的氨基酸殘基，相應(yīng)的氨基酸殘基編號對應(yīng)于序列表中SEQIDNO:23所示氨基酸序列的編號。此外，圖右側(cè)的His31、Asn33、Val99和Trp101是來源于cB273輕鏈的氨基酸殘基，相應(yīng)的氨基酸殘基編號通過使用序列表中SEQIDNO:16的21位天冬氨酸殘基作為起始點給出。位于距cB273的Fab片段4?或更小的DR5的氨基酸殘基為序列表中SEQIDNO:23所示氨基酸序列26位的甘氨酸殘基、34位的異亮氨酸殘基、36位的谷氨酸殘基、37位的天冬氨酸殘基、38位的甘氨酸殘基、56位的天冬氨酸殘基、57位的亮氨酸殘基、58位的亮氨酸殘基、59位的苯丙氨酸殘基、61位的亮氨酸殘基和62位的精氨酸殘基。[圖8-1]圖8-1是顯示采用Biacore的hB273抗體與人DR5的結(jié)合活性的圖示，以及顯示各個抗體的測量曲線圖。[圖8-2]圖8-2是采用Biacore的hB273抗體與人DR5的結(jié)合活性的表格，并顯示利用分析軟件計算的各個抗體的Kon、Koff和KD值。順便提一句，圖8-1各曲線圖給出的數(shù)目對應(yīng)于圖8-2表格中的條目編號。[圖9]圖9是顯示hB273抗體針對Jurkat細胞的體外殺細胞活性的圖示，所述Jurkat細胞是人T淋巴瘤衍生細胞系。[圖10-1]圖10-1是顯示采用Biacore的hB273抗體與人DR5的結(jié)合活性的圖示，并顯示各個抗體的測量曲線圖。[圖10-2]圖10-2是顯示采用Biacore的hB273抗體與人DR5的結(jié)合活性的表格，并顯示利用分析軟件計算的各個抗體的Kon、Koff和KD值。順便提一句，圖10-1各曲線圖給出的數(shù)目對應(yīng)于圖10-2表格中的條目編號。[圖11]圖11是顯示hB273抗體針對Jurkat細胞的體外殺細胞活性的圖示，所述Jurkat細胞是人T淋巴瘤衍生細胞系。[圖12-1]圖12-1是顯示采用Biacore的CDR修飾的hB273抗體與人DR5的結(jié)合活性的視圖，并顯示各個抗體的測量曲線圖。[圖12-2]圖12-2是顯示采用Biacore的CDR修飾的hB273抗體與人DR5的結(jié)合活性的表格，并顯示利用分析軟件計算的各個抗體的Kon、Koff和KD值。順便提一句，圖12-1中各曲線圖給出的數(shù)目對應(yīng)于圖12-2表中的條目編號。[圖13-1]圖13-1是顯示采用示差掃描量熱法(DSC)評價CDR修飾的hB273抗體的熱穩(wěn)定性的圖示，并顯示各個抗體的測量曲線圖。[圖13-2]圖13-2是顯示采用示差掃描量熱法(DSC)評價CDR修飾的hB273抗體的熱穩(wěn)定性的圖示，并顯示各個抗體的測量曲線圖。[圖13-3]圖13-3顯示自圖13-1和13-2所示曲線圖計算的各個抗體的Tm值。順便提一句，圖13-1和13-2中各曲線圖給出的數(shù)字對應(yīng)于圖13-3中的條目編號。[圖14]圖14是顯示CDR修飾的hB273抗體針對Jurkat細胞的體外殺細胞活性的圖示，所述Jurkat細胞為人T淋巴瘤衍生細胞系。[圖15]圖15是顯示hB273_H2-1-NE/L1-NK抗體對人癌細胞系的胱天蛋白酶-3/7活化作用和體外殺細胞活性的視圖。A)顯示人結(jié)腸癌細胞系HCT-15的結(jié)果，B)顯示人成膠質(zhì)細胞瘤細胞系U-87MG的結(jié)果。[圖16]圖16是顯示植入人結(jié)腸癌細胞系COLO205的裸小鼠中cB273抗體的體內(nèi)抗腫瘤活性的圖示。[圖17]圖17是顯示植入人胰腺癌細胞系MIAPaCa-2的裸小鼠中cB273抗體的體內(nèi)抗腫瘤活性的圖示。[圖18]圖18是顯示植入人成膠質(zhì)細胞瘤細胞系U-87MG的裸小鼠中cB273抗體的體內(nèi)抗腫瘤活性的圖示。[圖19]圖19是顯示植入人肺癌細胞系NCI-H2122的裸小鼠中cB273抗體的體內(nèi)抗腫瘤活性的圖示(與紫杉醇和卡鉑組合)。[圖20]圖20是顯示植入人肺癌細胞系NCI-H460的裸小鼠中cB273抗體的體內(nèi)抗腫瘤活性的圖示(與紫杉醇和卡鉑組合)。[圖21]圖21是顯示植入人結(jié)腸癌細胞系DLD-1的裸小鼠中cB273抗體的體內(nèi)抗腫瘤活性的圖示(與CPT-11組合)。[圖22]圖22是顯示植入人結(jié)腸癌細胞系HCT-15的裸小鼠中cB273抗體的體內(nèi)抗腫瘤活性的圖示(與CPT-11組合)。[圖23]圖23是顯示植入人結(jié)腸癌細胞系HCT-116的裸小鼠中cB273抗體的體內(nèi)抗腫瘤活性的圖示(與CPT-11組合)。[圖24]圖24是顯示植入人黑素瘤細胞系A(chǔ)375的裸小鼠中cB273抗體的體內(nèi)抗腫瘤活性的圖示(與長春堿組合)。[圖25]圖25是顯示植入人結(jié)腸癌細胞系HCT-15的裸小鼠中cB273抗體和可那木單抗(conatumumab)之間體內(nèi)抗腫瘤活性的比較的圖示。[圖26]圖26是顯示植入人肺癌細胞系NCI-H1975的裸小鼠中cB273抗體和可那木單抗之間體內(nèi)抗腫瘤活性的比較的圖示。[圖27]圖27是顯示植入人結(jié)腸癌細胞COLO205的裸小鼠中hB273_H2-1-NE/L1-NK抗體(圖中標為“hB273”)的體內(nèi)抗腫瘤活性的圖示。[圖28]圖28是顯示編碼小鼠抗體B273重鏈的cDNA的核苷酸序列和小鼠抗體B273重鏈的氨基酸序列的圖示。[圖29]圖29是顯示編碼小鼠抗體B273輕鏈的cDNA的核苷酸序列和小鼠抗體B273輕鏈的氨基酸序列的圖示。[圖30]圖30是顯示編碼B273嵌合型輕鏈的核苷酸序列和B273嵌合型輕鏈的氨基酸序列的圖示。[圖31]圖31是顯示編碼B273嵌合型重鏈的核苷酸序列和B273嵌合型重鏈的氨基酸序列的圖示。[圖32]圖32是顯示編碼hB273_L1型輕鏈的核苷酸序列和hB273_L1型輕鏈的氨基酸序列的圖示。[圖33]圖33是顯示編碼hB273_L2型輕鏈的核苷酸序列和hB273_L2型輕鏈的氨基酸序列的圖示。[圖34]圖34是顯示編碼hB273_L3型輕鏈的核苷酸序列和hB273_L3型輕鏈的氨基酸序列的圖示。[圖35]圖35是顯示編碼hB273_H1型重鏈的核苷酸序列和hB273_H1型重鏈的氨基酸序列的圖示。[圖36]圖36是顯示編碼hB273_H2型重鏈的核苷酸序列和hB273_H2型重鏈的氨基酸序列的圖示。[圖37]圖37是顯示編碼hB273_H3型重鏈的核苷酸序列和hB273_H3型重鏈的氨基酸序列的圖示。[圖38]圖38是顯示編碼hB273_H1-1型重鏈的核苷酸序列和hB273_H1-1型重鏈的氨基酸序列的圖示。[圖39]圖39是顯示編碼hB273_H2-1型重鏈的核苷酸序列和hB273_H2-1型重鏈的氨基酸序列的圖示。[圖40]圖40是顯示編碼hB273_H2-2型重鏈的核苷酸序列和hB273_H2-2型重鏈的氨基酸序列的圖示。[圖41]圖41是顯示編碼hB273_H2-3型重鏈的核苷酸序列和hB273_H2-3型重鏈的氨基酸序列的圖示。[圖42]圖42是顯示編碼hB273_H2-4型重鏈的核苷酸序列和hB273_H2-4型重鏈的氨基酸序列的顯示。[圖43]圖43是顯示編碼hB273_H2-5型重鏈的核苷酸序列和hB273_H2-5型重鏈的氨基酸序列的圖示。[圖44]圖44是顯示編碼hB273_L1-NE型輕鏈的核苷酸序列和hB273_L1-NE型輕鏈的氨基酸序列的圖示。[圖45]圖45是顯示編碼hB273_L1-NF型輕鏈的核苷酸序列和hB273_L1-NF型輕鏈的氨基酸序列的圖示。[圖46]圖46是顯示編碼hB273_L1-NK型輕鏈的核苷酸序列和hB273_L1-NK型輕鏈的氨基酸序列的圖示。[圖47]圖47是顯示編碼hB273_L1-NL型輕鏈的核苷酸序列和hB273_L1-NL型輕鏈的氨基酸序列的圖示。[圖48]圖48是顯示編碼hB273_H2-1-NE型重鏈的核苷酸序列和hB273_H2-1-NE型重鏈的氨基酸序列的圖示。[圖49]圖49是顯示編碼可那木單抗輕鏈的cDNA的核苷酸序列和可那木單抗輕鏈的氨基酸序列的圖示。[圖50]圖50是顯示編碼可那木單抗重鏈的cDNA的核苷酸序列和可那木單抗重鏈的氨基酸序列的圖示。[圖51]圖51是顯示hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體針對人癌細胞系的體外殺細胞活性的圖示。A)顯示人胃癌細胞系的結(jié)果，B)顯示人腎癌細胞系的結(jié)果，C)顯示人肝癌細胞系的結(jié)果，D)顯示人纖維肉瘤細胞系的結(jié)果。[圖52]圖52是顯示植入人結(jié)腸癌細胞系HCT-15的裸小鼠中與5-FU組合的hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體(圖中標為“hB273”)的體內(nèi)抗腫瘤活性及該活性與可那木單抗比較的圖示。[圖53]圖53是顯示植入人非小細胞肺癌細胞系NCI-H1975的裸小鼠中與紫杉醇組合的hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體(圖中標為“hB273”)的體內(nèi)抗腫瘤活性及該活性與可那木單抗比較的圖示。[實施本發(fā)明的方式]本文所用術(shù)語“癌癥”和“腫瘤”以相同含義使用。本文所用術(shù)語“基因”不僅包括DNA，而且還包括其mRNA、其cDNA和cRNA。本文所用術(shù)語“多核苷酸”按與“核酸”相同的含義使用，且還包括DNA、RNA、探針、寡核苷酸和引物。本文所用術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”無差別地使用。本文所用術(shù)語“RNA級分”是指含有RNA的級分。本文所用術(shù)語“細胞”還包括動物個體和培養(yǎng)細胞中的細胞。本文所用術(shù)語“細胞的惡性轉(zhuǎn)化”是指其中細胞顯示異常增殖的狀態(tài)，例如細胞失去其對接觸抑制現(xiàn)象的敏感性、細胞顯示貼壁非依賴性增殖等，而顯示這類異常增殖的細胞稱為“癌細胞”。本文所用術(shù)語“細胞損傷”是指其中在細胞中引起某種形式的病理變化的狀態(tài)，細胞損傷不限于直接損傷，包括對細胞結(jié)構(gòu)和功能的各種類別的損害，例如DNA切割、堿基二聚體形成、染色體切割、細胞分裂機器受損和各種酶活性降低。本文所用術(shù)語“細胞毒性活性”是指引起上述細胞損傷的活性。本文所用術(shù)語“含有死亡結(jié)構(gòu)域的受體”(其包括Fas、TNFRI、DR3、DR4、DR5和DR6，但不限于此)是指胞內(nèi)域中具有凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)(稱為“死亡結(jié)構(gòu)域”)的受體分子，其與果蠅自殺基因reaper顯示同源性。本文所用術(shù)語“抗體的功能性片段”是指具有抗原結(jié)合活性的抗體的部分片段，包括Fab、F(ab’)2、scFv等。術(shù)語還包括Fab’，其是通過在還原條件下處理F(ab’)2而得到的抗體可變區(qū)中的單價片段。然而，該術(shù)語不限于這些分子，只要片段對抗原具有結(jié)合親和力。此外，這些功能性片段不僅包括通過用合適的酶處理抗體蛋白質(zhì)的全長分子所得到的片段，而且還包括使用經(jīng)遺傳修飾的抗體基因在合適的宿主細胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。本文所用術(shù)語“Fab’”是指通過在上述還原條件下處理F(ab’)2所得到的抗體的可變區(qū)中的單價片段。然而，使用經(jīng)遺傳修飾的抗體基因產(chǎn)生的Fab’也包括在本發(fā)明的Fab’中。本文所用術(shù)語“單鏈可變片段抗體”按與單鏈Fv(scFv)相同的含義使用。本文所用術(shù)語“表位”是指特異性抗體與之結(jié)合的抗原的部分肽或部分三級結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法(例如免疫測定法)以及例如可采用下列方法，測定其為抗原的部分肽的表位。首先，產(chǎn)生抗原的各種各樣的部分結(jié)構(gòu)。在部分結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生中，可采用已知的寡肽合成技術(shù)。例如，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的遺傳重組技術(shù)，產(chǎn)生通過從C端或N端連續(xù)縮短抗原而得到的具有適當減短長度的一系列多肽。此后，檢查抗體針對這些多肽的反應(yīng)性，并大致確定識別位點。然后，合成具有較短長度的肽，用這些肽檢查反應(yīng)性，藉此可確定表位。此外，可通過X射線結(jié)構(gòu)分析，通過指定位于抗體附近的抗原的氨基酸殘基，來確定其為與特異性抗體結(jié)合的抗原的部分三級結(jié)構(gòu)的表位。本文所用術(shù)語“與相同表位結(jié)合的抗體”是指與共同表位結(jié)合的不同抗體。如果第二抗體與第一抗體與之結(jié)合的部分肽或部分三級結(jié)構(gòu)結(jié)合，則可確定第一抗體和第二抗體與相同表位結(jié)合。此外，通過證實第二抗體與第一抗體競爭結(jié)合抗原(即第二抗體抑制第一抗體與抗原的結(jié)合)，則可確定第一抗體和第二抗體與相同表位結(jié)合，即使未確定具體的表位序列或結(jié)構(gòu)。此外，當?shù)谝豢贵w和第二抗體與相同表位結(jié)合，第一抗體還具有特殊作用(例如細胞凋亡誘導(dǎo)活性)時，可以預(yù)期第二抗體也具有相同活性。本文所用術(shù)語“CDR”是指互補決定區(qū)(CDR)，已知抗體分子的每條重鏈和輕鏈具有3個互補決定區(qū)(CDR)。CDR亦稱為超變結(jié)構(gòu)域，且存在于抗體每條重鏈和輕鏈的可變區(qū)中。它是在其一級結(jié)構(gòu)中具有極高可變性的部位，在每條多肽重鏈和輕鏈的一級結(jié)構(gòu)中有3個單獨的CDR。在本說明書中，對于抗體的CDR，重鏈的CDR用自重鏈氨基酸序列的氨基末端側(cè)開始的CDRH1、CDRH2和CDRH3表示，輕鏈的CDR用自輕鏈氨基酸序列的氨基末端側(cè)開始的CDRL1、CDRL2和CDRL3表示。這些部位在三級結(jié)構(gòu)中彼此接近，并決定抗體與之結(jié)合的抗原的特異性。本文所用術(shù)語“第二抗體”是指與抗體分子特異性結(jié)合，從而與該抗體分子交聯(lián)的抗體。本文所用短語“在嚴格條件下進行雜交”是指其中在以下條件下進行雜交的過程：可通過在市售雜交溶液ExpressHybHybridizationSolution(Clontech，Inc.制造)中于68℃進行雜交，或者通過使用DNA固定在之上的濾器(filter)，在0.7-1.0MNaCl存在下于68℃進行雜交，接著使用0.1-2xSSC溶液(1xSSC溶液由150mMNaCl和15mM檸檬酸鈉組成)于68℃進行洗滌或在其等同條件下，在這樣的條件下實現(xiàn)鑒定。本文在描述“包括一個至幾個氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列”時所用術(shù)語“幾個氨基酸”是指選自2-10的任意數(shù)目的氨基酸殘基。更具體地講，當取代、缺失或添加10個以下氨基酸，5-6個以下氨基酸，或2-3個以下氨基酸時，使用“包括幾個氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列”的描述。例如，本文所用“具有包含SEQIDNO:34的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)”的描述按與“包含SEQIDNO:34的氨基酸殘基20-141的重鏈可變區(qū)序列”的描述相同的含義使用。此外，例如，“具有包含SEQIDNO:34的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列的重鏈”的描述按與“包含SEQIDNO:34的氨基酸殘基20-471的重鏈序列”的描述相同的含義使用。1.有關(guān)細胞凋亡相關(guān)基因本發(fā)明的抗體需要與特異性抗原結(jié)合，并通過抗原顯示細胞毒性活性。此外，必需選擇特異性地存在于腫瘤細胞中的抗原以防止正常細胞被殺死。這類抗原組的一個實例可包括腫瘤壞死因子(本說明書下文中亦稱為“TNF”)相關(guān)細胞凋亡誘導(dǎo)配體(本說明書下文中亦稱為“TRAIL”)受體組。TRAIL是蛋白質(zhì)TNF家族的成員，包括Fas配體和TNF-α(WileySR等，Immunity1995年12月；3(6):673-82)。這些蛋白質(zhì)是強的細胞凋亡誘導(dǎo)因子。這些TNF家族蛋白質(zhì)的受體的特征在于胞外域中富含半胱氨酸的重復(fù)序列。這些受體當中，作為Fas配體的受體的Fas和作為TNFα的受體的TNF受體I(本說明書下文中亦稱為“TNFRI”)在胞內(nèi)域內(nèi)具有凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的區(qū)域，稱為“死亡結(jié)構(gòu)域”，其是與果蠅自殺基因reaper顯示同源性的區(qū)域(Golstein，P.等(1995)Cell.81，185-186；以及White，K等(1994)Science264，677-683)，通稱為含有死亡結(jié)構(gòu)域的受體。已鑒定出TRAIL的5種受體，其中，2種受體(DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2))能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號，其它3種受體(DcR1(TRAIL-R3)、DcR2(TRAIL-R4)和護骨蛋白(OPG))不轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號。與Fas和TNFRI類似，DR4和DR5兩者在胞內(nèi)區(qū)段中包括死亡結(jié)構(gòu)域，并通過含有Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(本說明書下文中稱為“FADD”)和胱天蛋白酶8的途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號(ChaudharyPM等，Immunity1997年12月；7(6):813-20；以及SchneiderP等，Immunity1997年12月；7(6):821-30)。對于上述Fas、TNFRI、DR4或DR5，已知與這些分子的任一種結(jié)合并起激動劑作用的抗體顯示針對細胞表面上帶有該分子的細胞的凋亡誘導(dǎo)活性(JournalofCellularPhysiology，209:1221-1028(2006)；Leukemia，Apl；21(4):805-812(2007)；Blood，99:1666-1675(2002)；以及CellularImmunology，Jan；153(1):184-193(1994))。上述激動性抗體的藥理作用通過與第二抗體或效應(yīng)子細胞交聯(lián)而提高(JournalofImmunology，149:3166-3173(1992)；以及EuropeanJournalofImmunology，Oct；23(10):2676-2681(1993))。人DR5(死亡受體5)基因的核苷酸序列及其氨基酸序列在GenBank以GI:22547118(登錄號:NM_147187)登記。順便提一句，編碼具有在DR5的氨基酸序列中包括一個至幾個氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列并還具有相當于DR5的生物活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列也包括在術(shù)語“DR5基因的核苷酸序列”的含義內(nèi)。此外，具有在DR5的氨基酸序列中包括一個至幾個氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列并還具有相當于DR5的生物活性的蛋白質(zhì)也包括在術(shù)語“DR5”的含義內(nèi)。2.抗DR5抗體的產(chǎn)生可通過用DR5或選自DR5的氨基酸序列的任意多肽免疫動物，并按照通用程序收集和純化體內(nèi)產(chǎn)生的抗體，來獲得針對本發(fā)明的DR5的抗體。用作抗原的DR5的生物種類不限于人，動物可用來源于非人動物(例如小鼠或大鼠)的DR5免疫。在這種情況下，可通過檢查與所獲得的異源DR5和人DR5結(jié)合的抗體的交叉反應(yīng)性，選擇適用于人類疾病的抗體。此外，可按照已知方法(例如Kohler和Milstein，Nature，(1975)256，第495-497頁，Kennet，R.主編,MonoclonalAntibodies,第365-367頁，PlenumPress，N.Y.(1980))，通過使產(chǎn)生抗DR5抗體的產(chǎn)抗體細胞與骨髓瘤細胞融合以建立雜交瘤，來獲得單克隆抗體。順便提一句，可通過使宿主細胞表達DR5基因的遺傳工程，來獲得將用作抗原的DR5。具體地講，產(chǎn)生能夠表達DR5基因的載體，將所得載體轉(zhuǎn)染至宿主細胞以表達該基因，然后純化所表達的DR5。在下文中，將具體地描述獲得抗DR5抗體的方法。(1)抗原的制備用于產(chǎn)生抗DR5抗體的抗原的實例包括DR5、包含含有至少6個DR5的連續(xù)氨基酸的部分氨基酸序列的多肽，和通過向其中加入指定氨基酸序列或載體獲得的衍生物。DR5可直接從人腫瘤組織或腫瘤細胞中純化并使用。此外，可通過體外合成DR5或通過遺傳工程使宿主細胞產(chǎn)生DR5，來獲得DR5。就遺傳工程而言，具體地講，將DR5cDNA整合到能夠表達DR5cDNA的載體中，在含有轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的酶、底物和能量物質(zhì)的溶液中合成DR5，或者轉(zhuǎn)化另一種原核或真核宿主細胞以表達DR5，籍此可獲得抗原。此外，還可通過使DR5的胞外域(其是一種膜蛋白質(zhì))與抗體的恒定區(qū)連接而獲得的融合蛋白在合適的宿主-載體系統(tǒng)中表達，來獲得作為分泌蛋白的抗原?？赏ㄟ^例如所謂的PCR方法來獲得DR5cDNA，所述PCR方法使用含有DR5cDNA的cDNA文庫作為模板和特異性擴增DR5cDNA的引物進行聚合酶鏈式反應(yīng)(下文中稱為“PCR”)(參見Saiki，R.K.等，Science，(1988)239，第487-489頁)。至于用于多肽的體外合成的系統(tǒng)，可例示由RocheDiagnostics，Inc.制造的快速翻譯系統(tǒng)(RapidTranslationSystem,RTS)，但是不限于此。原核宿主細胞的實例包括大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。為了用靶基因轉(zhuǎn)化宿主細胞，使用含有復(fù)制子(即來源于與宿主相容的物種的復(fù)制起點)和調(diào)節(jié)序列的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主細胞。此外，載體優(yōu)選具有能夠賦予轉(zhuǎn)化細胞表型選擇性的序列。真核宿主細胞的實例包括脊椎動物細胞、昆蟲細胞和酵母細胞。作為脊椎動物細胞，常使用例如猿猴COS細胞(Gluzman,Y.,Cell,(1981)23,第175-182頁,ATCCCRL-1650)、鼠成纖維細胞NIH3T3(ATCC號.CRL-1658)和中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞；ATCC:CCL-61)的二氫葉酸還原酶缺陷型品系(Urlaub,G.和Chasin,L.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77,第4126-4220頁)等，然而，并不限于此?？砂凑胀ㄓ贸绦蚺囵B(yǎng)如此獲得的轉(zhuǎn)化體，并且通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，在胞內(nèi)或胞外產(chǎn)生目標多肽。用于培養(yǎng)的合適培養(yǎng)基可選自各種常用的培養(yǎng)基，這取決于所采用的宿主細胞。如果使用大腸桿菌，則可使用例如按需要補充抗生素(例如氨芐西林或IPMG)的LB培養(yǎng)基?？赏ㄟ^利用蛋白質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)的各種已知分離方法中的任一種，來分離并純化通過這類培養(yǎng)由轉(zhuǎn)化體在胞內(nèi)或胞外產(chǎn)生的重組蛋白。所述方法的具體實例包括用普通蛋白質(zhì)沉淀劑處理、超濾、各種類型的液相層析法例如分子篩層析法(凝膠過濾)、吸附層析法、離子交換層析法和親和層析法、透析及其組合。此外，可通過使6個組氨酸殘基的標簽與待表達的重組蛋白連接，用鎳親和柱有效地純化蛋白質(zhì)。或者，可通過使IgGFc區(qū)與待表達的重組蛋白連接，用A蛋白柱有效地純化蛋白質(zhì)。可通過聯(lián)合上述方法，以高收率和高純度容易地產(chǎn)生大量目標多肽。(2)抗DR5單克隆抗體的產(chǎn)生與DR5特異性結(jié)合的抗體的實例包括與DR5特異性結(jié)合的單克隆抗體，獲得所述抗體的方法如下所述。單克隆抗體的產(chǎn)生一般需要以下操作步驟：(a)純化待用作抗原的生物聚合物；(b)通過抗原注射對動物進行免疫，以制備產(chǎn)抗體的細胞，收集血液，測定其抗體效價，以確定何時摘除脾；(c)制備骨髓瘤細胞(下文中稱為“骨髓瘤“)；(d)使產(chǎn)抗體細胞與骨髓瘤融合；(e)篩選產(chǎn)生目標抗體的雜交瘤群；(f)雜交瘤分裂為單一細胞克隆(克隆形成)；(g)任選培養(yǎng)雜交瘤或飼養(yǎng)植入雜交瘤的動物以產(chǎn)生大量的單克隆抗體；(h)針對生物活性和結(jié)合特異性檢查如此產(chǎn)生的單克隆抗體，或針對作為標記的試劑的性質(zhì)測定所述抗體等。在下文中，根據(jù)上述步驟，將更詳細地描述產(chǎn)生單克隆抗體的方法，然而，方法不限于此，例如，可使用脾細胞和骨髓瘤以外的產(chǎn)抗體的細胞。(a)抗原的純化作為抗原，可以使用通過上述方法制備的DR5或其部分肽。此外，由表達DR5的重組細胞制備的膜級分或表達DR5的重組細胞本身，以及通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法化學(xué)合成的本發(fā)明蛋白質(zhì)的部分肽也可用作抗原。(b)產(chǎn)抗體細胞的制備將步驟(a)中獲得的抗原與佐劑(例如弗氏完全佐劑或不完全佐劑)或硫酸鉀鋁混合，使用所得混合物作為免疫原免疫實驗動物。作為實驗動物，可以使用用于已知雜交瘤產(chǎn)生方法的任何動物而無任何困難。具體地講，可以使用例如小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬等。然而，從可得到待與提取的產(chǎn)抗體細胞融合的骨髓瘤細胞的容易性而言，優(yōu)選使用小鼠或大鼠作為待免疫的動物。此外，待使用的小鼠或大鼠的品系沒有特別限制，在小鼠的情況下，可使用例如A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、RIII、SJL、SWR、WB和129等各種品系，在大鼠的情況下，可使用例如Wistar、Low、Lewis、Sprague、Dawley、ACI、BN、Fischer等。其中，考慮到與下述骨髓瘤細胞融合的相容性，在小鼠的情況下特別優(yōu)選BALB/c品系，在大鼠的情況下特別優(yōu)選Wistar和Low品系，作為待免疫的動物。此外，考慮到人和小鼠間的抗原同源性，還優(yōu)選使用生物功能降低以除去自身抗體的小鼠，即患自身免疫病的小鼠。小鼠或大鼠在免疫時的周齡優(yōu)選為5-12周齡，更優(yōu)選6-8周齡。為了用DR5或其重組蛋白免疫動物，可采用例如詳細描述于以下文獻的已知方法：例如Weir,D.M.,HandbookofExperimentalImmunology第I.II.III.卷,BlackwellScientificPublications,Oxford(1987)；Kabat,E.A.和Mayer,M.M.,ExperimentalImmunochemistry,CharlesCThomasPublisherSpringfield,Illinois(1964)等。從免疫動物中無菌地取出包括產(chǎn)抗體細胞的脾細胞或淋巴細胞。此時，測量抗體效價，如果抗體效價充分提高的動物用作產(chǎn)抗體細胞的供應(yīng)源，則可更有效地進行后續(xù)程序。測量待用于本文的抗體效價的方法的實例包括RIA方法和ELISA方法，但方法不限于此?？砂凑找阎椒?，將產(chǎn)抗體的細胞從免疫動物的脾細胞或淋巴細胞中進行分離(例如Kohler等，Nature(1975)，256，第495頁；Kohler等,Eur.J.Immunol.(1977)，6，第511頁；Milstein等，Nature(1977)，266，第550頁；Walsh，Nature(1977)，266，第495頁)。(c)骨髓瘤細胞(下文中稱為“骨髓瘤“)用于細胞融合的骨髓瘤細胞沒有特別限制，合適的細胞可選自已知的細胞系。然而，考慮到當雜交瘤選自融合細胞時的方便性，優(yōu)選使用其選擇程序已確立的HGPRT(次黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶)缺陷型品系。更具體地講，HGPRT缺陷型品系的實例包括來源于小鼠的X63-Ag8(X63)、NS1-ANS/1(NS1)、P3X63-Ag8.U1(P3U1)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、F0、S149/5XXO和BU.1；來源于大鼠的210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)；以及來源于人的U266AR(SKO-007)、GM1500·GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)和8226AR/NIP4-1(NP41)。(d)細胞融合可按照已知方法(Weir,D.M.HandbookofExperimentalImmunology第I.II.III.卷,BlackwellScientificPublications,Oxford(1987)；Kabat,E.A.和Mayer,M.M.,ExperimentalImmunochemistry,CharlesCThomasPublisher,Spigfield,Illinois(1964)等)，在使得細胞的存活率不過度降低的條件下，合適地進行產(chǎn)抗體細胞與骨髓瘤細胞間的融合。作為這類方法，可以采用例如其中產(chǎn)抗體細胞和骨髓瘤細胞在含有高濃度聚合物(例如聚乙二醇)的溶液中混合的化學(xué)方法、使用電刺激的物理方法等。(e)雜交瘤群的選擇選擇通過上述細胞融合獲得的雜交瘤的方法沒有特別限制。通常采用HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)選擇方法(Kohler等，Nature(1975)，256，第495頁；Milstein等，Nature(1977)，266，第550頁)。當使用在氨基蝶呤存在下無法存活的HGPRT缺陷型品系的骨髓瘤細胞獲得雜交瘤時，該方法是有效的。就是說，通過在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)未融合的細胞和雜交瘤，僅選擇性地允許對氨基蝶呤有抗性的雜交瘤存活和增殖。(f)分裂成單個細胞克隆(克隆形成)作為雜交瘤的克隆方法，可采用已知方法例如甲基纖維素方法、軟瓊脂糖方法或有限稀釋方法(參見例如Barbara,B.M.和Stanley,M.S.:SelectedMethodsinCellularImmunology,W.H.FreemanandCompany,SanFrancisco(1980))。在這些方法中，特別優(yōu)選三維培養(yǎng)方法，例如甲基纖維素方法。例如，將通過細胞融合產(chǎn)生的雜交瘤群懸浮于甲基纖維素培養(yǎng)基例如ClonaCell-HY選擇培養(yǎng)基D(由StemCellTechnologies，inc.制造，#03804)中并培養(yǎng)。然后，收集所形成的雜交瘤集落，藉此可獲得單克隆雜交瘤。培養(yǎng)所收集的各個雜交瘤集落，選出在所獲得的雜交瘤培養(yǎng)上清液中證實具有穩(wěn)定抗體效價的雜交瘤作為產(chǎn)生DR5單克隆抗體的雜交瘤品系。由此確立的雜交瘤品系的實例包括DR5雜交瘤B273。順便提一句，在本說明書中，由雜交瘤B273產(chǎn)生的抗體稱為“B273抗體”或簡稱“B273”。B273抗體的重鏈具有序列表中SEQIDNO:8所示氨基酸序列。此外，B273抗體的輕鏈具有序列表中SEQIDNO:10所示氨基酸序列。順便提一句，在序列表的SEQIDNO:8所示重鏈氨基酸序列中，包含氨基酸殘基1-19的氨基酸序列是信號序列，包含氨基酸殘基20-141的氨基酸序列是可變區(qū)，而包含氨基酸殘基142-465的氨基酸序列是恒定區(qū)。此外，在序列表的SEQIDNO:10所示輕鏈氨基酸序列中，包含氨基酸殘基1-19的氨基酸序列是信號序列，包含氨基酸殘基20-133的氨基酸序列是可變區(qū)，而包含氨基酸殘基134-238的氨基酸序列是恒定區(qū)。序列表的SEQIDNO:8所示重鏈氨基酸序列由序列表的SEQIDNO:7所示核苷酸序列編碼。在序列表的SEQIDNO:7所示核苷酸序列中，包含核苷酸1-57的核苷酸序列編碼抗體的重鏈信號序列，包含核苷酸58-423的核苷酸序列編碼抗體的重鏈可變區(qū)，而包含核苷酸424-1395的核苷酸序列編碼抗體的重鏈恒定區(qū)。序列表的SEQIDNO:10所示輕鏈氨基酸序列由序列表的SEQIDNO:9所示核苷酸序列編碼。在序列表的SEQIDNO:9所示核苷酸序列中，包含核苷酸1-57的核苷酸序列編碼抗體的輕鏈信號序列，包含核苷酸58-399的核苷酸序列編碼抗體的輕鏈可變區(qū)，而包含核苷酸400-714的核苷酸序列編碼抗體的輕鏈恒定區(qū)。(g)通過培養(yǎng)雜交瘤制備單克隆抗體通過培養(yǎng)如此選出的雜交瘤，可有效地獲得單克隆抗體。然而，在培養(yǎng)前，優(yōu)選對產(chǎn)生目標單克隆抗體的雜交瘤進行篩選。在這類篩選中，可采用已知的方法?？赏ㄟ^例如上述(b)項中解釋的ELISA方法，進行本發(fā)明的抗體效價的測量。通過上述方法獲得的雜交瘤可以凍結(jié)態(tài)保存在液氮中或保存在-80℃以下的致冷器中。在完成克隆后，從HT培養(yǎng)基交換培養(yǎng)基至正常培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)雜交瘤。通過使用大培養(yǎng)瓶的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)或通過旋動培養(yǎng)進行大量培養(yǎng)。可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法(例如凝膠過濾)，從通過大量培養(yǎng)獲得的上清液中，通過純化獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的單克隆抗體。此外，將雜交瘤注射入與雜交瘤同一品系的小鼠(例如上述BALB/c)或Nu/Nu小鼠的腹腔中以使雜交瘤增殖，藉此可獲得含有大量本發(fā)明的單克隆抗體的腹水。在將雜交瘤給予腹腔內(nèi)的情況下，如果在給予雜交瘤前(3-7天前)給予礦物油例如2,6,10,14-四甲基十五烷(姥鮫烷)，則可獲得大量腹水。例如，事先將免疫抑制藥注射入與雜交瘤相同品系的小鼠腹腔以使T細胞失活。此后20天，將106-107個雜交瘤克隆細胞懸浮于無血清培養(yǎng)基(0.5ml)中，將懸液注射入小鼠腹腔。通常在腹部膨脹并充滿腹水時，從小鼠中收集腹水。通過該方法，可以獲得濃度是培養(yǎng)液濃度約100倍以上的單克隆抗體。通過上述方法獲得的單克隆抗體可通過描述于以下文獻的方法純化：例如Weir,D.M.:HandbookofExperimentalImmunology第I,II,III卷,BlackwellScientificPublications,Oxford(1978)。如此獲得的單克隆抗體對DR5具有高度抗原特異性。(h)單克隆抗體的測定可如下確定如此獲得的單克隆抗體的同種型和亞類。首先，鑒定方法的實例包括Ouchterlony方法、ELISA方法和RIA方法。Ouchterlony方法簡單，但是當單克隆抗體的濃度低時，需要濃縮操作。另一方面，當采用ELISA方法或RIA方法時，通過使培養(yǎng)上清液與抗原吸附固相直接反應(yīng)，并使用相當于免疫球蛋白同種型和亞類的各種類型的抗體作為第二抗體，便可鑒定出單克隆抗體的同種型和亞類。另外，作為較簡單方法，亦可使用市售鑒定試劑盒(例如由Bio-RadLaboratories，Inc.制造的MouseTyper試劑盒)等。此外，可通過FolinLowry方法和基于280nm處吸光度的計算方法[1.4(OD280)=免疫球蛋白1mg/ml]，來進行蛋白質(zhì)的定量測定。此外，即使當通過再次進行上述(2)的(a)-(h)步驟分別而獨立地獲得單克隆抗體，也有可能獲得具有相當于B273的細胞毒性活性的抗體。作為這類抗體的一個實例，可例示結(jié)合與B273抗體相同的表位的抗體。如果新產(chǎn)生的單克隆抗體與B273抗體與之結(jié)合的部分肽或部分三級結(jié)構(gòu)結(jié)合，則可確定單克隆抗體結(jié)合與B273抗體相同的表位。此外，通過證實單克隆抗體與B273抗體競爭結(jié)合DR5(即單克隆抗體抑制B273抗體和DR5之間的結(jié)合)，可以確定單克隆抗體結(jié)合與B273抗體相同的表位，即使具體的表位序列或結(jié)構(gòu)未確定。在單克隆抗體結(jié)合與B273抗體相同的表位的情況下，強有力地預(yù)期單克隆抗體具有相當于B273的細胞毒性活性。此外，如實施例4所示，可根據(jù)Fab片段與DR5間的復(fù)合物的X射線衍射數(shù)據(jù)，確定位于抗體Fab片段的DR5側(cè)附近的氨基酸殘基。具體地講，在來源于任意抗體的Fab片段位于序列表中SEQIDNO:23所示氨基酸序列的26位的甘氨酸殘基、34位的異亮氨酸殘基、36位的谷氨酸殘基、37位的天冬氨酸殘基、38位的甘氨酸殘基、56位的天冬氨酸殘基、57位的亮氨酸殘基、58位的亮氨酸殘基、59位的苯丙氨酸殘基、61位的亮氨酸殘基和62位的精氨酸殘基的附近4?以下距離的情況下，可以確定該抗體對與B273相同的表位具有特異性。(3)其它抗體本發(fā)明的抗體不僅包括上述針對DR5的單克隆抗體，而且還包括出于降低在人中的異源抗原性的目的而通過人工修飾獲得的重組抗體，例如嵌合抗體、人源化抗體和人抗體。這些抗體可采用已知方法產(chǎn)生。作為嵌合抗體，其中抗體可變區(qū)和恒定區(qū)來源于不同物種的抗體，例如，可例示其中小鼠來源或大鼠來源的抗體可變區(qū)與人來源的恒定區(qū)連接的嵌合抗體(參見Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,6851-6855,(1984))。來源于小鼠抗人DR5抗體B273的嵌合抗體是包含以下重鏈和輕鏈及可具有任意恒定區(qū)的抗體：所述重鏈含有具有包含SEQIDNO:20的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述輕鏈含有具有包含SEQIDNO:16的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。作為這類嵌合抗體的一個實例，可例示包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含序列表中SEQIDNO:20的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:16的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列。順便提一句，在序列表的SEQIDNO:20所示重鏈序列中，包含氨基酸殘基1-19的氨基酸序列是信號序列，包含氨基酸殘基20-141的氨基酸序列是可變區(qū)，而包含氨基酸殘基142-471的氨基酸序列是恒定區(qū)。此外，在序列表的SEQIDNO:16所示輕鏈氨基酸序列中，包含氨基酸殘基1-20的氨基酸序列是信號序列，包含氨基酸殘基21-134的氨基酸序列是可變區(qū)，而包含氨基酸殘基135-239的氨基酸序列是恒定區(qū)。序列表的SEQIDNO:20所示重鏈氨基酸序列由序列表的SEQIDNO:19所示核苷酸序列編碼。在序列表的SEQIDNO:19所示核苷酸序列中，包含核苷酸1-57的核苷酸序列編碼抗體的重鏈信號序列，包含核苷酸58-423的核苷酸序列編碼抗體的重鏈可變區(qū)，而包含核苷酸424-1413的核苷酸序列編碼抗體的重鏈恒定區(qū)。序列表的SEQIDNO:16所示輕鏈氨基酸序列由序列表的SEQIDNO:15所示核苷酸序列編碼。在序列表的SEQIDNO:15所示核苷酸序列中，包含核苷酸1-60的核苷酸序列編碼抗體的輕鏈信號序列，包含核苷酸61-402的核苷酸序列編碼抗體的輕鏈可變區(qū)，而包含核苷酸403-717的核苷酸序列編碼抗體的輕鏈恒定區(qū)。作為人源化抗體，可例示以下抗體：通過僅將互補決定區(qū)(CDR)整合至人來源的抗體所獲得的抗體(參見Nature(1986)321，第522-525頁)和通過將構(gòu)架的氨基酸殘基的部分以及CDR序列通過CDR移植方法(WO90/07861)移植到人抗體所獲得的抗體。然而，來源于B273抗體的人源化抗體不限于特定的人源化抗體，只要人源化抗體具有B273的CDR序列的所有6種類型，并且具有在細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡的活性。順便提一句，B273抗體的重鏈可變區(qū)具有由序列表的SEQIDNO:82所示氨基酸序列組成的CDRH1(GYFMN)、由SEQIDNO:83所示氨基酸序列組成的CDRH2(RFNPYNGDTFYNQKFKG)和由SEQIDNO:84所示氨基酸序列組成的CDRH3(SAYYFDSGGYFDY)。此外，B273抗體的輕鏈可變區(qū)具有由序列表的SEQIDNO:79所示氨基酸序列組成的CDRL1(RSSQSLVHSNGNTYLH)、由SEQIDNO:80所示氨基酸序列組成的CDRL2(KVSNRFS)和由SEQIDNO:81所示氨基酸序列組成的CDRL3(SQSTHVPWT)。此外，在上述CDR之一中包括一至幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加的序列可用作CDR序列，來源于B273抗體的CDR修飾抗體具有此序列。在CDRL1中包括一個氨基酸殘基取代的序列的實例包括由序列表的SEQIDNO:85所示氨基酸序列組成的序列(RSSQSLVHSNENTYLH)、由SEQIDNO:86所示氨基酸序列組成的序列(RSSQSLVHSNFNTYLH)、由SEQIDNO:87所示氨基酸序列組成的序列(RSSQSLVHSNKNTYLH)和由SEQIDNO:88所示氨基酸序列組成的序列(RSSQSLVHSNLNTYLH)。此外，在CDRH2中包括一個氨基酸殘基取代的序列的實例包括由SEQIDNO:89所示氨基酸序列組成的序列(RFNPYNEDTFYNQKFKG)。一般來講，通過天冬酰胺和C末端側(cè)的鄰接氨基酸之間形成環(huán)狀琥珀酰亞胺過渡態(tài)而對蛋白質(zhì)中的天冬酰胺進行脫酰胺作用(Geiger,T.和Clarke,S.(1987)Deamidation,Isomerization,andracemizationatasparaginylandaspartylresiduesinpeptides.Succinimide-linkedreactionsthatcontributetoproteindegradation(肽中天冬酰胺酰和天冬氨酰殘基處的脫酰胺、異構(gòu)化和外消旋化。造成蛋白質(zhì)降解的琥珀酰亞胺連接反應(yīng)).J.Biol.Chem.262,785-794)。環(huán)狀琥珀酰亞胺過渡態(tài)形成的限速因素是鄰接氨基酸側(cè)鏈的大小，因此，具有最小側(cè)鏈的甘氨酸可達到最快的脫酰胺速率。另一方面，通過用具有大側(cè)鏈的氨基酸取代C末端側(cè)的鄰接基團，可抑制脫酰胺速率。B273抗體在CDRL1和CDRH2中具有對脫酰胺敏感的-N-G-(天冬酰胺-甘氨酸)序列。因此，本發(fā)明人制備了點突變體，其中鄰接基團由甘氨酸變?yōu)橘嚢彼帷⒈奖彼?、亮氨酸或谷氨酸，其每一個都具有比甘氨酸大的側(cè)鏈。就是說，在CDRH2中，-N-G-(天冬酰胺-甘氨酸)序列突變?yōu)?N-E-(天冬酰胺-谷氨酸)序列，在CDRL1中，-N-G-(天冬酰胺-甘氨酸)序列突變?yōu)?N-L-(天冬酰胺-亮氨酸)序列、-N-F-(天冬酰胺-苯丙氨酸)序列、-N-K-(天冬酰胺-賴氨酸)序列或-N-E-(天冬酰胺-谷氨酸)序列，藉此抑制抗體脫酰胺。作為具有上述CDR的抗體的一個實例，可例示以下抗體：含有以下重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體：所述重鏈可變區(qū)具有由序列表的SEQIDNO:82所示氨基酸序列組成的CDRH1、由SEQIDNO:83所示氨基酸序列組成的CDRH2和由SEQIDNO:84所示氨基酸序列組成的CDRH3，和所述輕鏈可變區(qū)具有由序列表的SEQIDNO:79所示氨基酸序列組成的CDRL1、由SEQIDNO:80所示氨基酸序列組成的CDRL2和由SEQIDNO:81所示氨基酸序列組成的CDRL3；含有以下重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體：所述重鏈可變區(qū)具有由序列表的SEQIDNO:82所示氨基酸序列組成的CDRH1、由SEQIDNO:89所示氨基酸序列組成的CDRH2和由SEQIDNO:84所示氨基酸序列組成的CDRH3，和所述輕鏈可變區(qū)具有由序列表的SEQIDNO:85所示氨基酸序列組成的CDRL1、由SEQIDNO:80所示氨基酸序列組成的CDRL2和由SEQIDNO:81所示氨基酸序列組成的CDRL3；含有以下重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體：所述重鏈可變區(qū)具有由序列表的SEQIDNO:82所示氨基酸序列組成的CDRH1、由SEQIDNO:89所示氨基酸序列組成的CDRH2和由SEQIDNO:84所示氨基酸序列組成的CDRH3，和所述輕鏈可變區(qū)具有由序列表的SEQIDNO:86所示氨基酸序列組成的CDRL1、由SEQIDNO:80所示氨基酸序列組成的CDRL2和由SEQIDNO:81所示氨基酸序列組成的CDRL3；含有以下重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體：所述重鏈可變區(qū)具有由序列表的SEQIDNO:82所示氨基酸序列組成的CDRH1、由SEQIDNO:89所示氨基酸序列組成的CDRH2和由SEQIDNO:84所示氨基酸序列組成的CDRH3，和所述輕鏈可變區(qū)具有由序列表的SEQIDNO:87所示氨基酸序列組成的CDRL1、由SEQIDNO:80所示氨基酸序列組成的CDRL2和由SEQIDNO:81所示氨基酸序列組成的CDRL3；含有以下重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體：所述重鏈可變區(qū)具有由序列表的SEQIDNO:82所示氨基酸序列組成的CDRH1、由SEQIDNO:89所示氨基酸序列組成的CDRH2和由SEQIDNO:84所示氨基酸序列組成的CDRH3，和所述輕鏈可變區(qū)具有由序列表的SEQIDNO:88所示氨基酸序列組成的CDRL1、由SEQIDNO:80所示氨基酸序列組成的CDRL2和由SEQIDNO:81所示氨基酸序列組成的CDRL3。作為小鼠抗體B273(包括CDR修飾抗體)的人源化抗體的一個實例，可例示含有包含以下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的重鏈與含有包含以下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的輕鏈的任意組合，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含序列表的SEQIDNO:34、36、38、40、42、44、46、48、50和70的任一個的氨基酸殘基20-141，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQIDNO:28、30、32、52、58、62和66的任一個的氨基酸殘基21-134。作為優(yōu)選的組合，可例示下列抗體：其特征在于含有包含SEQIDNO:34的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:34的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:30的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:34的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:32的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:36的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:36的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:30的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:36的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:32的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:38的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:38的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:30的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:38的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:32的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:40的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:42的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:44的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:46的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:48的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:50的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:70的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:52的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:70的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:58的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:70的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:62的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；及其特征在于含有包含SEQIDNO:70的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:66的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體。作為更優(yōu)選的組合，可例示下列抗體：包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:34的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:34的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:30的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:34的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:32的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:36的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:36的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:30的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:36的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:32的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:38的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:38的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:30的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:38的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:32的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:40的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:42的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:44的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:46的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:48的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:50的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:70的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:52的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:70的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:58的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:70的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:62的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；及包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:70的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:66的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列。作為進一步更優(yōu)選的組合，可例示下列抗體：其特征在于含有包含SEQIDNO:42的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:70的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:52的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:70的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:58的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；其特征在于含有包含SEQIDNO:70的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:62的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；以及其特征在于含有包含SEQIDNO:70的氨基酸殘基20-141的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:66的氨基酸殘基21-134的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體。作為最優(yōu)選的組合，可例示下列抗體：包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:42的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:28的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:70的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:52的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:70的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:58的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:70的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:62的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列；以及包含以下重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQIDNO:70的氨基酸殘基20-471的氨基酸序列和所述輕鏈具有包含SEQIDNO:66的氨基酸殘基21-239的氨基酸序列。通過使與上述重鏈氨基酸序列具有高度同源性的序列同與上述輕鏈氨基酸序列具有高度同源性的序列組合，可能選出具有相當于上述抗體每一種的細胞毒性活性的抗體。同源性一般為80%以上同源性，優(yōu)選90%以上同源性，更優(yōu)選95%以上同源性，最優(yōu)選99%以上同源性。此外，通過在重鏈或輕鏈氨基酸序列包括一至幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加的氨基酸序列組合，也可能選出具有相當于上述抗體每一種的細胞毒性活性的抗體。待取代、缺失或添加的氨基酸殘基的數(shù)目一般為10個以下，優(yōu)選5-6個以下，更優(yōu)選2-3個以下，最優(yōu)選1個?？蓱?yīng)用具有默認參數(shù)的Blast算法2.2.2版(Altschul,StephenF.,ThomasL.Madden,AlejandroA.Sch?ffer,JinghuiZhang,ZhengZhang,WebbMiller和DavidJ.Lipman(1997),“GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms(空位化BLAST和PSI-BLAST：新一代的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索程序)”,NucleicAcidsRes.25:3389-3402)，測定兩個氨基酸序列之間的同源性。還可通過訪問網(wǎng)址www.ncbi.nlm.nih.gov/blast通過互聯(lián)網(wǎng)來應(yīng)用Blast算法。順便提一句，通過Blast算法計算兩種類型的同一性(identity/identities)和確定性(positivity/positivities)的百分比值。前者是在待測定其同源性程度的兩個氨基酸序列中氨基酸殘基彼此匹配時的值，后者是還要考慮具有類似化學(xué)結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基獲得的值。在本說明書中，當氨基酸殘基彼此匹配時同一性的值用作同源性值。順便提一句，在序列表的SEQIDNO:34、36、38、40、42、44、46、48、50或70所示的重鏈氨基酸序列中，由氨基酸殘基1-19組成的氨基酸序列是信號序列，由氨基酸殘基20-141組成的氨基酸序列是可變區(qū)，由氨基酸殘基142-471組成的氨基酸序列是恒定區(qū)。此外，在序列表的SEQIDNO:28、30、32、52、58、62或66所示輕鏈氨基酸序列中，由氨基酸殘基1-20組成的氨基酸序列是信號序列，由氨基酸殘基21-134組成的氨基酸序列是可變區(qū)，由氨基酸殘基135-239組成的氨基酸序列是恒定區(qū)。序列表的SEQIDNO:34、36、38、40、42、44、46、48、50或70所示的重鏈氨基酸序列由序列表的SEQIDNO:33、35、37、39、41、43、45、47、49或69所示核苷酸序列編碼。在上述核苷酸序列的每一個中，由核苷酸1-57組成的核苷酸序列編碼抗體的重鏈信號序列，由核苷酸58-423組成的核苷酸序列編碼抗體的重鏈可變區(qū)，由核苷酸424-1413組成的核苷酸序列編碼抗體的重鏈恒定區(qū)。序列表的SEQIDNO:28、30、32、52、58、62或66所示輕鏈氨基酸序列由序列表的SEQIDNO:27、29、31、51、57、61或65所示核苷酸序列編碼。在上述核苷酸序列的每一個中，由核苷酸1-60組成的核苷酸序列編碼抗體的輕鏈信號序列，由核苷酸61-402組成的核苷酸序列編碼抗體的輕鏈可變區(qū)，由核苷酸403-717組成的核苷酸序列編碼抗體的輕鏈恒定區(qū)。這些核苷酸序列中的任一個與另一抗體的核苷酸序列之間的同源性也可應(yīng)用Blast算法確定。此外，本發(fā)明的抗體包括結(jié)合與B273抗體相同的表位的人抗體。人抗DR5抗體是指只具有來源于人染色體的抗體的基因序列的人抗體?？赏ㄟ^采用具有含有人抗體的重鏈和輕鏈基因的人染色體片段的產(chǎn)生人抗體的小鼠的方法，來獲得人抗DR5抗體(參見Tomizuka,K.等,NatureGenetics(1997)16,第133-143頁；Kuroiwa,Y.等,Nucl.AcidsRes.(1998)26,第3447-3448頁；Yoshida,H.等,AnimalCellTechnology:BasicandAppliedAspects第10卷,第69-73頁(Kitagawa,Y.,Matsuda,T.andIijima,S.主編),KluwerAcademicPublishers,1999；Tomizuka,K.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,第722-727頁等)?？删唧w如下產(chǎn)生這類產(chǎn)生人抗體的小鼠。通過產(chǎn)生敲除動物和轉(zhuǎn)基因動物并使這些動物交配，來產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的動物，其中內(nèi)源免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因基因座遭破壞，取而代之的是，通過酵母人工染色體(YAC)載體等引入人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因基因座。此外，按照遺傳工程技術(shù)，通過使用分別編碼人抗體的這類重鏈和輕鏈的cDNA和優(yōu)選含有所述cDNA的載體，使真核細胞轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)產(chǎn)生重組人單克隆抗體的轉(zhuǎn)化體，藉此還可從培養(yǎng)上清液中獲得抗體。在此，作為宿主，可以使用例如真核細胞，優(yōu)選哺乳動物細胞例如CHO細胞、淋巴細胞或骨髓瘤細胞。此外，亦已知獲取自人抗體文庫篩選的噬菌體展示來源的人抗體的方法(參見Wormstone,I.M.等,InvestigativeOphthalmology&VisualScience.(2002)43(7),第2301-2308頁；Carmen,S.等,BriefingsinFunctionalGenomicsandProteomics(2002),1(2),第189-203頁；Siriwardena,D.等,Ophthalmology(2002)109(3),第427-431頁等)。例如，可采用這樣的噬菌體展示方法，其中人抗體的可變區(qū)在噬菌體表面表達作為單鏈抗體(scFv)，并選出與抗原結(jié)合的噬菌體(NatureBiotechnology(2005),23,(9),第1105-1116頁)。通過分析根據(jù)與抗原結(jié)合選出的噬菌體的基因，可確定編碼與抗原結(jié)合的人抗體的可變區(qū)的DNA序列。如果測定出與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列，則可通過制備具有該序列的表達載體并將載體導(dǎo)入合適的宿主以使其表達來獲得人抗體(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol.(1994)12,第433-455頁、NatureBiotechnology(2005)23(9),第1105-1116頁)。如果新產(chǎn)生的人抗體結(jié)合B273抗體與之結(jié)合的部分肽或部分三級結(jié)構(gòu)，則可確定所述人抗體和B273抗體與相同表位結(jié)合。此外，通過證實人抗體與B273抗體競爭結(jié)合DR5(即人抗體抑制B273抗體與DR5間的結(jié)合)，可以確定人抗體和B273抗體與相同表位結(jié)合，即使具體的表位序列或結(jié)構(gòu)未確定。當證實人抗體和B273抗體與相同表位結(jié)合時，強有力地預(yù)期人抗體具有相當于B273的細胞毒性活性。此外，如實施例4所示，可根據(jù)Fab片段與DR5間的復(fù)合物的X射線衍射數(shù)據(jù)，確定位于抗體Fab片段附近的DR5側(cè)的氨基酸殘基。具體地講，在其中來源于任意抗體的Fab片段位于序列表的SEQIDNO:23所示氨基酸序列的26位的甘氨酸殘基、34位的異亮氨酸殘基、36位的谷氨酸殘基、37位的天冬氨酸殘基、38位的甘氨酸殘基、56位的天冬氨酸殘基、57位的亮氨酸殘基、58位的亮氨酸殘基、59位的苯丙氨酸殘基、61位的亮氨酸殘基和62位的精氨酸殘基的附近(為4?以下距離)的情況下，可以確定該抗體結(jié)合與B273相同的表位。通過實施例3所示的已知方法等，針對與抗原結(jié)合的性質(zhì)，對通過上述方法獲得的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體進行評價，可選出優(yōu)選的抗體。作為用于比較抗體性質(zhì)的另一個指標的一個實例，可例示抗體穩(wěn)定性。實施例10中所示的示差掃描量熱法(DSC)是一種能夠快速準確地測量熱變性中點溫度(Tm)(用作蛋白質(zhì)的相對構(gòu)象穩(wěn)定性的有利指標)的裝置?？赏ㄟ^采用DSC測量Tm值并對所述值進行比較，來比較熱穩(wěn)定性的差異。已知抗體的貯存穩(wěn)定性顯示與抗體的熱穩(wěn)定性有某種相關(guān)性(LoriBurton等,PharmaceuticalDevelopmentandTechnology(2007)12,第265-273頁)，可使用熱穩(wěn)定性作為指標選擇優(yōu)選的抗體。用于選擇抗體的其它指標的實例包括下列因素：在合適宿主細胞中的產(chǎn)量高，且在水溶液中的聚集性低。例如，顯示最高產(chǎn)量的抗體并不總是顯示最高的熱穩(wěn)定性，因此，必需根據(jù)上述指標進行全面評價來選擇最適于給予人的抗體。此外，其中抗體的全長重鏈和輕鏈序列使用合適的接頭連接，由此獲得單鏈免疫球蛋白的方法也是已知的(Lee，H-S等，MolecularImmunology(1999)36，第61-71頁；Shirrmann，T.等，mAbs(2010)，2，(1)第1-4頁)。通過使這類單鏈免疫球蛋白二聚化，所得二聚體可具有與本身是四聚體的抗體類似的結(jié)構(gòu)和活性。此外，本發(fā)明的抗體可以是具有單一重鏈可變區(qū)且沒有輕鏈序列的抗體。這類抗體稱為單域抗體(sdAb)或納米抗體(nanobody)，實際上，在駱駝和美洲駝中觀察到這類抗體，據(jù)報道這類抗體具有抗原結(jié)合親和力(MuyldemansS.等，ProteinEng.(1994)7(9)，1129-35，Hamers-CastermanC.等，Nature(1993)363(6428)446-8)。本發(fā)明的抗體包括上述抗體。此外，通過控制其中聚糖與本發(fā)明的抗體結(jié)合的糖基化，可能提高抗體依賴性細胞毒性活性。作為用于控制抗體的糖基化的技術(shù)，WO99/54342、WO00/61739、WO02/31140等是已知的。然而，不限于此。在其中通過先分離抗體基因然后將基因?qū)牒线m宿主中來產(chǎn)生抗體的情況下，可使用合適宿主和合適表達載體的組合。抗體基因的具體實例包括編碼本說明書所述抗體的重鏈序列的基因及編碼其輕鏈序列的基因的組合。當宿主細胞被轉(zhuǎn)化時，可能將重鏈序列基因和輕鏈序列基因插入相同的表達載體，也可能分別插入不同的表達載體。在其中真核細胞用作宿主的情況下，可以使用動物細胞、植物細胞和真核微生物。作為動物細胞，可例示下列細胞：(1)哺乳動物細胞，例如猿猴COS細胞(Gluzman，Y.，Cell，(1981)23，第175-182頁，ATCCCRL-1650)、鼠成纖維細胞NIH3T3(ATCC號.CRL-1658)和中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞；ATCC:CCL-61)的二氫葉酸還原酶缺陷型品系(Urlaub,G.和Chasin,L.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77,第4126-4220頁)。此外，在其中使用原核細胞的情況下，可例示例如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌?？赏ㄟ^經(jīng)轉(zhuǎn)化將目標抗體基因?qū)脒@些細胞，體外培養(yǎng)如此轉(zhuǎn)化的細胞，獲得抗體。在上述培養(yǎng)方法中，產(chǎn)量有時可根據(jù)抗體的序列而變化，因此，可能通過使用產(chǎn)量作為指標，在具有相當?shù)慕Y(jié)合活性的抗體中選出容易產(chǎn)生作為藥物的抗體。對本發(fā)明抗體的同種型沒有限制，其實例包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD和IgE，其優(yōu)選的實例包括IgG和IgM，其還更優(yōu)選的實例包括IgG1和IgG2。此外，本發(fā)明的抗體可以是具有抗體的抗原結(jié)合部位或其修飾片段的抗體的功能性片段?？赏ㄟ^用蛋白酶例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體，或按照遺傳工程技術(shù)修飾抗體基因并在合適的培養(yǎng)細胞中表達修飾基因，來獲得抗體的片段。在這些抗體片段當中，具有抗體全長分子的全部或部分功能的片段可稱為抗體的功能性片段。作為抗體的功能，一般可例示抗原結(jié)合活性、中和抗原活性的活性、提高抗原活性的活性、抗體依賴性細胞毒性活性、補體依賴性細胞毒性活性和補體依賴性細胞細胞毒性活性。本發(fā)明抗體的功能性片段的功能是與DR5結(jié)合的活性，優(yōu)選在細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡的活性，更優(yōu)選通過在癌細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡的細胞毒性活性。然而，本發(fā)明的抗體可具有抗體依賴性細胞毒性活性、補體依賴性細胞毒性活性和/或補體依賴性細胞細胞毒性活性以及在細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡的活性?？贵w片段的實例包括Fab、F(ab’)2、Fv、其中重鏈和輕鏈的Fv分子通過合適的接頭連接的單鏈Fv(scFv)、雙鏈抗體(diabody/diabodies)、線性抗體和由抗體片段組成的多特異性抗體。此外，作為通過在還原條件下處理F(ab’)2獲得的抗體可變區(qū)中的單價片段的Fab’也包括在抗體的片段中。此外，本發(fā)明的抗體可以是具有針對至少兩種不同抗原的特異性的多特異性抗體。通常這類分子與兩種抗原結(jié)合(即雙特異性抗體)，然而，本文所用術(shù)語“多特異性抗體”包括對兩種或更多種(例如3種)抗原具有特異性的抗體。本發(fā)明的多特異性抗體可以是全長抗體或這類抗體的片段(例如F(ab’)2雙特異性抗體)。雙特異性抗體可通過連接兩種類型的抗體的重鏈和輕鏈(HL對)而產(chǎn)生，或也可通過產(chǎn)生不同單克隆抗體以制備產(chǎn)生雙特異性抗體的融合細胞的融合雜交瘤來產(chǎn)生(Millstein等，Nature(1983)305，第537-539頁)。本發(fā)明的抗體可以是單鏈抗體(亦稱scFv)。單鏈抗體可通過經(jīng)由多肽接頭而連接抗體的重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)來獲得(Pluckthun,ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,113(Rosenburg和Moore主編),SpringerVerlag,NewYork,第269-315頁(1994),NatureBiotechnology(2005),23,第1126-1136頁)。此外，通過經(jīng)由多肽接頭而連接兩個scFv分子產(chǎn)生的BiscFv片段也可用作雙特異性抗體。產(chǎn)生單鏈抗體的方法是該技術(shù)領(lǐng)域已知的(參見例如美國專利號4,946,778、5,260,203、5,091,513、5,455,030等)。在這種scFv中，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過不形成綴合物的接頭，優(yōu)選通過多肽接頭連接(Huston,J.S.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988),85,第5879-5883頁)。在該scFv中，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)可來源于相同抗體或不同抗體。作為用于連接可變區(qū)的多肽接頭，使用例如由12-19個殘基組成的指定的單鏈肽?？扇缦芦@得編碼scFv的DNA：使用編碼DNA(選自編碼上述抗體的重鏈或重鏈可變區(qū)的DNA)的整個氨基酸序列或所需部分氨基酸序列的DNA和編碼輕鏈或其輕鏈可變區(qū)的DNA作為模板，通過使用規(guī)定其兩個末端的引物對，通過PCR方法進行擴增，并且通過使編碼多肽接頭部分的DNA與規(guī)定其兩個末端的引物對組合，使得兩個末端分別與重鏈和輕鏈連接，進行進一步擴增。此外，一旦產(chǎn)生編碼scFv的DNA，則可按照通用程序，獲得含有所述DNA的表達載體和由表達載體轉(zhuǎn)化的宿主。此外，可按照通用程序，通過使用所得宿主，來獲得scFv。按與上述相同的方式，可通過獲得基因并表達基因，以在宿主中產(chǎn)生其抗體片段?？墒贡景l(fā)明的抗體多聚化以提高其對抗原的親和力。待多聚化的抗體可為一種抗體類型或識別相同抗原的多個表位的多種抗體。作為抗體多聚化的方法，可例示IgGCH3結(jié)構(gòu)域與兩個scFv分子結(jié)合、與鏈霉抗生物素結(jié)合、螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序的引入等。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體，其是具有不同氨基酸序列的多種抗DR5抗體類型的混合物。作為多克隆抗體的一個實例，可例示具有不同CDR的多種抗體類型的混合物。作為這類多克隆抗體，可以使用如下得到的抗體：通過培養(yǎng)產(chǎn)生不同抗體的細胞的混合物，然后從所得培養(yǎng)物中純化抗體(參見WO2004/061104)。作為修飾抗體，還可以使用與任何類型的分子(例如聚乙二醇(PEG))結(jié)合的抗體。此外，本發(fā)明的抗體可以是這些抗體的任一種與另一種藥劑之間形成的綴合物的形式(免疫綴合物)。這類抗體的實例包括其中抗體與具有藥理作用的放射性物質(zhì)或化合物綴合的抗體(NatureBiotechnology(2005)23，第1137-1146頁)?？蓪⑺每贵w純化至同質(zhì)性?？贵w的分離和純化可采用常規(guī)蛋白質(zhì)分離和純化方法進行。例如，可通過適當選擇并結(jié)合柱層析法、過濾器過濾、超濾、鹽沉淀、透析、制備型聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點聚焦電泳等(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual,DanielR.Marshak等主編,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1996);Antibodies:ALaboratoryManual.EdHarlowandDavidLane,ColdSpringHarborLaboratory(1988))，來分離并純化抗體，但方法不限于這些。這類層析法的實例包括親和層析法、離子交換層析法、疏水層析法、凝膠過濾層析法、反相層析法和吸附層析法。可采用液相層析法例如HPLC或FPLC，進行這類層析法。作為待用于親和層析法的柱，可例示A蛋白柱和G蛋白柱。例如，作為使用A蛋白柱的柱，可例示HyperD、POROS、SepharoseFF(Pharmacia)等。此外，亦可通過使用抗原固定在其上的載體，利用抗體對抗原的結(jié)合性質(zhì)，來純化抗體。(4)其它抗DR5抗體的具體實例在表達DR5的細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡的抗DR5抗體描述于例如WO98/51793、WO2001/83560、WO2002/94880、WO2003/54216、WO2006/83971和WO2007/22157。此外，稱為替加珠單抗(tigatuzumab)(CS-1008)、來沙木單抗(lexatumumab)(HGS-ETR2)、HGS-TR2J、drozitumab(APOMAB)、可那木單抗(AMG-655)和LBY135的抗DR5抗體正在臨床試驗中，或者過去曾經(jīng)臨床試驗。在本申請?zhí)峤蝗杖栽谂R床試驗中的抗DR5抗體為替加珠單抗、來沙木單抗和可那木單抗。與上述替加珠單抗、來沙木單抗、可那木單抗和drozitumab相比，本說明書中描述的新的抗DR5抗體具有優(yōu)異的體外和/或體內(nèi)抗腫瘤活性。3.含有抗DR5抗體的藥物通過上述“2.抗DR5抗體的產(chǎn)生”項中描述的方法獲得的抗體可用作藥物，特別是用于癌癥的治療劑和/或預(yù)防劑，因為抗體各自在體內(nèi)起細胞凋亡相關(guān)受體DR5的激動劑的作用，并通過受體誘導(dǎo)癌細胞的細胞凋亡以顯示細胞毒性活性。可通過測量其抑制過量表達細胞凋亡相關(guān)受體的細胞增殖中的活性，來確定抗體體外顯示的殺細胞活性。例如，培養(yǎng)過量表達DR5的癌細胞系，將不同濃度的抗體加入培養(yǎng)系統(tǒng)中，可測量針對病灶形成(focusformation)、集落形成和球狀體增殖的抑制活性?？赏ㄟ^例如將抗體給予植入過量表達DR5的腫瘤細胞系的裸小鼠，測量癌細胞的變化，來確定使用實驗動物的抗體對癌癥的體內(nèi)治療作用。癌癥類型的實例包括肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌、腎癌、子宮癌包括子宮內(nèi)膜癌、黑素細胞癌包括黑素瘤、纖維肉瘤、成膠質(zhì)細胞瘤和血細胞癌(例如白血病和淋巴瘤)，然而，癌癥的類型不限于此，只要待治療的癌細胞表達DR5。此外，已知針對DR5的抗體在炎性細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡(J.Clin.Invest.1996,98(2),271-278;Int.Immunol.1996,8(10),1595-1602)。因此，本發(fā)明的抗體還可用作自身免疫病或炎性疾病的治療劑。自身免疫病或炎性疾病的實例包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、橋本病(Hashimoto’sdisease)、類風濕性關(guān)節(jié)炎、移植物抗宿主病、斯耶格倫綜合征(Sjogren’ssyndrome)、惡性貧血、艾迪生病(Addison’sdisease)、硬皮病、古德帕斯徹綜合征(Goodpasture’ssyndrome)、克羅恩病(Crohn’sdisease)、自身免疫性溶血性貧血、不育、重癥肌無力、多發(fā)性硬化、巴塞多病(Basedow’sdisease)、血小板減少性紫癜、胰島素依賴性糖尿病、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、特應(yīng)性疾病、動脈硬化、心肌炎、心肌病、腎小球性腎炎、再生障礙性貧血和器官移植后排斥。待用于本發(fā)明的藥物組合物中可接受的制劑中的物質(zhì)優(yōu)選就劑量和濃度而言對被給予藥物組合物的人是無毒的。本發(fā)明的藥物組合物可含有用于藥物用途的物質(zhì)，所述物質(zhì)能夠改變或保持其pH、滲透壓、粘度、透明度、顏色、等張性、無菌狀態(tài)、穩(wěn)定性、溶解度、釋放率、吸收率和滲透性。用于藥物用途的這類物質(zhì)的實例包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和賴氨酸等氨基酸；抗微生物劑；抗壞血酸、硫酸鈉和亞硫酸氫鈉等抗氧化劑；磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽緩沖劑、碳酸氫鈉和Tris-HCl溶液等緩沖劑；甘露糖醇和甘氨酸等填充劑；乙二胺四乙酸鹽(EDTA)等螯合劑；咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環(huán)糊精和羥丙基-β-環(huán)糊精等絡(luò)合劑；葡萄糖、甘露糖和糊精等增量劑；單糖和二糖等其它碳水化合物；著色劑；香料劑；稀釋劑；乳化劑；聚乙烯吡咯烷酮等親水聚合物；低分子量多肽、成鹽抗衡離子、苯扎氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸和過氧化氫等防腐劑；甘油、丙二醇和聚乙二醇等溶劑；甘露糖醇和山梨糖醇等糖醇；助懸劑；山梨坦酯、聚山梨酯(包括聚山梨酯20和聚山梨酯80)、Triton、氨丁三醇、卵磷脂和膽固醇等表面活性劑；蔗糖和山梨糖醇等穩(wěn)定促進劑；氯化鈉、氯化鉀和甘露糖醇和山梨糖醇等彈性增強劑；輸送劑；賦形劑和/或藥用佐劑。藥物用途的這些物質(zhì)的量優(yōu)選為抗DR5抗體重量的0.01-100倍，特別優(yōu)選為0.1-10倍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)向其施用組合物的疾病、待采用的給藥途徑等，適當?shù)卮_定制劑中藥物組合物的優(yōu)選制劑。藥物組合物中賦形劑或載體可呈液體或固體的形式。合適的賦形劑或載體可為注射用水、生理鹽水、人工腦脊液或常用于胃腸外給藥的其它物質(zhì)。此外，中性生理鹽水或含有血清白蛋白的生理鹽水也可用作載體。藥物組合物可含有pH7.0-8.5的Tris緩沖液、pH4.0-5.5的乙酸鹽緩沖液或pH3.0-6.2的檸檬酸鹽緩沖液。此外，這類緩沖液可補充山梨糖醇或另一種化合物。本發(fā)明的藥物組合物的實例包括含有抗DR5抗體的藥物組合物和含有抗DR5抗體和至少一種癌癥治療劑的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可以凍干制品或液體的形式制備，作為具有所選組成和所需純度的藥劑。還可使用合適的賦形劑(例如蔗糖)，將含有抗DR5抗體的藥物組合物和含有抗DR5抗體和至少一種癌癥治療劑的藥物組合物制成凍干制品。在上述藥物組合物中，待與抗DR5抗體一起摻入的癌癥治療劑可與抗DR5抗體同時、分別或序貫給予，或者治療劑和抗DR5抗體可以不同的劑量間隔給予。這類癌癥治療劑的實例包括凱素(abraxane)、卡鉑、順鉑、吉西他濱、伊立替康(CPT-11)、紫杉醇、培美曲塞、索拉非尼、長春堿、5-FU和描述于WO2003/038043的藥劑，然而，藥劑不限于此，只要藥劑是具有抗腫瘤活性的藥劑?？梢灾苽浔景l(fā)明的藥物組合物用于胃腸外給藥或用于通過口服給藥用于胃腸吸收。制劑的組成和濃度可根據(jù)給藥方法確定。本發(fā)明的藥物組合物中所含抗DR5抗體對DR5的親和力越高，即其對DR5的解離常數(shù)(Kd值)越低，則抗DR5抗體可顯示其藥物功效越大，甚至當人用劑量降低時。因此，還可根據(jù)該事實確定本發(fā)明的藥物組合物用于人的劑量。至于劑量，在其中將人抗DR5抗體給予人的情況下，抗體可以約0.1-100mg/kg的劑量每1-180天給予一次。本發(fā)明的藥物組合物的劑型的實例包括注射劑包括輸注劑、栓劑、經(jīng)鼻劑、舌下劑和經(jīng)皮吸收劑。在下文中，將參照實施例更具體地描述本發(fā)明，然而，本發(fā)明不限于此。注意，在下列實施例中有關(guān)基因操作的各種操作按照描述于"MolecularCloning"(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.編著,ColdSpringHarborLaboratoryPress于1989出版)的方法進行，或在使用市售試劑或試劑盒的情況下，按照隨附方案使用，除非另有說明。[實施例1]小鼠抗體B273的產(chǎn)生1)-1人DR5蛋白(人DR5胞外域/人Fc融合蛋白)的產(chǎn)生1)-1-1人DR5胞外域表達載體的產(chǎn)生通過插入基因來構(gòu)建表達人DR5蛋白(同種型2:NP_671716)的載體，其中人DR5胞外域與CMV啟動子下游的人IgG1/Fc區(qū)融合。1)-1-2人DR5蛋白的產(chǎn)生表達載體導(dǎo)入293FreeStyle細胞和收集培養(yǎng)上清液由InvitrogenCorporation(現(xiàn)為LifeTechnologiesJapanLtd.)進行。1)-1-3人DR5蛋白的純化上述b)中獲得的培養(yǎng)上清液使用A蛋白親和柱層析法純化。將5L培養(yǎng)上清液施用于用PBS平衡接著用PBS洗滌的“HiTrapProteinAFF”(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.,目錄號17-5079-01)中。隨后，將2M精氨酸溶液(pH4.0)加入柱中，收集含有人DR5蛋白的流分。將該流分加入離心過濾裝置(AmiconUltra-4，流分分子量：10K，MilliporeCo.,Ltd.)，用PBS進行液體置換并進行濃縮。將最終體積配制成6ml，其用作純化的樣品(rDR5-hFc)。蛋白質(zhì)純化產(chǎn)物的定量測定采用“MicroBCA蛋白質(zhì)測定試劑盒”(PIERCE#23235)進行。作為參比標準，使用試劑盒中所包含的“白蛋白標準品”。1)-2免疫使用5-6周齡的BALB/cAJcl小鼠(CLEAJapan，Inc.)。在第0天，將1)-1-3中制備的50μgrDR5-hFc和弗式完全佐劑(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.制造)(按1:1的體積比)的混合物皮下給予每只小鼠頸部附近。在第14和28天，將50μgrDR5-hFc和弗式不完全佐劑(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.制造)(按1:1的體積比)的混合物皮下給予每只小鼠背部區(qū)域。在第42天，將50μgrDR5-hFc給予每只小鼠的腹腔，在第45天，從每只小鼠中摘取脾，用于產(chǎn)生雜交瘤。1)-3雜交瘤的產(chǎn)生使用PEG4000(Immuno-biologicalLaboratoriesCo.,Ltd.制造)，對脾細胞和小鼠骨髓瘤P3X63Ag8U.1細胞進行細胞融合，所得融合細胞用ClonaCell-HY選擇培養(yǎng)基D(StemCellTechnologies，Inc.制造，#03804)稀釋并培養(yǎng)。然后，收集形成的雜交瘤集落，由此產(chǎn)生單克隆雜交瘤。分別培養(yǎng)所收集的雜交瘤集落，通過使用所得到的各個雜交瘤的培養(yǎng)上清液，篩選產(chǎn)生抗DR5抗體的雜交瘤。1)-4通過細胞-ELISA方法篩選抗體1)-4-1人DR5突變型表達載體(pcDNA3.1-DR5M)的構(gòu)建將編碼人DR5蛋白(同種型2:NP_671716)的cDNA克隆至pcDNA3.1(+)載體，并構(gòu)建死亡結(jié)構(gòu)域修飾的表達載體pcDNA3.1-DR5M，其經(jīng)設(shè)計從而表達其中死亡結(jié)構(gòu)域334位處的氨基酸L被D取代的蛋白質(zhì)。1)-4-2表達抗原基因的細胞的制備在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中制備7.5x105個細胞/ml的HEK293細胞。然后，使用Lipofectamine2000(LifeTechnologiesJapanLtd.制造)，將HEK293細胞用死亡結(jié)構(gòu)域修飾的DR5表達載體pcDNA3.1-DR5M或用作對照的pcDNA3.1模擬品(mock)轉(zhuǎn)染，將各細胞懸液以50μl/孔分配在96孔半面積微量培養(yǎng)板(CorningIncorporated制造)中。在37℃和5%CO2的條件下，將細胞在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。在細胞-ELISA(cell-ELISA)中按原樣使用如此獲得的呈貼壁狀態(tài)的轉(zhuǎn)染細胞。1)-4-3細胞-ELISA在用1)-4-2中制備的表達載體轉(zhuǎn)染的HEK293細胞的培養(yǎng)物中取出上清液后，將雜交瘤培養(yǎng)上清液加入用pcDNA3.1-DR5M轉(zhuǎn)染的HEK293細胞和用pcDNA3.1模擬品轉(zhuǎn)染的HEK293細胞的每種中，使板在4℃下靜置1小時。在各孔的細胞用含有5%FBS的PBS洗滌一次后，將用含有5%FBS的PBS稀釋至500倍的過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(ChemiconCo.,Ltd.制造，#AP181P)加入各孔中，使板在4℃下靜置1小時。在各孔的細胞用含有5%FBS的PBS洗滌5次后，將OPD顯色溶液(鄰苯二胺二鹽酸鹽(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.制造)和H2O2分別以0.4mg/ml和0.6%(v/v)溶解，以25μl/孔加入用于溶解OPD(0.05M檸檬酸三鈉和0.1M磷酸氫二鈉十水合物，pH4.5))的溶液。在不時攪拌反應(yīng)混合物的同時，允許進行顯色反應(yīng)，通過以25μl/孔加入1MHCl終止顯色反應(yīng)。此后，使用讀板儀(ARVO，PerkinElmer，Inc.制造)，測量490nm處的吸光度。為了選擇產(chǎn)生與細胞膜上表達的DR5特異性結(jié)合的抗體的雜交瘤，選出對于抗DR5抗體產(chǎn)生為陽性的雜交瘤，所述雜交瘤與用pcDNA3.1模擬品(對照)轉(zhuǎn)染的HEK293細胞相比，產(chǎn)生在用pcDNA3.1-DR5M表達載體轉(zhuǎn)染的HEK293細胞中顯示較高吸光度的培養(yǎng)上清液。1)-5通過流式細胞方法篩選抗體1)-5-1表達抗原基因的細胞的制備以5x104個細胞/cm2將293T細胞接種到225-cm2培養(yǎng)瓶(SumitomoBakeliteCo.,Ltd.制造)中，在37℃和5%CO2的條件下，在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。次日，使用Lipofectamine2000，將293T細胞用pcDNA3.1-DR5M或用作對照的pcDNA3.1模擬品轉(zhuǎn)染，在37℃和5%CO2的條件下進一步培養(yǎng)過夜。次日，將用表達載體轉(zhuǎn)染的293T細胞用TrypLEExpress(LifeTechnologiesJapanLtd.制造)處理。然后，細胞用含有10%FBS的DMEM洗滌，此后懸浮于含有5%FBS的PBS中。將由此獲得的細胞懸液用于流式細胞分析。1)-5-2流式細胞分析將在1)-5-1中制備的293T細胞懸液離心，取出上清液。然后，將雜交瘤培養(yǎng)上清液分別加入用pcDNA3.1-DR5M轉(zhuǎn)染的293T細胞和用pcDNA3.1模擬品轉(zhuǎn)染的293T細胞中以懸浮細胞，使細胞在4℃下靜置1小時。在細胞用含有5%FBS的PBS洗滌兩次后，將用含有5%FBS的PBS稀釋1000倍的小鼠IgG(完整分子)的熒光素綴合的山羊IgG部分(CappelCo.,Ltd.制造，#55493)加入其中以懸浮細胞，使細胞在4℃下靜置1小時。在細胞用含有5%FBS的PBS洗滌3次后，將細胞重懸浮于補充2μg/ml7-氨基放線菌素D(Invitrogen(MolecularProbes)Corporation制造)的含有5%FBS的PBS中，使用流式細胞儀(FC500，BeckmanCoulter，Inc.)進行檢測。應(yīng)用Flowjo(TreeStar，Inc.)分析數(shù)據(jù)。使用門(gate)排除7-氨基放線菌素D-陽性死細胞。然后，繪制活細胞的FITC熒光強度直方圖。選出對于抗DR5抗體產(chǎn)生是陽性的雜交瘤，所述雜交瘤產(chǎn)生這樣的樣品，其在用pcDNA3.1-DR5M轉(zhuǎn)染的293T細胞的熒光強度直方圖中產(chǎn)生比在用pcDNA3.1模擬品(用作對照)轉(zhuǎn)染的293T細胞的熒光強度直方圖中強的熒光強度。1)-6根據(jù)殺細胞作用的篩選通過使用所選的對于1)-4和1)-5中的抗DR5抗體產(chǎn)生為陽性的雜交瘤的培養(yǎng)上清液，證實對人T-淋巴瘤細胞系Jurkat的細胞死亡誘導(dǎo)作用。將用5mMTris-HCl(pH8.5)以50μg/ml制備的特異性AffiniPure山羊抗小鼠IgGFc(AffiniPuregoatanti-mouseIgGFcspecific)(JacksonImmunoResearchLaboratories，Inc.制造，#115-005-071)以25μL/孔分配于96孔半面積微量培養(yǎng)板(CorningIncorporated制造)中，使板在4℃下靜置過夜。在各孔用PBS洗滌兩次后，將雜交瘤培養(yǎng)上清液加入各孔中，使板在4℃下靜置過夜。在各孔用PBS洗滌兩次后，按25μl/孔加入在含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基制備的4.0x104個細胞/ml的Jurkat細胞中，在37℃和5%CO2的條件下培養(yǎng)20小時。通過使用CellTiter-Glo發(fā)光細胞活力測定試劑盒(luminescentcellviabilityassaykit)(PromegaCorporation制造，#G7571)，定量測定來源于活細胞的ATP的量，來評價雜交瘤培養(yǎng)上清液中存在的抗DR5單克隆抗體的殺細胞作用。結(jié)果，建立了產(chǎn)生5種類型的單克隆抗體(B086、B139、B192、B273和B467)的雜交瘤，與加入用于培養(yǎng)雜交瘤的培養(yǎng)基的情況相比，其每一種顯示ATP的量降低達80%以上。1)-7單克隆抗體的同種型確定使用小鼠單克隆同種型分型試劑盒(AbDSerotec，Inc.制造)，確定單克隆抗體的同種型。結(jié)果，B086、B139、B192、B273和B467的同種型被證實為IgG1，κ鏈。1)-8單克隆抗體的制備從植入雜交瘤的小鼠腹水(下文亦稱為“抗體純化的起始原料”)中純化單克隆抗體。如下制備小鼠腹水。首先，將7-8周齡的BALB/cAJcl-nu/nu(JapanSLC，Inc.)小鼠用姥鮫烷處理(SigmaCo.,Ltd.制造)，在約3周后，將用生理鹽水洗滌的雜交瘤按1x107個細胞/小鼠植入腹腔。在1-2周后，收集在腹腔中蓄積的腹水，通過0.22-μm網(wǎng)式過濾器除菌，所得材料用作抗體純化的起始原料。抗體用HitrapMabSelectSuRe(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.制造)純化。即，將抗體純化的起始原料加到柱上，柱用PBS洗滌，此后，用2M精氨酸-HClpH4.0進行洗脫。在中和洗脫的抗體溶液后，緩沖液用PBS置換。通過洗脫與POROSG20μm柱PEEK，4.6mm×50mm，0.83ml(AppliedBiosystems,Inc.)結(jié)合的抗體，測量洗出液的吸光度(O.D.280nm)，獲得抗體的濃度。具體地講，將用PBS稀釋的抗體樣品加入用平衡緩沖液(30.6mM磷酸二氫鈉十水合物、19.5mM磷酸一鉀、0.15MNaCl，pH7.0)平衡的POROSG20μm中。然后，柱用平衡緩沖液洗滌，與柱結(jié)合的抗體然后用洗脫液(0.1%(v/v)HCl、0.15MNaCl)洗脫。測量洗出液的吸光度(O.D.280nm)的峰面積，按照下列等式計算濃度：抗體樣品的濃度(mg/ml)=(抗體樣品的峰面積)/(參比標準(人IgG1)的峰面積)×參比標準的濃度(mg/ml)×樣品的稀釋因子。此外，使用LimulusES-IISingleTestWako(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.，含有對照標準內(nèi)毒素的295-51030)和內(nèi)毒素檢測儀(toxinometer)(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.，ET-301或ET-5000)，測量所得抗體所含內(nèi)毒素的濃度，并證實為1EU/mg以下。所得抗體用于隨后的實驗。1)-9針對人癌細胞系的小鼠抗體B273的體外殺細胞活性在含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基或含有10%FBS的MEM(極限必需培養(yǎng)基)培養(yǎng)基中，制備4.4x104個細胞/ml的人T-淋巴瘤細胞系Jurkat和人成膠質(zhì)細胞瘤細胞系U-87MG的每一種，按45μl/孔加入白色透明底6孔微量培養(yǎng)板(CorningIncorporated制造)中，在37℃和5%CO2的條件下培養(yǎng)過夜。將小鼠B273抗體或小鼠IgG1抗體(R&DSystems，Inc.制造)與相同濃度的特異性AffiniPure山羊抗小鼠IgGFc(JacksonImmunoResearchLaboratories，Inc.制造，#115-005-071)混合，以5μl/孔加入所得混合物中，使得小鼠B273抗體或小鼠IgG1抗體的最終濃度為10,000-0.01ng/ml，將細胞在37℃和5%CO2的條件下培養(yǎng)24小時。按照隨附的方案，使用CellTiter-Glo發(fā)光細胞活力測定試劑盒(PromegaCorporation制造，#G7571)，通過發(fā)光計(PerkinElmer，Inc.制造)測量來源于各孔的活細胞的ATP的量。將向其中加入培養(yǎng)基(替換抗體溶液)的孔中所得到的值計為100%，來評價殺細胞活性(圖1)。在各曲線中，細胞成活率表示為平均值±標準差(n=3)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)小鼠B273抗體以抗體濃度依賴性方式對兩種細胞系顯示殺細胞作用。[實施例2]小鼠抗體B273基因的克隆和人嵌合抗體基因的產(chǎn)生2)-1小鼠抗體B273cDNA的克隆和序列的測定2)-1-1小鼠抗體B273的重鏈和輕鏈N末端氨基酸序列的測定為了測定小鼠抗體B273重鏈和輕鏈的N末端氨基酸序列，通過SDS-PAGE分離實施例1-8中純化的小鼠抗體B273。在分離后，將凝膠中的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜(孔徑大?。?.45μm，InvitrogenCorporation制造)上。膜用洗滌緩沖液(25mMNaCl、10mM硼酸鈉緩沖液pH8.0)洗滌，此后通過浸入染料溶液(50%甲醇、20%乙酸、0.05%考馬斯亮藍)達5分鐘染色，接著用90%甲醇脫色。切取PVDF膜上顯現(xiàn)的相當于重鏈的條帶(具有較小遷移率的條帶)和相當于輕鏈的條帶(具有較大遷移率的條帶)的部分，并采用Procise(注冊商標)cLC蛋白質(zhì)序列分析儀492cLC型(AppliedBiosystems,Inc.)，通過自動Edman方法(參見Edman等(1967)Eur.J.Biochem.1，80)，進行鑒定其相應(yīng)N末端氨基酸序列的嘗試。結(jié)果，相當于小鼠抗體B273重鏈的條帶的N末端氨基酸序列為EVQLQQSGPELVKPG(序列表的SEQIDNO:1)，相當于小鼠抗體B273輕鏈的條帶的N末端氨基酸序列為DVVMTQTPLSLPVSLGDQAS(序列表的SEQIDNO:2)。2)-1-2由產(chǎn)生小鼠抗體B273的雜交瘤制備mRNA為了分別克隆編碼小鼠抗體B273的重鏈和輕鏈cDNA，使用QuickPrepmRNAPurificationKit(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.)，由產(chǎn)生小鼠抗體B273的雜交瘤制備mRNA。2)-1-3小鼠抗體B273cDNA的克隆和序列的測定參照見于實施例1-7中的小鼠抗體B273重鏈和輕鏈的同種型為γ1和κ的研究結(jié)果、上述2)-1-1中測定的重鏈和輕鏈的N末端氨基酸序列和Kabat等人(參見Kabat,E.A.等,(1991)載于SequencesofProteinsofImmunologicalInterest第I和II卷,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices)制備的抗體氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫，分別合成了與抗體基因編碼區(qū)的5’末端區(qū)及其含有終止密碼子的3’末端區(qū)雜交的若干寡核苷酸引物，并采用2)-1-2中制備的mRNA和TaKaRaOneStepRNAPCRKit(AMV)(TaKaRaBio，Inc.)，擴增編碼重鏈的cDNA和編碼輕鏈的cDNA。結(jié)果，編碼抗體重鏈的cDNA和編碼抗體輕鏈的cDNA可通過下列引物組擴增。用于重鏈的引物組5’-aagaattcatgggatggagctgtatc-3’(MH258E1F1：序列表的SEQIDNO:3)5’-aagatatcttatttaccaggagagtgggagag-3’(G1EVR1：序列表的SEQIDNO:4)用于輕鏈的引物組5’-aagaattcatgaagttgcctgttagg-3’(MK19EIF1：序列表的SEQIDNO:5)5’-aagatatcttaacactcattcctgttgaagct-3’(序列表的KEVR1:SEQIDNO:6)通過PCR擴增的編碼重鏈的cDNA和編碼輕鏈的cDNA的每一種使用pEF6/V5-HisTOPOTAExpressionKit(InvitrogenCorporation)克隆，并采用基因序列分析儀(“ABIPRISM3700DNAAnalyzer；AppliedBiosystems”或“AppliedBiosystems3730xlAnalyzer；AppliedBiosystems”)測定克隆的重鏈和輕鏈的核苷酸序列的每一種。在測序反應(yīng)中，采用GeneAmp9700(AppliedBiosystems,Inc.)。已測定的編碼小鼠抗體B273重鏈cDNA的核苷酸序列由序列表的SEQIDNO:7表示，其氨基酸序列由SEQIDNO:8表示。編碼小鼠抗體B273輕鏈cDNA的核苷酸序列由序列表的SEQIDNO:9表示，其氨基酸序列由序列表的SEQIDNO:10表示。SEQIDNO:7和8的序列見圖28，SEQIDNO:9和10的序列見圖29。此外，應(yīng)用作為抗體氨基酸序列數(shù)據(jù)庫的KabatMan(參見PROTEINS:Structure,FunctionandGenetics,25(1996)，130-133)，通過比較，分析重鏈和輕鏈的氨基酸序列。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在小鼠抗體B273的重鏈中，由序列表的SEQIDNO:8的氨基酸編號20-141所示氨基酸序列是可變區(qū)。還發(fā)現(xiàn)在小鼠抗體B273的輕鏈中，由序列表的SEQIDNO:10所示氨基酸編號20-133的氨基酸序列是可變區(qū)。2)-2嵌合抗體B273表達載體的產(chǎn)生2)-2-1通用表達載體pEF6KCL和pEF1FCCU的產(chǎn)生2)-2-1-1嵌合和人源化輕鏈表達載體pEF6KCL的構(gòu)建通過使用質(zhì)粒pEF6/V5-HisB(InvitrogenCorporation)作為模板，并且還使用下列引物進行PCR，獲得自BGHpA的緊接下游(序列位置：2174)到SmaI(序列位置：2958)的DNA片段(一種含有f1復(fù)制起點和SV40啟動子和起點的DNA片段，下文中稱為“片段A”)。5’-ccacgcgccctgtagcggcgcattaagc-3’(引物EFF1：序列表的SEQIDNO:11)5’-aaacccgggagctttttgcaaaagcctagg-3’(引物EFsmaR：序列表的SEQIDNO:12)所得到的片段A及含有編碼人κ鏈分泌信號、人κ鏈恒定區(qū)和人聚腺苷酸附加信號的DNA序列的DNA片段(SEQIDNO:13，下文中稱為“片段B”)通過重疊延伸PCR彼此連接。如此獲得的其中片段A和片段B彼此連接的DNA片段用限制性內(nèi)切酶KpnI和SmaI消化，將其與用限制性內(nèi)切酶KpnI和SmaI消化的質(zhì)粒pEF6/V5-HisB(InvitrogenCorporation)連接，從而構(gòu)建具有信號序列、克隆位點、人κ鏈恒定區(qū)和EF1啟動子下游的人聚腺苷酸附加信號序列的嵌合和人源化輕鏈表達載體pEF6KCL。2)-2-1-2pEF1/KCL的構(gòu)建將通過用限制性內(nèi)切酶KpnI和SmaI切割通過上述方法獲得的pEF6KCL而得到的DNA片段與用KpnI和SmaI消化的pEF1/myc-HisB(InvitrogenCorporation)連接，由此構(gòu)建質(zhì)粒pEF1KCL。2)-2-1-3嵌合和人源化重鏈表達載體pEF1FCCU的構(gòu)建將含有編碼信號序列和人IgG1恒定區(qū)的氨基酸的DNA序列的DNA片段(SEQIDNO:14)用限制性內(nèi)切酶NheI和PmeI消化，并且與用NheI和PmeI消化的質(zhì)粒pEF1KCL連接，由此構(gòu)建具有信號序列、克隆位點、人重鏈恒定區(qū)和EF1啟動子下游的人聚腺苷酸附加信號序列的嵌合和人源化重鏈表達載體pEF1FCCU。2)-2-2B273嵌合型輕鏈表達載體的構(gòu)建通過使用編碼小鼠抗體B273輕鏈的cDNA作為模板，并且還使用KOD-Plus-(TOYOBO，Co.,Ltd.)和下列引物組，擴增含有編碼輕鏈可變區(qū)的cDNA的區(qū)域。將通過用限制性內(nèi)切酶NdeI和BsiWI切割擴增產(chǎn)物獲得的DNA片段在用限制性內(nèi)切酶NdeI和BsiWI切割的位點處插入通用嵌合和人源化抗體輕鏈表達載體(pEF6KCL)，由此構(gòu)建B273嵌合型輕鏈表達載體。如此獲得的表達載體被命名為“pEF6KCL/B273L”。B273嵌合型輕鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:15表示，其氨基酸序列用SEQIDNO:16表示。SEQIDNO:15和16的序列見圖30。順便提一句，序列表的SEQIDNO:16所示嵌合型輕鏈氨基酸序列134位處的氨基酸殘基位于輕鏈可變區(qū)的羧基端，并且對應(yīng)于序列表的SEQIDNO:10所示小鼠抗體B273輕鏈氨基酸序列133位處的丙氨酸殘基，然而，在SEQIDNO:16所示氨基酸序列中，該殘基已被來源于人抗體輕鏈的蘇氨酸殘基取代。用于輕鏈的引物組：5’-aaacatatggcgatgttgtgatgacccaaactccactctcc-3’(B273LF：序列表的SEQIDNO:17)5’-aaacgtacgtttgatttccagcttggtgcctccaccgaacg-3’(B273LR：序列表的SEQIDNO:18)2)-2-3B273嵌合型重鏈表達載體的構(gòu)建通過使用編碼小鼠抗體B273重鏈的cDNA作為模板，且另使用KOD-Plus-(TOYOBO，Co.,Ltd.)和下列引物組，擴增含有編碼重鏈可變區(qū)的cDNA的區(qū)域。將用限制性內(nèi)切酶BlpI切割擴增產(chǎn)物獲得的DNA片段在用限制性內(nèi)切酶BlpI切割的位點處插入通用嵌合和人源化抗體重鏈表達載體(pEF1FCCU)，由此構(gòu)建B273嵌合型重鏈表達載體。如此獲得的表達載體被命名為“pEF1FCCU/B273H”。B273嵌合型重鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:19表示，其氨基酸序列用SEQIDNO:20表示。SEQIDNO:19和20的序列見圖31。用于重鏈的引物組：5’-aaagctgagcgaggttcagctgcagcagtctggacctgagc-3’(B273HF：序列表的SEQIDNO:21)5’-aaagctgagctgactgtgagagtggtgccttggccccagtag-3’(B273HR：序列表的SEQIDNO:22)2)-3嵌合抗體B273的制備2)-3-1嵌合抗體B273的產(chǎn)生將對數(shù)生長期的FreeStyle293F細胞(InvitrogenCorporation)的1.2×109個細胞接種到1.2L新鮮的FreeStyle293表達培養(yǎng)基(InvitrogenCorporation)中，通過在8%CO2培養(yǎng)箱中在90rpm下于37℃振蕩1小時來培養(yǎng)。將3.6mg聚乙烯亞胺(Polyscience#24765)溶于20mlOpti-ProSFM培養(yǎng)基(InvitrogenCorporation)中。隨后，將用PureLinkHiPurePlasmid試劑盒(InvitrogenCorporation)制備的pEF1FCCU/B273H(0.4mg)和pEF6KCL/B273L(0.8mg)懸浮于20mlOpti-ProSFM培養(yǎng)基中。然后，將20ml所得到的表達載體/Opti-ProSFM混合液加入20ml所得的聚乙烯亞胺/Opti-ProSFM混合液中，輕輕攪拌所得混合物，然后放置5分鐘。此后，將混合物加入FreeStyle293F細胞中，在8%CO2培養(yǎng)箱中在90rpm下于37℃進行培養(yǎng)振蕩達7天。使所得培養(yǎng)上清液通過一次性囊式過濾器(Advantec#CCS-045-E1H)過濾。通過pEF1FCCU/B273H和pEF6KCL/B273L的組合獲得的嵌合抗體B273被命名為“cB273”。2)-3-2cB273的純化上述2)-3-1中獲得的培養(yǎng)上清液通過包括rProteinA親和層析法(在4-6℃下)和陶瓷羥基磷灰石(在室溫下)的兩步過程進行純化。在通過rProteinA親和層析法純化后以及在通過陶瓷羥基磷灰石純化后，在室溫下進行緩沖液置換步驟。首先，將1100-1200ml培養(yǎng)上清液施加于用PBS平衡的MabSelectSuRe(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.制造，兩個HiTrap柱(容積：1ml)串聯(lián)連接)中。在將全部培養(yǎng)液倒入柱中后，將柱用15-30ml的PBS洗滌。隨后，用2M精氨酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)進行洗脫，收集含有抗體的流分。將該流分施加于脫鹽柱(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.制造，兩個HiTrap脫鹽柱(容積：5ml)串聯(lián)連接)中，藉此用含有5mM磷酸鈉、50mMMES和20mMNaCl的pH6.5緩沖液置換緩沖液。此外，將進行緩沖液置換的抗體溶液施加于用含有5mMNaPi、50mMMES和20mMNaCl的pH6.5緩沖液平衡的陶瓷羥基磷灰石柱(JapanBio-RadLaboratories，Inc.，Bio-ScaleCHT2-1羥基磷灰石柱(容積：2ml))中。然后，用氯化鈉進行線性濃度梯度洗脫，收集含有抗體的流分。將該流分施加于脫鹽柱(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.制造，兩個HiTrap脫鹽柱(容積：5ml)串聯(lián)連接)中，藉此用CBS(含有140mM氯化鈉的10mM檸檬酸鹽緩沖液，pH6.0)置換液體。最后，采用CentrifugalUFFilterDeviceVIVASPIN20(流分分子量：30K，SartoriusCo.,Ltd.，在4℃下)將所得溶液濃縮，調(diào)節(jié)IgG的濃度至1.0mg/ml以上，將如此獲得的溶液用作純化樣品。[實施例3]人嵌合B273(cB273)抗體活性的測量(體外)3)-1cB273抗體與人DR5胞外域的選擇結(jié)合性質(zhì)研究通過下文描述的直接ELISA方法，對cB273與人TRAILR1-R4和小鼠TRAILR2的胞外域蛋白質(zhì)(R&DSystems，Inc.制造)的結(jié)合性質(zhì)進行了研究。首先，用PBS將TRAILR的胞外域蛋白質(zhì)的每一種稀釋至1μg/ml，將稀釋溶液以50μl/孔分配在免疫板(Nunc，Inc.制造，#442404)中，使板在4℃下靜置過夜，蛋白質(zhì)因此吸附到板上。次日，除去各孔的液體，將各孔用PBS洗滌一次。此后，為了抑制蛋白質(zhì)的非特異性吸附，按200μl/孔分配含有3%胎牛血清的PBS，使板在室溫下靜置1.5小時。除去各孔的液體，將用含有3%胎牛血清的PBS稀釋的cB273或可溶性人TRAIL(ALEXISCorporation制造，#ALX-522-003)以50μl/孔加入其中。使板在室溫下靜置1.5小時后，將PBS加入各孔中，然后，除去孔中的液體，孔用PBS洗滌兩次。然后，按50μl/孔向其中加入cB273抗體的孔中加入用含有3%胎牛血清的PBS稀釋2500倍的過氧化物酶綴合的特異性山羊抗人IgGF(ab’)2片段(goatanti-HumanIgGF(ab’)2fragmentspecific,peroxidaseconjugated)(JacksonImmunoResearchLaboratories，Inc.制造，#109-035-097)，并按50μl/孔向其中加入可溶性TRAIL的孔中加入稀釋2000倍的抗FLAGM2單克隆抗體-過氧化物酶綴合物，使板在室溫下靜置1小時。在將PBS加入各孔后，除去孔中的液體，將孔用PBS洗滌兩次。此后，以100μl/孔加入OPD顯色液，藉此顯色。然后，以100μl/孔加入1MHCl，藉此終止顯色反應(yīng)。此后，使用讀板儀測量492nm處的吸光度。圖2A顯示cB273的結(jié)果，圖2B顯示可溶性TRAIL的結(jié)果。圖中的數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(n=3)。結(jié)果，表明cB273與人TRAILR2的胞外域選擇性結(jié)合。3)-2采用Biacore對cB273抗體的結(jié)合活性的評價3)-2-1人DR5胞外域蛋白質(zhì)的制備3)-2-1-1DR5胞外域蛋白質(zhì)表達載體的產(chǎn)生為了構(gòu)建表達由序列表的SEQIDNO:23所示人DR5氨基酸編號1-130的氨基酸序列組成的區(qū)域(下文中稱為“sDR5”)的載體，使用以下擴增sDR5的引物組：DR5Ndefw：5’-gtggcatatggctctgatcacccaacaa-3’(序列表的SEQIDNO:24)和DR5Xhorv：5’-cgcctcgagtgattctttgtggacaca-3’(序列表的SEQIDNO:25)，且還使用編碼人DR5胞外域的cDNA作為模板，進行PCR反應(yīng)。所得PCR產(chǎn)物用NdeI和XhoI切割，并克隆至pET21b(+)(Novagen，Inc.制造)的NdeI/XhoI位點(下文簡稱為“pET21b(+)-sDR5”)。此外，由“pET21b(+)-sDR5”表達的重組蛋白在下文和附圖中稱為“rsDR5”(序列表的SEQIDNO:26)。3)-2-1-2DR5胞外域蛋白質(zhì)(rsDR5)的產(chǎn)生大腸桿菌OrigamiB(DE3)(Novagen，Inc.制造)用表達質(zhì)粒pET21b(+)-sDR5轉(zhuǎn)化，并在補充100μg/ml氨芐西林(SigmaCo.,Ltd.制造)和15μg/ml卡那霉素(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.制造)的2-YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過加入0.5mMIPTG誘導(dǎo)DR5的部分蛋白質(zhì)表達。細胞通過以6000rpm離心20分鐘來收集，并懸浮于結(jié)合緩沖液(50mMTris-HClpH7.5，300mMNaCl)中，接著在冰上超聲均化。將所得勻漿物以25000rpm離心20分鐘?；厥丈锨逡?，加入Ni-NTA(InvitrogenCorporation制造)中。在用結(jié)合緩沖液進行洗滌后，用洗脫緩沖液(50mMTris-HClpH7.5、300mMNaCl和300mM咪唑)進行洗脫。洗脫樣品用透析緩沖液(50mMTris-HClpH8.0、20mMNaCl)透析，加入MONOQ中，用洗脫緩沖液(50mMTris-HClpH8.0、1MNaCl)進行梯度洗脫。使用PBS作為溶劑，通過凝膠過濾柱層析法(Superdex7516/60，GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.制造)進一步純化經(jīng)洗脫的樣品。在UV280nm處測量如此獲得的重組蛋白的濃度(摩爾吸光常數(shù)：14855)。3)-2-2采用Biacore測量結(jié)合活性采用Biacore3000(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.)，通過其中抗體被固定化抗人IgG(Fc)抗體俘獲的俘獲方法，并且使用抗原作為分析物進行測量，來測量cB273抗體和rsDR5每種的解離常數(shù)。通過胺偶聯(lián)方法，將抗人IgG(Fc)抗體(HumanAntibodyCaptureKit，GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.)以約8000RU共價固定在傳感器芯片CM5(BIAcore，Inc.)上。另以相同方式對參比細胞進行固定。作為運行緩沖液，使用HBS-EP(10mMHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA和0.05%表面活性劑P20)。在其上面固定了抗人IgG(Fc)抗體的芯片上，按10μl/分鐘的流速加入50nMcB273抗體溶液達60秒鐘，然后，按30μl/分鐘的流速加入rsDR5的系列稀釋液(0.63-20nM)達60秒鐘，隨后，監(jiān)測解離相300秒鐘。作為再生溶液，按10μl/分鐘的流速加入3M氯化鎂達30秒鐘。在數(shù)據(jù)分析中，以一對一結(jié)合模型應(yīng)用分析軟件(BIAevaluation軟件，3.1版)，計算結(jié)合速率常數(shù)(kon)、解離速率常數(shù)(koff)和解離常數(shù)(KD；KD=koff/kon)。采用Biacore測量獲得的cB273抗體的結(jié)果見圖3。3)-3cB273抗體對人癌細胞系的體外殺細胞作用按照下列方法，研究了cB273抗體對各種癌細胞系的殺細胞作用。A2780、SK-OV-3、SK-CO-1、Caov-3和NIH:OVCAR-5(其全部均為人卵巢癌細胞系)、HCT-15、COLO205、HT29、SW480、SW620、DLD-1、COLO201和WiDr(其全部均為人結(jié)腸癌細胞系)、NCI-H1975、NCI-H292、NCI-H460和NCI-H358(其全部均為人肺癌細胞系)、MDA-MB-231和ZR-75-1(這兩種為人乳腺癌細胞系)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)。用含有10%胎牛血清(HyCloneLaboratories,Inc.制造)的培養(yǎng)基(下文中稱為“培養(yǎng)基”)制備1×105個細胞/ml的這些細胞系的每一種，并以50μl/孔接種在白色透明底6孔微量培養(yǎng)板(CorningIncorporated制造)中。用1μg/ml第二抗體(山羊抗人IgGFc，MPBiomedicals，LLC.制造)的溶液制備20000ng/ml的cB273抗體，然后用培養(yǎng)基制成2000、200、20和2ng/ml，將每種所得溶液以50ml/孔加入板中(最終的抗體濃度：10000、1000、100、10和1ng/ml)。使板在37℃和5%CO2的條件下溫育72小時后，按照隨附的方案，使用CellTiter-Glo發(fā)光細胞活力測定試劑盒(PromegaCorporation制造，#G7571)，通過發(fā)光計(BertholdTechnologies制造)測量來源于各孔活細胞的ATP的量。制備向其中加入培養(yǎng)基和細胞懸液的孔作為陰性對照孔，制備向其只加入培養(yǎng)基的孔作為背景孔，并計算各試驗孔的細胞成活率。在圖4中，顯示了用cB273抗體處理的各個癌細胞系細胞成活率的平均值±標準誤差(n=3)。cB273抗體對除SK-CO-1以外的細胞系顯示殺細胞活性。使用BxPC-3和MIAPaCa-2(這兩種為人胰腺癌細胞系)、A2058和A375(這兩種為人黑素瘤細胞系)、U-87MG(人成膠質(zhì)細胞瘤細胞系)、AN3CA(人子宮內(nèi)膜癌細胞系)作為試驗對象，研究了對各種癌細胞系的體外殺細胞作用。用含有10%FBS的培養(yǎng)基制備4.4×104個細胞/ml的這些細胞系的每一種，以45μl/孔加入白色透明底6孔微量培養(yǎng)板(CorningIncorporated制造)中，使板在37℃和5%CO2的條件下溫育過夜。將cB273抗體與相同濃度的山羊抗人IgGFc(MPBiomedicals，LLC.制造)混合，然后將所得混合物加入以5μl/孔加入板中，使得cB273抗體的最終濃度為10,000-1ng/ml，使板在37℃和5%CO2的條件下溫育24小時。按照隨附的方案，使用CellTiter-Glo發(fā)光細胞活力測定試劑盒(PromegaCorporation制造，#G7571)通過發(fā)光計(PerkinElmerInc.制造)，測量來源于各孔活細胞的ATP的量。各圖顯示表示為平均值±標準差(n=3)的細胞成活率。結(jié)果，cB273抗體對所研究的全部癌細胞系顯示殺細胞作用(圖5)。[實施例4]cB273抗體表位的鑒定4)-1cB273Fab片段的產(chǎn)生CB273用PBS透析，然后用PBS稀釋至2mg/ml，并制成17ml的最終體積。向其中加入用PBS以1.7ml的量制備的0.1mM半胱氨酸(SigmaCo.,Ltd.制造)和用PBS以2.04ml量稀釋至0.1mg/ml的木瓜蛋白酶(SigmaCo.,Ltd.制造)，使反應(yīng)在37℃下進行5小時。5小時后，向其中加入以120mM溶于量為6.33ml的PBS中的N-乙基馬來酰亞胺(TokyoChemicalIndustryCo.,Ltd.制造)以終止反應(yīng)。將反應(yīng)溶液加入用含有20mMNaCl的50mMTris-HCl平衡的Superdex20026/60(GEHealthcare，Co.,Ltd.制造)中，收集14ml相當于Fab片段的流分。4)-2cB273Fab片段-rsDR5復(fù)合物樣品的制備采用AmiconUltra-15(MWCO：10K)(MilliporeCo.,Ltd.制造)，將cB273Fab片段濃縮至9.46mg/ml，將2ml如此濃縮的cB273Fab片段與采用AmiconUltra-15(MWCO：3K)濃縮至5.6mg/ml的2mlrsDR5混合，將所得混合物加入用含有50mMNaCl的20mMTris-HCl平衡的Superdex20016/60中。收集8ml相當于復(fù)合物的流分。4)-3cB273Fab片段-rsDR5復(fù)合物的結(jié)晶和結(jié)構(gòu)分析使如此獲得的rsDR5-cB273Fab復(fù)合物濃縮至25mg/ml，其被用于結(jié)晶。對于結(jié)晶，采用蒸氣擴散方法。將通過將等量的沉淀劑溶液(6-8%(w/v)聚乙二醇4000、20%(v/v)異丙醇、0.1M氯化鋰、0.1M檸檬酸鹽緩沖液(pH5.6))加入0.45-1.0μl的蛋白質(zhì)溶液中所獲得的溶液放入密封容器中，其中已放入0.45ml沉淀劑溶液，使得兩種溶液彼此不接觸，使容器在22℃下靜置。3天后，獲得板狀晶體(0.4mmx0.3mmx0.03mm)。將如此獲得的晶體浸入補充30%(v/v)甘油的沉淀劑溶液中，然后在-180℃下氮氣流中冷凍。在高能加速器研究機構(gòu)(HighEnergyAcceleratorResearchOrganization)的材料結(jié)構(gòu)科學(xué)研究所光子工廠(PhotonFactoryoftheInstituteofMaterialsStructureScience)的BL17A中，在氮氣流中于95K收集X射線衍射數(shù)據(jù)。應(yīng)用HKL-2000軟件(HKLResearch，Inc.生產(chǎn))，根據(jù)所得到的衍射圖像，定量測量衍射強度，并計算晶體結(jié)構(gòu)因子。所得晶體屬于單斜晶系，空間群為C2，晶體具有以下晶胞參數(shù)：a=152.0?，b=75.5?，c=116.3?，β=110.2。使用如此獲得的結(jié)構(gòu)因子和DR5(PDB代碼：2H9G)和赫賽汀(Herceptin)Fab(PDB代碼：1N8Z)的三維結(jié)構(gòu)坐標，進行分子置換方法，并測定相位。在計算中應(yīng)用軟件phaser(CCP4：CollaborativeComputationalProjectNo.4)。晶體在不對稱單位中含有兩種復(fù)合物。應(yīng)用CNX軟件(AccerlysInc.)對結(jié)構(gòu)進行精修，并應(yīng)用Coot軟件校正模型。重復(fù)該程序，以2.1?的分辨率，得到最終的R值為25.0%，自由R值為28.7%。最終模型由兩個復(fù)合物組成，并含有cB273FabL鏈的氨基酸殘基1-218(兩個分子)、H鏈的氨基酸殘基1-222(兩個分子)、兩分子中DR5的一個分子的氨基酸殘基18-92和98-127、DR5另一個分子的氨基酸殘基21-92和98-127以及324個水分子。未觀察到DR5的氨基酸殘基93-97、DR5N端的17或20個殘基、DR5C端的6個殘基和His標簽、cB273FabL鏈C端1個殘基和cB273FabH鏈C端5個殘基的清晰的電子密度，因此，未構(gòu)建模型。通過Ramachandran圖證實了該模型，發(fā)現(xiàn)僅L鏈的Val56位于允許區(qū)域以外，且該氨基酸Val56具有CDRL2的特有結(jié)構(gòu)。DR5和cB273Fab間已確定的相互作用在不對稱單位的兩個分子中基本相等。位于距cB273Fab4?以下距離的DR5的氨基酸殘基(每個氨基酸殘基的位置對應(yīng)于SEQIDNO:23的位置)如下：Gly26、Ile34、Glu36、Asp37、Gly38、Asp56、Leu57、Leu58、Phe59、Leu61和Arg62。圖6顯示整個復(fù)合物的帶狀模型及其表面，圖7顯示DR5與cB273Fab的H或L鏈之間的相互作用。[實施例5]cB273抗體的人源化(1)5)-1人源化B273(hB273)的設(shè)計5)-1-1B273可變區(qū)的分子建模按照一般稱為同源性建模(MethodsinEnzymology,203,121-153,(1991))的方法，進行B273可變區(qū)的分子建模。將在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Nuc.AcidRes.28,235-242(2000))中登記的人免疫球蛋白可變區(qū)的一級序列(可獲得來源于X射線晶體結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu))與上述確定的B273可變區(qū)進行比較。結(jié)果，選擇1T66作為與B273輕鏈可變區(qū)具有最高序列同源性的序列。此外，選擇1XIW作為與B273重鏈可變區(qū)具有最高序列同源性的序列。根據(jù)“構(gòu)架模型”通過將相當于B273輕鏈和重鏈的1T66和1XIW的坐標組合，來制作構(gòu)架區(qū)的三維結(jié)構(gòu)。對于B273CDR，按照Thornton等人(J.Mol.Biol.,263,800-815,(1996))的分類，分別將CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和CDRH2指定為16A、7A、9A、10A和10A聚簇。按照H3原則(FEBSletters399，1-8(1996))，將CDRH3歸類為k(11)。隨后，將每個CDR的代表性構(gòu)象結(jié)合到構(gòu)架模型中。最后，就能量方面而言，為了得到B273可變區(qū)可能的分子模型，進行了能量計算，以排除不利的原子間接觸。應(yīng)用市售蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測程序Prime和坐標搜索程序MacroModel(Schr?dinger，LLC)，進行上述程序。5)-1-2人源化B273氨基酸序列設(shè)計按照一般稱為CDR移植的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，10029-10033(1989))，構(gòu)建人源化B273抗體。根據(jù)構(gòu)架區(qū)內(nèi)的氨基酸同源性選擇接納體抗體。將B273構(gòu)架區(qū)的序列與抗體氨基酸序列的Kabat數(shù)據(jù)庫(Nuc.AcidRes.29，205-206(2001))中的全部人構(gòu)架序列進行比較。結(jié)果，根據(jù)構(gòu)架區(qū)中76%的序列同源性，選擇HuMc3抗體作為接納體。將HuMc3構(gòu)架區(qū)中的氨基酸殘基與B273的氨基酸殘基比對，鑒定出其中使用不同氨基酸的位置。使用上文構(gòu)建的B273的三維模型，分析這些殘基的位置。然后，按照Queen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，10029-10033(1989))提供的標準，選出待移植到接納體的供體殘基。按照下列實施例中所述，通過將某些選定的供體殘基轉(zhuǎn)移到接納體抗體上，來構(gòu)建人源化B273序列。5)-1-2B273輕鏈的人源化5)-1-2-1hB273_L1型輕鏈：通過分別將序列表的SEQIDNO:16所示cB273輕鏈的氨基酸編號22(纈氨酸)、27(蘇氨酸)、34(絲氨酸)、35(亮氨酸)、37(天冬氨酸)、38(谷氨酰胺)、70(賴氨酸)、108(亮氨酸)、110(異亮氨酸)、112(苯丙氨酸)、125(甘氨酸)和129(亮氨酸)用異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸、纈氨酸、酪氨酸、脯氨酸和纈氨酸取代而設(shè)計的人源化B273輕鏈被命名為“hB273_L1型輕鏈”。編碼hB273_L1型輕鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:27表示。此外，hB273_L1型輕鏈的氨基酸序列用序列表的SEQIDNO:28表示。SEQIDNO:27和28的序列亦見圖32。5)-1-2-2hB273_L2型輕鏈：通過分別將序列表的SEQIDNO:16所示cB273輕鏈的氨基酸編號37(天冬氨酸)、38(谷氨酰胺)、108(亮氨酸)、110(異亮氨酸)、125(甘氨酸)和129(亮氨酸)用谷氨酸、脯氨酸、纈氨酸、纈氨酸、脯氨酸和纈氨酸取代而設(shè)計的人源化B273輕鏈被命名為“hB273_L2型輕鏈”。編碼hB273_L2型輕鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:29表示。此外，hB273_L2型輕鏈的氨基酸序列用序列表的SEQIDNO:30表示。SEQIDNO:29和30的序列亦見圖33。5)-1-2-3hB273_L3型輕鏈：通過分別將序列表的SEQIDNO:16所示cB273輕鏈的氨基酸編號37(天冬氨酸)、38(谷氨酰胺)、108(亮氨酸)、110(異亮氨酸)、和129(亮氨酸)用谷氨酸、脯氨酸、纈氨酸、纈氨酸和纈氨酸取代而設(shè)計的人源化B273輕鏈被命名為“hB273_L3型輕鏈”。編碼hB273_L3型輕鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:31表示。此外，hB273_L3型輕鏈的氨基酸序列用序列表的SEQIDNO:32表示。SEQIDNO:31和32的序列亦見圖34。5)-1-3B273重鏈的人源化5)-1-3-1hB273_H1型重鏈：通過分別將序列表的SEQIDNO:20所示cB273重鏈的氨基酸編號20(谷氨酸)、24(谷氨酰胺)、28(脯氨酸)、30(亮氨酸)、31(纈氨酸)、39(異亮氨酸)、56(甲硫氨酸)、57(賴氨酸)、59(絲氨酸)、60(組氨酸)、62(賴氨酸)、63(絲氨酸)、67(異亮氨酸)、86(賴氨酸)、87(丙氨酸)、95(絲氨酸)、96(蘇氨酸)、99(組氨酸)、103(亮氨酸)、106(蘇氨酸)、110(絲氨酸)、114(苯丙氨酸)、116(甘氨酸)、136(蘇氨酸)和137(亮氨酸)用谷氨酰胺、纈氨酸、丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、纈氨酸、纈氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、酪氨酸、絲氨酸、精氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、丙氨酸、亮氨酸和纈氨酸取代而設(shè)計的人源化B273重鏈被命名為“hB273_H1型重鏈”。編碼hB273_H1型重鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:33表示。此外，hB273_H1型重鏈的氨基酸序列用序列表的SEQIDNO:34表示。SEQIDNO:33和34的序列亦見圖35。5)-1-3-2hB273_H2型重鏈：通過分別將序列表的SEQIDNO:20所示cB273重鏈的氨基酸編號20(谷氨酸)、24(谷氨酰胺)、28(脯氨酸)、30(亮氨酸)、31(纈氨酸)、39(異亮氨酸)、60(組氨酸)、62(賴氨酸)、95(絲氨酸)、96(蘇氨酸)、99(組氨酸)、103(亮氨酸)、106(蘇氨酸)、110(絲氨酸)、116(甘氨酸)、136(蘇氨酸)和137(亮氨酸)用谷氨酰胺、纈氨酸、丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、纈氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、酪氨酸、絲氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、亮氨酸和纈氨酸取代而設(shè)計的人源化B273重鏈被命名為“hB273_H2型重鏈”。編碼hB273_H2型重鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:35表示。此外，hB273_H2型重鏈的氨基酸序列用序列表的SEQIDNO:36表示。SEQIDNO:35和36的序列亦見圖36。5)-1-3-3hB273_H3型重鏈：通過分別將序列表的SEQIDNO:20所示cB273重鏈的氨基酸編號24(谷氨酰胺)、28(脯氨酸)、30(亮氨酸)、31(纈氨酸)、39(異亮氨酸)、60(組氨酸)、95(絲氨酸)、96(蘇氨酸)、103(亮氨酸)、106(蘇氨酸)、110(絲氨酸)、136(蘇氨酸)和137(亮氨酸)用纈氨酸、丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、纈氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、絲氨酸、精氨酸、蘇氨酸、亮氨酸和纈氨酸取代而設(shè)計的人源化B273重鏈被命名為“hB273_H3型重鏈”。編碼hB273_H3型重鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:37表示。此外，hB273_H3型重鏈的氨基酸序列用序列表的SEQIDNO:38表示。SEQIDNO:37和38的序列亦見圖37。5)-2hB273_L1、hB273_L2和hB273_L3型輕鏈表達載體的構(gòu)建合成含有編碼SEQIDNO:28的氨基酸編號21-134、SEQIDNO:30的氨基酸編號21-134或SEQIDNO:32的氨基酸編號21-134所表示的hB273_L1、hB273_L2或hB273_L3型輕鏈可變區(qū)的基因的DNA(GENEART,Inc.ArtificialGeneSynthesisService)。然后，將通過用限制性內(nèi)切酶NdeI和BsiWI切割合成的DNA所獲得的各個DNA片段在用限制性內(nèi)切酶NdeI和BsiWI切割的位點處插入通用人源化抗體輕鏈表達載體(pEF6KCL)，藉此構(gòu)建hB273_L1、hB273_L2和hB273_L3型輕鏈表達載體。如此獲得的表達載體分別被命名為“pEF6KCL/hB273_L1”、“pEF6KCL/hB273_L2”和“pEF6KCL/hB273_L3”。5)-3hB273_H1、hB273_H2和hB273_H3型重鏈表達載體的構(gòu)建合成含有編碼序列表的SEQIDNO:34的氨基酸編號20-141、SEQIDNO:36的氨基酸編號20-141或SEQIDNO:38的氨基酸編號20-141所表示的hB273_H1、hB273_H2或hB273_H3型重鏈可變區(qū)的基因的DNA(GENEART,Inc.ArtificialGeneSynthesisService)。然后，將通過用限制性內(nèi)切酶BlpI切割合成的DNA所獲得的各個DNA片段在用限制性內(nèi)切酶BlpI切割的位點處插入通用人源化抗體重鏈表達載體(pEF1FCCU)，藉此構(gòu)建hB273_H1、hB273_H2和hB273_H3型重鏈表達載體。如此獲得的表達載體分別被命名為“pEF1FCCU/hB273_H1”、“pEF1FCCU/hB273_H2”和“pEF1FCCU/hB273_H3”。5)-4人源化抗體的制備5)-4-1人源化抗體的產(chǎn)生將對數(shù)生長期的FreeStyle293F細胞(InvitrogenCorporation)的1.2×109個細胞接種到1.2L新鮮的FreeStyle293表達培養(yǎng)基(InvitrogenCorporation)中，在8%CO2培養(yǎng)箱中，在90rpm下于37℃振蕩培養(yǎng)1小時。將3.6mg聚乙烯亞胺(Polyscience#24765)溶于20mlOpti-ProSFM培養(yǎng)基(InvitrogenCorporation)中。隨后，將用PureLinkHiPurePlasmidKit(InvitrogenCorporation)制備的重鏈表達載體(0.4mg)和輕鏈表達載體(0.8mg)懸浮于20mlOpti-ProSFM培養(yǎng)基中。然后，將20ml所得到的表達載體/Opti-ProSFM混合液加入20ml所得的聚乙烯亞胺/Opti-ProSFM混合液中，輕輕攪拌所得混合物，然后放置5分鐘。此后，將混合物加入FreeStyle293F細胞中。3小時后，以10mM的最終濃度向其中加入Z-VAD-FMK(PEPTIDEINSTITUTE,Inc.)，在8%CO2培養(yǎng)箱中在90rpm下于37℃進行培養(yǎng)振蕩達7天。使所得培養(yǎng)上清液通過一次性囊式過濾器(Advantec#CCS-045-E1H)過濾。通過pEF1FCCU/hB273_H1和pEF6KCL/hB273_L1的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H1/hB273_L1”，通過pEF1FCCU/hB273_H1和pEF6KCL/hB273_L2的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H1/hB273_L2”，通過pEF1FCCU/hB273_H1和pEF6KCL/hB273_L3的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H1/hB273_L3”，通過pEF1FCCU/hB273_H2和pEF6KCL/hB273_L1的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H2/hB273_L1”，通過pEF1FCCU/hB273_H2和pEF6KCL/hB273_L2的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H2/hB273_L2”，通過pEF1FCCU/hB273_H2和pEF6KCL/hB273_L3的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H2/hB273_L3”，通過pEF1FCCU/hB273_H3和pEF6KCL/hB273_L1的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H3/hB273_L1”，通過pEF1FCCU/hB273_H3和pEF6KCL/hB273_L2的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H3/hB273_L2”，通過pEF1FCCU/hB273_H3和pEF6KCL/hB273_L3的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H3/hB273_L3”。5)-4-2人源化抗體的純化將上述5)-4-1獲得的培養(yǎng)上清液通過包括rProteinA親和層析法(在4-6℃下)和陶瓷羥基磷灰石(在室溫下)的兩步過程進行純化。在通過rProteinA親和層析法純化后以及在通過陶瓷羥基磷灰石純化后，在室溫下進行緩沖液置換步驟。首先，將1100-1200ml培養(yǎng)上清液施加于用PBS平衡的MabSelectSuRe(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.制造，兩個HiTrap柱(容積：1ml)串聯(lián)連接)中。在將全部培養(yǎng)液倒入柱中后，將柱用15-30ml的PBS洗滌。隨后，用2M精氨酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)進行洗脫，收集含有抗體的流分。將該流分施加于脫鹽柱(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.制造，兩個HiTrap脫鹽柱(容積：5ml)串聯(lián)連接)中，藉此用含有5mM磷酸鈉、50mMMES和20mMNaCl的pH6.5緩沖液置換緩沖液。此外，將進行緩沖液置換的抗體溶液施加于用含有5mMNaPi、50mMMES和20mMNaCl的pH6.5緩沖液平衡的陶瓷羥基磷灰石柱(JapanBio-RadLaboratories，Inc.，Bio-ScaleCHT2-1羥基磷灰石柱(容積：2ml))中。然后，用氯化鈉進行線性濃度梯度洗脫，收集含有抗體的流分。將該流分施加于脫鹽柱(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.制造，兩個HiTrap脫鹽柱(容積：5ml)串聯(lián)連接)中，藉此用CBS(含有140mM氯化鈉的10mM檸檬酸鹽緩沖液，pH6.0)置換液體。最后，采用CentrifugalUFFilterDeviceVIVASPIN20(流分分子量：30K，SartoriusCo.,Ltd.，在4℃下)將所得溶液濃縮，調(diào)節(jié)IgG的濃度至1.0mg/ml以上，將如此獲得的溶液用作純化樣品。[實施例6]人源化B273(hB273)抗體活性的測量(1)6)-1采用Biacore評價hB273抗體的結(jié)合活性采用BiacoreT100(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.)，通過其中抗體被固定化抗人IgG(Fc)抗體俘獲的俘獲方法并使用抗原作為分析物進行測量，來測量人源化抗DR5抗體和rsDR5每一個的解離常數(shù)。通過胺偶聯(lián)方法，將約10,000RU的抗人IgG(Fc)抗體(HumanAntibodyCaptureKit，GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.)共價固定在傳感器芯片CM5(BIAcore，Inc.)上。以相同方式同樣對參比細胞進行固定。作為運行緩沖液，使用HBS-EP(10mMHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA和0.05%表面活性劑P20)。在其上面固定了抗人IgG(Fc)抗體的芯片上，按10μl/分鐘的流速加入約20nM的抗體溶液達60秒鐘，然后，按30μl/分鐘的流速加入rsDR5的系列稀釋液(3.13-50nM)達120秒鐘，隨后，監(jiān)測解離相180秒鐘。作為再生溶液，按10μl/分鐘的流速加入3M氯化鎂達30秒鐘。在數(shù)據(jù)分析中，應(yīng)用具有一對一結(jié)合模型的分析軟件(BiacoreT100評價軟件，2.0.1版)，計算結(jié)合速率常數(shù)(kon)、解離速率常數(shù)(koff)和解離常數(shù)(KD；KD=koff/kon)。對于9種類型的人源化DR5抗體，采用Biacore通過測量得到的結(jié)果見圖8。6)-2hB273抗體針對人癌細胞系的體外殺細胞活性將用50mMTris-HCl(pH8.5)以50mg/ml制備的特異性AffiniPureF(ab’)2片段山羊抗人IgGFc片段(AffiniPureF(ab’)2fragmentgoatanti-humanIgGFcfragmentspecific)(JacksonImmunoResearchLaboratories，Inc.制造，#109-006-098)按45mL/孔分配在96孔微量培養(yǎng)板(CorningIncorporated制造)中，使板在4℃下靜置過夜。在各孔用PBS洗滌兩次后，以50μL/孔加入允許產(chǎn)生5)-4-1中的抗體的293F的培養(yǎng)上清液、純化的cB273抗體(實施例2-3-2)或市售人IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories，Inc.制造，#009-000-003)，使得最終的抗體濃度為150-1.5ng/ml，使板在4℃下靜置過夜。在各孔用PBS洗滌兩次后，以50μl/孔加入在含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中以4.0x104個細胞/ml制備的Jurkat細胞，在37℃和5%CO2的條件下培養(yǎng)23小時。使用CellTiter-Glo發(fā)光細胞活力測定試劑盒(PromegaCorporation制造，#G7571)，定量測定來源于活細胞的ATP的量，將通過從向其中加入培養(yǎng)基(替換抗體溶液)的孔中得到的值作為100%，來評價各種hB273抗體的殺細胞作用。結(jié)果，如圖9所示，就B273重鏈的人源化而言，觀察到包含H1型重鏈的抗體顯示出比包含H2或H3型重鏈的抗體略微低的殺細胞作用的趨勢。另一方面，就B273輕鏈的人源化而言，發(fā)現(xiàn)包含設(shè)計的L1、L2和L3型輕鏈任一種的抗體可顯示出大致相同的殺細胞作用。[實施例7]cB273抗體的人源化(2)7)-1人源化B273(hB273)的設(shè)計7)-1-1人源化B273氨基酸序列的設(shè)計根據(jù)實施例5和6中顯示的人源化抗體(1)的設(shè)計結(jié)果，按照下列實施例中所述，通過將一些供體殘基轉(zhuǎn)移至接納體抗體上，來構(gòu)建人源化B273序列。7)-1-2人源化B273氨基酸序列的設(shè)計7)-1-2-1hB273_H1-1型重鏈：通過分別將序列表的SEQIDNO:20所示cB273重鏈的氨基酸編號20(谷氨酸)、24(谷氨酰胺)、28(脯氨酸)、30(亮氨酸)、31(纈氨酸)、39(異亮氨酸)、57(賴氨酸)、59(絲氨酸)、60(組氨酸)、62(賴氨酸)、63(絲氨酸)、67(異亮氨酸)、86(賴氨酸)、87(丙氨酸)、95(絲氨酸)、96(蘇氨酸)、99(組氨酸)、103(亮氨酸)、106(蘇氨酸)、110(絲氨酸)、136(蘇氨酸)和137(亮氨酸)用谷氨酰胺、纈氨酸、丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、纈氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、酪氨酸、絲氨酸、精氨酸、蘇氨酸、亮氨酸和纈氨酸取代而設(shè)計的人源化B273重鏈被命名為“hB273_H1-1型重鏈”。編碼hB273_H1-1型重鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:39表示。此外，hB273_H1-1型重鏈的氨基酸序列用序列表的SEQIDNO:40表示。SEQIDNO:39和40的序列亦見圖38。7)-1-2-2hB273_H2-1型重鏈：通過分別將序列表的SEQIDNO:20所示cB273重鏈的氨基酸編號24(谷氨酰胺)、28(脯氨酸)、30(亮氨酸)、31(纈氨酸)、39(異亮氨酸)、60(組氨酸)、62(賴氨酸)、95(絲氨酸)、96(蘇氨酸)、99(組氨酸)、103(亮氨酸)、106(蘇氨酸)、110(絲氨酸)、116(甘氨酸)、136(蘇氨酸)和137(亮氨酸)用纈氨酸、丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、纈氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、酪氨酸、絲氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、亮氨酸和纈氨酸取代而設(shè)計的人源化B273重鏈被命名為“hB273_H2-1型重鏈”。編碼hB273_H2-1型重鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:41表示。此外，hB273_H2-1型重鏈的氨基酸序列用序列表的SEQIDNO:42表示。SEQIDNO:41和42的序列亦見圖39。7)-1-2-3hB273_H2-2型重鏈：通過分別將序列表的SEQIDNO:20所示cB273重鏈的氨基酸編號20(谷氨酸)、24(谷氨酰胺)、28(脯氨酸)、30(亮氨酸)、31(纈氨酸)、39(異亮氨酸)、60(組氨酸)、62(賴氨酸)、95(絲氨酸)、96(蘇氨酸)、103(亮氨酸)、106(蘇氨酸)、110(絲氨酸)、116(甘氨酸)、136(蘇氨酸)和137(亮氨酸)用谷氨酰胺、纈氨酸、丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、纈氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、絲氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、亮氨酸和纈氨酸取代而設(shè)計的人源化B273重鏈被命名為“hB273_H2-2型重鏈”。編碼hB273_H2-2型重鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:43表示。此外，hB273_H2-2型重鏈的氨基酸序列用序列表的SEQIDNO:44表示。SEQIDNO:43和44的序列亦見圖40。7)-1-2-4hB273_H2-3型重鏈：通過分別將序列表的SEQIDNO:20所示cB273重鏈的氨基酸編號24(谷氨酰胺)、28(脯氨酸)、30(亮氨酸)、31(纈氨酸)、39(異亮氨酸)、60(組氨酸)、62(賴氨酸)、95(絲氨酸)、96(蘇氨酸)、103(亮氨酸)、106(蘇氨酸)、110(絲氨酸)、116(甘氨酸)、136(蘇氨酸)和137(亮氨酸)用纈氨酸、丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、纈氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、絲氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、亮氨酸和纈氨酸取代而設(shè)計的人源化B273重鏈被命名為“hB273_H2-3型重鏈”。編碼hB273_H2-3型重鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:45表示。此外，hB273_H2-3型重鏈的氨基酸序列用序列表的SEQIDNO:46表示。SEQIDNO:45和46的序列亦見圖41。7)-1-2-5hB273_H2-4型重鏈：通過分別將序列表的SEQIDNO:20所示cB273重鏈的氨基酸編號20(谷氨酸)、24(谷氨酰胺)、28(脯氨酸)、30(亮氨酸)、31(纈氨酸)、39(異亮氨酸)、60(組氨酸)、62(賴氨酸)、95(絲氨酸)、96(蘇氨酸)、99(組氨酸)、103(亮氨酸)、106(蘇氨酸)、110(絲氨酸)、136(蘇氨酸)和137(亮氨酸)用谷氨酰胺、纈氨酸、丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、纈氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、酪氨酸、絲氨酸、精氨酸、蘇氨酸、亮氨酸和纈氨酸取代而設(shè)計的人源化B273重鏈被命名為“hB273_H2-4型重鏈”。編碼hB273_H2-4型重鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:47表示。此外，hB273_H2-4型重鏈的氨基酸序列用序列表的SEQIDNO:48表示。SEQIDNO:47和48的序列亦見圖42。7)-1-2-6hB273_H2-5型重鏈：通過分別將序列表的SEQIDNO:20所示cB273重鏈的氨基酸編號20(谷氨酸)、24(谷氨酰胺)、28(脯氨酸)、30(亮氨酸)、31(纈氨酸)、39(異亮氨酸)、60(組氨酸)、95(絲氨酸)、96(蘇氨酸)、99(組氨酸)、103(亮氨酸)、106(蘇氨酸)、110(絲氨酸)、136(蘇氨酸)和137(亮氨酸)用谷氨酰胺、纈氨酸、丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、纈氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、酪氨酸、絲氨酸、精氨酸、蘇氨酸、亮氨酸和纈氨酸取代而設(shè)計的人源化B273重鏈被命名為“hB273_H2-5型重鏈”。編碼hB273_H2-5型重鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:49表示。此外，hB273_H2-5型重鏈的氨基酸序列用序列表的SEQIDNO:50表示。SEQIDNO:49和50的序列亦見圖43。7)-2hB273_H1-1、hB273_H2-1、hB273_H2-2、hB273_H2-3、hB273_H2-4和hB273_H2-5型重鏈表達載體的構(gòu)建合成含有編碼序列表的SEQIDNO:40的氨基酸編號20-141、SEQIDNO:42的氨基酸編號20-141、SEQIDNO:44的氨基酸編號20-141、SEQIDNO:46的氨基酸編號20-141、SEQIDNO:48的氨基酸編號20-141或SEQIDNO:50的氨基酸編號20-141所表示的hB273_H1-1、hB273_H2-1、hB273_H2-2、hB273_H2-3、hB273_H2-4或hB273_H2-5-型重鏈可變區(qū)的基因的DNA(GENEART,Inc.ArtificialGeneSynthesisService)。然后，將用限制性內(nèi)切酶BlpI切割合成的DNA所獲得的每個DNA片段在用限制性內(nèi)切酶BlpI切割的位點處插入通用人源化抗體重鏈表達載體(pEF1FCCU)，藉此構(gòu)建hB273_H1-1、hB273_H2-1、hB273_H2-2、hB273_H2-3、hB273_H2-4和hB273_H2-5型重鏈表達載體。如此獲得的表達載體分別被命名為“pEF1FCCU/hB273_H1-1”、“pEF1FCCU/hB273_H2-1”、“pEF1FCCU/hB273_H2-2”、“pEF1FCCU/hB273_H2-3”、“pEF1FCCU/hB273_H2-4”和“pEF1FCCU/hB273_H2-5”。7)-3人源化抗體的制備7)-3-1人源化抗體的產(chǎn)生將對數(shù)生長期的FreeStyle293F細胞(InvitrogenCorporation)的1.2×109個細胞接種到1.2L新鮮的FreeStyle293表達培養(yǎng)基(InvitrogenCorporation)中，在8%CO2培養(yǎng)箱中通過在90rpm下于37℃振蕩1小時進行培養(yǎng)。將3.6mg聚乙烯亞胺(Polyscience#24765)溶于20mlOpti-ProSFM培養(yǎng)基(InvitrogenCorporation)中。隨后，將用PureLinkHiPurePlasmidKit(InvitrogenCorporation)制備的重鏈表達載體(0.4mg)和輕鏈表達載體(0.8mg)懸浮于20mlOpti-ProSFM培養(yǎng)基中。然后，將20ml所得到的表達載體/Opti-ProSFM混合液加入20ml所得的聚乙烯亞胺/Opti-ProSFM混合液中，輕輕攪拌所得混合物，然后放置5分鐘。此后，將混合物加入FreeStyle293F細胞中。3小時后，以10mM的最終濃度將Z-VAD-FMK(PEPTIDEINSTITUTE,Inc.)加入其中，在8%CO2培養(yǎng)箱中在90rpm下于37℃進行培養(yǎng)振蕩達7天。使所得培養(yǎng)上清液通過一次性囊式過濾器(Advantec#CCS-045-E1H)過濾。通過pEF1FCCU/hB273_H1-1和pEF6KCL/hB273_L1的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H1-1/hB273_L1”，通過pEF1FCCU/hB273_H2-1和pEF6KCL/hB273_L1的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H2-1/hB273_L1”，通過pEF1FCCU/hB273_H2-2和pEF6KCL/hB273_L1的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H2-2/hB273_L1”，通過pEF1FCCU/hB273_H2-3和pEF6KCL/hB273_L1的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H2-3/hB273_L1”，通過pEF1FCCU/hB273_H2-4和pEF6KCL/hB273_L1的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H2-4/hB273_L1”，通過pEF1FCCU/hB273_H2-5和pEF6KCL/hB273_L1的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H2-5/hB273_L1”。7)-3-2人源化抗體的純化將在上述7)-3-1中獲得的培養(yǎng)上清液通過包括rProteinA親和層析法(在4-6℃下)和陶瓷羥基磷灰石(在室溫下)的兩步過程進行純化。在通過rProteinA親和層析法純化后以及在通過陶瓷羥基磷灰石純化后，在室溫下進行緩沖液置換步驟。首先，將1100-1200ml培養(yǎng)上清液施加于用PBS平衡的MabSelectSuRe(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.制造，兩個HiTrap柱(容積：1ml)串聯(lián)連接)中。在將全部培養(yǎng)液倒入柱中后，將柱用15-30ml的PBS洗滌。隨后，用2M精氨酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)進行洗脫，收集含有抗體的流分。將該流分施加于脫鹽柱(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.制造，兩個HiTrap脫鹽柱(容積：5ml)串聯(lián)連接)中，藉此用含有5mM磷酸鈉、50mMMES和20mMNaCl的pH6.5緩沖液置換緩沖液。此外，將進行緩沖液置換的抗體溶液施加于用含有5mMNaPi、50mMMES和20mMNaCl的pH6.5緩沖液平衡的陶瓷羥基磷灰石柱(JapanBio-RadLaboratories，Inc.，Bio-ScaleCHT2-1羥基磷灰石柱(容積：2ml))中。然后，用氯化鈉進行線性濃度梯度洗脫，收集含有抗體的流分。將該流分施加于脫鹽柱(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.制造，兩個HiTrap脫鹽柱(容積：5ml)串聯(lián)連接)中，藉此用CBS(含有140mM氯化鈉的10mM檸檬酸鹽緩沖液，pH6.0)置換液體。最后，采用CentrifugalUFFilterDeviceVIVASPIN20(流分分子量：30K，SartoriusCo.,Ltd.，在4℃下)將所得溶液濃縮，調(diào)節(jié)IgG的濃度至1.0mg/ml以上，將如此獲得的溶液用作純化樣品。[實施例8]人源化B273(hB273)抗體活性的測量(2)8)-1采用Biacore評價hB273抗體的結(jié)合活性采用BiacoreT100(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.)，通過其中抗體被固定化抗人IgG(Fc)抗體俘獲的俘獲方法并使用抗原作為分析物進行測量，來測量人源化抗DR5抗體和rsDR5每種的解離常數(shù)。通過胺偶聯(lián)方法，將約10,000RU的抗人IgG(Fc)抗體(HumanAntibodyCaptureKit，GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.)共價固定在傳感器芯片CM5(BIAcore，Inc.)上。以相同方式同樣對參比細胞進行固定。作為運行緩沖液，使用HBS-EP(10mMHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA和0.05%表面活性劑P20)。在其上面固定了抗人IgG(Fc)抗體的芯片上，按10μl/分鐘的流速加入約20nM的抗體溶液達60秒鐘，然后，按30μl/分鐘的流速加入rsDR5的系列稀釋液(3.13-50nM)達120秒鐘，隨后，監(jiān)測解離相180秒鐘。作為再生溶液，按10μl/分鐘的流速加入3M氯化鎂達30秒鐘。在數(shù)據(jù)分析中，應(yīng)用具有一對一結(jié)合模型的分析軟件(BiacoreT100評價軟件，2.0.1版)，計算結(jié)合速率常數(shù)(kon)、解離速率常數(shù)(koff)和解離常數(shù)(KD；KD=koff/kon)。對于6種類型的人源化DR5抗體，采用Biacore通過測量得到的結(jié)果見圖10。8)-2hB273抗體針對人癌細胞系的體外殺細胞活性將用50mMTris-HCl(pH8.5)以50μg/ml制備的特異性AffiniPureF(ab’)2片段山羊抗人IgGFc片段(JacksonImmunoResearchLaboratories，Inc.制造，#109-006-098)按45mL/孔分配在96孔微量培養(yǎng)板(CorningIncorporated制造)中，使板在4℃下靜置過夜。在各孔用PBS洗滌兩次后，以50μL/孔加入允許產(chǎn)生7)-3-1中的抗體的293F的培養(yǎng)上清液，使得最終的抗體濃度為150-1.5ng/ml，使板在4℃下靜置過夜。在各孔用PBS洗滌兩次后，按50μl/孔加入在含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中以4.0x104個細胞/ml制備的Jurkat細胞，在37℃和5%CO2的條件下培養(yǎng)23小時。使用CellTiter-Glo發(fā)光細胞活力測定試劑盒(PromegaCorporation制造，#G7571)，定量測定來源于活細胞的ATP的量，并將通過從向其中加入培養(yǎng)基(替換抗體溶液)的孔中得到的值作為100%，來評價各種hB273抗體的殺細胞作用。結(jié)果，如圖11所示，觀察到hB273_H1-1/L1抗體顯示比hB273_H1/L1抗體高的殺細胞活性趨勢，在所述抗體基礎(chǔ)上，設(shè)計出hB273_H1-1/L1抗體。另一方面，hB273_H2-1/L1至hB273_H2-5/L1抗體顯示與hB273_H2/L1抗體大致相同的殺細胞作用，在所述抗體基礎(chǔ)上，設(shè)計出hB273_H2-1/L1至hB273_H2-5/L1抗體。[實施例9]自cB273抗體CDR除去脫酰胺位點9)-1突變體的設(shè)計和表達載體的構(gòu)建9)-1-1突變體的設(shè)計一般來講，通過天冬酰胺和C末端側(cè)的鄰接氨基酸之間形成環(huán)狀琥珀酰亞胺過渡態(tài)而在蛋白質(zhì)中進行天冬酰胺的脫酰胺作用(Geiger,T.和Clarke,S.(1987)Deamidation,Isomerization,andracemizationatasparaginylandaspartylresiduesinpeptides.Succinimide-linkedreactionsthatcontributetoproteindegradation(肽中天冬酰胺酰和天冬氨酰殘基處的脫酰胺、異構(gòu)化和外消旋化。造成蛋白質(zhì)降解的琥珀酰亞胺連接反應(yīng)).J.Biol.Chem.262,785-794)。環(huán)狀琥珀酰亞胺過渡態(tài)形成的限速因素是鄰接氨基酸側(cè)鏈的大小，因此，具有最小側(cè)鏈的甘氨酸可實現(xiàn)最快的脫酰胺速率。另一方面，通過將C末端側(cè)上的鄰接基團用具有大的側(cè)鏈的氨基酸取代，可以抑制脫酰胺速率。B273抗體在L鏈和H鏈兩者中具有對脫酰胺敏感的-N-G-(天冬酰胺-甘氨酸)序列。因此，本發(fā)明人產(chǎn)生其中將鄰接基團由甘氨酸變?yōu)橘嚢彼?、苯丙氨酸、亮氨酸或谷氨酸的點突變體，其每一個都有比甘氨酸大的側(cè)鏈。就是說，進行突變體的設(shè)計，使得在H鏈中，-N-G-(天冬酰胺-甘氨酸)序列突變成-N-E-(天冬酰胺-谷氨酸)序列，而在L鏈中，-N-G-(天冬酰胺-甘氨酸)序列突變成-N-L-(天冬酰胺-亮氨酸)序列、-N-F-(天冬酰胺-苯丙氨酸)序列、-N-K-(天冬酰胺-賴氨酸)序列或-N-E-(天冬酰胺-谷氨酸)序列。9)-1-2hB273_L1-NE型輕鏈表達載體的構(gòu)建通過使用pEF6KCL/hB273_L1(其是在實施例5中產(chǎn)生的hB273_L1型輕鏈表達載體)作為模板，使通過使用引物組A進行PCR獲得的DNA片段和通過使用引物組B進行PCR獲得的DNA片段通過使用引物組C的重疊延伸PCR彼此連接。將通過用限制性內(nèi)切酶NheI和PmeI切割如此獲得的DNA片段而獲得的DNA片段在用限制性內(nèi)切酶NheI和PmeI切割的位點處插入通用人源化抗體輕鏈表達載體(pEF6KCL)，藉此構(gòu)建其中SEQIDNO:28的氨基酸編號54處的甘氨酸被谷氨酸取代的hB273_L1-NE型輕鏈表達載體。如此獲得的表達載體被命名為“pEF6KCL/hB273_L1-NE”。編碼hB273_L1-NE型輕鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:51表示。此外，hB273_L1-NE型輕鏈的氨基酸序列用序列表的SEQIDNO:52表示。SEQIDNO:51和52的序列亦見圖44。引物組A5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(L-F1：序列表的SEQIDNO:53)5’-ccaatgcaggtaagtgttctcattgctatggaccagtgactg-3’(L-NE-R2：序列表的SEQIDNO:54)引物組B5’-cagtcactggtccatagcaatgagaacacttacctgcattgg-3’(L-NE-F2：序列表的SEQIDNO:55)5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(L-R1：序列表的SEQIDNO:56)引物組C5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(L-F1：序列表的SEQIDNO:53)5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(L-R1：序列表的SEQIDNO:56)9)-1-3hB273_L1-NF型輕鏈表達載體的構(gòu)建通過使用pEF6KCL/hB273_L1(其是在實施例5中產(chǎn)生的hB273_L1型輕鏈表達載體)作為模板，使通過使用引物組A進行PCR獲得的DNA片段和通過使用引物組B進行PCR獲得的DNA片段通過使用引物組C的重疊延伸PCR彼此連接。將通過用限制性內(nèi)切酶NheI和PmeI切割如此獲得的DNA片段而獲得的DNA片段在用限制性內(nèi)切酶NheI和PmeI切割的位點處插入通用人源化抗體輕鏈表達載體(pEF6KCL)，藉此構(gòu)建其中SEQIDNO:28的氨基酸編號54處的甘氨酸被苯丙氨酸取代的hB273_L1-NF型輕鏈表達載體。如此獲得的表達載體被命名為“pEF6KCL/hB273_L1-NF”。編碼hB273_L1-NF型輕鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:57表示。此外，hB273_L1-NF型輕鏈的氨基酸序列用序列表的SEQIDNO:58表示。SEQIDNO:57和58的序列亦見圖45。引物組A5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(L-F1：序列表的SEQIDNO:53)5’-ccaatgcaggtaagtgttgaaattgctatggaccagtgactg-3’(L-NF-R2：序列表的SEQIDNO:59)引物組B5’-cagtcactggtccatagcaatttcaacacttacctgcattgg-3’(L-NF-F2：序列表的SEQIDNO:60)5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(L-R1：序列表的SEQIDNO:56)引物組C5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(L-F1：序列表的SEQIDNO:53)5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(L-R1：序列表的SEQIDNO:56)9)-1-4hB273_L1-NK型輕鏈表達載體的構(gòu)建通過使用pEF6KCL/hB273_L1(其是在實施例5中產(chǎn)生的hB273_L1型輕鏈表達載體)作為模板，使通過使用引物組A進行PCR獲得的DNA片段和通過使用引物組B進行PCR獲得的DNA片段通過使用引物組C的重疊延伸PCR彼此連接。將通過用限制性內(nèi)切酶NheI和PmeI切割如此獲得的DNA片段而獲得的DNA片段在用限制性內(nèi)切酶NheI和PmeI切割的位點處插入通用人源化抗體輕鏈表達載體(pEF6KCL)，藉此構(gòu)建其中SEQIDNO:28的氨基酸編號54處的甘氨酸被賴氨酸取代的hB273_L1-NK型輕鏈表達載體。如此獲得的表達載體被命名為“pEF6KCL/hB273_L1-NK”。編碼hB273_L1-NK型輕鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:61表示。此外，hB273_L1-NK型輕鏈的氨基酸序列用序列表的SEQIDNO:62表示。SEQIDNO:61和62的序列亦見圖46。引物組A5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(L-F1：序列表的SEQIDNO:53)5’-ccaatgcaggtaagtgttcttattgctatggaccagtgactg-3’(L-NK-R2：序列表的SEQIDNO:63)引物組B5’-cagtcactggtccatagcaataagaacacttacctgcattgg-3’(L-NK-F2：序列表的SEQIDNO:64)5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(L-R1：序列表的SEQIDNO:56)引物組C5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(L-F1：序列表的SEQIDNO:53)5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(L-R1：序列表的SEQIDNO:56)9)-1-5hB273_L1-NL型輕鏈表達載體的構(gòu)建通過使用pEF6KCL/hB273_L1(其是在實施例5中產(chǎn)生的hB273_L1型輕鏈表達載體)作為模板，使通過使用引物組A進行PCR獲得的DNA片段和通過使用引物組B進行PCR獲得的DNA片段通過使用引物組C的重疊延伸PCR彼此連接。將通過用限制性內(nèi)切酶NheI和PmeI切割如此獲得的DNA片段而獲得的DNA片段在用限制性內(nèi)切酶NheI和PmeI切割的位點處插入通用人源化抗體輕鏈表達載體(pEF6KCL)，藉此構(gòu)建其中SEQIDNO:28的氨基酸編號54處的甘氨酸被亮氨酸取代的hB273_L1-NL型輕鏈表達載體。如此獲得的表達載體被命名為“pEF6KCL/hB273_L1-NL”。編碼hB273_L1-NL型輕鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:65表示。此外，hB273_L1-NL型輕鏈的氨基酸序列用序列表的SEQIDNO:66表示。SEQIDNO:65和66的序列亦見圖47。引物組A5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(L-F1：序列表的SEQIDNO:53)5’-ccaatgcaggtaagtgttcagattgctatggaccagtgactg-3’(L-NL-R2：序列表的SEQIDNO:67)引物組B5’-cagtcactggtccatagcaatctgaacacttacctgcattgg-3’(L-NL-F2：序列表的SEQIDNO:68)5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(L-R1：序列表的SEQIDNO:56)引物組C5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(L-F1：序列表的SEQIDNO:53)5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(L-R1：序列表的SEQIDNO:56)9)-1-6hB273_H2-1-NE型重鏈表達載體的構(gòu)建通過使用pEF1FCCU/hB273_H2-1(其是在實施例7中產(chǎn)生的hB273_H2-1型重鏈表達載體)作為模板，使通過使用引物組A進行PCR獲得的DNA片段和通過使用引物組B進行PCR獲得的DNA片段通過使用引物組C的重疊延伸PCR彼此連接。通過用限制性內(nèi)切酶NheI和PmeI切割如此獲得的DNA片段而獲得的DNA片段在用限制性內(nèi)切酶NheI和PmeI切割的位點處插入通用人源化抗體重鏈表達載體(pEF1FCCU)，藉此構(gòu)建其中SEQIDNO:42的氨基酸編號75的甘氨酸被谷氨酸取代的hB273_H2-1-NE型重鏈表達載體。如此獲得的表達載體被命名為“pEF1FCCU/hB273_H2-1-NE”。編碼hB273_H2-1-NE型重鏈的核苷酸序列用序列表的SEQIDNO:69表示。此外，hB273_H2-1-NE型重鏈的氨基酸序列用序列表的SEQIDNO:70表示。SEQIDNO:69和70的序列亦見圖48。引物組A5’-aggtaagcttgctagcgccaccatgaaacacc-3’(H-F1：序列表的SEQIDNO:71)5’-ctggttgtagaaggtgtcctcgttgtaggggttgaaccggcc-3’(H-NE-R2：序列表的SEQIDNO:72)引物組B5’-ggccggttcaacccctacaacgaggacaccttctacaaccag-3’(H-NE-F2：序列表的SEQIDNO:73)5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccgatatctc-3’(H-R1：序列表的SEQIDNO:74)引物組C5’-aggtaagcttgctagcgccaccatgaaacacc-3’(H-F1：序列表的SEQIDNO:71)5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccgatatctc-3’(H-R1：序列表的SEQIDNO:74)9)-2CDR修飾的hB273抗體的制備9)-2-1CDR修飾的hB273抗體的產(chǎn)生將對數(shù)生長期的FreeStyle293F細胞(InvitrogenCorporation)的1.2×109個細胞接種到1.2L新鮮的FreeStyle293表達培養(yǎng)基(InvitrogenCorporation)中，在8%CO2培養(yǎng)箱中通過在90rpm下于37℃振蕩1小時進行培養(yǎng)。將3.6mg聚乙烯亞胺(Polyscience#24765)溶于20mlOpti-ProSFM培養(yǎng)基(InvitrogenCorporation)中。隨后，將用PureLinkHiPurePlasmidKit(InvitrogenCorporation)制備的重鏈表達載體(0.4mg)和輕鏈表達載體(0.8mg)懸浮于20mlOpti-ProSFM培養(yǎng)基中。然后，將20ml所得到的表達載體/Opti-ProSFM混合液加入20ml所得的聚乙烯亞胺/Opti-ProSFM混合液中，輕輕攪拌所得混合物，然后放置5分鐘。此后，將混合物加入FreeStyle293F細胞中。3小時后，以10mM的最終濃度將Z-VAD-FMK(PEPTIDEINSTITUTE,Inc.)加入其中，在8%CO2培養(yǎng)箱中在90rpm下于37℃進行培養(yǎng)振蕩達7天。使所得培養(yǎng)上清液通過一次性囊式過濾器(Advantec#CCS-045-E1H)過濾。通過pEF1FCCU/hB273_H2-1-NE和pEF6KCL/hB273_L1-NE的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NE”，通過pEF1FCCU/hB273_H2-1-NE和pEF6KCL/hB273_L1-NF的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NF”，通過pEF1FCCU/hB273_H2-1-NE和pEF6KCL/hB273_L1-NK的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK”，通過pEF1FCCU/hB273_H2-1-NE和ppEF6KCL/hB273_L1-NL的組合獲得的cB273的人源化抗體被命名為“hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NL”。9)-2-2CDR修飾的hB273抗體的純化將上述9)-2-1中獲得的培養(yǎng)上清液通過包括rProteinA親和層析法(在4-6℃下)和陶瓷羥基磷灰石(在室溫下)的兩步過程進行純化。在通過rProteinA親和層析法純化后以及在通過陶瓷羥基磷灰石純化后，在室溫下進行緩沖液置換步驟。首先，將1100-1200ml培養(yǎng)上清液施加于用PBS平衡的MabSelectSuRe(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.制造，兩個HiTrap柱(容積：1ml)串聯(lián)連接)中。在將全部培養(yǎng)液倒入柱中后，將柱用15-30ml的PBS洗滌。隨后，用2M精氨酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)進行洗脫，收集含有抗體的流分。將該流分施加于脫鹽柱(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.制造，兩個HiTrap脫鹽柱(容積：5ml)串聯(lián)連接)中，藉此用含有5mM磷酸鈉、50mMMES和20mMNaCl的pH6.5緩沖液置換緩沖液。此外，將進行緩沖液置換的抗體溶液施加于用含有5mMNaPi、50mMMES和20mMNaCl的pH6.5緩沖液平衡的陶瓷羥基磷灰石柱(JapanBio-RadLaboratories，Inc.，Bio-ScaleCHT2-1羥基磷灰石柱(容積：2ml))中。然后，用氯化鈉進行線性濃度梯度洗脫，收集含有抗體的流分。將該流分施加于脫鹽柱(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.制造，兩個HiTrap脫鹽柱(容積：5ml)串聯(lián)連接)中，藉此用CBS(含有140mM氯化鈉的10mM檸檬酸鹽緩沖液，pH6.0)置換液體。最后，采用CentrifugalUFFilterDeviceVIVASPIN20(流分分子量：30K，SartoriusCo.,Ltd.，在4℃下)將所得溶液濃縮，調(diào)節(jié)IgG的濃度至1.0mg/ml以上，將如此獲得的溶液用作純化樣品。[實施例10]CDR修飾的hB273抗體活性的測量10)-1采用Biacore評價CDR修飾的hB273抗體的結(jié)合活性采用BiacoreT100(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.)，通過其中抗體被固定化抗人IgG(Fc)抗體俘獲的俘獲方法，并使用抗原作為分析物進行測量，來測量人源化抗DR5抗體和rsDR5每種的解離常數(shù)。通過胺偶聯(lián)方法，將約10,000RU的抗人IgG(Fc)抗體(HumanAntibodyCaptureKit，GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.)共價固定在傳感器芯片CM5(BIAcore，Inc.)上。另以相同方式對參比細胞進行固定。作為運行緩沖液，使用HBS-EP(10mMHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA和0.05%表面活性劑P20)。在其上面固定了抗人IgG(Fc)抗體的芯片上，按10μl/分鐘的流速加入約20nM的抗體溶液達60秒鐘，然后，按30μl/分鐘的流速加入rsDR5的系列稀釋液(3.13-50nM)達120秒鐘，隨后，監(jiān)測解離相180秒鐘。作為再生溶液，按10μl/分鐘的流速加入3M氯化鎂達30秒鐘。在數(shù)據(jù)分析中，應(yīng)用具有一對一結(jié)合模型的分析軟件(BiacoreT100評價軟件，2.0.1版)，計算結(jié)合速率常數(shù)(kon)、解離速率常數(shù)(koff)和解離常數(shù)(KD；KD=koff/kon)。對于4種類型的人源化DR5抗體，采用Biacore通過測量獲得的結(jié)果見圖12。10)-2采用示差掃描量熱法(DSC)測量人源化抗DR5抗體及其突變體的熱穩(wěn)定性采用示差掃描量熱法(DSC)，進行熱穩(wěn)定性的測量。將樣品按0.5mg/ml溶于CBS緩沖液(含有10mM檸檬酸和140mMNaCl，在pH6.0下制備)中，其400μl等分量用作DSC測量的樣品溶液。如下設(shè)置DSC測量條件：初始溫度：20℃；最終溫度：100℃；升溫速度：200℃/小時；過濾時間：2秒鐘；反饋模式：低。作為參比溶液，使用CBS。作為DSC測量裝置，所有測量都使用MicroCal，Inc.(US)(現(xiàn)為GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.)制造的VP-CapillaryDSCPlatform。從得自樣品溶液的掃描曲線減去基線(亦通過用參比溶液充入樣品池來獲得掃描曲線)來進行基線校正。整個溫譜圖中的峰頂溫度值定義為Fab區(qū)的熱變性中點Tm。4種類型的人源化DR5抗體的DSC測量結(jié)果見圖13。10)-3CDR修飾的hB273抗體針對人癌細胞系的體外殺細胞活性將用50mMTris-HCl(pH8.5)以50mg/ml制備的特異性AffiniPureF(ab’)2片段山羊抗人IgGFc片段(JacksonImmunoResearchLaboratories，Inc.制造，#109-006-098)按45mL/孔分配在96孔微量培養(yǎng)板(CorningIncorporated制造)中，使板在4℃下靜置過夜。在各孔用PBS洗滌兩次后，按50μL/孔加入允許產(chǎn)生9)-2-1中的抗體的293F的培養(yǎng)上清液，使得最終的抗體濃度為150-1.5ng/ml，使板在4℃下靜置過夜。在各孔用PBS洗滌兩次后，按50μl/孔加入在含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中以4.0x104個細胞/ml制備的Jurkat細胞中，在37℃和5%CO2的條件下培養(yǎng)23小時。使用CellTiter-Glo發(fā)光細胞活力測定試劑盒(PromegaCorporation制造，#G7571)，定量測定來源于活細胞的ATP的量，并將通過從向其中加入培養(yǎng)基(替換抗體溶液)的孔中得到的值作為100%，來評價各種hB273抗體的殺細胞作用。4種類型的CDR修飾抗體每一種的殺細胞活性見圖14。10)-4胱天蛋白酶-3/7活化作用和hB273_H2-1-NE/L1-NK抗體對人癌細胞系的體外殺細胞活性在含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基或含有10%FBS的MEM(極限必需培養(yǎng)基)培養(yǎng)基中，按1.1x105個細胞/ml制備人結(jié)腸癌細胞系HCT-15和人成膠質(zhì)細胞瘤細胞系U-87MG的每一種，按45μl/孔加入白色透明底96孔微量培養(yǎng)板(CorningIncorporated制造)中，在37℃和5%CO2的條件下培養(yǎng)過夜。將hB273_H2-1-NE/L1-NK抗體、cB273抗體或人IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories，Inc.制造)與相同濃度的特異性AffiniPure山羊抗人IgGFcγ片段(JacksonImmunoResearchLaboratories，Inc.制造，#109-005-098)混合，按5μl/孔加入所得混合物，使得hB273_H2-1-NE/L1-NK抗體、cB273抗體或人IgG的最終濃度為10,000-0.1ng/ml，將細胞在37℃和5%CO2的條件下培養(yǎng)4小時。使用Caspase-Glo3/7測定試劑盒(PromegaCorporation制造，#G8093)，通過發(fā)光計(PerkinElmer，Inc.制造)測量各孔中的胱天蛋白酶-3/7活性。按照試劑盒隨附的方案，在室溫下溫育30分鐘后進行測量。然后，將從向其中加入培養(yǎng)基(替換抗體溶液)的孔中所得到的值作為100%，來評價胱天蛋白酶-3/7活性。此外，按照實施例3-3所示方法，通過在用抗體處理后，測量在24小時時ATP的量，來評價體外殺細胞活性。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)hB273_H2-1-NE/L1-NK抗體具有胱天蛋白酶-3/7活化作用，且殺細胞作用與cB273抗體的作用相當(圖15)。[實施例11]cB273抗體的體內(nèi)抗腫瘤作用11)-1cB273抗體的抗腫瘤活性11)-1-1移植人結(jié)腸癌細胞系COLO205的裸小鼠中的抗腫瘤活性將人結(jié)腸癌細胞系COLO205(購自ATCC)的2x106個細胞皮下植入裸小鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj，購自CharlesRiverLaboratoriesJapan，Inc.)腋區(qū)。植入后第7、14和21天，將cB273抗體以1、3或10mg/kg的劑量通過尾靜脈給予荷瘤小鼠(n=10)。使用電子數(shù)字測徑器(MitutoyoCorporation制造)，一周兩次測量植入腫瘤的長軸和短軸，按照下列計算公式計算腫瘤體積。腫瘤體積(mm3)=1/2x(短軸)2(mm)x(長軸)2(mm)結(jié)果見圖16。在cB273抗體給予組中，在所有小鼠中觀察到腫瘤完全消退。11)-1-2植入人胰腺癌細胞系MIAPaCa-2的裸小鼠的抗腫瘤活性將人胰腺癌細胞系MIAPaCa-2(購自ATCC)的3x106個細胞皮下植入裸小鼠腋區(qū)。在植入后第11、19、26和33天，將cB273抗體以3或10mg/kg的劑量通過尾靜脈給予荷瘤小鼠(n=10)。按與上述相同的方式，測量植入腫瘤的長軸和短軸，并計算腫瘤體積。結(jié)果見圖17。在植入后第39天，該日為最終測量日，腫瘤生長抑制率在3mg/kg給予組中為73.5%，在10mg/kg給予組中為77.4%。11)-1-3植入人成膠質(zhì)細胞瘤細胞系U-87MG的裸小鼠的抗腫瘤活性將人成膠質(zhì)細胞瘤細胞系U-87MG(購自ATCC)的5x106個細胞皮下植入裸小鼠腋區(qū)。在植入后第4、11、18和25天，將cB273抗體以1、3或10mg/kg的劑量通過尾靜脈給予荷瘤小鼠(n=10)。按與上述相同的方式，測量植入腫瘤的長軸和短軸，并計算腫瘤體積。結(jié)果見圖18。在植入后第32天，該日為最終測量日，腫瘤生長抑制率在1mg/kg給予組中為99.7%，在3mg/kg給予組中為97.8%，在10mg/kg給予組中為98.0%。此外，在1mg/kg給予組中觀察到10只小鼠中的2只腫瘤完全消退，在3mg/kg給予組中10只小鼠中的5只腫瘤完全消退，在10mg/kg給予組中10只小鼠的3只腫瘤完全消退。11)-1-4植入人肺癌細胞系NCI-H2122的裸小鼠的抗腫瘤活性(與紫杉醇和卡鉑組合)將人肺癌細胞系NCI-H2122(購自ATCC)的5x106個細胞皮下植入裸小鼠腋區(qū)。在植入后第13和20天，將cB273抗體以10mg/kg的劑量通過尾靜脈給予荷瘤小鼠。在植入后第13、14、15、16和17天，以6.25mg/kg的劑量皮下給予紫杉醇。在植入后第13天，以100mg/kg的劑量腹膜內(nèi)給予卡鉑(n=10)。按與上述相同的方式，測量植入腫瘤的長軸和短軸，并計算腫瘤體積。結(jié)果見圖19。在植入后第41天，該日為最終測量日，腫瘤生長抑制率在cB273抗體給予組中為99.6%，在紫杉醇和卡鉑組合給予組中為10.2%，在cB273抗體、紫杉醇和卡鉑組合給予組中為99.7%。11)-1-5植入人肺癌細胞系NCI-H460的裸小鼠的抗腫瘤活性(與紫杉醇和卡鉑組合)將人肺癌細胞系NCI-H460(購自ATCC)的5x106個細胞皮下植入裸小鼠腋區(qū)。在植入后第6天，將cB273抗體以10mg/kg的劑量腹膜內(nèi)給予荷瘤小鼠。在植入后第6、7、8、9和10天以6.25mg/kg的劑量皮下給予紫杉醇。在植入后第6天以100mg/kg的劑量腹膜內(nèi)給予卡鉑(n=10)。按與上述相同的方式，測量植入腫瘤的長軸和短軸，并計算腫瘤體積。結(jié)果見圖20。在植入后第16天，該日為最終測量日，腫瘤生長抑制率在cB273抗體給予組中為43.3%，在紫杉醇和卡鉑組合給予組中為66.4%，在cB273抗體、紫杉醇和卡鉑組合給予組中為79.6%。11)-1-6植入人結(jié)腸癌細胞系DLD-1的裸小鼠的抗腫瘤活性(與CPT-11組合)將人結(jié)腸癌細胞系DLD-1(購自ATCC)的5x106個細胞皮下植入裸小鼠腋區(qū)。在植入后第35天，將cB273抗體以10mg/kg的劑量腹膜內(nèi)給予荷瘤小鼠。在植入后第35、40和43天，以80mg/kg的劑量腹膜內(nèi)給予CPT-11(n=10)。按與上述相同的方式，測量植入腫瘤的長軸和短軸，并計算腫瘤體積。結(jié)果見圖21。在植入后第55天，該日為最終測量日，腫瘤生長抑制率在cB273抗體給予組中為25.9%，在CPT-11給予組中為29.5%，在cB273抗體和CPT-11組合給予組中為72.7%。11)-1-7植入人結(jié)腸癌細胞系HCT-15的裸小鼠的抗腫瘤活性(與CPT-11組合)將人結(jié)腸癌細胞系HCT-15(購自ATCC)的5x106個細胞皮下植入裸小鼠腋區(qū)。在植入后第7天，將cB273抗體以10mg/kg的劑量通過尾靜脈給予荷瘤小鼠。在植入后第7、10和14天，以80mg/kg的劑量腹膜內(nèi)給予CPT-11(n=10)。按與上述相同的方式，測量植入腫瘤的長軸和短軸，并計算腫瘤體積。結(jié)果見圖22。在植入后第31天，該日為最終測量日，腫瘤生長抑制率在cB273抗體給予組中為52.8%，在CPT-11給予組中為83.5%，在cB273抗體和CPT-11組合給予組中為97.8%。11)-1-8植入人結(jié)腸癌細胞系HCT-116的裸小鼠的抗腫瘤活性(與CPT-11組合)將人結(jié)腸癌細胞系HCT-116(購自ATCC)的1x107個細胞皮下植入裸小鼠腋區(qū)。在植入后第7天，將cB273抗體以10mg/kg的劑量通過尾靜脈給予荷瘤小鼠。在植入后第7、10和14天，以65mg/kg的劑量腹膜內(nèi)給予CPT-11(n=10)。按與上述相同的方式，測量植入腫瘤的長軸和短軸，并計算腫瘤體積。結(jié)果見圖23。在植入后第28天，該日為最終測量日，腫瘤生長抑制率在cB273抗體給予組中為13.9%，在CPT-11給予組中為89.8%，在cB273抗體和CPT-11組合給予組中為99.7%。11)-1-9植入人黑素瘤細胞系A(chǔ)375的裸小鼠的抗腫瘤活性(與長春堿組合)將人黑素瘤細胞系A(chǔ)375(購自ATCC)的2x106個細胞皮下植入裸小鼠腋區(qū)。在植入后第10、17和24天，將cB273抗體以10mg/kg的劑量通過尾靜脈給予荷瘤小鼠。在植入后10天，以10mg/kg的劑量通過尾靜脈給予長春堿(n=10)。按與上述相同的方式，測量植入腫瘤的長軸和短軸，并計算腫瘤體積。結(jié)果見圖24。在植入后第46天，該日為最終測量日，腫瘤生長抑制率在cB273抗體給予組中為53.1%，在長春堿給予組中為43.6%，在cB273抗體和長春堿組合給予組中為100%，在cB273抗體和長春堿組合給予組中，在所有小鼠中觀察到腫瘤完全消退。11)-2cB273抗體和可那木單抗間抗腫瘤活性的比較11)-2-1可那木單抗的制備根據(jù)WHODrugInformation，第22卷，第2期，2008，第129-130頁中描述的輕鏈和重鏈的氨基酸序列制備可那木單抗。11)-2-1-1可那木單抗輕鏈表達載體的構(gòu)建合成含有編碼SEQIDNO:76的氨基酸編號21-130所示可那木單抗輕鏈可變區(qū)的基因的DNA(GENEART,Inc.ArtificialGeneSynthesisService)。然后，將通過用限制性內(nèi)切酶NdeI和BsiWI切割所合成的DNA而獲得的DNA片段在用限制性內(nèi)切酶NdeI和BsiWI切割的位點處插入通用人源化抗體輕鏈表達載體(pEF6KCL)，藉此構(gòu)建可那木單抗輕鏈表達載體。如此獲得的表達載體被命名為“pEF6KCL/可那木單抗_L”。11)-2-1-2可那木單抗重鏈表達載體的構(gòu)建合成含有編碼序列表的SEQIDNO:78的氨基酸編號20-141所示可那木單抗重鏈可變區(qū)的基因的DNA(GENEART,Inc.ArtificialGeneSynthesisService)。然后，將通過用限制性內(nèi)切酶BlpI切割所合成的DNA而獲得的DNA片段在用限制性內(nèi)切酶BlpI切割的位點處插入通用人源化抗體重鏈表達載體(pEF1FCCU)，藉此構(gòu)建可那木單抗重鏈表達載體。如此獲得的表達載體被命名為“pEF1FCCU/可那木單抗_H”。11)-2-1-3可那木單抗的產(chǎn)生將對數(shù)生長期的FreeStyle293F細胞(InvitrogenCorporation)的1.2×109個細胞接種到1.2L新鮮的FreeStyle293表達培養(yǎng)基(InvitrogenCorporation)中，在8%CO2培養(yǎng)箱中通過在90rpm下于37℃振蕩1小時進行培養(yǎng)。將3.6mg聚乙烯亞胺(Polyscience#24765)溶于20mlOpti-ProSFM培養(yǎng)基(InvitrogenCorporation)中。隨后，將用PureLinkHiPurePlasmidKit(InvitrogenCorporation)制備的重鏈表達載體pEF1FCCU/可那木單抗_H(0.4mg)和輕鏈表達載體pEF6KCL/可那木單抗_L(0.8mg)懸浮于20mlOpti-ProSFM培養(yǎng)基中。然后，將20ml所得到的表達載體/Opti-ProSFM混合液加入20ml所得的聚乙烯亞胺/Opti-ProSFM混合液中，輕輕攪拌所得混合物，然后放置5分鐘。此后，將混合物加入FreeStyle293F細胞中，在8%CO2培養(yǎng)箱中，在90rpm下于37℃進行培養(yǎng)振蕩達7天。使所得培養(yǎng)上清液通過一次性囊式過濾器(Advantec#CCS-045-E1H)過濾。11)-2-1-4可那木單抗的純化將上述11)-2-1-3中獲得的培養(yǎng)上清液通過包括rProteinA親和層析法(在4-6℃下)和陶瓷羥基磷灰石(在室溫下)的兩步過程進行純化。在通過rProteinA親和層析法純化后以及在通過陶瓷羥基磷灰石純化后，在室溫下進行緩沖液置換步驟。首先，將1100-1200ml培養(yǎng)上清液施加于用PBS平衡的MabSelectSuRe(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.制造，兩個HiTrap柱(容積：1ml)串聯(lián)連接)中。在將全部培養(yǎng)液倒入柱中后，將柱用15-30ml的PBS洗滌。隨后，用2M精氨酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)進行洗脫，收集含有抗體的流分。將該流分施加于脫鹽柱(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.制造，兩個HiTrap脫鹽柱(容積：5ml)串聯(lián)連接)中，藉此用含有5mM磷酸鈉、50mMMES和20mMNaCl的pH6.5緩沖液置換緩沖液。此外，將進行緩沖液置換的抗體溶液施加于用含有5mMNaPi、50mMMES和20mMNaCl的pH6.5緩沖液平衡的陶瓷羥基磷灰石柱(JapanBio-RadLaboratories，Inc.，Bio-ScaleCHT2-1羥基磷灰石柱(容積：2ml))中。然后，用氯化鈉進行線性濃度梯度洗脫，收集含有抗體的流分。將該流分施加于脫鹽柱(GEHealthcareBio-SciencesCo.,Ltd.制造，兩個HiTrap脫鹽柱(容積：5ml)串聯(lián)連接)中，藉此用CBS(含有140mM氯化鈉的10mM檸檬酸鹽緩沖液，pH6.0)置換液體。最后，采用CentrifugalUFFilterDeviceVIVASPIN20(流分分子量：30K，SartoriusCo.,Ltd.，在4℃下)將所得溶液濃縮，調(diào)節(jié)IgG的濃度至1.0mg/ml以上，將如此獲得的溶液用作純化樣品。11)-2-2植入人結(jié)腸癌細胞系HCT-15的裸小鼠中cB273抗體和可那木單抗間抗腫瘤活性的比較將人結(jié)腸癌細胞系HCT-15(購自ATCC)的1x107個細胞皮下植入裸小鼠腋區(qū)。在植入后第6、13和20天，將cB273抗體或可那木單抗以3、10或30mg/kg的劑量通過尾靜脈給予荷瘤小鼠(n=10)。按與上述相同的方式，測量植入腫瘤的長軸和短軸，并計算腫瘤體積。結(jié)果見圖25。在植入后第30天，該日為最終測量日，腫瘤生長抑制率在給予3mg/kg的cB273抗體的組中為57.9%，在給予10mg/kg的cB273抗體的組中為56.0%，在給予30mg/kg的cB273抗體的組中為53.6%，在給予3mg/kg的可那木單抗的組中為27.4%，在給予10mg/kg的可那木單抗的組中為26.9%，在給予30mg/kg的可那木單抗的組中為20.3%。11)-2-3植入人肺癌細胞系NCI-H1975的裸小鼠中cB273抗體和可那木單抗間抗腫瘤活性的比較將人肺癌細胞系NCI-H1975(購自ATCC)的3x106個細胞皮下植入裸小鼠腋區(qū)。在植入后第12、19和26天，將cB273抗體或可那木單抗以3或10mg/kg的劑量通過尾靜脈給予荷瘤小鼠(n=10)。按與上述相同的方式，測量植入腫瘤的長軸和短軸，并計算腫瘤體積。結(jié)果見圖26。在植入后第32天，該日為最終測量日，腫瘤生長抑制率在給予3mg/kg的cB273抗體的組中為71.5%，在給予10mg/kg的cB273抗體的組中為73.3%，在給予3mg/kg的可那木單抗的組中為13.5%，在給予10mg/kg的可那木單抗的組中為12.6%。[實施例12]hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體的體內(nèi)抗腫瘤作用12)-1植入人結(jié)腸癌細胞系COLO205的裸小鼠中hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體的抗腫瘤活性將人結(jié)腸癌細胞系COLO205(購自ATCC)的2x106個細胞皮下植入裸小鼠腋區(qū)。在植入后第8、15和22天，將hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體或cB273抗體以0.3或3mg/kg的劑量通過尾靜脈給予荷瘤小鼠(n=10)。按與上述相同的方式，測量植入腫瘤的長軸和短軸，并計算腫瘤體積。結(jié)果見圖27。在給予3mg/kg的hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體的組中和給予0.3mg/kg的cB273抗體的組中，在所有小鼠中觀察到腫瘤完全消退。此外，在給予0.3mg/kg的hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體的組中，觀察到10只小鼠中的9只腫瘤完全消退，在給予3mg/kg的cB273抗體的組中，觀察到10只小鼠的8只腫瘤完全消退。[實施例13]hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體針對人癌細胞系的體外殺細胞活性NCI-N87、KATO-III和SNU-16(其每種為人胃癌細胞系)；Caki-1、ACHN和786-O(其每種為人腎癌細胞系)；Hep3B、SK-HEP-1和HepG2(C3A)(其每種為人肝癌細胞系)和HT-1080(其為人纖維肉瘤細胞系)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。GCIY(其為人胃癌細胞系)購自RIKEN。HuH-7(其為人肝癌細胞系)購自NationalInstituteofBiomedicalInnovation。按照下列方法，測量針對各種類型的細胞系的體外殺細胞活性。至于胃癌細胞系、腎癌細胞系和纖維肉瘤細胞系，適當繼代培養(yǎng)的細胞通過錐蟲藍染色方法計數(shù)，此后以1x105個細胞/ml在含有10%胎牛血清(HyCloneLaboratories,Inc.制造)的培養(yǎng)基(下文中稱為“培養(yǎng)基”)中制備。在培養(yǎng)基中，將20μg/ml的hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體與40μg/ml的第二抗體(山羊抗人IgG抗體，MPBiomedicals，LLC.制造)混合。然后，所得混合物用培養(yǎng)基稀釋，藉此制備溶液，使得hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體的濃度為2000、200、20或2ng/ml。將具有相應(yīng)濃度的所得溶液的每一種以50μl/孔加入透明的96孔微量培養(yǎng)板(CorningIncorporated制造)中(3孔/組)，以50μl/孔(5x103個細胞)接種細胞懸液(hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體的最終濃度：10000、1000、100、10或1ng/ml)。至于肝癌細胞系，適當繼代培養(yǎng)的細胞通過錐蟲藍染色方法計數(shù)，此后以4x104個細胞/ml在培養(yǎng)基中制備。在培養(yǎng)基中，將2μg/ml的hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體與4μg/ml的第二抗體混合。然后，所得混合物用培養(yǎng)基稀釋，藉此制備溶液，使得hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體的濃度為200、20、2、0.2或0.02ng/ml。將具有相應(yīng)濃度的所得溶液的每一種以50μl/孔加入黑色透明底96孔微量培養(yǎng)板(CorningIncorporated制造)中(2孔/組)，以50μl/孔(2x103個細胞)接種細胞懸液(最終的抗體濃度：1000、100、10、1、0.1或0.01ng/ml)。在5%CO2存在下，將細胞在37℃下培養(yǎng)72小時，測量各孔ATP的量。按照隨附的方案，使用螢光素酶發(fā)光試劑(CellTiter-Glo，PromegaCorporation制造)進行ATP的量的測量。即，將由細胞裂解物組分和發(fā)光底物組分組成的試驗溶液以100μl/孔加入板中，接著攪拌。此后，使用發(fā)光計(BertholdTechnologies制造)，測量各孔的發(fā)光。至于胃癌細胞系、腎癌細胞系和纖維肉瘤細胞系，以100μl/孔的量將試驗溶液從透明96孔微量培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移到白色96孔微量培養(yǎng)板(CorningIncorporated制造)中，然后，測量發(fā)光。制備向其中加入培養(yǎng)基和細胞懸液的孔作為陰性對照孔，制備向其中僅加入培養(yǎng)基的孔作為背景孔，按照下列公式，計算各試驗孔的細胞成活率。細胞成活率(%)=(試驗孔的發(fā)光強度-背景孔的平均發(fā)光強度)/(陰性對照孔的平均發(fā)光強度-背景孔的平均發(fā)光強度)x100在圖51中，顯示了用于處理的相應(yīng)抗體濃度的各細胞系的細胞成活率的平均值。至于胃癌細胞系、腎癌細胞系和纖維肉瘤細胞系，標準誤差用誤差棒表示。hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體顯示針對所測試的所有細胞系(786-O除外)的細胞毒性活性。[實施例14]與化療劑組合的hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體的體內(nèi)活性的測量14)-1植入人結(jié)腸癌細胞系HCT-15的裸小鼠中與5-FU組合的hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體的抗腫瘤活性及活性與可那木單抗的比較將人結(jié)腸癌細胞系HCT-15(購自ATCC)的1x107個細胞皮下植入裸小鼠腋區(qū)(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj，購自CharlesRiverLaboratoriesJapan，Inc.)。植入后第7、14和21天，將hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體或可那木單抗以3mg/kg的劑量通過尾靜脈給予荷瘤小鼠。在植入后第7天，以160mg/kg的劑量通過尾靜脈給予5-FU。以n=6進行實驗。使用電子數(shù)字測徑器(MitutoyoCorporation制造)，一周兩次測量植入腫瘤的長軸和短軸，按照下列計算公式計算腫瘤體積。腫瘤體積(mm3)=1/2x(短軸)2(mm)x(長軸)2(mm)結(jié)果見圖52。在植入后第28天，該日為最終測量日，腫瘤生長抑制率在hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體給予組中為62%，在可那木單抗給予組中為27%，在5-FU給予組中為54%，在hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體和5-FU組合給予組中為91%，在可那木單抗和5-FU組合給予組中為78%。即觀察到hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體和5-FU的聯(lián)合作用，此外，在hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體和5-FU組合給予組中觀察到比可那木單抗和5-FU組合給予組中高的抗腫瘤活性。14)-2植入人非小細胞肺癌細胞系NCI-H1975的裸小鼠中與紫杉醇組合的hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體的抗腫瘤活性和活性與可那木單抗的比較將人非小細胞肺癌細胞系NCI-H1975(購自ATCC)的3x106個細胞皮下植入裸小鼠腋區(qū)。在植入后第11、18和25天，將hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體或可那木單抗以3mg/kg的劑量通過尾靜脈給予荷瘤小鼠。在植入后第11、12、13和14天，將紫杉醇以6.25mg/kg的劑量通過尾靜脈給予荷瘤小鼠。以n=6進行實驗。按與上述相同的方式，測量植入腫瘤的長軸和短軸，并計算腫瘤體積。結(jié)果見圖53。在植入后第32天，該日為最終測量日，腫瘤生長抑制率在hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體給予組中為66%，在可那木單抗給予組中為40%，在紫杉醇給予組中為49%，在hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體和紫杉醇的組合給予組中為91%，在可那木單抗和紫杉醇的組合給予組中為79%。即觀察到hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體和紫杉醇的聯(lián)合作用，此外，在hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體和紫杉醇的組合給予組中觀察到比可那木單抗和紫杉醇的組合給予組中高的抗腫瘤活性。