專利名稱：水凝膠前體制劑及其制備方法
水凝膠前體制劑及其制備方法本發(fā)明涉及水凝膠前體制劑、其制備方法和包含所述制劑的試劑盒以及利用所述制劑制備水凝膠的方法。三維細(xì)胞培養(yǎng)支架已被認(rèn)為提供基因表達(dá)譜和其它細(xì)胞活動的可能，所述基因表達(dá)譜和其它細(xì)胞活動相比于傳統(tǒng)的在皿中的二維細(xì)胞培養(yǎng)物更接近地模擬活的有機(jī)體。這已經(jīng)導(dǎo)致了新的合 成聚合物水凝膠家族的開發(fā)，所述的新的合成聚合物水凝膠通常被稱為人工ECM (aECM)，因為它們模擬了細(xì)胞外基質(zhì)的許多方面。一個主要的挑戰(zhàn)是提供化學(xué)作用，該化學(xué)作用使基質(zhì)在細(xì)胞或生物分子存在下能交聯(lián)以及使得生物分子對基質(zhì)自身穩(wěn)定栓接。近年來，開發(fā)了使得在細(xì)胞或生物分子存在下形成凝膠的不同機(jī)理。例如，建議了基于低分子量構(gòu)件的自組裝的機(jī)理，所述低分子量構(gòu)件如肽(Estroff等人Watergelation by small organic molecules;Chem. Rev. 2004;104(3);1201-18)或服基 U密唆酮(ueidopyrmimidinone) (Zhang S. :Fabricationof novel biomaterials throughmolecular self-assembly; Nat. Bio-technol. 2003; 21 (10) ; 1171-8)以及中等分子量的兩性嵌端共聚物(例如，參見Hartgerink等人Peptide amphiphile nonofibers:Aversatile scaffold for the preparationof self-assembling materials;Proc. Nat.Acad. Sci.U. S. A. 2002; 99 (8) ; 5133-8)。W000/454808描述了新的生物材料，特別用于形成水凝膠，其具有基于在親核試劑和共軛的不飽和鍵或基團(tuán)之間Michael型加成反應(yīng)的交聯(lián)化學(xué)作用，其使得在細(xì)胞或生物分子存在下形成凝膠。此外，可以將特異的信號分子通過特異性反應(yīng)整合到凝膠基質(zhì)中。該系統(tǒng)的一個主要缺點是在凝膠化之前它依賴于將至少兩種前體組分人工混合。實際上，由于i)粉末形式的不同組分的再懸浮條件、ii)前體溶液的混合比例的無意識變化，使用多組分的溶液可能是誤差的源頭，由此導(dǎo)致該凝膠組合物的使用復(fù)雜以及有重復(fù)性上的問題。此外，與將需要單一的溶液來生產(chǎn)凝膠的方法進(jìn)行放大相比，將需要將幾種溶液混合來生產(chǎn)凝膠系統(tǒng)的方法進(jìn)行放大更為昂貴。因此，本發(fā)明的目的在于避免已知水凝膠制劑的缺點，并且特別地在于提供水凝膠前體，所述的水凝膠前體易于處理并使得能夠使用高度可重復(fù)的組合物來制備水凝膠。這一目的由根據(jù)權(quán)利要求I的水凝膠前體解決。根據(jù)本發(fā)明的水凝膠前體制劑包含至少一種結(jié)構(gòu)性的(structural)化合物和至少一種連接體化合物，其中所述結(jié)構(gòu)性的化合物與所述連接體化合物可以通過親核試劑與共軛不飽和鍵或基團(tuán)之間選擇性的反應(yīng)來聚合。所述水凝膠前體制劑是未反應(yīng)的粉末形式。所述制劑的優(yōu)點在于所述粉末可以簡單地再懸浮，優(yōu)選地在緩沖溶液中再懸浮，來使凝膠化反應(yīng)開始。不需要將不同組分進(jìn)行混合，由此可觀地降低了在至少一種結(jié)構(gòu)性化合物與至少一種連接體化合物之間比例出錯的可能性。因此，這提高了由這些水凝膠前體制備的水凝膠的可重復(fù)性。此外，本發(fā)明的水凝膠前體提供了使用上的便利。本發(fā)明的水凝膠制劑是粉末形式的。所述的粉末可以包含任何尺寸和形狀的顆粒。供選擇地，粉末還可以作為壓實的小片或小丸來提供。最優(yōu)選地，粉末可以以穩(wěn)定的壓縮塊的形式來提供，例如所述的壓縮塊在容器底部。所述的粉末是未反應(yīng)的，意味著幾乎沒有至少一種結(jié)構(gòu)性化合物已經(jīng)與至少一種連接體化合物通過選擇性反應(yīng)發(fā)生了反應(yīng)。優(yōu)選地，大于70%、更優(yōu)選地大于85%、最優(yōu)選地大于95%的化合物未曾經(jīng)歷選擇性反應(yīng)。

所述的選擇性反應(yīng)是親核試劑與共軛的不飽和鍵或基團(tuán)之間通過親核加成的反應(yīng)。這樣的反應(yīng)也稱作Michael型加成反應(yīng)。所述結(jié)構(gòu)性化合物的官能度至少為三，但最優(yōu)選地所述結(jié)構(gòu)性化合物的官能度為四或者更多。“官能度”的意思是在分子上反應(yīng)性位點的數(shù)目。所述的結(jié)構(gòu)性化合物優(yōu)選地選自寡聚物、聚合物、生物合成的或天然的蛋白質(zhì)或肽和多糖。優(yōu)選地，所述的結(jié)構(gòu)性化合物選自聚乙二醇、聚氧乙烯、聚乙烯醇、乙烯-乙烯醇共聚物、聚丙烯酸、乙烯-丙烯酸共聚物、聚乙烯噁唑啉、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-乙烯吡咯烷酮共聚物、聚馬來酸、乙烯-馬來酸共聚物、聚丙烯酸酰胺或聚氧化乙烯與聚氧化丙烯的嵌段共聚物或其混合物。更優(yōu)選地，所述的結(jié)構(gòu)性化合物為聚乙二醇，最優(yōu)選地為具有三個、四個或更多個臂(arm)的支化聚乙二醇。所述的連接體化合物的官能度至少為二，并且選自寡聚物、聚合物、生物合成的或天然的蛋白質(zhì)或肽以及多糖、或它們的混合物。優(yōu)選地，所述的連接體化合物為肽序列，最優(yōu)選地其包含粘附位點、生長因子結(jié)合位點或蛋白酶結(jié)合位點。所述的親核試劑優(yōu)選地為強(qiáng)親核試劑，例如硫醇或含有硫醇的基團(tuán)。所述的親核試劑還可以為本領(lǐng)域已知的任意其它類型的親核試劑，例如胺，條件是其足夠強(qiáng)以進(jìn)行選擇性反應(yīng)。此外，所述的共軛的不飽和基團(tuán)優(yōu)選為丙烯酸、丙烯酰胺、醌或乙烯基吡啶。最優(yōu)選地，所述不飽和基團(tuán)為乙烯砜。此外，本發(fā)明的水凝膠前體制劑可以包含至少一種生物活性化合物，優(yōu)選地包含RGD肽序列，所述生物活性化合物可以通過親核試劑與共軛的不飽和鍵或基團(tuán)之間的選擇性反應(yīng)與結(jié)構(gòu)性化合物綴合。所述的生物活性化合物可以包括粘附位點，如來自纖連蛋白的RGD序列或來自層粘連蛋白的YISG序列；生長因子結(jié)合位點，如肝素結(jié)合位點；蛋白酶結(jié)合位點或藥學(xué)活性化合物。優(yōu)選地，所述的生物活性化合物包含細(xì)胞粘附位點，最優(yōu)選地為RGD序列。所述的生物活性化合物包括至少一種能夠經(jīng)歷自身選擇性反應(yīng)的活性基團(tuán)。更優(yōu)選地，所述的生物活性化合物包含至少一種親核基團(tuán)，最優(yōu)選地包含硫醇基團(tuán)。所述的生物活性化合物可以通過親核試劑與共軛的不飽和鍵或基團(tuán)之間的自身選擇性反應(yīng)與結(jié)構(gòu)性化合物綴合。最優(yōu)選地，這一自身選擇性反應(yīng)與在結(jié)構(gòu)性化合物與連接體化合物之間的自身選擇性反應(yīng)，特別地與相同類型的親核試劑與共軛的不飽和鍵或基團(tuán)之間的自身選擇性反應(yīng)是相同的反應(yīng)。供選擇地，在連接體化合物與結(jié)構(gòu)性化合物聚合之前，所述的生物活性化合物可以通過自身選擇性反應(yīng)來與結(jié)構(gòu)性化合物綴合。所述的結(jié)構(gòu)性化合物優(yōu)選地為具有官能化的末端基團(tuán)的多支化聚乙二醇(PEG)。更優(yōu)選地，所述的末端基團(tuán)用乙烯砜來官能化。最優(yōu)選地，所述結(jié)構(gòu)性化合物為PEG-三(乙烯砜)或PEG-四(乙烯砜)。PEG的醇基團(tuán)的乙烯砜官能化可以通過本領(lǐng)域已知的任何適合的反應(yīng)來實現(xiàn)。通過使用具有三個、四個或更多個分支的支化聚乙二醇有可能制備出官能度為三、四或者更多的結(jié)構(gòu)性化合物。優(yōu)選地，所述的連接體包括至少兩種親核基團(tuán)，優(yōu)選地硫醇基團(tuán)。硫醇是強(qiáng)的親核試劑，其易于在生理pH下與不飽和鍵或基團(tuán)經(jīng)歷Michael型加成。此外,硫醇普遍存在于生物體系中，使得它們的使用不造成毒性問題。所述的連接體化合物優(yōu)選地為肽，該肽包含至少兩個半胱氨酸，優(yōu)選地所述的半胱氨酸位于肽的N-端和C-端附近。合成具有兩個或更多個半胱氨酸殘基的肽是簡單易行的。還可能的是，在此肽中引入特異性的蛋白酶位點，以制備可降解的水凝膠，所述的水凝膠例如用于在活體內(nèi)使用。此外，通過改 變臨近半胱氨酸的氨基酸，可以改變硫醇基團(tuán)的pKa 值。優(yōu)選地，所述的半胱氨酸位于肽的N-端和C-端，從而得到了具有h2n-cxxxxxxxxc-cooh(seq id noi)結(jié)構(gòu)的肽，優(yōu)選地所述的肽具有乙?；膎-端，Ac ;和酰胺化的C-端，NH2 ;其中C是半胱氨酸的單字母表示，而X代表除了半胱氨酸外的任意氨基酸。該肽可以具有任意長度，因此X(Xn)的數(shù)目可以是任何數(shù)目。優(yōu)選地，所述的肽具有16個氨基酸的長度。供選擇地，所述的半胱氨酸可能位于從N-端或C-端遠(yuǎn)離的一個或多個氨基酸處，例如，從而得到了具有一般結(jié)構(gòu)H2N-XmCXnCXp-COOH (SEQ ID NO:2)的肽。這里m、n和P可以是包括零的任意整數(shù)。最優(yōu)選地，所述的連接體化合物是序列為H2N-GCRE-XXXXXXXX-ERCG-COOH (SEQ IDN0:3)的肽。甘氨酸(G)作為間隔子(spacer)，精氨酸(R)提高了鄰近的半胱氨酸的硫醇基團(tuán)的反應(yīng)性，并且谷氨酸(E)增強(qiáng)了肽在水溶液中的溶解性。最優(yōu)選地，所述的連接體化合物的序列是h2n-gcre-gpqgiwgqercg-cooh (seq idNO:4)或者H2N-GCRE⑶QGIAGFERCG-COOH (SEQ ID NO: 5)，還優(yōu)選地具有乙酰化的N端和酰胺化的C端。用于連接體化合物和生物活性化合物的肽應(yīng)當(dāng)在在酸性溶劑中合成和處理，最優(yōu)選地，在含有三氟乙酸(TFA)的溶液中合成和處理。在肽合成之后，結(jié)合至肽粉末的殘留三氟乙酸可以起到使含有相對應(yīng)肽的水懸浮液的PH值降低至4以下的作用。結(jié)構(gòu)性化合物和/或連接體化合物進(jìn)行選擇，以使得在混合的條件下，結(jié)構(gòu)性化合物與連接體化合物之間的選擇性反應(yīng)速率被阻止或者大大地減慢。優(yōu)選地，相比于pH值為7或者在7以上時，此反應(yīng)的速率在pH值為4或在4以下時被大大地減慢。如此地選擇化合物以提供前體制劑，所述前體制劑在生理條件下會易于發(fā)生凝膠化反應(yīng)，但這使得它的制備能在沒有或者幾乎沒有選擇性反應(yīng)發(fā)生的條件下進(jìn)行。優(yōu)選地，對結(jié)構(gòu)性化合物和/或連接體化合物進(jìn)行選擇，從而使得在pH為7. 5時的自身選擇性反應(yīng)的反應(yīng)速率是PH為7時的反應(yīng)速率的至少2倍。本發(fā)明的另一個目的是提供水凝膠前體制劑的制備方法。這個問題可以通過如權(quán)利要求8所述的方法來解決。所述的方法包括以下步驟一提供包含至少一種結(jié)構(gòu)性化合物的第一溶液A ；一提供包含至少一種連接體化合物的第二溶液B ；一將所述溶液A與B混合；并且一將得到的前體溶液凍干
所述至少一種結(jié)構(gòu)性化合物和所述至少一種連接體化合物可通過親核試劑與共軛的不飽和鍵或基團(tuán)之間的選擇性反應(yīng)聚合。所述溶液A和B兩者在阻止所述選擇性反應(yīng)的條件下混合。所述方法使得能夠制備粉末形式的，包含結(jié)構(gòu)性化合物和連接體化合物的水凝膠前體制劑?？梢园凑兆柚棺陨磉x擇性反應(yīng)這樣的方式來選擇混合的條件。這就意味著該反應(yīng)的速率足夠慢，以致溶液A和B中很大部分的化合物在凍干之前沒有通過自身選擇性反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)。優(yōu)選地，在兩種溶液中大于70%的、更優(yōu)選地大于85%、最優(yōu)選地大于90%以上的分子在凍干步驟之前不經(jīng)歷選擇性反應(yīng)。
混合的條件可以通過pH的調(diào)節(jié)、不同化合物的濃度、制備時間、溫度或者溶劑等條件來選擇。優(yōu)選地，在PH為4或者4以下進(jìn)行混合。特別是，當(dāng)將硫醇用作親核試劑時，PH值為4或者4以下充分地阻止了自身選擇性反應(yīng)?；旌蟽?yōu)選在室溫下進(jìn)行。因為溶液A的pH大約在7左右，而溶液B的pH在4以下，所以重要的是將溶液A加入到溶液B中。如果將溶液B加入到溶液A中，那么自身選擇性的聚合反應(yīng)就會在混合步驟過程中開始。當(dāng)將溶液A加入到溶液B時，得到的溶液的pH將一直在4以下，因此抑制了反應(yīng)。溶液A優(yōu)選地包含5-10% w/v的至少一種結(jié)構(gòu)性化合物。最優(yōu)選地，溶液A包含
7.5% w/v的至少一種結(jié)構(gòu)性化合物。此外，溶液B優(yōu)選地包含O. 1-2% w/v的至少一種連接體化合物，最優(yōu)選地，溶液B包含1% w/v的至少一種連接體化合物。連接體化合物的此濃度為化合物在溶液中提供良好的溶解度。通過對于溶液A和B使用前文所述的結(jié)構(gòu)性化合物和連接體化合物濃度，導(dǎo)致了在凍干之后形成壓縮粉末。該壓縮粉末會在容器的底部形成像蛋糕一樣的層，這是有利的。此外，在制備過程中，使用兩種化合物的這些相對低的溶度可以額外降低在結(jié)構(gòu)性化合物與連接體化合物之間發(fā)生不想要的超前反應(yīng)(pre-mature reaction)的可能性。另外，相比于較高的濃度，在隨后的制備步驟中這樣的濃度使得材料的損失減少。此外，溶液A和/或溶液B優(yōu)選分別為至少一種結(jié)構(gòu)性化合物或者至少一種連接體化合物分別在蒸餾水中的溶液。因此，兩種化合物都存在于非緩沖溶液中。由于粘附到溶液B的肽連接體化合物的三氟乙酸，因此該溶液的pH會降低。這使得由溶液A和B得到的混合物的PH優(yōu)選地為4以下。更優(yōu)選地，得到的溶液的pH在3. 5左右。供選擇地，在與溶液B混合之前，溶液A)可以先與另外的溶液C混合，所述C溶液含有生物活性化合物，所述的生物活性化合物可以通過在親核試劑與共軛的不飽和鍵或者基團(tuán)之間的選擇性反應(yīng)來與結(jié)構(gòu)性化合物二聚化。這種生物活性化合物可以包括粘附位點，比如來自于纖連蛋白的RGD序列或者來自于層粘連蛋白的HSG序列；生長因子結(jié)合位點，如肝素結(jié)合位點；蛋白酶結(jié)合位點或者有治療活性的化合物。優(yōu)選地，所述的生物活性化合物包括細(xì)胞粘附位點，最優(yōu)選地包括RGD序列。優(yōu)選地，溶液C包含O. 1-10% w/v的生物活性化合物。更優(yōu)選地，溶液C包含O. 1-5%w/v的生物活性化合物，最優(yōu)選地包含O. 1-2% w/v的生物活性化合物。分別改變?nèi)芤篈中的結(jié)構(gòu)性化合物的量，任選的溶液C中生物活性化合物的量，以及溶液B中連接體化合物的濃度以及性質(zhì)(例如，氨基酸序列)使得能夠制備出具有不同特性的水凝膠前體制劑。盡管改變?nèi)芤篈和溶液B中化合物的濃度的可能性很多，但是優(yōu)選地，選擇化合物的濃度以使得親核試劑與共軛不飽和鍵或基團(tuán)的摩爾比率產(chǎn)生最佳的物理化學(xué)性質(zhì)，比如最終凝膠的最大的剪切模量和最小的膨脹特性。通常，親核試劑與共軛的不飽和鍵或基團(tuán)的最佳比率為O. 8:1至I. 3:1的范圍。這保證了幾乎所有的活性基團(tuán)都已經(jīng)歷選擇性反應(yīng)來形成水凝膠，從而使得任何反應(yīng)性基團(tuán)的副反應(yīng)相當(dāng)大地減少了。此外，在進(jìn)行凍干步驟之前，前體溶液可以進(jìn)行過濾。所述過濾優(yōu)選為無菌過濾。在進(jìn)行凍干步驟之前，可以將任何未溶解的化合物以及細(xì)菌污染物都從混合物中去除掉。優(yōu)選地，在凍干步驟之前，將預(yù)混合的前體溶液等分并裝入容器中，所述的容器優(yōu)選地是無菌容器。這使得能夠生產(chǎn)出含有特定量水凝膠前體制劑的單一容器。這種容器可以是任何合適的材料的，例如塑料或者玻璃。優(yōu)選所述的容器是小瓶子。
優(yōu)選地在凍干步驟之后將容器用無菌氮氣填充并立即加蓋。這保護(hù)了水凝膠前體粉末不與水和/或氧接觸，這樣的接觸可能會導(dǎo)致親核試劑過早的聚合或氧化。本發(fā)明的另一個目標(biāo)在于如上所述的水凝膠前體制劑在制備水凝膠中的用途。本發(fā)明的又一個的目標(biāo)在于提供易于使用的系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于制備具有高度地可重現(xiàn)結(jié)果的水凝膠。這個問題通過根據(jù)權(quán)利要求20的試劑盒來解決。本發(fā)明的試劑盒包括至少一個本文所述的水凝膠前體制劑填充的容器和一個具有反應(yīng)緩沖液的容器。所述的容器優(yōu)選包括一定量的前體制劑粉末，該粉末當(dāng)使用定量的反應(yīng)緩沖液來再懸浮時，將得到具有預(yù)定特性的凝膠。所述的反應(yīng)緩沖液的pH優(yōu)選為7以上。更優(yōu)選地,該反應(yīng)緩沖液的pH為7至8。該緩沖液優(yōu)選地包含HEPES，優(yōu)選地HEPES的濃度為O. 3M且pH調(diào)節(jié)為7至8之間的值。這使得聚合反應(yīng)足夠快地進(jìn)行。本發(fā)明再一個目標(biāo)在于提供一種易于使用方法來制備水凝膠。這個目標(biāo)通過根據(jù)權(quán)利要求22的方法來實現(xiàn)。制備水凝膠的此方法包括以下步驟一在pH為7的緩沖液中，更優(yōu)選地在7至8的緩沖液中將本文所述的水凝膠前體制劑再懸浮；一任選地將細(xì)胞培養(yǎng)懸浮液加入至該前體懸浮液；一使用前體懸浮液來燒注(casting)凝膠前體；和一將凝膠前體聚合至少30分鐘，優(yōu)選地聚合30-45分鐘，優(yōu)選地在37°C的恒溫箱中進(jìn)行聚合。本發(fā)明的水凝膠前體制劑可以在生理條件下聚合，這使得可以將細(xì)胞培養(yǎng)液加入到前體懸浮液中，從而在凝膠化之前，細(xì)胞均勻地分布在懸浮液中。這對于任何其他前體系統(tǒng)是不太輕易辦到的。本發(fā)明的進(jìn)一步細(xì)節(jié)和益處將通過以下的附圖
和實施例來呈現(xiàn)。圖I :根據(jù)本發(fā)明的水凝膠前體制劑的制備方法的實施方案的示意圖；圖2 :根據(jù)本發(fā)明的水凝膠前體制劑的制備方法的第二實施方案的示意圖；圖3 :根據(jù)本發(fā)明的水凝膠前體制劑的制備方法的第三實施方案的示意圖。圖I顯示了根據(jù)本發(fā)明的水凝膠前體制劑的制備方法的實施方案的示意圖。在混合步驟I中，將包含7. 5% w/v的帶有4個由乙烯砜官能化的手臂的支化PEG的溶液A加入到包含1% w/v的含有兩個半胱氨酸的肽序列的溶液B進(jìn)行混合步驟I，所述兩個半胱氨酸的一個接近C端而另一個接近N端。例如，將275mL包含7. 5% w/v官能化的PEG的溶液A加入到425mL包含1% w/v連接體肽的溶液B中。溶液A和B通過將相應(yīng)的化合物分別懸浮在蒸餾水中來制備。對于溶液B來講，優(yōu)選地將肽連接體化合物以小部分加入至水中。使用磁力攪拌器以400RPM下持續(xù)地攪拌來進(jìn)行混合。隨后，對如此得到的前體溶液4進(jìn)行無菌過濾步驟5，例如使用具有O. 2 μ m的絕對速率(absolute rating)的，具有 PTEE 膜的 Mini Kleenpak 過濾器(PALL Corp.),得到經(jīng)過濾的前體溶液6。然后，對該溶液進(jìn)行凍干步驟7，得到粉末形式的水凝膠前體制劑
8。得到的粉末為穩(wěn)定壓縮蛋糕形式。凍干步驟7可以通過在架上將溶液在-50°C下進(jìn)行第一冷凍150分鐘，然后在O. 26mbar的壓力下、_10°C的溫度下進(jìn)行第一干燥570分鐘來實施。接著在O. 02mbar的壓力下、20°C的溫度下進(jìn)行第二干燥步驟180分鐘。圖2中顯示了根據(jù)本發(fā)明的水凝膠前體制劑的制備方法的第二實施方案。在該實施方案中，將包含7. 5% w/v的帶有4個由乙烯砜官能化的手臂的支化PEG的溶液A與包含2% w/v的含有RGD序列的肽溶液C在混合步驟2中混合。例如，將包含7. 5% w/v的四分枝官能化的PEG的275mL溶液A與含有2% w/v生物活性化合物的5mL溶液C混合。然后，將此溶液隨即與包含1% w/v的含有兩個半胱氨酸的肽連接體溶液B在混合步驟I中混合，所述兩個半胱氨酸一個接近于C端而另一個接近
于N端。隨后，將如此得到的前體溶液4進(jìn)行無菌過濾步驟5，得到濾液前體溶液6。然后，對該溶液進(jìn)行凍干步驟7，得到粉末形式的水凝膠前體制劑8。圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的水凝膠前體制劑的制備方法的第三實施方案。將包含7. 5% w/v的帶有4個由乙烯砜官能化的手臂支化PEG的溶液A與包含1% w/v含有兩個半胱氨酸的肽序列的溶液B在步驟I中混合，所述兩個半胱氨酸一個接近C端而另一個接近N端。溶液A和B通過將相應(yīng)的化合物分別懸浮在蒸餾水中來制備。借助磁力攪拌器優(yōu)選以400RPM下持續(xù)攪拌進(jìn)行混合。隨后，對如此得到的前體溶液4進(jìn)行無菌過濾步驟5，得到經(jīng)過濾的前體溶液6。然后將得到的溶液在等分步驟9中等分至容器中。每個容器可以僅含有少量，優(yōu)選為0.3-0. 4mL。容器是可密封的，且優(yōu)選由玻璃制造。將等分的前體溶液10在凍干步驟7中凍干以得到前體制劑粉末8。
權(quán)利要求
1.一種水凝膠前體制劑，其包含至少一種結(jié)構(gòu)性化合物和至少一種連接體化合物，其 中所述結(jié)構(gòu)性化合物與所述連接體化合物可以通過親核試劑與共軛不飽和鍵或基團(tuán)之間的選擇性反應(yīng)來聚合，其特征在于，所述水凝膠前體制劑為未反應(yīng)的粉末形式。
2.如權(quán)利要求I的水凝膠前體制劑，其特征在于，所述制劑還包含至少一種生物活性化合物，優(yōu)選包含RGD肽序列，所述生物活性化合物可以通過親核試劑與共軛不飽和鍵或基團(tuán)之間的選擇性反應(yīng)與所述結(jié)構(gòu)性化合物二聚化。
3.如權(quán)利要求I或2所述的水凝膠前體制劑，其特征在于，所述結(jié)構(gòu)性化合物為具有乙烯砜端基的多支化聚乙二醇，優(yōu)選為PEG-三(乙烯砜)或PEG (四乙烯砜)。
4.如權(quán)利要求I至3中任一項所述的水凝膠前體制劑，其特征在于，所述連接體包含至少兩個親核基團(tuán)，優(yōu)選硫醇基團(tuán)。
5.如權(quán)利要求I至4中任一項所述的水凝膠前體制劑，其特征在于，所述連接體為肽，所述肽包含至少兩個半胱氨酸，所述兩個半胱氨酸優(yōu)選位于所述肽的N端和C端?！?br> 6.如權(quán)利要求I至5中任一項所述的水凝膠前體制劑，其特征在于，選擇所述結(jié)構(gòu)化合物和/或所述連接體化合物，從而使得所述選擇性反應(yīng)在pH于4. O或4. O以下時被阻止。
7.如權(quán)利要求6所述的水凝膠前體制劑，其特征在于，pH為7.5時的反應(yīng)速率是pH為7.0時反應(yīng)速率的至少2倍。
8.一種制備粉末形式的水凝膠前體制劑，特別是根據(jù)權(quán)利要求I至7中所述的粉末形式的水凝膠前體制劑的方法，所述方法包括以下步驟 —提供至少一種結(jié)構(gòu)性化合物的第一溶液A ； —提供包含至少一種連接體化合物的第二溶液B ； —將溶液A與B混合(I);和 一將得到的前體溶液凍干(7)； 其中，所述的至少一種結(jié)構(gòu)性化合物與至少一種連接體化合物通過親核試劑與共軛的不飽和鍵或基團(tuán)之間的選擇性反應(yīng)來聚合，其特征在于，所述溶液A和B在阻止所述選擇性反應(yīng)的條件下混合(I)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述溶液在pH4.O或4. O以下混合(I)，優(yōu)選為pH 3. 5。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法,其特征在于，所述溶液A包含5-10%w/V的至少一種結(jié)構(gòu)性化合物，優(yōu)選為7. 5%w/v。
11.如權(quán)利要求8至10中任一項所述的方法，其特征在于，所述溶液B包含O.l-2%w/v的至少一種連接體化合物，優(yōu)選為l%w/v。
12.如權(quán)利要求8至11中任一項所述的方法，其特征在于，所述溶液C包含至少一種生物活性化合物，所述生物活性化合物可以通過親核試劑與共軛的不飽和鍵或基團(tuán)之間的選擇性反應(yīng)來與所述結(jié)構(gòu)性化合物二聚化，在混合所述溶液A和B (I)之前，將所述生物活性化合物加入到溶液A中(2)。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述溶液C包含O.l-10%w/v的，優(yōu)選地2%的至少一種活性化合物。
14.如權(quán)利要求8至13中任一項所述的方法，其特征在于，所述溶液A、溶液B和/或溶液C為所述至少一種結(jié)構(gòu)性化合物、所述至少一種連接體化合物或所述至少一種生物活性化合物在蒸餾水中的溶液。
15.如權(quán)利要求8至14中任一項所述的方法，其特征在于，選擇所述化合物的濃度使得親核試劑與共軛不飽和鍵或基團(tuán)的摩爾比為O. 8:1至I. 3:1。
16.如權(quán)利要求8至15中任一項所述的方法，其特征在于，在凍干步驟(7)之前，將所述前體溶液過濾(5 )，優(yōu)選為無菌過濾。
17.如權(quán)利要求8至16中任一項所述的方法，其特征在于，將所述前體溶液等分(9)并裝入容器中，優(yōu)選在凍干步驟(7)之前于無菌條件下進(jìn)行。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，在凍干步驟(7)之后，將所述容器用無菌氮氣填充并立即加蓋。
19.如權(quán)利要求I至7中任一項所述的水凝膠前體制劑在制備水凝膠中的用途。
20.一種組件試劑盒，其包括至少一個填充以權(quán)利要求I至7中任一項所述的水凝膠前體制劑的容器和具有反應(yīng)緩沖液的容器。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組件試劑盒，其特征在于，所述的反應(yīng)緩沖液的pH至少為7，優(yōu)選地，所述反應(yīng)緩沖液的pH為7至8。
22.制備水凝膠的方法，其包括以下步驟 一將權(quán)利要求1-7中所述的水凝膠前體制劑再懸浮在至少為pH7的緩沖液中； 一任選地將細(xì)胞培養(yǎng)懸浮液加入至該前體懸浮液； 一使用該前體懸浮液來澆注凝膠前體； 一將凝膠前體聚合至少30分鐘，優(yōu)選地在37°C的恒溫箱中進(jìn)行聚合。
全文摘要
本發(fā)明涉及水凝膠前體制劑、其制備方法和包含所述制劑的試劑盒以及利用所述制劑制備水凝膠的方法。所述的前體制劑包含至少一種結(jié)構(gòu)性化合物和至少一種連接體化合物，所述結(jié)構(gòu)性化合物優(yōu)選為乙烯砜(丙烯酸支化的)聚(乙二醇)，所述連接體化合物可以通過親核試劑與共軛的不飽和鍵或基團(tuán)之間的選擇性反應(yīng)聚合。所述的前體制劑是粉末形式的。
文檔編號C08G65/00GK102858845SQ201180020044
公開日2013年1月2日 申請日期2011年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月22日
發(fā)明者S·里茲, M·盧托爾夫 申請人:Q吉爾股份有限公司