專利名稱：一種能智能釋放藥物的納米膠束及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于高分子化學和生物醫(yī)學工程領域，具體涉及一種新型藥物載體材料一能智能釋放藥物的納米膠束及其制備方法和應用。
背景技術：
癌癥是危害人類健康的最主要疾病之一。據(jù)國際抗癌聯(lián)盟發(fā)布的數(shù)據(jù)可知，2008 年，全球有1270萬人得了癌癥，死亡達760萬人。如果不采取有效措施，預計到2030年，每年將出現(xiàn)沈00萬新增癌癥病例，癌癥死亡人數(shù)將達1700萬。無論在世界范圍內，還是在中國，癌癥已成為人類第一位死因。所以，發(fā)展有效的癌癥治療手段對促進國人健康具有重大
眉、ο抗癌藥物化療是除手術以外最重要的癌癥治療手段。在癌癥的化學療法中，許多療效顯著的抗癌藥物如阿霉素(Doxorubicin，D0X)、紫杉醇(Paclitaxel)等親水性都很低，很難直接被肌體吸收和利用，而且直接使用對健康組織具有很強的毒副作用，循環(huán)時間太短以致不能發(fā)揮最佳的療效，大大地限制了其應用。因此，利用聚合物膠束作為藥物載體將其高效準確地傳輸?shù)讲≡畈课?，是當前的研究熱點。但是，一般的納米載藥膠束也有其不足(i )膠束粒徑容易被吞噬，肌體內循環(huán)半衰期不長，不能發(fā)揮最佳療效；(n )在生理條件下，膠束不是很穩(wěn)定，容易解體，造成突釋，不能長時間讓藥物維持在一個穩(wěn)定有效的濃度；( )膠束本身的載藥量不高，這極大地限制了其作為藥物載體的應用。而交聯(lián)膠束是新興的研究熱點，被認為有助于克服上述缺點，提高膠束穩(wěn)定性和同時提高載藥率。迄今為止，盡管納米聚合物膠束在治療試劑的傳輸，比如抗癌小分子藥物，表現(xiàn)了極大的潛力。特別是已經(jīng)報道的大部分聚合物納米膠束都有一種典型的藥物釋曲線，但這些曲線對藥物在腫瘤細胞內的最大優(yōu)化利用沒有起到作用。也就是說，在膠束形成后，通過物理包載的藥物在幾個小時內達到2(Γ30%的暴釋，隨后是持續(xù)很多天非常慢的藥物擴散。 這導致了藥物儲存于膠束中以及膠束在血液的循環(huán)中，藥物會發(fā)生沒有目標性的泄漏。由于這些原因，藥物不僅難以達到有效的細胞內藥物濃度，而且會導致癌細胞的抗藥性。因此，發(fā)展具有良好藥物釋放性能的傳遞系統(tǒng)有很大的作用。最有希望的策略之一是建構一種聚合物納米膠束，這種膠束能對特殊的刺激產(chǎn)生敏感，比如光照，酶降解，還原，ρΗ值的變化等。酸性觸發(fā)的藥物釋放能在腫瘤組織( 11值6.5)或者腫瘤細胞的溶酶體(ρΗ值5.0) 中得到實現(xiàn)，采用從帶有酸敏嵌段的共聚物組裝成的納米膠束能發(fā)生PH值敏感的親-疏水性的轉換。而且，這些酸敏感的納米膠束在中性條件下不會發(fā)生藥物泄漏，但仍然會在樣品制備完成幾小時后發(fā)生藥物暴釋。而且，在血液循環(huán)中，當聚合物膠束的濃度逐漸降低至 CMC以下時，超分子納米組裝體容易解體，這是藥物傳輸過程中藥物損失的另外一個原因。 盡管暴釋和解體導致游離藥物的損失能用藥物通過共價鍵作用于運輸載體來克服，不幸的是大多數(shù)藥物沒有可以發(fā)生共價作用的活性基團。對比而言，自組裝納米膠束的核或殼共價交聯(lián)已經(jīng)出現(xiàn)作為一種靈活的策略來阻止因膠束的降解而導致藥物的損失，這不需要藥物有任何活性基團。而且，已經(jīng)有報道在中性條件下殼交聯(lián)在減少藥物從交聯(lián)膠束的泄漏的可能性。在各種途徑中，二硫鍵可逆交聯(lián)的利用對用于藥物控制釋放的殼交聯(lián)膠束的制備特別重要。二硫鍵是可還原的，因此能通過交換反應被GSH (—種含巰基的多肽)打開。實際上，用含二硫鍵作為交聯(lián)劑的殼交聯(lián)交束已經(jīng)表現(xiàn)很大的潛力使藥物在細胞里的表現(xiàn)特殊的釋放。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術的上述不足，提供一種具有藥物智能釋放，能夠先暴釋后緩釋，提高藥物利用效率和治療效果的藥物載體材料——可智能釋放藥物的納米膠束。本發(fā)明的另一目的是提供上述納米膠束的制備方法。本發(fā)明的又一目的是提供上述納米膠束在作為藥物載體中的應用。本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)上述目的
一種能智能釋放藥物的納米膠束，其成分為聚乙二醇-聚(天冬氨酸-半胱氨酸)-聚 (天冬氨酸-二異丙基乙二胺)，英文簡寫為PEG-PAsp (MEA) -PAsp (DIP)。該納米膠束的疏水段具有酸敏響應性，能發(fā)生PH值敏感的親-疏水性的轉換；同時，交聯(lián)中間層帶有二硫鍵， 對還原試劑具有敏感性。兩親性聚合物PEG-PAsp (MEA) -PAsp (DIP)中間層帶有可交聯(lián)巰基，該兩親性聚合物的結構中聚乙二醇段的數(shù)均分子量為0. 2 10KD，聚(天冬氨酸-半胱胺酸)段的數(shù)均分子量為0.2 10KD，聚(天冬氨酸-二異丙基乙二胺)的數(shù)均分子量為0. 2 10KD。上述PEG-PAsp (MEA)-PAsp (DIP)的制備方法步驟如下用PEG-NH2為引發(fā)劑，引發(fā)BLA-NCA合成聚合物PEG-PBLA，然后PEG-PBLA進行溴化反應，合成PEG-PBLA-COCH2Br, PEG-PBLA-COCH2Br繼續(xù)進行疊氮化反應，合成PEG-PBLA-N3,同時，用丙炔胺作為引發(fā)劑弓I發(fā)BLA-NCA合成PA-PBLA，PA-PBLA再與N，N- 二異丙基乙二胺進行胺解反應，合成 PA-PAsp (DIP)，然后在溴化亞銅/五甲基二乙烯基三胺為催化劑的催化下，將PEG-PBLA-N3 和 PA-PAsp (DIP)進行點擊反應，合成 PEG-PBLA-PAsp (DIP)，將 PEG-PBLA-PAsp (DIP)用 2-氨基乙硫醇進行胺解反應，合成兩親性聚合物PEG- PAsp (MEA) -PAsp (DIP)。上述步驟中溴化亞銅/五甲基二乙烯基三胺是溴化亞銅和1，1，4，7，7-五甲基二乙烯基三胺以摩爾比為1:1組成的混合物。一種負載納米金的納米膠束，是通過原位還原法在聚乙二醇-聚(天冬氨酸-半胱氨酸)-聚(天冬氨酸-二異丙基乙二胺)上負載納米金得到的產(chǎn)物。原位還原法可按本領域常規(guī)操作進行。上述納米膠束或負載納米金的納米膠束可作為疏水性藥物的載體，尤其是疏水性抗腫瘤藥物，如阿霉素等。本發(fā)明的聚合物PEG-PAsp (MEA) -PAsp (DIP)納米膠束由親水段聚乙二醇 (Polyethyeneglycol,可簡寫為PEG)、中間層聚(天冬氨酸-半胱胺酸)[簡寫為 PAsp(MEA)]的交聯(lián)層和疏水段聚(天冬氨酸-二異丙基乙二胺)[簡寫為PAsp(DIP)] 構成。其中疏水段PAsp (DIP)具有良好的鏈柔順性、生物相容性和生物可降解性；親水的 PEG段能夠延長整個藥物載體的血液循環(huán)時間，以避免被網(wǎng)狀內皮組織系統(tǒng)排泄出去。在自組裝過程中，PAsp(DIP)段自發(fā)地形成膠束的疏水性外殼，PEG段位于該殼的外表面，中間層是二硫鍵的交聯(lián)層，其內部含有疏水性抗腫瘤藥物(如脫質子化阿霉素，hydrophobic doxorubicin,可簡寫為 DOX)。本發(fā)明的納米膠束或負載納米金的納米膠束作為藥物載體與疏水性藥物的重量份數(shù)比為5 1000:1組成載藥納米膠束。如納米膠束或負載納米金的納米膠束與疏水性抗腫瘤藥物可以按照重量份數(shù)比為5 1000:1的比例制成載藥納米捆綁凝膠。優(yōu)選比例為 5 20:1。上述載藥納米膠束的制備方法，步驟如下
以納米膠束或負載納米金的納米膠束作為藥物載體，同疏水性抗腫瘤藥物共同作為原料，在PH值為10的條件下自組裝形成中間層交聯(lián)的納米膠束，然后將pH調至7. 4，形成最終包載疏水性抗腫瘤藥物的載藥納米膠束。作為一種優(yōu)選方案，上述制備方法的步驟為以5 1000重量份納米膠束或負載納米金的納米膠束和1重量份的疏水性抗腫瘤藥物為原料，溶于四氫呋喃(THF)和二甲基亞砜(DMSO)按1:1體積比組成的有機溶劑中，同時加入還原劑，打開交聯(lián)的二硫鍵，超聲作用下將上述溶液滴加至PH值為10的碳酸鹽緩沖溶液中，然后通氧氣，這時巰基交聯(lián)成二硫鍵，再經(jīng)過透析除去未包裹的抗腫瘤藥物及有機溶劑，然后將溶液PH值調至7. 4，即得到最終載藥納米膠束。上述步驟中，所述還原劑為二硫蘇糖醇(簡寫為DTT)或谷胱甘肽(簡寫為GSH)等。上述步驟中，所述有機溶劑體積為原料重量的5 1000倍，還原劑加入量為聚乙二醇-聚(天冬氨酸-半胱胺酸)-聚(天冬氨酸-二異丙基乙二胺)的廣1000倍。本發(fā)明中用到的緩沖溶液配方如下
磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(PH5. 0)配制方法將濃度為0. 2mol/L磷酸氫二鈉水溶液103mL和濃度為0. lmol/L檸檬酸溶液97mL混合，即得。PBS (磷酸鹽緩沖液，pH7. 4)的配制方法稱取氯化鈉80克，氯化鉀2克，十二水合磷酸氫二鈉23. 13克，磷酸二氫鉀2克于1000ml的容量瓶中，用蒸餾水定容至1000ml，搖均。將所得溶液稀釋10倍后使用。碳酸鹽緩沖液(pH 10)配制方法稱取無水碳酸鈉63. 6克及碳酸氫鈉33. 6克溶于蒸餾水中稀釋至1000ml。本發(fā)明中英文簡寫的中文全稱對應如下 PEG-NH2 單甲基醚氨基聚乙二醇； BLA-NCA β -天門冬氨酸芐酯N-羧酸酐； PEG-PBLA 單甲基醚聚乙二醇-聚(天冬氨酸)； PEG-PBLA-COCH2Br 端溴代乙?；鶈渭谆丫垡叶?聚(天冬氨酸)； PEG-PBLA-N3 端(乙?；?疊氮基)單甲基醚聚乙二醇_聚(天冬氨酸)； PA-PBLA 端丙炔基聚(天冬氨酸)；
PA-PAsp (DIP)端丙炔基聚(天冬氨酸-二異丙基乙二胺)；
PEG-PBLA-PAsp(DIP)聚乙二醇-聚(天冬氨酸)_聚(天冬氨酸-二異丙基乙二胺)； PEG-PBLA (MEA)-PAsp (DIP)聚乙二醇-聚(天冬氨酸-半胱氨酸)_聚(天冬氨酸-二
異丙基乙二胺)；PAsp(DIP)聚(天冬氨酸-二異丙基乙二胺)； PAsp (MEA)聚(天冬氨酸-半胱胺酸)；
PEG-PBLA-COCH2N3 與PEG-PBLA-N3是同一種物質，端(乙?；?疊氮基)單甲基醚聚乙二醇-聚(天冬氨酸))
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果
(1)該納米膠束由聚乙二醇與聚天冬氨酸的兩親性共聚物制成，PEG作為親水段能夠延長載藥膠束的血液循環(huán)時間，而聚天冬氨酸作為疏水段則具有合適的鏈柔順度和優(yōu)良的生物活性。(2)該納米膠束的平均粒徑僅為59. 4nm,有利于在人體內的細胞吸收。(3)該納米膠束中間層是一層可逆的二硫鍵交聯(lián)層，該交聯(lián)層能穩(wěn)定疏水段的作用；交聯(lián)的巰基(二硫鍵)能通過還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)或者谷胱甘肽(GSH)等打開， 即該納米膠束具有還原敏感性。(4)該納米膠樹疏水段具有酸敏性，能發(fā)生pH值敏感的親-疏水性的轉換。(5)該納米膠束能通過原位還原法負載納米金，得到膠束外層是納米金修飾的納米膠束，納米金能使膠束在細胞中起定位作用。


圖1.實施例1中空白納米膠束的動態(tài)光散射拋物線圖； 圖2.實施例2中載藥納米膠束的動態(tài)光散射拋物線圖3.實施例3中納米金修飾的納米膠束的動態(tài)光散射拋物線圖4.實施例1中pH5. 0條件下膨脹后的膠束動態(tài)光散射拋物線圖5.實施例1中pH7. 4加DTT打開二硫鍵后納米凝膠膠束的動態(tài)光散射拋物線圖6.實施例1中空白納米膠束的透射電子顯微鏡圖片；
圖7.實施例3中納米金修飾的納米膠束的透射電子顯微鏡圖片；
圖8.實施例1中pH 5. 0條件下膨脹后的膠束的透射電子顯微鏡圖片；
圖9.實施例1中pH 7. 4加DTT打開二硫鍵后納米凝膠的透射電子顯微鏡圖片；
圖10.實施例1中納米膠束解體后的透射電子顯微鏡圖片；
圖11.實施例4中DOX的標準曲線；
圖12.實施例5中各種L -半胱氨酸的濃度和相對應的TNB吸光度對應的標準曲線； 圖13.實施例5中各種L -半胱氨酸的濃度和相對應的TNB吸光度對應的拉曼光譜
圖14.實施例6載藥納米膠束的藥物體外釋放曲線； 圖15.實施例7中載藥納米膠束的細胞毒性分析； 圖16.實施例7中空膠束的細胞毒性分析；
圖17.實施例8載藥納米膠束在老鼠體內對腫瘤的治療效果的實驗結果分析。
具體實施例方式以下通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明的技術方案，實施例中除特殊說明外均為本領域常規(guī)步驟。
本發(fā)明基于兩親性共聚物PEG-PAsp (MEA)-PAsp (DIP)的納米膠束被用于傳輸疏水性抗腫瘤藥物，所得納米膠束的大小、形狀、酸敏粒徑、酸敏熒光等基本性能分別采用動態(tài)光散射、透射電子顯微鏡和熒光光度儀等來測定，其對疏水性抗腫瘤藥物包負能力的大小則采用紫外可見分光光度計來進行測定，并通過體外吸收試驗來檢測載藥納米膠束體系的治療效果。此外，該載藥納米膠束還通過細胞實驗和動物實驗來評價這一潛在的傳輸抗腫瘤藥物到腫瘤細胞的體系，即采用人肝癌細胞株(human hepatocellular carcinoma BEL-7402 cells，可簡寫為Bel_7402)來進行體外的細胞毒性實驗，以分別測定空白納米膠束和負載抗癌藥物的納米膠束(如包附D0X，可簡寫為DOX-micelles)的細胞毒性。同時，在皮下種有Bel-7402腫瘤細胞的BALB/C裸鼠上進行載藥納米膠束對腫瘤生長遏制的實驗， 藥物通過靜脈注射進入老鼠體內，然后觀察隨著時間的變化腫瘤體積的變化。以下實施例中，如無特殊說明，均為本領域常規(guī)實驗試劑和操作步驟。實施例中緩沖液以PH值表示，如pH5. 0的緩沖液是指磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH7. 4的緩沖液為磷酸鹽緩沖液PBS，pH 10的緩沖液指碳酸鹽緩沖液。實施例1納米膠束PEG-PAsp (MEA)-PAsp (DIP)的制備 1.聚合物PEG-PBLA的制備
該聚合物以PEG-NH2為引發(fā)劑，通過BLA-NCA的開環(huán)聚合反應得到。將0. 8 g PEG-NH2 (0. 4mmol,2000 g/mol)加至100 mL反應瓶中，用50mL無水二氯甲烷溶解。稱取1. 0 g BLA-NCA (4 mmol，M9. 22g/mol)，加5 mL無水DMF (N，N-二甲基甲酰胺)溶解。將溶解的 BLA - NCA溶液轉入裝PEG-NH2的反應瓶中，于35°C下攪拌反應72h。反應結束后，將反應液滴入過量的冷乙醚(如500ml)中沉淀，經(jīng)抽濾和無水乙醚的反復洗滌，真空干燥得到最終產(chǎn)物。2.聚合物 PEG-PBLA-COCH2Br 的制備
稱取0.9 g PEG-PBLA(3025 g/mol,0. 3 mmol)于 25 mL反應瓶中，用 15 mL CHCl3進行溶解，然后加入 0.22 mL 三乙胺(101. 19 g/mol, 0. 70 g/mL, 1. 5 mmol,、eq)和 78 μ L 溴代乙酰溴(201. 86 g/mol, 2. 317 g/mL, 0.9 mmol廣3eq)，密封，室溫攪拌反應24 h。反應完畢，將反應液在冷乙醚中沉淀，抽濾，真空抽干，得到最終產(chǎn)物。3.聚合物 PEG-PBLA-N3 的制備
稱取 0.9g PEG-PBLA-COCH2Br (3136 g/mol,0. 29 mmol)于 25 mL 反應瓶中，加入 10 mL DMF進行溶解，再往反應瓶中加入0.094 g NaN3 (65.01 g/mol, 14. 5 mmol廣10eq)，室溫攪拌反應M h。反應完畢，反應液用1000 Da透析袋在超純水中透析。透析完畢，凍干，得到終產(chǎn)物。4.聚合物PA-PBLA的制備
將 55 μ L 丙炔胺(0. 8mmol,55. 08g/mol,0. 803/mL)加至 100 mL 反應瓶中，再加入 50mL 干燥的CH2Cl2,搖勻。用50mL燒杯稱取5 g BLA-NCA，加入5mL DMF溶解。然后將DMF溶液滴加到CH2Cl2溶液中，然后置于35 °C下攪拌反應72 h。反應結束后，將混合液滴入過量的冷乙醚(如500mL)中沉淀，經(jīng)抽濾和無水乙醚的反復洗滌，真空干燥得到最終產(chǎn)物。5.聚合物 PA-PAsp (DIP)的制備
稱取 2. 92 g PA-PBLA (2305 g/mol, 1. 26 mmol)于 25 mL 的反應管中，加入 8 mL 反應級DMF進行溶解。溶解完畢，加入1. 1 mL N，N-二異丙基乙二胺(144. 26 g/mol,0. 83 g/ mL，6. 33 mmol,、eq)后，于35 °C下攪拌反應M h。反應完畢，反應液裝在透析袋(MWC0: 1000 Da)中于無水甲醇中透析除去雜質，得到終產(chǎn)物。6.聚合物 PEG-PBLA-PAsp (DIP)的制備
以溴化亞銅/五甲基二乙烯基三胺為催化體系，在40°C下進行PEG-PBLA-COCH2N3與 PA-PAsp (DIP)的點擊反應(click反應)。稱取0.9g Peg-PBLA-COCH2N3 (3098 g/mol,0. 3 mmol)和 0. 94g PA-PAsp (DIP) (2629 g/mol,0. 36 mmol)于25 mL反應管中，加入10 mL DMF溶解，然后再加入 1，1，4，7，7-五甲基二乙烯基三胺(0. 36 mmol)和溴化亞銅(0. 36 mmol)，反應液于40 °〇下攪拌反應48 h。反應完畢，將反應液沉淀于無水冷乙醚中，抽濾，真空抽干，得到終產(chǎn)物。
7.聚合物 PEG-PAsp (MEA) -PAsp (DIP)的制備
稱取 0. 8 PEG-PBLA-PAsp (DIP) (5059g/mol, 0. 16mmol)于 10ml 反應管，用 4 mL DMSO 溶解，再加入半胱胺鹽酸鹽0.036g(113.61g/mol廣2 eq.)和乙三胺( 4 eq.)，于35°C下充分攪拌反應12 h。將反應物在無水甲醇中透析除去雜質。透析完畢，旋干，真空抽干，既得到終產(chǎn)物空白納米膠束。8.膠束 PEG-PAsp (MEA)-PAsp (DIP)的制備
將IOmg聚合物PEG-PAsp (MEA) -PAsp (DIP)溶于2ml DMSO中，在超聲下滴至20ml PBS (pH7. 4)中，將該溶液通氧氣池后，在PBS(pH7. 4)中透析2d，得到膠束溶液。所得膠束的粒徑大小采用動態(tài)光散射系統(tǒng)進行測量，其形態(tài)則通過透射電子顯微鏡來觀察確定，測試結果分別見圖1和圖6。從透射電子顯微鏡圖片可以明顯地看出兩親性聚合物在水溶液中自組裝成“實心球”；從動態(tài)光散射拋物線圖可以看出，空白納米膠束的粒徑為3(Tl00nm，平均粒徑為59. 4nm。如果將膠束PBS (pH7. 4)溶液的pH值用HCl溶液調至5. 0，膠束會發(fā)生膨脹，平均粒徑增大至沈9. 6nm，采用動態(tài)光散射系統(tǒng)進行測量的粒徑見圖4，其形態(tài)則通過透射電子顯微鏡來觀察，結果見圖8。因為通過透射電子顯微鏡測試前，要將膠束溶液滴在銅網(wǎng)上干燥，所以膠束發(fā)生脫水，粒徑稍微變小，但在圖8中可以看到縮小前的水紋。如果往膠束PBS (pH7. 4)溶液中加入IOmM的DTT (10倍于聚合物中的巰基)，交聯(lián)酸敏膠束的交聯(lián)層中的二硫鍵打開，膠束的平均粒徑增大至M4nm，采用動態(tài)光散射系統(tǒng)進行測量的粒徑見圖5，其形態(tài)則通過透射電子顯微鏡來觀察，結果見圖9。如果將膠束PBS (pH7. 4)溶液的pH值用HCl溶液調至5. 0后，再加入IOmM的DTT (10倍于聚合物中的巰基)，膠束會發(fā)生解體，其形態(tài)則通過透射電子顯微鏡來觀察，結果見圖10。實施例2載藥納米膠束的制備
5mg PEG-PAsp (MEA)-PAsp (DIP)聚合物和 Img DOX共溶于 THF和 DMSO (lmL, v/v=l/l) 的混合溶劑中，加入三乙胺調節(jié)溶液PH值到10，同時加入DTT (10 eq于聚合物)還原聚合物中存在的二硫鍵，持續(xù)30min。在超聲條件下，上述溶液慢慢滴至PBS CpH 7. 4)溶液中，所得混合液通氧氣濁后，裝于透析袋(MWC0: 1000 Da)中，在PBS (pH7. 4)溶液中邊通氧氣邊透析2 d，得到載藥納米膠束。所得載藥納米膠束的粒徑大小采用動態(tài)光散射系統(tǒng)進行測量，測試結果見圖2。從動態(tài)光散射拋物線圖可以看出，由于疏水性DOX的負載增大了膠束疏水核，載藥納米膠束的平均粒徑為83 nm。實施例3負載納米金納米捆綁凝膠的制備
取ImL實施例1制備的納米膠束溶液(0. 4mg/mL, pH7. 4)，加入20 μ L的HauCl4 (lmg/ mL)，將pH值調節(jié)并維持在7. 4，攪拌15min，然后加入20 μ L羥胺(50wt%)，繼續(xù)攪拌15min，即得。所得負載納米金的納米膠束的粒徑大小采用動態(tài)光散射系統(tǒng)進行測量，其形態(tài)則通過透射電子顯微鏡來觀察確定，測試結果見圖3和圖7。從動態(tài)光散射拋物線圖可以看出，納米金修飾的納米膠束平均粒徑為103. 6nm。實施例4納米捆綁凝膠的載藥率和包封率的測定
配制一系列DOX濃度的溶液，分別是1、2、5、10、20、50、100μ g/mL。通過紫外測量及分析得到DOX的標準曲線，如圖11。將凍干的負載樣品，溶解在pH值為7. 4的PBS緩沖液中， 采用紫外可見分光光度計測定該樣品溶液在482. 5nm處的吸光度。將吸光度值代入標準曲線方程計算得到DOX濃度，由此得出樣品中DOX的含量，根據(jù)凍干樣品容器和凍干后樣品的總質量得到干品質量，從而算出載藥率與包封率，計算公式如下 載藥率=膠束中DOX的含量/納米捆綁凝膠的質量X 100% 包封率=膠束中DOX的含量/DOX投料量X 100%
按照實例2的方法制備交聯(lián)載藥納米膠束，測得載藥納米膠束的載藥率為10. 50%，包封率為32. 72%。
實施例5納米膠束的交聯(lián)度測定
測量巰基含量的具體操作方法如下在氬氣保護下，配制具有一系列濃度的L-半胱氨酸(HSCH2CH(NH2)COOH)的 PBS (pH7. 4)溶液各 2. 4 mL，濃度分別為 0、2. 5、5、10、20 μ g/ mL。將0.6 ml (0. 5mg/ml )Ellman’ s試劑加入到上述各溶液中，室溫攪拌下反應15 min, 以生成TNB。然后馬上用紫外分光光度計測量反應生成物在412 nm波長處的吸光度，用各種濃度和相對應的TNB吸光度，制作標準曲線(見圖12)，建立吸光度-L -半胱氨酸濃度的擬合方程(Y=0. 079X -0.0117，R2=O. 999)。在氬氣保護下，稱取2 mg聚合物PEG-PAsp (MEA)-PAsp (DIP)，溶解于10 ml PBS (pH7. 4)溶液中，加入過量(IOeq)的還原劑硼氫化鈉進行處理，將二硫鍵還原打開，過量的 NaBH4用超濾管(MWCO: IOOkDa)除掉。然后將0. 6 mL (0. 5mg/mL) Ellman' s試劑加入到上述樣品溶液中，室溫攪拌下25 °C反應15 min后，馬上用紫外分光光度計測量樣品在412 nm波長處的吸光度。通過該吸光度和吸光度-L -半胱氨酸濃度的擬合方程，可以計算出納米捆綁凝膠的交聯(lián)度。按照實施例2的方法制備交聯(lián)載藥納米膠束，測得該膠束的交聯(lián)度為88. 45%。 上面方法是定量的測試，同時，通過拉曼光譜可定性測定到二硫鍵的存在(見圖13)。實施例6載藥納米膠束的藥物體外釋放
按照實施例2制備得到的包載DOX膠束溶液(lmg/mL)，定容后，平均分成12份，取其中三份轉移至三個透析袋(Mw cut-off: 14000Da)中，分別放入三個裝有45mL的相同的pH值為7. 4的PBS緩沖溶液的試劑瓶中；三份放在上述同樣的透析袋中，分別放入裝有45mLDTT 溶液(IOmM)的試劑瓶中；三份放在上述同樣的透析袋中，分別放入裝有45mL醋酸鹽緩沖溶液(pH 5.0)試劑瓶中。另外三份凍干后，用于測定負載率。釋放實驗是在37°C恒溫水浴培養(yǎng)搖床中進行。在選擇的時間間隔內，采集透析袋外面的5mL溶液進行紫外測量并加入 5mL新鮮醋酸鹽緩沖液。用波長掃描法測定DOX在482. 5nm處的紫外吸收強度，根據(jù)DOX標準曲線計算膠束中DOX的含量。在分析DOX釋放行為中，以時間對DOX累積釋放量作圖進行分析研究。自由DOX在透析袋中的釋放作為對照實驗。其中，所得結果為三組平行測試實驗的平均值。實驗結果見圖14。可以看出，在pH值為7. 4緩沖溶液中，藥物DOX的釋放量基本為零，說明在pH值為 7. 4時載藥納米膠束是個穩(wěn)定的致密的載藥體系。當在pH值為5. 0緩沖溶液中，載藥納米膠束有少量藥物的釋放，這說明載藥納米膠束在酸性條件下發(fā)生膨脹，部分藥物發(fā)生滲漏。 在PH值為7. 4緩沖溶液中加入IOmM的DTT，DOX快速地從膠束中釋放出來，而且比在pH值為5. 0的條件下要快得多，這是因為二硫鍵被打開后，疏水段發(fā)生大幅度的膨脹，遠遠超過在pH值5. 0條件下膨脹的程度。當在pH值為5. 0緩沖溶液加入IOmM的DTT，載藥納米膠束發(fā)生解體，大部分DOX快速釋放出來，5h內已經(jīng)釋放了接近65%的藥物，但隨后的藥物慢慢釋放出來。這說明了該交聯(lián)酸敏膠束能隨著環(huán)境的變化，智能地控制藥物的釋放，先發(fā)生暴釋，接著是保持緩釋，這明顯提高了藥物利用率和藥物的治療效果。實施例7載藥納米膠束的MTT細胞毒性分析
實驗對象為實施例2制備的載藥納米膠束。細胞增長的抑制率即細胞毒性通過經(jīng)典的 MTT進行分析。人類肝癌細胞Bel 7402在每孔0. 3 X IO4數(shù)量級的96孔板中進行種植培養(yǎng)。 在對數(shù)級增長階段進行收割，并最終用含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基調整成170 μ L。 24h之后，在每孔板中使用含有預先設定濃度的自由D0X，負載DOX交聯(lián)膠束以及負載DOX 非酸敏膠束(PEG-PCL，其中PEG分子量2000，PCL分子量3000)的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。在經(jīng)過 72h培養(yǎng)后，在每孔板中加入10 μ L濃度為5mg/mL的MTT鹽溶液(0. 9% NaCl saline)繼續(xù)在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h以允許活性細胞經(jīng)過還原反應把黃色MTT轉化為深蘭色formazan 晶體，然后這種晶體溶解于100 μ LDMSO中，通過酶標儀在540nm及655nm對每個板孔進行檢測。載藥納米膠束的細胞毒性分析和空膠束的細胞毒性分析見圖15、16。由圖15可見，載藥酸敏膠束的細胞毒性處于自由DOX和非酸敏載藥膠束之間，自由DOX毒性最大，非酸敏載藥膠束毒性最小，這說明將藥物包載于納米膠束中，能降低藥物的毒性。同時，載藥納米膠束在細胞內能智能釋放藥物，而非酸敏載藥膠束沒有這個功能，所以載藥納米膠束表現(xiàn)的細胞毒性要比非酸敏載藥膠束的要大。由圖16可見，空載體納米捆綁凝膠作用于 Bel7402細胞，發(fā)現(xiàn)其在所檢測的濃度下細胞存活率很高，在用量7(^g/mL時，細胞存活率仍達到88%以上，說明該納米膠束具有毒性低的特點。實施例8載藥納米膠束在體內對腫瘤的治療效果考察
在皮下種有Bel-7402 t腫瘤細胞的BALB/C裸鼠上進行載藥納米膠束對腫瘤生長遏制的實驗，藥物通過靜脈注射進入老鼠體內，然后觀察隨著時間的變化腫瘤體積的變化。載藥納米膠束用實施例2方法制備。圖17顯示了載藥納米膠束在老鼠體內對腫瘤的治療效果。由圖可見自由DOX對腫瘤基本沒有明顯的治療效果，因為自由DOX在體內迅速擴散了，到達腫瘤部位的量很少。 納米膠束對腫瘤生長有明顯的遏制作用，在20d內能使腫瘤的體積減少至10%，而且治療效果比非酸敏膠束明顯好很多，這是因為酸敏膠束能在腫瘤組織發(fā)生膨脹甚至解體的行為， 導致DOX的高效釋放，因為腫瘤組織的pH值大約只有6. 5，比正常細胞的pH值為7. 4的偏酸，甚至腫瘤細胞溶酶體內的PH值為5左右，更有利于酸敏載體發(fā)生藥物的智能釋放。
權利要求
1.一種能智能釋放藥物的納米膠束，其特征在于成分為聚乙二醇-聚(天冬氨酸-半胱氨酸)-聚(天冬氨酸-二異丙基乙二胺)。
2.根據(jù)權利要求1所述能智能釋放藥物的納米膠束，其特征在于所述聚乙二醇-聚(天冬氨酸-半胱氨酸)-聚(天冬氨酸-二異丙基乙二胺)結構中聚乙二醇段的數(shù)均分子量為 0. 2^10 KD，聚(天冬氨酸-半胱氨酸)段的數(shù)均分子量為0.2 10 KD，聚(天冬氨酸-二異丙基乙二胺的數(shù)均分子量為0. 2 10 KD。
3.權利要求1或2所述能智能釋放藥物的納米膠束的制備方法，其特征在于步驟如下用PEG-NH2為引發(fā)劑，引發(fā)BLA-NCA合成聚合物PEG-PBLA，然后PEG-PBLA進行溴化反應，合成 PEG-PBLA-COCH2Br, PEG-PBLA-COCH2Br 繼續(xù)進行疊氮化反應，合成 PEG-PBLA-N3, 同時，用丙炔胺作為引發(fā)劑引發(fā)BLA-NCA合成PA-PBLA，PA-PBLA再與N，N- 二異丙基乙二胺進行胺解反應，合成PA-PAsp (DIP)，然后在溴化亞銅/五甲基二乙烯基三胺的催化下，PEG-PBLA-N3 和 PA-PAsp (DIP)進行點擊反應，合成 PEG-PBLA-PAsp (DIP)，將 PEG-PBLA-PAsp(DIP)用2-氨基乙硫醇進行胺解反應，合成聚乙二醇-聚(天冬氨酸-半胱氨酸)-聚(天冬氨酸-二異丙基乙二胺)。
4.權利要求1或2所述能智能釋放藥物的納米膠束在作為疏水性藥物載體中的應用。
5.一種負載納米金的納米膠束，其特征在于通過原位還原法在聚乙二醇-聚(天冬氨酸-半胱氨酸)-聚(天冬氨酸-二異丙基乙二胺)上負載納米金得到的產(chǎn)物。
6.權利要求4所述負載納米金的納米膠束在作為疏水性藥物載體中的應用。
7.一種載藥納米膠束，其特征在于是由權利要求1或2所述可智能釋放藥物的納米膠束，或者權利要求5所述負載納米金的納米膠束與疏水性藥物按照重量份數(shù)比為5 1000:1 的比例組成。
8.權利要求7所述載藥納米膠束的制備方法，其特征在于步驟為以可智能釋放藥物的納米膠束或負載納米金的納米膠束作為載體，與疏水性藥物在PH值為10的條件下自組裝形成中間層交聯(lián)的納米膠束，然后將PH調至7. 4，形成最終的包載疏水性藥物的載藥納米膠束。
9.根據(jù)權利要求8所述載藥納米膠束的制備方法，其特征在于步驟為取5 1000重量份可智能釋放藥物的納米膠束或負載納米金的納米膠束，加上1重量份的疏水性藥物， 作為原料，溶于四氫呋喃和二甲基亞砜按1:1體積比組成的有機溶劑中，同時加入還原劑， 打開交聯(lián)的二硫鍵，超聲作用下將上述溶液滴加至PH值為10的碳酸鹽緩沖溶液中，然后通氧氣，再經(jīng)過透析除去未包裹的藥物及有機溶劑，然后，將溶液PH值調至7. 4，即得到最終的載藥納米膠束。
10.根據(jù)權利要求8所述載藥納米膠束的制備方法，其特征在于所述還原劑為二硫蘇糖醇或谷胱甘肽；所述有機溶劑體積為原料重量的5 1000倍；還原劑加入量為聚乙二醇-聚(天冬氨酸-半胱胺酸)_聚(天冬氨酸-二異丙基乙二胺)的廣1000倍。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能智能釋放藥物的納米膠束及其制備方法和應用。本發(fā)明的納米膠束成分為聚乙二醇-聚(天冬氨酸-半胱氨酸)-聚(天冬氨酸-二異丙基乙二胺)，其制備方法是先合成PEG-PBLA-N3和PA-PAsp(DIP)，然后以溴化亞銅/五甲基二乙烯基三胺為催化體系，將PEG-PBLA-N3和PA-PAsp(DIP)進行點擊反應合成PEG-PBLA-PAsp(DIP)，再經(jīng)過2-氨基乙硫醇進行胺解反應，得到最終聚合物PEG-PAsp(MEA)-PAsp(DIP)。本發(fā)明的納米膠束可以作為疏水性藥物載體。本發(fā)明的納米膠束對pH值變化敏感，同時中間交聯(lián)層的二硫鍵對還原劑敏感，具有智能釋放藥物的特點。
文檔編號C08G81/00GK102391517SQ20111023708
公開日2012年3月28日 申請日期2011年8月18日 優(yōu)先權日2011年8月18日
發(fā)明者帥心濤, 戴箭, 林樹東 申請人:中山大學