專利名稱：利用分子印跡聚合物凈化磺胺類藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物化學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體的說，是一種利用分子印跡聚合物凈化磺胺類藥物的方法。
背景技術(shù)：
磺胺類藥物一種廣泛使用的人畜共用的藥物，它能夠干擾細(xì)菌對氨基苯甲酸的利用，從而影響細(xì)菌DNA的合成。如果使用不當(dāng)會造成殘留。由于磺胺類藥物在動物體內(nèi)的代謝時間很長，所以很容易導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的藥物殘留?；前奉愃幬餁埩舻奈：π员憩F(xiàn)在以下幾個方面可導(dǎo)致機(jī)體的過敏反應(yīng)；誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生；侵害神經(jīng)系統(tǒng)，從而對后代的智力發(fā)育產(chǎn)生影響；破環(huán)機(jī)體的造血系統(tǒng)，導(dǎo)致各種貧血癥的發(fā)生；另外磺胺類藥物的殘留還有很強(qiáng)的致癌、致畸、致突變的作用。由于磺胺類獸藥殘留情況時有發(fā)生，而且危害日益嚴(yán)重，很多國家都出臺了相關(guān)的法律和標(biāo)準(zhǔn)限制磺胺類藥物在農(nóng)產(chǎn)品中的使用。我國農(nóng)業(yè)部也從2006年起，把畜產(chǎn)品中磺胺藥物的殘留作為繼鹽酸克倫特羅之后又一個重點(diǎn)監(jiān)控對象。在對外貿(mào)易活動中，磺胺的殘留檢測能力已經(jīng)成為很多發(fā)達(dá)國家對我國農(nóng)產(chǎn)品出口設(shè)置的技術(shù)性貿(mào)易壁壘，給我國動物性產(chǎn)品中磺胺類藥物的殘留檢測能力增加了新的考驗(yàn)。由于樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，常規(guī)檢測方法和儀器往往無法從復(fù)雜的樣品中準(zhǔn)確的檢測到痕量的藥物殘留。而且復(fù)雜的基質(zhì)也會影響檢測儀器的壽命，增加檢測成本。所以如何去除樣品基質(zhì)的影響，高效而快速的富集、純化待檢樣品中的痕量藥物，成為目前磺胺類藥物殘留分析的研究重點(diǎn)。由于動物性食品的基質(zhì)復(fù)雜，而磺胺類藥物往往痕量存在，所以有必要對其進(jìn)行前處理，從而提高檢測的靈敏度。目前通用的前處理的方法有液液分配、固相萃取、免疫柱層析技術(shù)等，其中固相萃取技術(shù)因?yàn)椴僮骱唵?，?jié)約試劑，可同時處理多個樣品而得到廣泛應(yīng)用。但是由于目前常用的固相萃取的填料與吸附目標(biāo)物的作用都是非特異的，固定相的選擇性低，易受復(fù)雜基質(zhì)的干擾，限制了該項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展。分子印跡技術(shù)是基于分子識別基礎(chǔ)上一種功能聚合物制備技術(shù)，該聚合物合成時采用目的分子或者類似物作為模板，合成后將模板洗脫后，內(nèi)部保留和目的分子互補(bǔ)的空間結(jié)構(gòu)和基團(tuán)，且具有“記憶” 功能，可特異的和模板分子發(fā)生作用，并通過相應(yīng)的方式洗脫，從而達(dá)到純化和富集目的分子的作用。由于分子印跡聚合物是采用化學(xué)方法合成的，具有抵抗酸堿等惡劣環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)， 可重復(fù)使用，所以應(yīng)用越來越廣泛。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，Su等采用表面印跡技術(shù)合成了磺胺甲嘧啶的 MII^s，合成的聚合物對磺胺甲嘧啶具有良好的親和性，并應(yīng)用到牛奶中磺胺甲嘧啶的檢測。 I sarankura-Na-Ayudhya等通過計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)研究了磺胺的印跡過程，指出氫鍵在印跡過程中占主導(dǎo)作用，其研究還比較了甲基丙烯酸和乙烯咪唑作為印跡單體的印跡效果。 He等采用表面印跡技術(shù)，用磺胺甲嘧啶作為模板，合成了對磺胺甲嘧啶、磺胺噻唑和磺胺甲基嘧啶都有親和力的MIPs，該研究采用在線固相萃取和HPLC聯(lián)用的方法檢測了豬肉和雞肉中的磺胺類獸藥殘留，回收率達(dá)到67%。劉慧君等采用犧牲硅膠法合成了磺胺二甲嘧啶的MIPs，并對其理化性質(zhì)進(jìn)行了研究。Su等采用表面印跡技術(shù)合成了磺胺甲嘧啶的 MII^s，合成的聚合物對磺胺甲嘧啶具有良好的親和性，并應(yīng)用到牛奶中磺胺甲嘧啶的檢測。 Isarankura-Na-Ayudhya等通過計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)研究了磺胺的印跡過程，指出氫鍵在印跡過程中占主導(dǎo)作用，其研究還比較了甲基丙烯酸和乙烯咪唑作為印跡單體的印跡效果。He 等采用表面印跡技術(shù)，用磺胺甲嘧啶作為模板，合成了對磺胺甲嘧啶、磺胺噻唑和磺胺甲基嘧啶都有親和力的MIPs，該研究采用在線固相萃取和HPLC聯(lián)用的方法檢測了豬肉和雞肉中的磺胺類獸藥殘留，回收率達(dá)到67%。劉慧君等采用犧牲硅膠法合成了磺胺二甲嘧啶的 MIPs,并對其理化性質(zhì)進(jìn)行了研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種利用分子印跡聚合物凈化磺胺類藥物的方法，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有環(huán)境中，動物性食品中磺胺類藥物多殘留檢測前處理的弊端，簡單、快速、特異、高效的純化和富集痕量磺胺，提高現(xiàn)有檢測的靈敏度。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明包括如下步驟如下(1)將模板分子(磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶，磺胺甲惡唑等比例混合)、功能單體甲基丙烯酸和交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，按模板分子功能單體交聯(lián)劑摩爾比=1 2 8 20，混合溶解到致孔劑中，致孔劑的成分為甲醇和乙腈的混合溶液，比例為2 3。當(dāng)模板分子為0.5mol時，致孔劑的體積為2. 5 5ml。加入引發(fā)劑偶氮二異丁氰(AIBN)；體系在氮?dú)夥障路饪冢?0 70°C熱引發(fā)聚合M 48小時；(2)將合成的聚合物磨碎后，分篩得到粒徑在30 60 μ m之間的顆粒，除去微細(xì)的顆粒，最后通過索氏萃取M 72小時進(jìn)一步除去模板分子；萃取劑的組成為甲醇、醋酸混合液，二者的比例為9 1。(3)將除去模板分子的聚合物60°C干燥過夜，獲得磺胺的分子印跡聚合物；(4)將分子印跡聚合物填充到固相萃取柱管中；所述的填充到固相萃取柱管，是指用甲醇淋洗聚丙烯固相萃取小柱和篩板，稱量分子印跡聚合物，用甲醇勻漿后，填充于商品化的Iml 6ml聚丙烯固相萃取小柱內(nèi)。所述的稱量分子印跡聚合物，其質(zhì)量為20mg 200mg。所述的填充到固相萃取柱管，在抽真空狀態(tài)下，將勻漿液裝入聚丙烯固相萃取小柱，填料的頂端和底端分別裝上聚乙烯篩板。所述的篩板，篩板的孔徑為20 μ m。(5)先后用5 IOml甲醇(10%醋酸)，5 IOml甲醇，5 10ml40%甲醇或水對固相萃取柱活化，加入動物組織提取物或水溶液經(jīng)抽提后溶于40%甲醇或水中的樣品，經(jīng)過淋洗固相萃取柱，即能洗脫、凈化和收集磺胺。所述的對固相萃取柱活化，是指用5 IOml甲醇(10%醋酸)，5 IOml甲醇，5 10ml40%甲醇或水對固相萃取柱活化。所述的加入樣品為Iml動物組織提取物或水溶液經(jīng)抽提后溶于40%甲醇或水中的樣品。所述的淋洗，用2. 5ml80%甲醇淋洗淋洗固相萃取柱。所述的洗脫，用3ml比例為甲醇和PBS緩沖液的混合液，二者的比例為8 2，其PH值為7.4。本發(fā)明中，合成的分子印跡聚合物是一種多孔的結(jié)構(gòu)，內(nèi)部具有和模板分子相互補(bǔ)的集團(tuán)，具有“記憶“功能，所以對模板分子具有很高的特異性和選擇性。本發(fā)明采用制備的磺胺分子印跡聚合物作為固相萃取小柱的填料可以用于動物源性食品和水溶液中實(shí)際樣品的前處理實(shí)踐，從而實(shí)現(xiàn)對干擾檢測的動物基質(zhì)的去除，富集痕量殘留的磺胺藥物， 提高檢測的靈敏度。本發(fā)明所述的方法比較普通C18固相萃取小柱具有特異性好，容量高的特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1 一 .磺胺藥物分子印跡聚合物的制備將磺胺(模板混合物)0. 6mol，單體甲基丙烯酸(MAA)，交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇脂(EGDMA)，按照1 2 20的摩爾比例混勻，溶解到2. 5ml致孔劑(乙腈甲醇= 3 2)中，置入安培瓶中，再加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)O. 02g，超聲5分鐘，然后沖入氮?dú)?分鐘，真空封口，60度水浴M小時，得磺胺分子印跡聚合物。取出塊狀聚合物，用研缽磨碎，篩分至平均30 60 μ m粒徑大小，用丙酮懸浮棄去過細(xì)微粒。烘干聚合物后，用甲醇(含10%醋酸)索氏抽提72小時去除模板，中間每隔8小時換液一次。取洗脫液20ul， HPLC測定洗脫完全后，60度烘干M小時備用。二 .磺胺分子印跡聚合物固相萃取小柱的制備首先用甲醇沖洗固相萃取小柱和篩板，將合成的分子印跡聚合物IOOmg用甲醇勻漿，填充到聚丙烯固相萃取小柱中，柱體積為:3ml，在抽真空狀態(tài)下壓緊填料，最后加上聚乙烯篩板。三.應(yīng)用分子印跡固相萃取小柱純化、富集豬肉中的磺胺嘧啶殘留先后用IOml甲醇(10%醋酸)，IOml甲醇，IOml 40%甲醇活化固相萃取柱，注意不能使之抽干。加入Iml提取后的樣品，用2. 5ml甲醇(80% )淋洗小柱，抽干，然后用3X Iml 甲醇(20% PBS，pH 7. 4)洗脫模板。將樣品用0. 22um的濾器過濾后，取20ul上樣，用HPLC 分離樣品并通過紫外檢測器檢測樣品中磺胺的濃度。本發(fā)明合成的分子印跡聚合物可以特異的識別磺胺類藥物，采用本發(fā)明所述的方法可以用于動物源性食品中磺胺嘧啶的分離，凈化和富集。對其它類藥物無特異性吸附。實(shí)施例2:一 .分子印跡聚合物的制備將模板混合物0. 6mol,單體甲基丙烯酸(MAA)，交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇脂 (EGDMA)，按照1 4 20的摩爾比例混勻，溶解到5ml致孔劑(乙腈甲醇=3 2)中， 置入安培瓶中，再加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)O. 02g，超聲5分鐘，然后沖入氮?dú)?分鐘，真空封口，60度水浴36小時，得分子印跡聚合物。取出塊狀聚合物，用研缽磨碎，篩分至 30 60μπι粒徑大小，用丙酮懸浮棄去過細(xì)微粒。烘干聚合物后，用甲醇(含10%醋酸)索氏抽提48小時去除模板每隔8小時換次液。HPLC測定洗脫完全后，60度烘干M小時備用。二 .磺胺分子印跡聚合物固相萃取小柱的制備首先用IOml甲醇沖洗固相萃取小柱和篩板，將合成的分子印跡聚合物20mg用甲醇勻漿，填充到Iml聚丙烯固相萃取小柱中，在抽真空狀態(tài)下壓緊填料，最后加上聚乙烯篩板。三.應(yīng)用分子印跡固相萃取小柱純化、富集豬肉中的磺胺二甲嘧啶殘留先后用5ml甲醇(含有10%醋酸)，5ml甲醇，5ml 40%甲醇活化固相萃取柱，注意不能使之抽干。加入Iml組織勻漿提取后的樣品，用2. 5ml甲醇(80% )淋洗小柱，抽干，然后用4X Iml甲醇(20% PBS, pH 7. 4)洗脫磺胺。將樣品用0. 22um的濾器過濾后，取20ul 上樣，用HPLC分離樣品并通過紫外檢測器檢測樣品中磺胺的濃度。本發(fā)明的效果為，應(yīng)用本發(fā)明所述的材料和方法對豬肉中添加磺胺二甲嘧啶 500 μ g/g標(biāo)準(zhǔn)樣品的回收率為80. 77%，對其它類藥物無特異性吸附。實(shí)施例3 一 .磺胺分子印跡聚合物的制備將模板混合物0. 6mol,單體甲基丙烯酸(MAA)，交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇脂 (EGDMA)，按照1 3 20的摩爾比例混勻，溶解到3ml致孔劑(乙腈甲醇=3 2)中， 置入安培瓶中，再加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)O. 02g，超聲10分鐘，然后沖入氮?dú)?分鐘，真空封口，65度水浴M小時，得分子印跡聚合物。取出塊狀聚合物，用研缽磨碎，篩分至 30 60μπι左右粒徑大小，用丙酮懸浮棄去過細(xì)微粒。烘干聚合物后，用甲醇(含10%醋酸)索氏抽提對小時去除模板。HPLC測定洗脫完全后，60度烘干M小時備用。二.分子印跡聚合物固相萃取小柱的制備將制得分子印跡聚合物50mg用甲醇勻漿，填充到聚丙烯固相萃取3ml小柱中，在抽真空狀態(tài)下壓緊填料，最后加上聚乙烯篩板。三.應(yīng)用分子印跡固相萃取小柱純化、富集雞肝中的磺胺甲惡唑殘留先后用5ml甲醇(10%醋酸)，5ml甲醇，5ml 40%甲醇活化固相萃取柱，注意不能使之抽干。加入Iml經(jīng)勻漿后的雞肝樣品，用2. 5ml甲醇(80% )淋洗小柱，抽干，然后用 3X Iml甲醇(20% PBS, pH 7. 4)洗脫。將樣品用0. 22um的濾器過濾后，取20ul上樣，用 HPLC分離樣品并通過紫外檢測器檢測樣品中樣品的濃度。本發(fā)明的效果為，應(yīng)用本發(fā)明所述的材料和方法對雞肝中添加磺胺甲惡唑 500 μ g/g標(biāo)準(zhǔn)樣品的回收率為85. 81%，對其它類藥物無特異性吸附。實(shí)施例4 一 .磺胺分子印跡聚合物的制備將模板混合物0. 6mol,單體甲基丙烯酸(MAA)，交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇脂 (EGDMA)，按照1 8 20的摩爾比例混勻，溶解到細(xì)1致孔劑(乙腈甲醇=3 2)中， 置入安培瓶中，再加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)O. 02g，超聲10分鐘，然后沖入氮?dú)?分鐘，真空封口，70度水浴M小時，得磺胺分子印跡聚合物。取出塊狀聚合物，用研缽磨碎， 篩分至30 60μπι左右粒徑大小，用丙酮懸浮棄去過細(xì)微粒。烘干聚合物后，用甲醇(含 10%醋酸)索氏抽提M小時去除模板。HPLC測定洗脫完全后，60度烘干M小時備用。
二 .分子印跡聚合物固相萃取小柱的制備首先用IOml甲醇沖洗固相萃取小柱和篩板，將合成的分子印跡聚合物200mg用甲醇勻漿，填充到6ml聚丙烯固相萃取小柱中，在抽真空狀態(tài)下壓緊填料，最后加上聚乙烯篩板。三.應(yīng)用分子印跡固相萃取小柱富集自來水中的磺胺藥物的殘留先后用IOml甲醇(10%醋酸)，IOml甲醇，IOml 40%甲醇活化固相萃取柱，注意不能使之抽干。加入IOOOml自來水樣品后，真空抽氣，使柱子處于半干燥狀態(tài)，用2. 5ml甲醇 (80% )淋洗小柱，抽干，然后用3 X Iml甲醇PBS，pH7. 4)洗脫模板。將樣品用0. 22um 的濾器過濾后，用HPLC分離樣品并通過紫外檢測器檢測樣品中目的物的濃度。應(yīng)用本發(fā)明所述的方法可以特異的從自來水中富集磺胺嘧啶，對添加磺胺嘧啶 0. 2 μ g/g標(biāo)準(zhǔn)樣品的自來水的回收率為109. 51%。
權(quán)利要求
1.一種利用分子印跡聚合物凈化磺胺類藥物的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將模板分子磺胺類藥物混合物、功能單體甲基丙烯酸和交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯，按摩爾比=1 2 8 20，混合溶解到致孔劑(乙腈和甲醇的混合液，比例為3 2) 中，加入引發(fā)劑偶氮二異丁氰，在氮?dú)夥障路饪冢?0 70°C熱引發(fā)聚合M 48小時；(2)將合成的聚合物磨碎后，分篩得到粒徑在30 60μ m之間的顆粒，除去微細(xì)的顆粒，通過萃取除去模板分子；(3)將除去模板分子的聚合物60°C干燥過夜，獲得分子印跡聚合物；(4)將分子印跡聚合物填充到固相萃取柱管中；(5)對固相萃取柱活化，加入動物組織提取物或水溶液經(jīng)抽提后溶于40%甲醇或水中的樣品lmL，經(jīng)過淋洗固相萃取柱，即洗脫、凈化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磺胺分子印跡聚合物的凈化磺胺的方法，其特征是，所述的萃取，其萃取劑的組成為甲醇、醋酸比例為9 1混合液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子印跡聚合物的提取磺胺的方法，其特征是，所述的填充到固相萃取柱管，是指用甲醇淋洗聚丙烯固相萃取小柱和篩板，稱量分子印跡聚合物，用甲醇勻漿后，填充于商品化的Iml 6ml聚丙烯固相萃取小柱內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的磺胺分子印跡聚合物的凈化磺胺的方法，其特征是，所述的填充到固相萃取柱管，在抽真空狀態(tài)下，將勻漿液裝入聚丙烯固相萃取小柱，填料的頂端和底端分別裝上聚乙烯篩板。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子印跡聚合物的凈化磺胺的方法，其特征是，所述的稱量磺胺分子印跡聚合物，其質(zhì)量為20mg 200mg。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分子印跡聚合物的凈化磺胺的方法，其特征是，所述的篩板， 篩板的孔徑為20 μ m。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子印跡聚合物的凈化磺胺的方法，其特征是，所述的對固相萃取柱活化，是指先后用5 IOml甲醇(含10%醋酸)，5 IOml甲醇，5 10ml40%甲醇或水活化固相萃取柱。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子印跡聚合物的凈化磺胺的方法，其特征是，所述的加入樣品，為Iml，溶解于40 %甲醇或水中。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子印跡聚合物的凈化磺胺的方法，其特征是，所述的淋洗， 用2. 5ml80%甲醇淋洗淋洗固相萃取柱，用:3ml比例為甲醇PBS緩沖液=8 2，pH 7. 4 的混合液洗脫、凈化、收集樣品。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子印跡聚合物的凈化磺胺的方法，其特征是，所述的洗脫，用:3ml比例為甲醇PBS緩沖液=8 2，pH 7. 4的混合液洗脫磺胺類藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的磺胺類藥物分子印跡聚合物的凈化磺胺的方法，包括以下步驟(1)將模板分子磺胺類藥物混合物、功能單體甲基丙烯酸和交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯混合溶解到致孔劑(甲醇乙腈的比例為2∶3)中，加入引發(fā)劑，封口；(2)將合成的聚合物磨碎后，除去微細(xì)的顆粒，通過萃取除去模板分子；(3)將除去模板分子的聚合物60℃干燥過夜，獲得磺胺的分子印跡聚合物；(4)將分子印跡聚合物填充到固相萃取柱管中；(5)對固相萃取柱活化，加入溶于40％甲醇中動物組織提取液或水樣，經(jīng)過淋洗固相萃取柱，即洗脫、凈化磺胺。本發(fā)明具有高選擇性、高特異性和耐不良環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用潛力。
文檔編號C08F222/14GK102344527SQ20101023977
公開日2012年2月8日 申請日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月29日
發(fā)明者姚春霞, 宋素泉, 趙志輝 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院