專利名稱：：用于抑制腫瘤和防治轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的茯苓多糖組合物與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于中藥制藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及具有治療腫瘤和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)活性的茯苓多糖組合物及其制備方法以及在制備藥物中應(yīng)用。更具體的說是通過分級醇沉將不同分子量的茯苓多糖分開，制備具有激活多形核白細(xì)胞，提高其殺傷腫瘤細(xì)胞能力而發(fā)揮治療腫瘤和防治腫瘤轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)作用的藥物。
背景技術(shù)：
：茯苓多糖(Pachymaran)來源于多孔菌科真菌茯苓(PoriacocosWolf)。茯苓是我國傳統(tǒng)的中藥材，被視為"中藥八珍"之一，味甘、平，入心脾、胃、腎經(jīng)，有健脾健腎、寧心安神等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)作用表明，茯苓多糖能增強(qiáng)人體免疫功能，提高人體抗病能力，起到防病、延緩衰老的作用。以往研究表明，茯苓核中抗腫瘤作用的有效成分為e-茯苓聚糖(e-Pachyman)，約占茯苓核干重的93%，e-茯苓聚糖轉(zhuǎn)化成為e-茯苓多糖(13-Pachymaran)才具有活性。茯苓聚糖(pachyman)是含有少量P-(l—6)葡聚糖支鏈的P-(l—3)_D_葡聚糖，無抗腫瘤活性。經(jīng)化學(xué)修飾切去茯苓聚糖分子主鏈上的—6)葡聚糖支鏈后，得到13-(l—3)_D-葡聚糖稱為茯苓多糖(pachymaran)，茯苓多糖經(jīng)羧甲基化得到溶于水的羧甲基茯苓多糖，具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，能減輕癌癥患者放、化療的毒副反應(yīng)，并使患者的免疫功能得到改善。選擇適合茯苓的提取方法，最大限度的提取茯苓的有效成分是研究茯苓藥理作用的基礎(chǔ)?，F(xiàn)有兩種最新的提取方法，能使水溶性多糖的提取率得到明顯的提高，即采用微波技術(shù)提取法和復(fù)合酶熱水浸提法提取法。前者與傳統(tǒng)的萃取方法相比，具有選擇性高、操作時(shí)間短、溶劑消耗量少、有效成分得率高、適合于熱不穩(wěn)定成分等優(yōu)點(diǎn)，而且作為吸收微波最好介質(zhì)的水也是中藥提取的主要提取劑。后者由于酶的作用具有專一性，不會破壞茯苓多糖的結(jié)構(gòu)，且蛋白酶可降解獲荃中所含蛋白質(zhì)，從而使雜質(zhì)含量低，可以在較低的溫度下提高多糖的提取率。茯苓多糖抗腫瘤的作用是通過以下方式來體現(xiàn)的1.茯苓多糖對細(xì)胞膜磷脂酰肌醇(PI)轉(zhuǎn)換具有明顯抑制作用。近年來發(fā)現(xiàn)，某些腫瘤細(xì)胞的PI轉(zhuǎn)換增強(qiáng)，癌基因編碼產(chǎn)物如EGF、PDGF、TGF等能促進(jìn)細(xì)胞的PI轉(zhuǎn)換，許多癌基因在腫瘤形成早期，PI激酶活性也增加，抑制和干擾PI轉(zhuǎn)換，則可影響腫瘤生長發(fā)育。因此，茯苓多糖通過對PI轉(zhuǎn)換的影響可產(chǎn)生抑制腫瘤細(xì)胞的作用。2.腫瘤細(xì)胞膜磷脂的脂肪酸組成明顯改變，主要是花生四烯酸比例升高，花生四烯酸在自由基攻擊下發(fā)生過氧化發(fā)應(yīng)的產(chǎn)物具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生和生長的作用。茯苓多糖可以改變其磷脂的脂肪組成，降低花生四烯酸和豆蔻酸的含量，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。茯苓多糖還可通過升高腫瘤細(xì)胞膜上的唾液酸量，影響細(xì)胞表面電荷特性，細(xì)胞膜的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，抗原決定簇的暴露以及改變免疫細(xì)胞的活化膜表面受體的功能，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。33.茯苓多糖可通過抑制腫瘤細(xì)胞DNA、RNA的合成發(fā)揮直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用4.激活機(jī)體的免疫監(jiān)視系統(tǒng)也是茯苓多糖發(fā)揮抗腫瘤作用的主要機(jī)制已有實(shí)驗(yàn)表明證明茯苓多糖可在體內(nèi)外促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放，對抗化療藥物對細(xì)胞因子的抑制作用。可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IL-6、IFN-a、IFN-g、TNF、LT、LR等，并能提高某些因子的活性。IL-2能誘導(dǎo)TH細(xì)胞和TC細(xì)胞增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞及淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞(LAK)的活性，茯苓多糖還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞識別功能，提高巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)，并能通過增強(qiáng)TNF基因的轉(zhuǎn)錄而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞釋放TNF，并增強(qiáng)其活性。TNF不僅直接參與單核細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷，而且能通過抑制基因轉(zhuǎn)錄活性，特異地降低myc基因mRNA的表達(dá)水平，使人白細(xì)胞抗原(HLA)的mRNA表達(dá)水平升高，增強(qiáng)細(xì)胞免疫尤其是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性，間接發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。5.增強(qiáng)脾、胸腺功能，對抗腫瘤及化療藥物對胸腺、脾臟的抑制脾、胸腺乃至骨髓都是人體重要的免疫器官，在腫瘤患者中多會出現(xiàn)脾及胸腺的功能低下，而放療、化療又對脾、胸腺及骨髓功能有不同程度的抑制。茯苓多糖在保護(hù)與提高脾、胸腺功能，增加脾、胸腺指數(shù)方面的作用已為多數(shù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)。6.對體液免疫的作用機(jī)體的免疫應(yīng)答有賴于體液免疫與細(xì)胞免疫的綜合作用，巨噬細(xì)胞，NK細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一便是介導(dǎo)體液免疫的B細(xì)胞所參與的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，因此對B細(xì)胞及體液免疫的增強(qiáng)在抗腫瘤治療中有積極意義。實(shí)驗(yàn)證明茯苓多糖可使血清免疫球蛋白的IgG和IgM水平提高，從而促進(jìn)體液免疫。在安全性方面，羧甲基茯苓多糖(CMP)無論是口服，還是腹腔注射或靜脈注射，安全劑量都較大。小鼠靜脈注射給藥，LD50為3.13/kg。犬長期毒性實(shí)驗(yàn)的高劑量組為LD50為10/kg，低劑量組為20/kg，連續(xù)3個月，未出現(xiàn)毒性反應(yīng)。CMP的人擬臨床給藥途徑是靜脈注射，最大劑量擬定為2mg/kgd，可以推算人擬最大劑量的78156倍是安全的。以細(xì)菌為指示生物的鼠傷寒沙門氏菌致突變實(shí)驗(yàn)的體外實(shí)驗(yàn)中，遺傳學(xué)終點(diǎn)為基因突變。在每皿中加入CMP的劑量在0.5iig5.Omg范圍內(nèi)，均能證明CMP為非致突變物。小鼠骨髓多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，相當(dāng)于人擬臨床最大劑量的125倍(250mg/kg)無致突變的結(jié)果，提示CMP為非致突變物。大鼠致畸胎實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，相當(dāng)于人擬臨床最大劑量的125倍(250mg/kgd)，對妊娠大鼠無致畸胎的結(jié)果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，是提供一種分級醇沉得到的茯苓多糖組合物(也可稱為有效部位)，其可與常規(guī)的藥用載體混合，制備具有治療腫瘤和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)活性的茯苓多糖藥物組合物。為達(dá)到上述目的本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案—種用于抑制腫瘤生長和防治其轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的茯苓多糖組合物，其特征在于含有茯苓屬植物中通過分級醇沉方法得到的不同分子量的多糖，總醇沉多糖含量為50-80%;其重均分子量道爾頓范圍為0.2-3萬。本發(fā)明優(yōu)選的茯苓多糖組合物。它是通過分級醇沉將不同分子量分布的醇沉物1、醇沉物2、醇沉物3和醇沉物4茯苓多糖分開，得到不同分子量的多糖，也可以將醇沉物3與醇沉物4混合，得到醇物3與醇沉物4的組合物。其中總醇沉多糖含量為60-70%;其重均分子量道爾頓范圍為0.2-2萬。本發(fā)明所述的茯苓多糖組合物，其中的茯苓多糖為含量大于60%的3、4醇沉物；其分子量范圍為0.2-1.5萬。它是通過分級醇沉，將醇沉物3(60%醇沉茯苓多糖)和醇沉物4(80%醇沉茯苳多糖)混合，其中醇沉物3、醇沉物4含量均大于60%;形成具有明顯激活多形核白細(xì)胞，提高其殺傷腫瘤細(xì)胞能力的組合物，從而發(fā)揮防治腫瘤轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)的作用。本發(fā)明所述茯苓多糖組合物可以按如下的方法制備(1)稱取茯苓切片后粉碎，加入3-12倍重量份數(shù)的水，回流提取2-3次，合并提取液濾過，除去不溶性雜質(zhì)；(2)取提取液減壓蒸餾濃縮，濃縮液邊攪拌邊加入乙醇，使含醇量達(dá)到80%，靜置，過濾，收集沉淀；(3)加水溶解沉淀并煮沸，趁熱過濾除去不溶物，濾液邊攪拌邊加入乙醇，使含醇量達(dá)到80%，放置，析出沉淀后過濾，使沉淀物在40-7(TC干燥，得茯苓總多糖粗品；(4)將茯苓總多糖粗品按l:4加蒸餾水使其溶解，加入乙醇使含醇量達(dá)到20%，靜置，過濾得沉淀物1;濾液再加乙醇使含醇量達(dá)到40%，靜置，過濾得沉物2;濾液再加乙醇使含醇量達(dá)到60%，靜置，過濾得沉物3;濾液再加乙醇使含醇量達(dá)到80%，靜置，過濾得沉物4;(5)采用酚-硫酸紫外分光光度法測定總茯苓多糖的含量為56.2%;高效液相凝膠(HPGPC)色譜圖計(jì)算平均相對分子質(zhì)量的范圍為0.2-3萬。其中醇沉物3、4采用酚-硫酸紫外分光光度法測定多糖含量均大于60%;高效液相凝膠(HPGPC)色譜圖計(jì)算平均相對分子質(zhì)量的范圍為O.2-1.5萬。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例中，茯苓多糖提取分離及精制的方法如下1:提取稱取茯苓500g，切片后粉碎，加入2.5L的水，回流提取3次，每次提取2h;合并3次提取液濾過，除去不溶性雜質(zhì)。取lOOOmL提取液減壓蒸餾濃縮成100ml，濃縮液邊攪拌邊加入乙醇，使含醇量達(dá)到80%，靜置12h，10000rpm離心，收集沉淀；加蒸餾水50ml溶解煮沸，趁熱過濾除去不溶物，濾液在攪拌下再加入乙醇，使含醇量達(dá)到80%，放置，析出沉淀后，40-70°C干燥，得茯苓多糖粗品。2:含量測定酚-硫酸紫外分光光度法測定茯苓多糖的含量。多糖在強(qiáng)酸作用下水解生成單糖，并迅速脫水生成糠醛，糠醛與酚性物質(zhì)如苯酚縮合成有色化合物，有色物生成量與多糖濃度存在定量關(guān)系，用分光光度法在490nm處測定。以葡萄糖做為對照品。產(chǎn)品中多糖含量為56.2%。3:多糖的分子量段的篩選通過分級醇沉可將不同分子量分布的多糖分開。將總多糖按l:4加蒸餾水使其溶解，加入乙醇，使溶液含醇量達(dá)到20%，靜置，過濾得沉淀物l，濾液再加醇達(dá)到40%，靜置，過濾得沉物2，濾液再加醇達(dá)到60%，靜置，過濾得沉物3，濾液再加醇達(dá)到80%，靜置，過濾得沉物4。四種沉淀物分別作藥效評價(jià)。4:多糖的GPC分子量分布分析根據(jù)在凝膠柱上不同分子量的多糖與洗脫保留時(shí)間(tR)成一定關(guān)系的特性，先用各種已知分子量的多糖制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后由樣品的保留時(shí)間(tR)從曲線中求得分子量分布范圍。依據(jù)HPGPC校正曲線及茯苓多糖凝膠色譜圖計(jì)算各組分的平均相對分子質(zhì)量。選擇Pullulan標(biāo)樣，計(jì)算茯苓多糖的各組分相對分子量及分子量分布。結(jié)果表明，沉物3合并沉物4相對分子量范圍為0.2-1.5萬。本發(fā)明進(jìn)一步公開了具有激活多形核白細(xì)胞，提高其殺傷腫瘤細(xì)胞能力而發(fā)揮防治腫瘤轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)作用的茯苓多糖組合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑制備成各種藥物組合物，包括注射劑(粉針劑、水針劑、輸液劑)、各種固體口服制劑、液體口服制劑等。當(dāng)非腸道給藥時(shí)，本發(fā)明所述的具有抗腫瘤活性的茯苓多糖組合物可以被制成注射劑形式給藥，給藥劑量依治療對象、給藥方式、癥狀及其它因素而改變。本發(fā)明的茯苓多糖組合物在相當(dāng)寬的劑量范圍內(nèi)是有效的。例如每天服用的劑量可在每公斤體重大約0.lmg-1000mg的范圍內(nèi)。在成人的治療中，劑量范圍最好是在lmg/kg-10mg/kg，一次或幾次給予。實(shí)際注射茯苓多糖組合物的劑量應(yīng)該由醫(yī)生根據(jù)有關(guān)的情況來決定，這些情況包括被治療者的身體狀態(tài)、年齡、體重、患者對藥物的個體反應(yīng)、患者癥狀的嚴(yán)重程度等等，因此上述劑量范圍并不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。為制備注射用凍干粉針劑可采用甘露醇、氯化鈉等材料作載體，保證粉針劑的形態(tài)及溶解性能。當(dāng)口服給藥時(shí)，組合物可配制成片劑、分散片、糖衣劑、顆粒劑、干粉劑、溶液劑或膠囊。為制備口服藥物組合物可采用乳糖或淀粉做載體，明膠，羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等是合適的粘合劑。作為崩解劑可選用淀粉或微晶纖維素，常以滑石粉，膠體硅膠，硬脂酸甘油酯，硬脂酸鈣或鎂，聚乙二醇-4000，聚乙二醇-6000，焦亞硫酸鈉等；作為合適的抗粘合劑和潤滑劑。例如，可通過壓制濕顆粒來制備片劑?；钚猿煞峙c載體以及選擇性的與一份崩解添加劑組成混合物，該混合物與粘合劑的含水溶液，醇性或含水醇性溶液在合適的設(shè)備中進(jìn)行顆?；?，干燥顆粒隨后加入其它的崩解劑，潤滑劑和抗粘劑將此混合物壓片。本發(fā)明更進(jìn)一步公開了茯苓多糖組合物在制備促進(jìn)多形核白細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞藥物方面的應(yīng)用。藥物作用于白細(xì)胞后，激活了多形核白細(xì)胞，提高了多形核白細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，從而達(dá)到治療腫瘤和防治腫瘤轉(zhuǎn)移與術(shù)后復(fù)發(fā)的目的，為治療腫瘤和防治腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供了新的治療方法及組合藥物。本發(fā)明通過在體、離體實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了茯苓多糖組合物，包括茯苓總多糖(醇沉物1、醇沉物2、醇沉物3和醇沉物4或醇沉物3與醇沉物4的組合)在激活多形核白細(xì)胞，治療腫瘤和防治腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等方面的應(yīng)用。具體包括茯苓總多糖組合物在制備治療肝癌藥物方面的應(yīng)用。茯苓總多糖組合物在制備治療肺腺癌藥物方面的應(yīng)用。茯苓總多糖組合物在制備治療結(jié)腸癌藥物方面的應(yīng)用。茯苓總多糖組合物在制備治療黑色素瘤細(xì)胞殺傷作用方面的應(yīng)用。進(jìn)一步還包括茯苓總多糖對小鼠移植性肺腺癌和肝癌生長及轉(zhuǎn)移的抑制作用方面的應(yīng)用。茯苓多糖醇沉物3、醇沉物4對移植性肺腺癌和肝癌小鼠實(shí)體瘤質(zhì)量減少，肺臟和肝臟組織瘤栓和轉(zhuǎn)移灶明顯減少，顯示其具有治療腫瘤和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。6實(shí)驗(yàn)具體內(nèi)容如下—、離體實(shí)驗(yàn)茯苓多糖促進(jìn)多形核白細(xì)胞殺傷體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的作用1、大鼠多形核白細(xì)胞分離取12月齡大鼠一只，乙醚麻醉，心臟取血3mL，加入肝素抗凝的試管中，再加入到等量Ficoll(有市售)上層，1800rpm離心20分鐘后取PMN(多形核白細(xì)胞層)，臺盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)95%以上，調(diào)整多形核白細(xì)胞數(shù)至1X104個/mL，備用。2、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)選取肺腺癌細(xì)胞株(人肺腺癌A549細(xì)胞和小鼠肺腺癌LA795細(xì)胞，有市售)、肝癌細(xì)胞株(人肝癌H印G-2細(xì)胞和人肝癌7402細(xì)胞，有市售)、結(jié)腸癌細(xì)胞株(有市售)和黑色素瘤細(xì)胞株A-375(有市售)，將傳代的腫瘤細(xì)胞1X103/孔，種于24孔板，培養(yǎng)24小時(shí)備用。3、茯苓總多糖激活多形核白細(xì)胞對培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞殺傷作用的影響將分離出的多形核白細(xì)胞以1X104個/mL/孔接種于24孔板，加入茯苓總多糖(采用實(shí)施例1方法獲得)，使其終濃度分別為250ug/mL，125ug/mL，并作空白對照(只接種多形核白細(xì)胞，加入等量培養(yǎng)基)。作用2小時(shí)后，平板離心機(jī)離心，棄上清，用lmL全培養(yǎng)基重懸后加入預(yù)先培養(yǎng)有癌細(xì)胞的24孔板，即將經(jīng)過藥物作用的多形核白細(xì)胞與未經(jīng)藥物作用的癌細(xì)胞共培養(yǎng)，4小時(shí)后，倒置顯微鏡下觀察，每孔隨機(jī)取5個10*10倍視野，照像并計(jì)數(shù)多形核白細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞周圍形成玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu)的比例。棄培養(yǎng)基，臺盼蘭染色，每孔隨機(jī)取5個10*10倍視野，照像，觀察并計(jì)數(shù)癌細(xì)胞死亡比例。結(jié)果如下(1)茯苓總多糖激活多形核白細(xì)胞對肺腺癌細(xì)胞(A549)殺傷作用的影響藥物(ug/mL)花環(huán)形成率(％)癌細(xì)胞死亡率(％)茯苓總多糖25032.77±17.99*23.12±3.01*茯苓總多糖12525.99±6.02*18.51±2.88*空白10.67±4.333.16±3.05(2)茯苓總多糖激活多形核白細(xì)胞對肺腺癌細(xì)胞(LA795)殺傷作用的影響藥物(ug/mL)花環(huán)形成率(％)癌細(xì)胞死亡率(％)茯苓總多糖25035.52±7.86*29.21±5.23*茯苓總多糖12525.89±7.45*17.45±5.67*空白14.45±3.234.25±2.51(3)茯苓總多糖激活多形核白細(xì)胞對肝癌細(xì)胞(H印G-2)殺傷作用的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(4)茯苓總多糖激活多形核白細(xì)胞對肝癌細(xì)胞(7402)殺傷作用的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(5)茯苓總多糖激活多形核白細(xì)胞對結(jié)腸癌細(xì)胞殺傷作用的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(6)茯苓總多糖激活多形核白細(xì)胞對黑色素瘤細(xì)胞殺傷作用的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*，與空白組比較差異有顯著性。小結(jié)茯苓總多糖作用多形核白細(xì)胞2小時(shí)，可明顯提高多形核白細(xì)胞對人肺腺癌A549細(xì)胞、小鼠肺腺癌LA795細(xì)胞、人肝癌H印G-2細(xì)胞、人肝癌7402細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞株和黑色素瘤細(xì)胞株A-375細(xì)胞玫瑰花環(huán)形成率及對腫瘤細(xì)胞的殺傷力。4、不同分子量段茯苓多糖對多形核白細(xì)胞對培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞殺傷作用的影響我們通過將茯苓總多糖以20%，40%，60%，80%醇沉，得醇沉物1，2，3，4。鑒于茯苓總多糖有提高多形核白細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，且由于其激活多形核白細(xì)胞的特定抗腫瘤作用機(jī)理，使其對各腫瘤細(xì)胞均有很明顯的殺傷作用，因此我們以肺腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等細(xì)胞為代表，進(jìn)一步考察并篩選了不同分子量段茯苓多糖激活多形核白細(xì)胞對培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞殺傷作用的影響，方法同前。結(jié)果如下(1)茯苓多糖醇沉物激活多形核白細(xì)胞對肺腺癌細(xì)胞(A549)殺傷作用的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(2)茯苓多糖各醇沉物激活多形核白細(xì)胞對肺腺癌細(xì)胞(LA795)殺傷作用的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(3)茯苓多糖各醇沉物激活多形核白細(xì)胞對肝癌細(xì)胞(H印G-2)殺傷作用的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(4)茯苓多糖各醇沉物激活多形核白細(xì)胞對肝癌細(xì)胞(7402)殺傷作用的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(5)茯苓多糖各醇沉物激活多形核白細(xì)胞對結(jié)腸癌細(xì)胞殺傷作用的影響藥物<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>小結(jié)通過以上實(shí)驗(yàn)，證明茯苓多糖分段提取后，不同分子量段茯苓多糖成分對多形核白細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的作用影響不同，其中醇沉物3(60%醇沉茯苓多糖)和醇沉物4(80%醇沉茯苓多糖)作用明顯。二、動物實(shí)驗(yàn)1、茯苓總多糖對小鼠移植性肺腺癌生長及轉(zhuǎn)移的抑制作用體外實(shí)驗(yàn)顯示茯苓總多糖能明顯提高多形核白細(xì)胞對殺傷腫瘤細(xì)胞作用，為了進(jìn)一步探討其體內(nèi)是否能抗移植性腫瘤生長及轉(zhuǎn)移，我們采用LA795轉(zhuǎn)移性肺腺癌模型小鼠進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)。1、實(shí)驗(yàn)方法1.1藥物本發(fā)明制備的茯苓總多糖。陽性對照藥注射用環(huán)磷酰胺粉針劑。1.2動物及細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)動物采用SPF級近交T739小鼠，雌雄各半，體重(18.0±2.0)g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號為SCXK11-00-0005;瘤株為LA795小鼠肺腺癌瘤株，由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。1.3動物造模取接種后第6-8天腫瘤生長良好的荷瘤鼠，拉斷頸椎處死小鼠，在無菌條件下剝離腫瘤，選擇新鮮無壞死的瘤組織剪碎置玻璃研磨器中，加適量生理鹽水輕輕研磨制備成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞篩過濾后加生理鹽水稀釋、計(jì)數(shù)，調(diào)配成細(xì)胞濃度為1X107mL的細(xì)胞懸液，在冰浴條件下每只0.2mL接種于健康小鼠右前肢腋窩皮下，接種濃度為2X106/mL。1.4動物分組及給藥接種5天后的小鼠按瘤大小分為(1)模型組每只腹腔注射0.2mL生理鹽水；(2)環(huán)磷酰胺組按20mg/kg，腹腔注射給藥；(3)茯苓總多糖高劑量組按200mg/kg，腹腔注射給藥；(4)茯苓總多糖低劑量組按100mg/kg，腹腔注射給藥；實(shí)驗(yàn)前將藥物用蒸餾水配制成所需的濃度。環(huán)磷酰胺性質(zhì)不穩(wěn)定，于給藥前用無菌生理鹽水配制，振蕩完全溶解后使用。每日給藥1次。給藥兩周，于給藥結(jié)束后次日頸部脫臼處死小鼠。1.2檢測指標(biāo)1.2.1茯苓總多糖對小鼠移植性肺腺癌體瘤質(zhì)量大小及抑瘤率的影響于給藥后第15天處死，解剖取其肺臟、肝臟、其中瘤組織稱重，分別按下列公式計(jì)算抑瘤率抑瘤率(％)=[(l-給藥組平均瘤質(zhì)量/對照組平均瘤質(zhì)量)X100X]。將各組織于10%中性福爾馬林保存。1.2.2茯苓總多糖對小鼠移植性肺腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移的影響將福爾馬林中保存的肺、肝臟和做石蠟切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組肺、肝臟內(nèi)瘤栓與轉(zhuǎn)移灶情況。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組數(shù)據(jù)均采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較使用方差分析。兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為有顯著性差異。1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.4.1茯苓總多糖對荷瘤小鼠抑瘤率的影響環(huán)磷酰胺組的瘤重與模型組相比具有顯著性差異，茯苓總多糖對腫瘤生長具有不同程度的抑制作用，結(jié)果見表l:表1茯苓總多糖對LA795轉(zhuǎn)移性肺腺癌小鼠瘤重和抑瘤率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>與模型組比較*p<0.051.4.2茯苓總多糖對荷瘤小鼠肺臟，肝臟轉(zhuǎn)移病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果1.4.2.1肺組織病理形態(tài)變化模型組和環(huán)磷酰胺組都有較多瘤栓與轉(zhuǎn)移灶，但環(huán)磷酰胺組中數(shù)量更多面積更大。茯苓總多糖瘤栓與轉(zhuǎn)移灶數(shù)量最少且單個面積小，瘤栓極少，只發(fā)現(xiàn)散在的小轉(zhuǎn)移灶，其中高劑量組少于低劑量組。1.4.2.2肝臟病理形態(tài)變化模型組肝臟中瘤栓與轉(zhuǎn)移灶數(shù)量多面積大，而環(huán)磷酰胺組數(shù)量最少，只發(fā)現(xiàn)極少量瘤栓。茯苓總多糖組肝臟中瘤栓與轉(zhuǎn)移灶數(shù)量最少，其中低劑量組少于高劑量組。1.5小結(jié)環(huán)磷酰胺組實(shí)體瘤重量顯著減少，但肺中瘤栓與轉(zhuǎn)移灶與模型組比較明顯增加。茯苓總多糖組實(shí)體瘤質(zhì)量顯著減少，且肺臟組織和肝臟組織瘤栓和轉(zhuǎn)移灶都與模型組比較顯著減少，顯示其具有治療腫瘤和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。2、茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4對小鼠lewis肺癌生長及轉(zhuǎn)移的抑制作用茯苓總多糖對移植性小鼠肺腺癌具有明顯抑制實(shí)體瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用，且體外實(shí)驗(yàn)表明茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4具有更強(qiáng)的抗腫瘤作用，為了進(jìn)一步探討活性茯苓多糖部位及分子量分布，我們采用小鼠lewis肺腺癌模型，對茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4進(jìn)行了進(jìn)一步的體內(nèi)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)。2.l實(shí)驗(yàn)方法2.1.1藥物本發(fā)明制備的醇沉物3，醇沉物4。陽性對照藥為注射用順鉑。2.1.2動物及細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)動物采用SPF級近交傳C57BL/6小鼠，雌雄各半，體重(18.0±2.0)g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號為SCXK11-00-0005;瘤株為lewis小鼠肺腺癌瘤株，由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。2.1.3動物造模取接種后第6-8天腫瘤生長良好的荷瘤鼠，拉斷頸椎處死小鼠，在無菌條件下剝離腫瘤，選擇新鮮無壞死的瘤組織剪碎置玻璃研磨器中，加適量生理鹽水輕輕研磨制備成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞篩過濾后加生理鹽水稀釋、計(jì)數(shù)，調(diào)配成細(xì)胞濃度為1X107mL的細(xì)胞懸液，在冰浴條件下每只0.2mL接種于健康小鼠右前肢腋窩皮下，接種濃度為2X106/mL。2.1.4動物分組及給藥接種7天后的小鼠按瘤大小分為(1)模型組尾靜脈注射生理鹽水0.2mL/只；(2)順鉑組按0.5mg/kg，尾靜脈注射給藥；(3)多糖醇沉物3高劑量組按40mg/kg，尾靜脈注射給藥(4)多糖醇沉物3低劑量組按20mg/kg，尾靜脈注射給藥(5)多糖醇沉物4高劑量組按40mg/kg，尾靜脈注射給藥(6)多糖醇沉物4低劑量組按20mg/kg，尾靜脈注射給藥實(shí)驗(yàn)前將藥物用蒸餾水配制成所需的濃度。順鉑性質(zhì)不穩(wěn)定水配制，振蕩完全溶解后使用。隔天給藥1次。給藥7次，于給藥結(jié)束后0137]2.2檢測指標(biāo)0138]2.2.1茯苳多糖醇沉物3，醇沉物4對小鼠lewis肺癌抑瘤率的影響0139]于給藥后第17天處死，解剖取其肺臟、肝臟、腎臟，其中瘤組織稱重，分別按下列&式計(jì)算抑瘤率抑瘤率(％)=[(l-給藥組平均瘤質(zhì)量/對照組平均瘤質(zhì)量)X100X]。瞎各組織于10%中性福爾馬林保存。0140]2.2.2茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4對小鼠lewis肺癌腫瘤轉(zhuǎn)移的影響0128]0129]0130]0131]0132]0133]0134]0135]0136]于給藥前用無菌生理鹽次日頸部脫臼處死小鼠。0141]將3福爾馬林中保存的肺、肝臟、腎臟和做石蠟切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組肺、肝臟、腎臟內(nèi)瘤栓與轉(zhuǎn)移灶情況。0142]2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理0143]各組數(shù)據(jù)均采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較使用方差分析。兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為有顯著性差異。0144]2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果0145]2.4.1茯苳多糖醇沉物3，醇沉物4對荷瘤lewis小鼠抑瘤率的影響0146]順鉑組的瘤重與模型組相比具有顯著性差異，實(shí)體瘤質(zhì)量顯著減少，抑瘤率可達(dá)60.19%;茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4均可不同程度的減少實(shí)體瘤質(zhì)量，結(jié)果見表2:0147]表2茯苳多糖醇沉物3，醇沉物4對Lewis肺癌瘤重和抑瘤率的影響0148]<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>與模型組比較*p<0.052.4.2茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4對荷瘤lewis小鼠肺臟，肝臟、腎臟腫瘤轉(zhuǎn)移病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果2.4.2.1肺組織病理形態(tài)變化各組都有不同程度肺淤血和炎性浸潤，模型組有較多瘤栓與轉(zhuǎn)移灶，順鉑組中轉(zhuǎn)移灶較少。茯苓多糖醇沉物3組瘤栓與轉(zhuǎn)移灶數(shù)量最少且單個面積小，瘤栓極少，只發(fā)現(xiàn)散在的小轉(zhuǎn)移灶，其中高劑量組少于低劑量組。茯苓多糖醇沉物4組有少量瘤栓與轉(zhuǎn)移灶，其中高劑量組少于低劑量組。2.4.2.2腎臟病理形態(tài)變化順鉑組中部分小鼠的腎臟毛細(xì)管存在壞死的情況，其余各組腎臟結(jié)構(gòu)未見明顯異常。腎小球、腎小管、毛細(xì)血管及間質(zhì)結(jié)構(gòu)基本正常，管腔均勻，管壁可見內(nèi)皮細(xì)胞分部完整。2.5小結(jié)順鉑組肺組織中瘤栓與轉(zhuǎn)移灶與模型組比較顯著減少，但具有較強(qiáng)的腎臟毒性。茯苓多糖醇沉物3組、4組肺臟組織瘤栓和轉(zhuǎn)移灶都與模型組比較顯著減少，顯示其具有抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的作用，且毒副作用小。3、茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4對轉(zhuǎn)移性肝癌小鼠的影響鑒于茯苓多糖有提高多形核白細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，且由于其激活多形核白細(xì)胞的特定抗腫瘤作用機(jī)理，使其對各腫瘤細(xì)胞均有很明顯的殺傷作用，在明確茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4對肺腺癌生長及轉(zhuǎn)移的影響實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步考察了茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4對轉(zhuǎn)移性肝癌小鼠模型的影響。3.l實(shí)驗(yàn)方法3.1.1藥物本發(fā)明制備的醇沉物3，醇沉物4。陽性對照藥注射用環(huán)磷酰胺粉針劑。3.1.2動物及細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)動物采用SPF級昆明小鼠，雌雄各半，體重(18.0士2.0)g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號為SCXK11-00-0005;瘤株為小鼠肝癌H22細(xì)胞株，由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。3.1.3動物造模取小鼠H22肝癌細(xì)胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，8天后無菌條件下抽取腹水，O.4%臺盼藍(lán)染色，低倍顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞率>90%，用0.9%生理鹽水稀釋調(diào)整濃度，以1Xl(f個/ml，接種于小鼠右腋皮下0.2ml。3.1.4動物分組及給藥接種5天后的小鼠分為以下幾組(1)模型組，生理鹽水，每只0.2mL，腹腔注射給藥；(2)環(huán)磷酰胺組，按20mg/kg，腹腔注射給藥；(3)多糖醇沉物3組，按40mg/kg，腹腔注射給藥；(4)多糖醇沉物3組，按20mg/kg，腹腔注射給藥(5)多糖醇沉物4組，按40mg/kg，腹腔注射給藥(6)多糖醇沉物4組，按20mg/kg，腹腔注射給藥實(shí)驗(yàn)前將藥物用蒸餾水配制成所需的濃度。環(huán)磷酰胺性質(zhì)不穩(wěn)定，于給藥前用無菌生理鹽水配制，振蕩完全溶解后使用。每日給藥1次。給藥兩周，于給藥結(jié)束后次日頸部脫臼處死小鼠。3.2檢測指標(biāo)3.2.1茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4對轉(zhuǎn)移性肝癌小鼠抑瘤率的影響于給藥后第15天處死，解剖取其肝臟、肺臟，其中瘤組織稱重，分別按下列公式計(jì)算抑瘤率抑瘤率(％)=[(l-給藥組平均瘤質(zhì)量/對照組平均瘤質(zhì)量)X100X]。將各組織于10%中性福爾馬林保存。3.2.2茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4對轉(zhuǎn)移性肝癌小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移的影響將福爾馬林中保存的肝臟、肺臟做石蠟切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組肺、肝臟內(nèi)瘤栓與轉(zhuǎn)移灶情況。3.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組數(shù)據(jù)均采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較使用方差分析。兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為有顯著性差異。3.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.4.1茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4對荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影響環(huán)磷酰胺組實(shí)體瘤質(zhì)量顯著減少，抑瘤率與模型組相比顯著降低；茯苓多糖醇沉物3高劑量組，醇沉物4高劑量組對腫瘤生長均有明顯抑制作用，結(jié)果見表4:表4給藥組對轉(zhuǎn)移性肝癌小鼠瘤重及抑瘤率的影響組別劑量(mg/kg/d)瘤重(g)抑瘤率(％)模型組2.17±0.85環(huán)磷酰胺組200.96±0.77*55.76±5.85多糖醇沉物3高劑量組401.06±0.85*51.15±4.83多糖醇沉物3低劑量組201.56±0.45*28.11±3.25多糖醇沉物4高劑量組401.15±0.48*47.00±2.68多糖醇沉物4低劑量組201.34±0.36*38.24±2.32與模型組比較*p<0.053.4.2茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4對荷瘤小鼠肝臟、肺臟腫瘤轉(zhuǎn)移病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果3.4.2.1肝組織病理形態(tài)變化各組都有不同程度炎性浸潤，模型組有較多瘤栓與轉(zhuǎn)移灶，茯苓多糖醇沉物3組瘤栓與轉(zhuǎn)移灶數(shù)量最少，且單個面積小，瘤栓極少，只發(fā)現(xiàn)散在的小轉(zhuǎn)移灶，其中高劑量組少于低劑量組。茯苓多糖醇沉物4組有少量瘤栓與轉(zhuǎn)移灶，其中高劑量組少于低劑量組。3.4.2.2肺病理形態(tài)變化模型組肝臟中瘤栓與轉(zhuǎn)移灶數(shù)量多，面積大。茯苓多糖醇沉物3、醇沉物4各組肝臟中瘤栓與轉(zhuǎn)移灶數(shù)量均較少，均明顯少于模型組，其中茯苓多糖醇沉物3低劑量組最少。3.5小結(jié)茯苓多糖醇沉物3、醇沉物4作用于轉(zhuǎn)移性肝癌小鼠模型后，肝中瘤栓與轉(zhuǎn)移灶與模型組比較顯著減少，表明其對肝臟腫瘤的轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用。茯苓多糖醇沉物3組、4組肺臟組織和肝臟組織瘤栓和轉(zhuǎn)移灶都與模型組比較顯著減少，顯示其具有抑制腫瘤肝轉(zhuǎn)移的作用。總結(jié)1.茯苓總多糖作用多形核白細(xì)胞2小時(shí)，可明顯提高多形核白細(xì)胞在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞周圍形成玫瑰花環(huán)的比例及對腫瘤細(xì)胞的殺傷力。2.茯苓多糖分段提取后，其中醇沉物3(60%醇沉茯苓多糖)和醇沉物4(80%醇沉茯苓多糖)可明顯提高多形核白細(xì)胞在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞周圍形成玫瑰花環(huán)的比例及對腫瘤細(xì)胞的殺傷力。3.茯苓總多糖及茯苓多糖醇沉物3和醇沉物4能使移植性肺腺癌小鼠實(shí)體瘤質(zhì)量顯著減少，肺臟組織和肝臟組織瘤栓和轉(zhuǎn)移灶明顯減少，顯示其具有治療腫瘤和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。4.茯苓多糖醇沉物3和醇沉物4能使移植性肝癌小鼠實(shí)體瘤質(zhì)量顯著減少，肺臟組織和肝臟組織瘤栓和轉(zhuǎn)移灶明顯減少，顯示其具有治療腫瘤和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。具體實(shí)施例方式為了更充分的解釋本發(fā)明的實(shí)施，提供下述制備方法、制劑的實(shí)施實(shí)例。這些實(shí)施實(shí)例僅僅是解釋、而不是限制本發(fā)明的范圍。制劑可以采用本發(fā)明中的任意一批的茯苓多糖醇沉物活性成分。其中的茯苓有市售。實(shí)施例1(1)稱取茯苓切片后粉碎，加入10倍重量份數(shù)的水，回流提取2次，合并提取液濾過，除去不溶性雜質(zhì)；(2)取提取液減壓蒸餾濃縮，濃縮液邊攪拌邊加入乙醇，使含醇量達(dá)到80%，靜置，過濾，收集沉淀；(3)加水溶解沉淀并煮沸，趁熱過濾除去不溶物，濾液邊攪拌邊加入乙醇，使含醇量達(dá)到80%，放置，析出沉淀后過濾，使沉淀物在6(TC干燥，得茯苓總多糖粗品；(4)將茯苓總多糖粗品按1:4加蒸餾水使其溶解，加入乙醇使含醇量達(dá)到20%，靜置，過濾得沉淀物1;濾液再加乙醇使含醇量達(dá)到40%，靜置，過濾得沉物2;濾液再加乙醇使含醇量達(dá)到60%，靜置，過濾得沉物3;濾液再加乙醇使含醇量達(dá)到80%，靜置，過濾得沉物4;(5)采用酚-硫酸紫外分光光度法測定總茯苓多糖的含量為56.2%;高效液相凝膠(HPGPC)色譜圖計(jì)算平均相對分子質(zhì)量的范圍為0.2-3萬。其中醇沉物3、4采用酚-硫17酸紫外分光光度法測定多糖含量均大于60%;高效液相凝膠(HPGPC)色譜圖計(jì)算平均相對分子質(zhì)量的范圍為O.2-1.5萬。實(shí)施例21、提取稱取茯苓500g，切片后粉碎，加入2.5L的水，回流提取3次，每次提取2h;合并3次提取液濾過，除去不溶性雜質(zhì)。取lOOOmL提取液減壓蒸餾濃縮成100ml，邊攪拌邊加入乙醇，使含醇量達(dá)到80%，靜置12h，10000rpm離心，收集沉淀；加蒸餾水50ml溶解煮沸，趁熱過濾除去不溶物，濾液在攪拌下再加入乙醇，使含醇量達(dá)到80%，放置，析出沉淀后，低溫干燥，得茯苓多糖粗品50g。產(chǎn)品中多糖含量為56.2%。2、多糖的分子量段的篩選通過分級醇沉可將不同分子量分布的多糖分開。將總多糖按l:4加蒸餾水使其溶解，加入乙醇，使溶液含醇量達(dá)到20%，得沉淀物1，0.8g，過濾，濾液再加醇達(dá)到40%，得沉物2，1.6g，過濾，濾液再加醇達(dá)到60%，得沉物3，22.5g，過濾，濾液再加醇達(dá)到80%，得沉物4，10.2g。采用酚-硫酸紫外分光光度法測定總茯苓多糖的含量為58.9%;高效液相凝膠(HPGPC)色譜圖計(jì)算平均相對分子質(zhì)量的范圍為1.8萬。其中醇沉物3、4采用酚-硫酸紫外分光光度法測定多糖含量均為70%;高效液相凝膠(HPGPC)色譜圖計(jì)算平均相對分子質(zhì)量的范圍為0.8萬。實(shí)施例3:取沉淀物3，5g，沉淀物4，5g，甘油100ml，葡萄糖50g，注射用水補(bǔ)足至1000ml。制備方法取處方量的沉淀物3，4，室溫下溶于處方量的乙醇和甘油中，攪拌溶解后，加入部分注射用水，攪勻后，加入葡萄糖，攪拌溶解，再補(bǔ)注射用水至1000ml，過濾，灌封，滅菌，即得5ml規(guī)格茯苓多糖注射液。采用酚-硫酸紫外分光光度法測定總茯苓多糖的含量為56.6%;高效液相凝膠(HPGPC)色譜圖計(jì)算平均相對分子質(zhì)量的范圍為2萬。實(shí)施例4:取沉淀物3，5g，沉淀物4，5g，甘露醇100g，氯化鈉90g，注射用水補(bǔ)足至1000ml。制備方法取處方量的沉淀物3，4，室溫下溶于適量的注射用水中，攪拌溶解后，加入甘露醇，攪拌溶解，再補(bǔ)注射用水至1000ml，經(jīng)6號垂熔濾器除菌濾過，將濾液立即在無菌條件下灌裝，每支5ml，冷凍干燥后封口，即得茯苓多糖凍干粉針注射液。采用酚-硫酸紫外分光光度法測定總茯苓多糖的含量為56.0%;高效液相凝膠(HPGPC)色譜圖計(jì)算平均相對分子質(zhì)量的范圍為l萬。實(shí)施例5:取沉淀物3，15g，沉淀物4，18g，加入蒸餾水，攪拌溶解，蔗糖適量，再加蒸餾水至1000ml，攪拌均勻，過濾，將濾液在無菌條件下灌裝，每支5ml、封口即得茯苓多糖口服液。采用酚-硫酸紫外分光光度法測定總茯苓多糖的含量為58.4%;高效液相凝膠(HPGPC)色譜圖計(jì)算平均相對分子質(zhì)量的范圍為0.6萬。實(shí)施例6:取沉淀物3，10g，沉物4，15g。藥用淀粉50.Og，50%乙醇適量，制粒，整粒，烘干，裝2#膠囊，每粒含茯苓多糖0.lg。采用酚-硫酸紫外分光光度法測定總茯苓多糖的含量為56.4%;高效液相凝膠(HPGPC)色譜圖計(jì)算平均相對分子質(zhì)量的范圍為1.2萬。實(shí)施例7:取沉淀物3，8g，沉物4，12g，藥用淀粉30.0g，糊精30.0g，50%乙醇適量，將上述原料充分?jǐn)嚢杌旌现瞥深w粒，在607(TC干燥24小時(shí)，制成100片，每片含茯苓多糖0.2g。采用酚-硫酸紫外分光光度法測定總茯苓多糖的含量為57.0%;高效液相凝膠(HPGPC)色譜圖計(jì)算平均相對分子質(zhì)量的范圍為1.3萬。實(shí)施例8:取沉淀物3，10g，甘油100ml，葡萄糖50g，注射用水補(bǔ)足至1000ml。制備方法取處方量的沉淀物3，10g，室溫下溶于處方量的乙醇和甘油中，攪拌溶解后，加入部分注射用水，攪勻后，加入葡萄糖，攪拌溶解，再補(bǔ)注射用水至1000ml，過濾，灌封，滅菌，即得5ml規(guī)格茯苓多糖注射液。采用酚-硫酸紫外分光光度法測定總茯苓多糖的含量為55.9%;高效液相凝膠(HPGPC)色譜圖計(jì)算平均相對分子質(zhì)量的范圍為1.5萬。實(shí)施例9:取沉淀物4，25g，加入蒸餾水，攪拌溶解，蔗糖適量，再加蒸餾水至1000ml，攪拌均勻，過濾，將濾液在無菌條件下灌裝，每支5ml、封口即得茯苓多糖口服液。采用酚_硫酸紫外分光光度法測定總茯苓多糖的含量為58.9%;高效液相凝膠(HPGPC)色譜圖計(jì)算平均相對分子質(zhì)量的范圍為0.3萬。實(shí)施例10:取醇沉物1，2g，醇沉物2，3g，醇沉物3，1.5g，和醇沉物4，3g，甘油100ml，葡萄糖50g，注射用水補(bǔ)足至1000ml。制備方法取處方量的沉淀物3，4，室溫下溶于處方量的乙醇和甘油中，攪拌溶解后，加入部分注射用水，攪勻后，加入葡萄糖，攪拌溶解，再補(bǔ)注射用水至1000ml，過濾，灌封，滅菌，即得5ml規(guī)格茯苓多糖注射液。采用酚_硫酸紫外分光光度法測定總茯苓多糖的含量為56.2%;高效液相凝膠(HPGPC)色譜圖計(jì)算平均相對分子質(zhì)量的范圍為3萬。實(shí)施例11:取醇沉物1、3g，醇沉物2、5g，醇沉物3，5g，和醇沉物4，7g，藥用淀粉30.Og，糊精30.0g，50X乙醇適量，將上述原料充分?jǐn)嚢杌旌现瞥深w粒，在607(TC干燥24小時(shí)，制成100片，每片含茯苓多糖0.2g。采用酚-硫酸紫外分光光度法測定總茯苓多糖的含量為56.0%;高效液相凝膠(HPGPC)色譜圖計(jì)算平均相對分子質(zhì)量的范圍為2.8萬。實(shí)施例12:取醇沉物1、6g，醇沉物2、4g，醇沉物3，8g，和醇沉物4，7g，藥用淀粉50.Og，50%乙醇適量，制粒，整粒，烘干，裝2#膠囊，每粒含茯苓多糖0.lg。采用酚-硫酸紫外分光光度法測定總茯苓多糖的含量為58.9%;高效液相凝膠(HPGPC)色譜圖計(jì)算平均相對分子質(zhì)量的范圍為2.9萬。在詳細(xì)說明的較佳實(shí)施例之后，熟悉該項(xiàng)技術(shù)人士可清楚地了解，在不脫離上述申請專利范圍與精神下可進(jìn)行各種變化與修改，凡依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍。且本發(fā)明亦不受限于說明書中所舉實(shí)例的實(shí)施方式。權(quán)利要求一種用于抑制腫瘤生長和防治其轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的茯苓多糖組合物，其特征在于含有茯苓屬植物中通過分級醇沉方法得到的不同分子量的多糖，總醇沉多糖含量為50-80％；其重均分子量道爾頓范圍為0.2-3萬。2.如權(quán)利要求1所述的茯苓多糖組合物，其特征在于所述的總醇沉多糖包括醇沉物1、醇沉物2、醇沉物3和醇沉物4或醇沉物3與醇沉物4的組合。3.如權(quán)利要求1或2所述的茯苓多糖組合物，其中總醇沉多糖含量為60-70%;其分子量范圍為O.2-2萬。4.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中的總醇沉多糖為含量大于60%的3、4醇沉物；其分子量范圍為O.2-1.5萬。5.—種制備權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)所述茯苓多糖組合物的方法，其特征在于，總醇沉多糖以如下的方法制備(1)稱取茯苓切片后粉碎，加入3-12倍重量份數(shù)的水，回流提取2-3次，合并提取液濾過，除去不溶性雜質(zhì)；(2)取提取液減壓蒸餾濃縮，濃縮液邊攪拌邊加入乙醇，使含醇量達(dá)到80%，靜置，過濾，收集沉淀；(3)加水溶解沉淀并煮沸，趁熱過濾除去不溶物，濾液邊攪拌邊加入乙醇，使含醇量達(dá)到80%，放置，析出沉淀后過濾，使沉淀物在40-7(TC干燥，得茯苓總多糖粗品；(4)將茯苓總多糖粗品按l:4加蒸餾水使其溶解，加入乙醇使含醇量達(dá)到20%，靜置，過濾得沉淀物1;濾液再加乙醇使含醇量達(dá)到40%，靜置，過濾得沉淀物2;濾液再加乙醇使含醇量達(dá)到60%，靜置，過濾得沉淀物3;濾液再加乙醇使含醇量達(dá)到80%，靜置，過濾得沉淀物4;(5)采用酚-硫酸紫外分光光度法測定總茯苓多糖的含量為56.2%;高效液相凝膠(HPGPC)色譜圖計(jì)算平均相對分子質(zhì)量的范圍為0.2-3萬。6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其中醇沉物3、4采用酚-硫酸紫外分光光度法測定多糖含量均大于60%;高效液相凝膠(HPGPC)色譜圖計(jì)算平均相對分子質(zhì)量的范圍為0.2-1.5萬。7.權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)所述的茯苓多糖組合物，其中總醇沉多糖與藥學(xué)上可接受的載體混合制成口服制劑或注射劑。8.如權(quán)利要求7所述的茯苓多糖組合物，其特征在于所述的口服制劑為片劑、顆粒劑、膠囊或口服液；注射劑為靜脈注射。9.權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)所述的茯苓多糖組合物在制備激活多形核白細(xì)胞，提高殺傷腫瘤細(xì)胞能力藥物方面的應(yīng)用。10.權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)所述的茯苓多糖組合物在制備治療肺癌、肝癌、結(jié)腸癌腫瘤和抑制其轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)藥物方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種從茯苓屬植物中提取的用于治療腫瘤和防治腫瘤轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)的茯苓多糖組合物。它含有茯苓屬植物中通過分級醇沉方法得到的不同分子量的多糖，總醇沉物多糖含量大于50-80％，重均分子量道爾頓范圍為0.2-3萬。其中醇沉物3(60％醇沉茯苓多糖)和醇沉物4(80％醇沉茯苓多糖)具有明顯的激活多形核白細(xì)胞，提高其殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，從而發(fā)揮治療肺癌、肝癌和結(jié)腸癌等腫瘤和防治其轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)的作用。藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的組合物療效顯著，安全有效且未出現(xiàn)任何毒副反應(yīng)。本發(fā)明的中藥組合物可以被制備成任何一種治療腫瘤和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)的制劑。文檔編號C08B37/00GK101711778SQ200910176539公開日2010年5月26日申請日期2009年9月22日優(yōu)先權(quán)日2008年10月7日發(fā)明者莊朋偉,張密霞,張艷軍,李怡文,趙駿,陳波申請人:天津中醫(yī)藥大學(xué)