專利名稱：一種分子印跡整體柱及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分子印跡整體柱及其制備方法和用途，具體地說(shuō)，涉及一種以鳥苷為模板分子的分子印跡整體柱及其制備方法，該分子印跡整體柱用于萃取富集8-羥基脫氧鳥苷和鳥苷。
背景技術(shù)：
8-羥基脫氧鳥苷(8-hydrodeoxyguanosine， 8-OHdG)是一種DNA氧化損傷產(chǎn)生的加合物，也是靈敏和有效標(biāo)示DNA氧化損傷的一種生物標(biāo)記物。它是指在受到化學(xué)物質(zhì)、電離輻射、吸煙以及空氣污染等因素的影響下，體內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧自由基，致使DNA氧化損傷產(chǎn)生的氧化加合物，若這種損傷未被修復(fù)或被錯(cuò)誤修復(fù)時(shí)，即會(huì)引起基因突變，而這種突變?nèi)舭l(fā)生在功能基團(tuán)的表達(dá)序列，將會(huì)導(dǎo)致腫瘤等疾病的發(fā)生。因此，DNA氧化加合物的形成代表著化學(xué)致癌過(guò)程中的一個(gè)早期的、可檢測(cè)的關(guān)鍵階段。在已發(fā)現(xiàn)的二十幾種DNA氧化損傷產(chǎn)物中，鳥嘌呤由于擁有的分子軌道具有較高的能級(jí)，因此最容易被氧化損傷而生成較穩(wěn)定的8-羥基脫氧鳥苷的加合物。它在非特異性酶作用下的DNA修復(fù)過(guò)程將被釋放，并可從體液如血漿和尿樣中檢出。其檢出量的水平與一些慢性疾病如糖尿病、腎病和不同癌癥呈顯著相關(guān)性。對(duì)吸煙和受嚴(yán)重污染環(huán)境下的人群與健康人也有明顯差別。同時(shí)，它性能穩(wěn)定，不受飲食等因素影響，可實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)傷性檢測(cè)。為此，8-OHdG已被公認(rèn)為DNA氧化損傷的一種主要生物標(biāo)記物，其在尿樣中的含量水平，有助于為醫(yī)學(xué)提供早期發(fā)現(xiàn)處于癌前病變的個(gè)體，以求實(shí)施早期干預(yù)措施，在個(gè)體健康普查和環(huán)境污染評(píng)價(jià)中起到指標(biāo)性作用。但是由于尿樣中8-OHdG含量很低、基質(zhì)干擾很大，分析中常用固相萃取(SPE)進(jìn)行樣品富集，萃取材料主要有C18、C18/OH和混合型(C18和陰離子交換樹脂)三種。C18萃取柱屬于通用型非選擇性材料，處理尿樣時(shí)，需要雙柱多次萃取，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作復(fù)雜。使用C18/OH或混合型萃取柱，雖然增加了萃取的選擇性，簡(jiǎn)化了萃取操作，但是尿樣中其它相關(guān)組分也會(huì)被同時(shí)萃取，嚴(yán)重干擾了含量很低的8-OHdG的分離分析，給定性和定量帶來(lái)較大困難。
鳥苷是許多名貴中藥的主要有效成分之一，有明顯的藥理作用，已被用作冬蟲夏草、半夏和紅毛五加等中藥及中成藥的質(zhì)控檢測(cè)指標(biāo)。由于中藥成分復(fù)雜，分析干擾大，為控制藥品質(zhì)量，對(duì)冬蟲夏草中核苷類物質(zhì)建立快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的測(cè)定方法具有重要的實(shí)際意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有富集技術(shù)的不足，提供一種以鳥苷為模板分子的分子印跡整體柱及其制備方法和用途，該分子印跡整體柱對(duì)8-羥基脫氧鳥苷和鳥苷有較高富集能力和選擇性，分析速度快，且制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉。 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是 一種分子印跡整體柱，包括石英毛細(xì)管和石英毛細(xì)管內(nèi)的分子印跡聚合物，所述分子印跡聚合物是以鳥苷為模板分子，將鳥苷、丙烯
3酰胺、4-乙烯基吡啶、N， N'-亞甲基雙丙烯酰胺和十二醇在40 501:水浴條件下超聲溶解于二甲亞砜中，除去混合物中的氧，然后加入偶氮二異丁腈混勻，其中鳥苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N， N'-亞甲基雙丙烯酰胺、十二醇、二甲亞砜和偶氮二異丁腈的質(zhì)量比為17.5 : 55 58 : 48 56 : 62 64 : 275 285 : 350 360 : 1.8 2.2，然后在3-(三乙氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯或3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯修飾的石英毛細(xì)管中于55 6(TC恒溫聚合16 20小時(shí)而成。
本發(fā)明還提供了上述分子印跡整體柱的制備方法，包括以下步驟
(l)以鳥苷為模板分子，將鳥苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N， N'-亞甲基雙丙烯酰胺和十二醇在40 5(TC水浴條件下超聲溶解于二甲亞砜中，除去混合物中的氧，然后加入偶氮二異丁腈，其中鳥苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N， N'-亞甲基雙丙烯酰胺、十二醇、二甲亞砜和偶氮二異丁腈的質(zhì)量比為17.5 : 55 58 : 48 56 : 62 64 : 275 285 : 350 360 : 1.8 2.2，混合均勻后作為分子印跡預(yù)聚體混合液；
(2)將分子印跡預(yù)聚體混合液灌入經(jīng)3-(三乙氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯或3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯修飾的石英毛細(xì)管內(nèi)，封口，然后于6(TC恒溫聚合16
20小時(shí); (3)聚合反應(yīng)完成后，依次用甲醇或乙腈，甲醇與醋酸按體積比7 : 3 9 : 1混合的混合液，甲醇與質(zhì)量百分比濃度為0.1 0.5%的醋酸溶液按體積比2 : 8 7 : 3
混合的混合液，充分洗脫毛細(xì)管，直至從毛細(xì)管流出的洗脫液中沒(méi)有鳥苷為止，得到分子印跡整體柱。 上述步驟(l)中鳥苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N， N'-亞甲基雙丙烯酰胺、
十二醇、二甲亞砜和偶氮二異丁腈的質(zhì)量比為17.5 : 56 : 56 : 63 : 280 : 350 : 2。上述步驟(2)中是于6(TC恒溫聚合16 20小時(shí)。 本發(fā)明的分子印跡整體柱用于萃取富集8-羥基脫氧鳥苷和鳥苷。 本發(fā)明采用原位整體聚合分子印跡技術(shù)，制作了一種以鳥苷為模板分子的分子
印跡整體柱，該分子印跡整體柱對(duì)8-羥基脫氧鳥苷和鳥苷有較高富集能力和選擇性，富
集容量大，分析速度快，可以離線也可在線和液相色譜、毛細(xì)管電泳結(jié)合使用，使用壽
命長(zhǎng)，且制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1所得分子印跡整體柱的掃描電鏡圖(放大5000倍)；
圖2為本發(fā)明實(shí)施例1所得分子印跡整體柱的掃描電鏡圖(放大600倍)。
具體實(shí)施例方式
為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。
實(shí)施例1分子印跡整體柱的制備 將石英毛細(xì)管柱用NaOH活化，而后用HC1和二次蒸餾水沖洗，干燥后灌入3-(三乙氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯進(jìn)行管內(nèi)壁修飾。將鳥苷17.5mg、丙烯酰胺56mg、 4-乙烯基吡啶56mg、 N， N'-亞甲基雙丙烯酰胺63mg和十二醇280mg在5(TC水浴條件下超聲溶解于350mg二甲亞砜中，通氮?dú)?0 分鐘以除去混合物中的氧，然后加入偶氮二異丁腈2mg，超聲混合均勻后作為分子印跡 預(yù)聚體混合液。然后將分子印跡預(yù)聚體混合液灌入經(jīng)3-(三乙氧基硅基)丙基甲基丙烯酸 酯修飾的毛細(xì)管柱中，用硅橡膠封口，于6(TC恒溫聚合，反應(yīng)18小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依 次用甲醇(3mL)、甲醇與醋酸的混合液(3mL，其中甲醇與醋酸體積比為9 : 1)、甲醇與 質(zhì)量百分比濃度為0.1X的醋酸溶液的混合液(15mL，混合液中甲醇與0.1%醋酸溶液的體 積比為2 : 8)，連續(xù)沖洗毛細(xì)管柱，直至液相色譜檢測(cè)從毛細(xì)管流出的淋洗液中沒(méi)有模板 分子鳥苷為止，得到分子印跡整體柱，其最終實(shí)際有效長(zhǎng)度為4.8cm。本實(shí)施例的分子印 跡整體柱的掃描電鏡(SEM)圖如圖l(放大5000倍)和圖2(放大600倍)所示。
實(shí)施例2分子印跡整體柱的制備 按與實(shí)施例1相同的方法，用3-(三乙氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯對(duì)石英毛細(xì) 管進(jìn)行管內(nèi)壁修飾。將鳥苷17.5mg、丙烯酰胺55mg、 4-乙烯基吡啶48mg、 N， N'-亞 甲基雙丙烯酰胺62mg和十二醇275mg在4(TC水浴條件下超聲溶解于355mg 二甲亞砜中， 通入氮?dú)?分鐘以除去混合物中的氧，然后加入偶氮二異丁腈1.9mg，超聲混合均勻后作 為分子印跡預(yù)聚體混合液。然后將分子印跡預(yù)聚體混合液灌入經(jīng)3-(三乙氧基硅基)丙基 甲基丙烯酸酯修飾的毛細(xì)管柱中，用硅橡膠封口，于55t:恒溫聚合，反應(yīng)22小時(shí)。反應(yīng) 結(jié)束后，依次用乙腈(3mL)、甲醇與醋酸的混合液(甲醇與醋酸體積比為7 : 3， 2mL)、 甲醇與質(zhì)量百分比濃度為0.1 %的醋酸溶液的混合液(15mL，混合液中甲醇與0.1 %醋酸溶 液的體積比為7 : 3)，連續(xù)沖洗毛細(xì)管柱，直至液相色譜檢測(cè)從毛細(xì)管流出的淋洗液中沒(méi) 有模板分子鳥苷為止，得到分子印跡整體柱。
實(shí)施例3分子印跡整體柱的制備 按與實(shí)施例1相同的方法，用3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯對(duì)石英毛細(xì) 管進(jìn)行管內(nèi)壁修飾。將鳥苷17.5mg、丙烯酰胺58mg、 4-乙烯基吡啶56mg、 N， N'-亞 甲基雙丙烯酰胺64mg和十二醇285mg在5(TC水浴條件下超聲溶解于360mg 二甲亞砜中， 通入氮?dú)?分鐘以除去混合物中的氧，然后加入偶氮二異丁腈2.2mg，混合均勻后作為分 子印跡預(yù)聚體混合液。將分子印跡預(yù)聚體混合液灌入經(jīng)3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯 酸酯修飾的毛細(xì)管柱中，用硅橡膠封口，于6(TC恒溫聚合，反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后， 依次用乙腈(3mL)、甲醇與醋酸的混合液(4mL，其中甲醇與醋酸體積比為8 : 2)、甲醇 與質(zhì)量百分比濃度為0.5X的醋酸溶液的混合液(13mL，混合液中甲醇與0.5%醋酸溶液的 體積比為2 : 8)，連續(xù)沖洗毛細(xì)管柱，直至液相色譜檢測(cè)從毛細(xì)管流出的淋洗液中沒(méi)有模 板分子鳥苷為止，得到分子印跡整體柱。 實(shí)施例4以實(shí)施例1的分子印跡整體柱作為萃取柱檢測(cè)尿樣中的8-羥基脫氧鳥 苷 萃取裝置是由一臺(tái)注射泵和改裝過(guò)的注射器組成。以實(shí)施例1中制備的分子印 跡整體柱作為萃取柱。首先把注射器的金屬針頭去掉，然后裝上實(shí)施例1中制備的分子 印跡整體柱，用膠水密封即可。經(jīng)優(yōu)化后萃取的溶劑選擇乙腈。將8-羥基脫氧鳥苷標(biāo) 樣溶解于乙腈中配制成濃度為0.35 ii mol/L的溶液，以0.03mL/min速度推過(guò)萃取柱進(jìn)行 萃取，用甲醇與質(zhì)量百分比濃度為0.1 %的醋酸溶液的混合液(混合液中甲醇與質(zhì)量百分 比濃度為0.1%的醋酸溶液的體積比為1 : 9作洗脫液，收集前30iiL洗脫液，結(jié)合液相
5色譜/紫外檢測(cè)器(HPLC/UV)，對(duì)樣品中的8-羥基脫氧鳥苷進(jìn)行檢測(cè)分析。通過(guò)與對(duì)0.35 ii mol/L 8-羥基脫氧鳥苷標(biāo)樣直接進(jìn)樣的液相色譜進(jìn)行比較，本方法對(duì)8-OHdG的富集因子達(dá)到75.67。在0.35 8.83 y mol/L濃度范圍通過(guò)與空白柱(即無(wú)模板分子的萃取柱)的富集結(jié)果進(jìn)行比較，印跡技術(shù)對(duì)富集效果的貢獻(xiàn)為41.72% 52.50%。表明該柱對(duì)8-羥基脫氧鳥苷有很強(qiáng)的富集能力和良好的選擇性，完全能夠滿足對(duì)尿樣中8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的檢測(cè)需要。本檢測(cè)方法的線性范圍為0.010 5.30 iimol/L、最小檢測(cè)限(LOD)和最低定量限(LOQ)分別為3.17nmol/L(S/N = 3)、 10.56腿ol/L(S/N =10)，回收率為93% 101%。 采集學(xué)生志愿者、焦化廠工人和肺癌病人的晨尿(10mL)作為分析應(yīng)用對(duì)象，進(jìn)行實(shí)際樣品測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1 : 表1.學(xué)生志愿者、焦化廠工人和肺癌病人晨尿樣中的8-OHdG檢測(cè)結(jié)果
分析對(duì)象)Hd(;濃度
學(xué)生志愿者14.68土4.59 ,o!,l(n=15)
焦化r工人17,63 ±2,74 iimoi/L (n= 12)
肺癌病人106,89 ± 26,06腿ol/L (n=6) 由于分子印跡整體柱具有整體柱的雙孔結(jié)構(gòu)和較大的比表面積以及印跡技術(shù)特定選擇性等特點(diǎn)，它表現(xiàn)出較大的萃取容量和良好的選擇性。萃取后的尿樣，干擾少，有效改善了對(duì)8-OHdG的分離，提高了定量精度(RSD在3X以內(nèi))，分離速度快，時(shí)間短，使用壽命達(dá)到50次以上。采用本發(fā)明整體柱的制備方法，可以將不同規(guī)格的石英毛細(xì)管制成分子印跡整體柱，可以離線也可在線和液相色譜、毛細(xì)管電泳結(jié)合使用。本萃取檢測(cè)方法可望用于重大疾病(如癌癥)的早期診斷、健康普查；也可用于環(huán)境污染的評(píng)價(jià)。 實(shí)施例5以實(shí)施例1的分子印跡整體柱作為萃取柱萃取富集中成藥中的鳥苷
以實(shí)施例1中的分子印跡整體柱作為萃取柱，按與實(shí)施例1相同的方法采用0.35iimol/L鳥苷標(biāo)樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分子印跡整體柱對(duì)鳥苷的富集因子達(dá)到100.33。 在0.35 8.83 ii mol/L濃度范圍內(nèi)，通過(guò)與空白柱(即無(wú)模板分子的萃取柱)的富集效果進(jìn)行比較，印跡技術(shù)對(duì)富集效果的貢獻(xiàn)為58.67%。本發(fā)明的分子印跡整體柱對(duì)鳥苷表現(xiàn)出很高的富集能力和良好的選擇性，完全能夠滿足藥材中微量鳥苷的檢測(cè)需要。本檢測(cè)方法的線性范圍為0.011 5.30 ii mol/L、最小檢測(cè)限(LOD)和最低定量限(LOQ)分別為0.25nmol/L(S/N = 3)、 0.88nmol/L(S/N = 10)，回收率為96% 102%。 對(duì)市場(chǎng)上所售某品牌中成藥剌五加片的鳥苷含量進(jìn)行分析，測(cè)得其鳥苷含量為4.31X10-、mol(3.05iig/g)，測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.22X(n二3)?；诒景l(fā)明的分子印跡整體柱建立的萃取方法能夠有效地萃取富集鳥苷等主要成分，減少干擾，適用于中藥及中成藥的質(zhì)量監(jiān)控。
權(quán)利要求
一種分子印跡整體柱，包括石英毛細(xì)管和石英毛細(xì)管內(nèi)的分子印跡聚合物，其特征在于所述分子印跡聚合物是以鳥苷為模板分子，將鳥苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺和十二醇在40～50℃水浴條件下超聲溶解于二甲亞砜中，除去混合物中的氧，然后加入偶氮二異丁腈混勻，其中鳥苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺、十二醇、二甲亞砜和偶氮二異丁腈的質(zhì)量比為17.5∶55～58∶48～56∶62～64∶275～285∶350～360∶1.8～2.2，然后在3-(三乙氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯或3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯修飾的石英毛細(xì)管中于55～60℃恒溫聚合16～20小時(shí)而成。
2. —種權(quán)利要求1所述的分子印跡整體柱的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1) 以鳥苷為模板分子，將鳥苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N， N'-亞甲基雙丙 烯酰胺和十二醇在40 5(TC水浴條件下超聲溶解于二甲亞砜中，除去混合物中的氧，然 后加入偶氮二異丁腈，其中鳥苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N， N'-亞甲基雙丙烯酰 胺、十二醇、二甲亞砜和偶氮二異丁腈的質(zhì)量比為17.5 : 55 58 : 48 56 : 62 64 : 275 285 : 350 360 : 1.8 2.2，混合均勻后作為分子印跡預(yù)聚體混合液；(2) 將分子印跡預(yù)聚體混合液灌入經(jīng)3-(三乙氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯或3-(三甲氧 基硅基)丙基甲基丙烯酸酯修飾的石英毛細(xì)管內(nèi)，封口，然后于55 6(TC恒溫聚合16 20小時(shí);(3) 聚合反應(yīng)完成后，依次用甲醇或乙腈，甲醇與醋酸按體積比7 : 3 9 : i混合的混合液，甲醇與質(zhì)量百分比濃度為0.1 0.5%的醋酸溶液按體積比2 : 8 7 : 3混合的混合液，充分洗脫毛細(xì)管，直至從毛細(xì)管流出的洗脫液中沒(méi)有鳥苷為止，得到分子印跡整體柱。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子印跡整體柱的制備方法，其特征在于步驟(l)中鳥苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N， N'-亞甲基雙丙烯酰胺、十二醇、二甲亞砜和偶氮 二異丁腈的質(zhì)量比為17.5 : 56 : 56 : 63 : 280 : 350 : 2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子印跡整體柱的制備方法，其特征在于步驟(2)中是于 60。C恒溫聚合16 20小時(shí)。
5. 如權(quán)利要求1所述的分子印跡整體柱用于萃取富集8-羥基脫氧鳥苷和鳥苷。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分子印跡整體柱及其制備方法和用途，該分子印跡整體柱包括石英毛細(xì)管和管內(nèi)的分子印跡聚合物，是以鳥苷為模板分子，將鳥苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺和十二醇在40～50℃水浴超聲溶解于二甲亞砜中，除氧后加入偶氮二異丁腈混勻，其中鳥苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺、十二醇、二甲亞砜和偶氮二異丁腈的質(zhì)量比為17.5∶55～58∶48～56∶62～64∶275～285∶350～360∶1.8～2.2，然后在3-(三乙氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯或3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯修飾的石英毛細(xì)管中于55～60℃恒溫聚合16～20小時(shí)而成。該分子印跡整體柱用于萃取富集8-羥基脫氧鳥苷和鳥苷，具有較高富集能力和選擇性。
文檔編號(hào)C08F2/44GK101690886SQ20091006276
公開日2010年4月7日 申請(qǐng)日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者吳采櫻, 張少文, 蔡凌霜, 邢鈞 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)