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從細(xì)胞中有效提取蛋白質(zhì)的方法與流程

文檔序號:12701778閱讀:來源:國知局
從細(xì)胞中有效提取蛋白質(zhì)的方法與流程

技術(shù)特征:
1.用于從固定的或未固定的細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物的方法,所述方法包括:a)使所述細(xì)胞與提取試劑相接觸,從而產(chǎn)生具有至少pH10.0的pH的中間組合物,和b)使所述中間組合物與中和試劑相接觸,從而中和所述中間組合物的所述pH,并產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)提取物,其中,所述提取試劑和所述中和試劑之一或二者含有聚氧乙烯烷基醚。2.權(quán)利要求1的方法,其中所述方法包括:a)使所述細(xì)胞與提取試劑相接觸,從而產(chǎn)生具有至少pH10.0的pH的中間組合物,其中所述提取試劑含有聚氧乙烯烷基醚;和b)使所述中間組合物與中和試劑相接觸,從而中和所述中間組合物的所述pH,并產(chǎn)生pH為6-9的所述蛋白質(zhì)提取物。3.權(quán)利要求1的方法,其中所述方法包括:a)使所述細(xì)胞與提取試劑相接觸,從而產(chǎn)生具有至少pH10.0的pH的中間組合物;和b)使所述中間組合物與中和試劑相接觸,從而中和所述中間組合物的所述pH,并產(chǎn)生pH為6-9的所述蛋白質(zhì)提取物,其中所述中和試劑包含聚氧乙烯烷基醚。4.權(quán)利要求1的方法,其中所述聚氧乙烯烷基醚為BrijTM表面活性劑。5.權(quán)利要求4的方法,其中所述BrijTM表面活性劑為聚氧乙烯(23)月桂醚。6.權(quán)利要求5的方法,其中所述聚氧乙烯(23)月桂醚在提取試劑中的濃度在2-6%(v/v)之內(nèi)。7.權(quán)利要求6的方法,其中所述提取試劑還包括0.1NNaOH,50mM檸檬酸三鈉,且具有12.5-12.9的pH。8.權(quán)利要求7的方法,其中所述提取試劑還包括TritonTM洗滌劑或TweenTM洗滌劑,或其混合物。9.權(quán)利要求7的方法,其中所述提取試劑還包括TritonTMX-100洗滌劑或TweenTM-20洗滌劑,或其混合物。10.權(quán)利要求9的方法,其中所述TritonTMX-100或TWEENTM-20洗滌劑或二者的濃度在1-6%(v/v)之內(nèi)。11.權(quán)利要求1的方法,其中所述中和試劑為包含Tris的緩沖液。12.權(quán)利要求1的方法,其中在加入所述提取試劑后,溫育所述中間組合物至少10分鐘。13.權(quán)利要求1的方法,其中在加入所述提取試劑后,溫育所述中間組合物10-30分鐘。14.權(quán)利要求1的方法,其中在加入所述中和試劑后,溫育所述中間組合物至少10分鐘。15.權(quán)利要求1的方法,其中在加入所述中和試劑后,溫育所述中間組合物10–30分鐘。16.權(quán)利要求4的方法,其中所述BrijTM表面活性劑為下列中的一種或多種:聚氧乙烯(23)月桂醚(CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)nOH,n=23);聚氧乙烯(4)月桂醚(CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)nOH,n=4);聚氧乙烯(2)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH,n=2);聚氧乙烯(10)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH,n=10);聚氧乙烯(20)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH,n=20);聚氧乙烯(2)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH,n=2);聚氧乙烯(10)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH,n=10);聚氧乙烯(20)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH,n=20);聚氧乙烯(2)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH,n=2);聚氧乙烯(2)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH,n=2);聚氧乙烯(10)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH,n=10);聚氧乙烯(20)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH,n=20);聚氧乙烯(100)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH,n=100);或聚氧乙烯(21)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH,n=21)。17.權(quán)利要求1的方法,其還包括:在步驟a)前,獲得包括所述固定的或未固定的細(xì)胞的細(xì)胞樣品,其中所述細(xì)胞樣品包含或被懷疑包含靶蛋白。18.權(quán)利要求17的方法,其中所述細(xì)胞是固定的子宮頸細(xì)胞,并且所述靶蛋白是人乳頭瘤病毒(HPV)E6蛋白。19.權(quán)利要求18的方法,其中所述固定的細(xì)胞存在于包含乙醇或包含甲醇的運送培養(yǎng)基中。20.權(quán)利要求17的方法,其中所述細(xì)胞是未固定的子宮頸細(xì)胞,并且所述靶蛋白是人乳頭瘤病毒(HPV)E6蛋白。21.權(quán)利要求17的方法,其中所述細(xì)胞樣品獲自個人。22.權(quán)利要求1的方法,其中所述pH處于pH11.0-pH13.0的范圍內(nèi)。23.權(quán)利要求1的方法,其中所述提取試劑還包括變性劑。24.權(quán)利要求23的方法,其中所述變性劑是十二烷基硫酸鈉(SDS)、尿素或十二烷基肌氨酸鈉。25.權(quán)利要求1的方法,其還包括通過濾器過濾所述蛋白質(zhì)提取物的步驟。26.權(quán)利要求25的方法,其中所述濾器具有0.1μm-50.0μm的孔徑。27.權(quán)利要求25的方法,其中所述濾器包括下列各項:聚乙烯,聚丙烯,聚(4-甲基丁烯),聚苯乙烯,聚甲基丙烯酸酯,聚(對苯二甲酸乙二酯),人造絲,尼龍,聚(丁酸乙烯酯),聚偏二氟乙烯(PVDF),硅氧烷,聚甲醛,纖維素,醋酸纖維素,硝化纖維素,玻璃纖維濾紙,聚氯乙烯,聚乙酸乙烯酯,乙酸乙烯酯和氯乙烯的共聚物,聚酰胺,聚碳酸酯,奧綸,聚酯,聚苯乙烯或它們的任意組合。28.a)具有至少pH10.0的pH的提取試劑和b)中和試劑在制備用于檢測早先已知或否則表征的靶蛋白的試劑盒中的用途,其中所述提取試劑和所述中和試劑之一或二者含有聚氧乙烯烷基醚,其中所述試劑盒用于從固定的或未固定的細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物;和所述蛋白質(zhì)在所述蛋白質(zhì)提取物中的存在被檢驗。29.權(quán)利要求28的用途,其中所述檢驗使用針對所述靶蛋白的捕獲劑。30.權(quán)利要求28的用途,其中所述檢驗包括免疫學(xué)測定。31.權(quán)利要求30的用途,其中所述測定是酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。32.權(quán)利要求30的用途,其中所述測定是免疫色譜測定或側(cè)向流動(LF)測定。33.權(quán)利要求32的用途,其中所述測定使用單克隆抗體綴合的金粒子。34.權(quán)利要求30的用途,其中所述測定使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體。35.權(quán)利要求30的用途,其中所述測定使用化學(xué)發(fā)光粒子、有色/染色的膠乳粒子、SERS拉曼粒子、具有多種報告染料的硅石包被的金核、或具有報告染料的硅石包被的銀核。36.權(quán)利要求30的用途,其中所述測定使用一種或多種單克隆抗體的連續(xù)應(yīng)用。37.權(quán)利要求28的用途,其中所述檢驗使用細(xì)胞計數(shù)珠陣列(CBA)或多元珠測定。38.權(quán)利要求28的用途,其中所述靶蛋白是人乳頭瘤病毒(HPV)蛋白,且所述檢驗使用與HPVE6蛋白結(jié)合的PDZ結(jié)構(gòu)域多肽。39.權(quán)利要求28的用途,其中所述未固定的細(xì)胞是剝離的子宮頸細(xì)胞。40.權(quán)利要求28的用途,其中所述固定的細(xì)胞是剝離的子宮頸細(xì)胞。41.權(quán)利要求28的用途,其中從遠(yuǎn)程位置接收所述固定的或未固定的細(xì)胞。42.權(quán)利要求28的用途,其還包括將所述檢驗的結(jié)果傳達(dá)到遠(yuǎn)程位置。43.用于按照權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物的試劑盒,所述試劑盒包括:a)包含固定的或未固定的細(xì)胞的細(xì)胞樣品,b)具有至少pH10.0的pH的提取試劑,和c)中和試劑,其中所述提取試劑和所述中和試劑之一或二者包含聚氧乙烯烷基醚。44.權(quán)利要求43的試劑盒,其中所述聚氧乙烯烷基醚是BrijTM表面活性劑。45.權(quán)利要求44的試劑盒,其中所述BrijTM表面活性劑為聚氧乙烯(23)月桂醚。46.權(quán)利要求43的試劑盒,其還包括用于檢測所述蛋白質(zhì)提取物中的靶蛋白的試劑。47.權(quán)利要求43的試劑盒,其還包括濾器。48.權(quán)利要求47的試劑盒,其中所述濾器具有0.1μm-50.0μm的孔徑。49.權(quán)利要求47的試劑盒,其中所述濾器包括下列各項:聚乙烯,聚丙烯,聚(4-甲基丁烯),聚苯乙烯,聚甲基丙烯酸酯,聚(對苯二甲酸乙二酯),人造絲,尼龍,聚(丁酸乙烯酯),聚偏二氟乙烯(PVDF),硅氧烷,聚甲醛,纖維素,醋酸纖維素,硝化纖維素,玻璃纖維濾紙,聚氯乙烯,聚乙酸乙烯酯,乙酸乙烯酯和氯乙烯的共聚物,聚酰胺,聚碳酸酯,奧綸,聚酯,聚苯乙烯或它們的任意組合。50.用于從固定的或未固定的細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物的試劑盒,所述試劑盒包括:a)具有至少pH10.0的pH的提取試劑;b)中和試劑;和c)用于利用所述提取試劑和所述中和試劑進(jìn)行權(quán)利要求1的方法的說明書;其中所述提取試劑和所述中和試劑之一或二者包含聚氧乙烯烷基醚。51.權(quán)利要求50的試劑盒,其中所述聚氧乙烯烷基醚是BrijTM表面活性劑。52.權(quán)利要求51的試劑盒,其中所述BrijTM表面活性劑為聚氧乙烯(23)月桂醚。53.權(quán)利要求50的試劑盒,其還包括用于檢測所述蛋白質(zhì)提取物中的靶蛋白的試劑。54.權(quán)利要求53的試劑盒,其中所述試劑包括針對所述靶蛋白的捕獲劑。55.權(quán)利要求54的試劑盒,其中所述靶蛋白是HPVE6蛋白,并且所述捕獲劑為針對所述HPVE6蛋白的單克隆抗體或結(jié)合所述HPVE6蛋白的PDZ結(jié)構(gòu)域多肽。56.以下物質(zhì)在制備用于產(chǎn)生靶病毒蛋白提取物的試劑盒中的應(yīng)用:a)提取試劑,其用于與包含存在或懷疑存在靶病毒蛋白的細(xì)胞的細(xì)胞樣品相接觸,從而產(chǎn)生具有至少pH10.0的pH的中間組合物;和b)中和試劑,其用于與所述中間組合物相接觸,從而中和所述中間組合物的所述pH,其中所述提取試劑和所述中和試劑之一或二者包含聚氧乙烯烷基醚。57.權(quán)利要求56的應(yīng)用,其中所述聚氧乙烯烷基醚是BrijTM表面活性劑。58.權(quán)利要求57的應(yīng)用,其中所述BrijTM表面活性劑是聚氧乙烯(23)月桂醚,其以2-6%(v/v)的濃度包含在所述提取試劑中。59.權(quán)利要求58的應(yīng)用,其中所述提取試劑還包含0.1NNaOH,50mM檸檬酸三鈉,并且pH為12.5-12.9。60.權(quán)利要求59的應(yīng)用,其中所述提取試劑還包含TritonTM洗滌劑或TweenTM洗滌劑,或其混合物。61.權(quán)利要求60的應(yīng)用,其中所述提取試劑還包含TritonTMX-100洗滌劑或TweenTM-20洗滌劑,或其混合物。62.權(quán)利要求61的應(yīng)用,其中所述TritonTMX-100或TWEENTM-20洗滌劑或二者的濃度在2-6%(v/v)之內(nèi)。63.權(quán)利要求56的應(yīng)用,其中所述中和試劑是包含Tris的緩沖液。64.權(quán)利要求56的應(yīng)用,其中在加入所述提取試劑后,溫育所述中間組合物10-30分鐘。65.權(quán)利要求56的應(yīng)用,其中在加入所述中和試劑后,溫育所述中間組合物10–30分鐘。66.權(quán)利要求57的應(yīng)用,其中所述BrijTM表面活性劑為下列中的一種或多種:聚氧乙烯(23)月桂醚(CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)nOH,n=23);聚氧乙烯(4)月桂醚(CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)nOH,n=4);聚氧乙烯(2)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH,n=2);聚氧乙烯(10)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH,n=10);聚氧乙烯(20)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH,n=20);聚氧乙烯(2)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH,n=2);聚氧乙烯(10)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH,n=10);聚氧乙烯(20)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH,n=20);聚氧乙烯(2)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH,n=2);聚氧乙烯(2)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH,n=2);聚氧乙烯(10)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH,n=10);聚氧乙烯(20)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH,n=20);聚氧乙烯(100)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH,n=100);或聚氧乙烯(21)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH,n=21)。67.權(quán)利要求56的應(yīng)用,其中所述細(xì)胞樣品中的細(xì)胞用化學(xué)固定劑固定。68.權(quán)利要求67的應(yīng)用,其中所述化學(xué)固定劑選自由下列各項組成的組:醇、醛、酮、四氧化鋨、乙酸、苦味酸、和重金屬離子鹽。69.權(quán)利要求68的應(yīng)用,其中所述醇是甲醇、乙醇、或丙二醇;所述醛是戊二醛或甲醛;且所述酮是丙酮。70.權(quán)利要求67的應(yīng)用,其中所述固定的細(xì)胞存在于包含乙醇或包含甲醇的運送培養(yǎng)基中。71.權(quán)利要求56的應(yīng)用,其中在與所述提取試劑接觸前接收所述細(xì)胞樣品。72.權(quán)利要求56的應(yīng)用,其中所述靶病毒蛋白由致病病毒編碼。73.權(quán)利要求72的應(yīng)用,其中所述致病病毒選自由下列各項組成的組:HIV、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、肝炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、單純皰疹病毒(HSV)、和人乳頭瘤病毒(HPV)。74.權(quán)利要求56的應(yīng)用,其中所述靶病毒蛋白是HPV的E6或E7蛋白。75.權(quán)利要求74的應(yīng)用,其中所述HPV是HPV毒株4,6,11,20,24,28,36,48,50,16,18,31,35,30,39,45,51,52,56,59,58,33,66,68,69,26,53,73,或82。76.權(quán)利要求74的應(yīng)用,其中所述HPV是致癌HPV毒株,所述致癌HPV毒株選自由下列各項組成的組:HPV26,HPV53,HPV66,HPV73,HPV82,HPV16,HPV18,HPV31,HPV35,HPV30,HPV39,HPV45,HPV51,HPV52,HPV56,HPV59,HPV58,HPV33,HPV68,HPV69,和HPV82。77.權(quán)利要求56的應(yīng)用,其中所述細(xì)胞樣品還含有粘液、血液或痰液。78.權(quán)利要求56的應(yīng)用,其中所述細(xì)胞樣品含有剝離的子宮頸細(xì)胞。79.以下物質(zhì)在制備用于檢測靶病毒蛋白在靶病毒蛋白提取物中的存在的試劑盒中的應(yīng)用:a)提取試劑,其用于與包含存在或懷疑存在靶病毒蛋白的細(xì)胞的細(xì)胞樣品相接觸,從而產(chǎn)生具有至少pH10.0的pH的中間組合物;和b)中和試劑,其用于與所述中間組合物相接觸,從而中和所述中間組合物的所述pH,以產(chǎn)生所述靶病毒蛋白提取物,其中所述提取試劑和所述中和試劑之一或二者包含聚氧乙烯烷基醚。80.權(quán)利要求79的應(yīng)用,其中所述檢測使用針對所述靶病毒蛋白的捕獲劑。81.權(quán)利要求80的應(yīng)用,其中所述靶病毒蛋白是HPV的E6蛋白;且所述捕獲劑是針對所述E6蛋白的抗體。82.權(quán)利要求80的應(yīng)用,其中所述靶病毒蛋白是HPV的E6蛋白;且所述捕獲劑包括包含PDZ結(jié)構(gòu)域的多肽。83.權(quán)利要求80的應(yīng)用,其中所述靶病毒蛋白是HPV的E6蛋白,并且所述捕獲劑包括針對所述E6蛋白的抗體和包含PDZ結(jié)構(gòu)域的多肽二者。84.權(quán)利要求80的應(yīng)用,其中所述靶病毒蛋白是HPV的E6蛋白;且所述捕獲劑包括BP或AP肽。85.權(quán)利要求82或83的應(yīng)用,其中所述PDZ結(jié)構(gòu)域是MAGI-1的第二結(jié)構(gòu)域、或者是DLG或TIP1的PDZ結(jié)構(gòu)域。86.權(quán)利要求79的應(yīng)用,其中所述檢測包括免疫學(xué)測定。87.權(quán)利要求86的應(yīng)用,其中所述測定是酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。88.權(quán)利要求86的應(yīng)用,其中所述測定是免疫色譜測定或側(cè)向流動(LF)測定。89.權(quán)利要求86的應(yīng)用,其中所述測定使用單克隆抗體綴合的金粒子。90.權(quán)利要求86的應(yīng)用,其中所述測定使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體。91.權(quán)利要求86的應(yīng)用,其中所述測定使用化學(xué)發(fā)光粒子、有色/染色的膠乳粒子、SERS拉曼粒子、或具有報告染料的硅石包被的金核或銀核。92.權(quán)利要求86的應(yīng)用,其中所述測定使用一種或多種單克隆抗體的連續(xù)應(yīng)用。93.權(quán)利要求79的應(yīng)用,其中所述檢測使用細(xì)胞計數(shù)珠陣列(CBA)或多元珠測定。
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