專利名稱：膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的抽提的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用不同去污劑切向流過滲濾法，從細(xì)菌或含有重組載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞中抽提革蘭陰性菌膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
革蘭陰性菌有內(nèi)膜和外膜。這些膜中所含的蛋白質(zhì)總體上稱為膜內(nèi)在蛋白質(zhì)?？蓮母锾m陰性菌中抽提獲得相對(duì)少量的天然膜內(nèi)在蛋白質(zhì)。重組表達(dá)技術(shù)能使細(xì)菌增加表達(dá)這些蛋白質(zhì)。
小規(guī)模批量純化這些天然的或重組的膜內(nèi)在蛋白質(zhì)涉及一利用離心從細(xì)菌細(xì)胞裂解液中抽提蛋白質(zhì)的抽提步驟，接著采用常規(guī)的技術(shù)進(jìn)行下游純化。
然而，離心不適用于大規(guī)模地抽提這些蛋白質(zhì)，因?yàn)殡x心是個(gè)麻煩的過程。需要一種大規(guī)模的抽提方法，以獲得足夠用于經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)的大量蛋白質(zhì)。
因而，需要一種避免使用離心從而更適用于大規(guī)模生產(chǎn)的抽提天然或重組革蘭陰性菌膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的方法。兩種這樣的蛋白質(zhì)是流感嗜血桿菌的脂化的外膜蛋白質(zhì)P4和P6。
發(fā)明概述因而，本發(fā)明的一個(gè)目的是發(fā)展一種避免使用離心并且更適用于大規(guī)模生產(chǎn)的抽提天然或重組革蘭陰性菌膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的方法。
本發(fā)明的另一目的是發(fā)展一種選擇性地溶解革蘭陰性菌的內(nèi)膜和外膜蛋白質(zhì)的方法。
本發(fā)明的又一目的是發(fā)展從大腸桿菌抽提脂化形式的重組流感嗜血桿菌外膜蛋白質(zhì)P4和P6的方法。
通過采用不同去污劑切向流滲濾且避免離心的方法實(shí)現(xiàn)本發(fā)明下述這些和其它目的。還可采用這些方法連續(xù)抽提所需的蛋白質(zhì)。
對(duì)于采用不同去污劑切向流滲濾，分別從細(xì)菌或含有重組載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞中抽提得到天然的或重組表達(dá)的革蘭陰性菌內(nèi)膜蛋白質(zhì)的方法，它包括
(a)裂解發(fā)酵培養(yǎng)液中的細(xì)菌或含有重組載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發(fā)酵培養(yǎng)液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內(nèi)和胞外性污染物，并用螯合劑防止蛋白質(zhì)水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產(chǎn)物，其中，所述去污劑溶解并取出內(nèi)膜蛋白質(zhì)，并使用二價(jià)陽離子穩(wěn)定外膜蛋白質(zhì)，防止它們?nèi)芙?；?d)收集(c)步取得的內(nèi)膜蛋白質(zhì)。
對(duì)于采用不同去污劑切向流滲濾，分別從細(xì)菌或含有重組載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞中抽提得到天然的或重組表達(dá)的革蘭陰性菌外膜蛋白質(zhì)的方法，它包括(a)裂解發(fā)酵培養(yǎng)液中的細(xì)菌或含有重組載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發(fā)酵培養(yǎng)液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內(nèi)和胞外性污染物，使用螯合劑防止蛋白質(zhì)水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產(chǎn)物，其中，所述去污劑溶解并去除內(nèi)膜蛋白質(zhì)，并使用二價(jià)陽離子穩(wěn)定外膜蛋白質(zhì)，從而防止它們?nèi)芙猓?d)用(c)步的緩沖液滲濾從(c)得到的裂解產(chǎn)物，并且用不含去污劑的(c)步的二價(jià)陽離子，以降低(c)步的去污劑濃度；(e)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(d)得到的裂解產(chǎn)物，并用螯合劑和去污劑溶解和取出外膜蛋白質(zhì)；(f)收集(e)步取得的外膜蛋白質(zhì)。
如果需要，在上述步驟之后，可進(jìn)一步進(jìn)行以下抽提步驟(g)使用(e)步中除去污劑以外的其余試劑滲濾從(e)得到的裂解產(chǎn)物，以減少去污劑的濃度；(h)用(e)步試劑滲濾從(g)得到的裂解產(chǎn)物；和(i)收集(h)步取得的外膜蛋白質(zhì)。
對(duì)于采用不同去污劑切向流滲濾，從細(xì)菌宿主細(xì)胞中抽提出流感嗜血桿菌脂化重組外膜蛋白質(zhì)P4(脂化rP4)的方法，它包括(a)裂解發(fā)酵培養(yǎng)液中的細(xì)菌宿主細(xì)胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發(fā)酵培養(yǎng)液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內(nèi)和胞外性污染物，并用螯合劑以防止蛋白質(zhì)水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產(chǎn)物，其中，所述去污劑溶解并去除內(nèi)膜蛋白質(zhì)，并使用二價(jià)陽離子穩(wěn)定外膜蛋白質(zhì)，從而防止它們的溶解；(d)用(c)步的緩沖液滲濾從(c)得到的裂解產(chǎn)物，并且使用不含去污劑的(c)步的二價(jià)陽離子，以降低(c)帶來的去污劑濃度；(e)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(d)得到的裂解產(chǎn)物，用螯合劑和去污劑溶解外膜蛋白質(zhì)；(f)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(e)得到的裂解產(chǎn)物，使用螯合劑和去污劑抽提和取出脂化rP4；和(g)收集(f)步取得的脂化rP4。
如果需要，在上述步驟之后，可進(jìn)一步進(jìn)行以下抽提步驟；(h)使用(f)步除去污劑外的其余試劑滲濾從(f)得到的裂解產(chǎn)物，以減少去污劑的濃度；(i)用(f)步試劑滲濾從(h)得到的裂解產(chǎn)物以抽提和取出脂化rP4；和(j)收集(i)步取得的脂化rP4。
如果還需要，在上述步驟之后，還可進(jìn)一步進(jìn)行以下抽提步驟(k)使用(f)步除去污劑外的其余試劑滲濾從(j)得到的裂解產(chǎn)物，以減少去污劑的濃度；(l)用(f)步的試劑滲濾從(k)得到的裂解產(chǎn)物以抽提和取出脂化rP4；和(m)收集(l)步取得的脂化rP4。
如果還需要，還可進(jìn)一步進(jìn)行脂化rP4抽提的循環(huán)。
對(duì)于采用不同去污劑切向流滲濾，從細(xì)菌宿主細(xì)胞中抽提得到流感嗜血桿菌脂化重組外膜蛋白質(zhì)P6(脂化rP6)的方法，它包括(a)裂解發(fā)酵培養(yǎng)液中的細(xì)菌宿主細(xì)胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發(fā)酵培養(yǎng)液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內(nèi)和胞外性污染物，并使用螯合劑防止蛋白質(zhì)水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產(chǎn)物，其中，所述去污劑溶解并去除內(nèi)膜蛋白質(zhì)，并使用二價(jià)陽離子穩(wěn)定外膜蛋白質(zhì)，從而防止它們的溶解；(d)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(c)得到的裂解產(chǎn)物，使用螯合劑螯合二價(jià)陽離子并防止蛋白質(zhì)水解，使用去污劑溶解和去除除脂化rP6外的外膜蛋白質(zhì)；(e)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(d)得到的裂解產(chǎn)物，用螯合劑防止蛋白質(zhì)水解、用去污劑去除其他外膜蛋白質(zhì)以及用鹽破壞膜/外膜蛋白質(zhì)復(fù)合體；(f)用(e)步試劑(除了去污劑和鹽外)滲濾從(e)得到的裂解產(chǎn)物，以減少去污劑的濃度；(g)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(f)得到的裂解產(chǎn)物，其中，所述去污劑溶解和去除結(jié)合于細(xì)胞外膜的其他蛋白質(zhì)，用螯合劑防止蛋白質(zhì)水解；(h)用(g)步緩沖液和(g)步螯合劑滲濾從(g)得到的裂解產(chǎn)物，以減少?gòu)?g)帶來的去污劑的濃度；(i)用磷酸鹽化合物和去污劑滲濾從(h)得到的裂解產(chǎn)物，以溶解和去除結(jié)合于細(xì)胞外膜的其他蛋白質(zhì)；(j)用磷酸鹽化合物滲濾從(i)得到的裂解產(chǎn)物，以降低(i)帶來的去污劑濃度；(k)加熱(j)步的裂解產(chǎn)物，以從膜中取出脂化rP6，同時(shí)用磷酸鹽化合物和去污劑滲濾該裂解產(chǎn)物以溶解、抽提和取出脂化rP6；(l)收集(k)步取得的脂化rP6。
如果需要，可修改抽提脂化rP6的方法，在進(jìn)行(k)步之前濃縮(j)步得到的裂解產(chǎn)物。
附圖的簡(jiǎn)短說明

圖1描述了抽提脂化rP4期間取自滲透液流的樣品的SDS-PAGE分析，如下面的實(shí)施例1所述。泳道泳道1是Pharmacia低分子量標(biāo)記物；2是0.1μg脂化rP4標(biāo)準(zhǔn)品；3是0.3μg脂化rP4標(biāo)準(zhǔn)品；4是1μg脂化rP4標(biāo)準(zhǔn)品；5是用裂解緩沖液(10mM Hepes，1mM EDTA)進(jìn)行滲濾的滲透液；6是用TritonTMX-100進(jìn)行滲濾的滲透液；7是用TrisTM緩沖液進(jìn)行滲濾的滲透液；8是用ZwittergentTM3-12緩沖液進(jìn)行1x滲濾的滲透液；9是用ZwittergentTM3-12緩沖液進(jìn)行10x滲濾的滲透液。
圖2描述了在脂化rP4的抽提過程中4個(gè)試驗(yàn)的滲透流量，如下面的實(shí)施例2所述。流量以升/平方米膜面積/小時(shí)(1mh)計(jì)。
圖3描述了脂化rP6抽提法第一部分期間取自滲透流液的樣品的SDS-PAGE分析，如下面的實(shí)施例3所述。泳道1是標(biāo)記物12標(biāo)準(zhǔn)品；2是用裂解緩沖液進(jìn)行滲濾的滲透液；3是用TritonTMX-100進(jìn)行滲濾的滲透液；4是用TrisTM緩沖液進(jìn)行滲濾的滲透液；5是用ZwittergentTM3-14進(jìn)行滲濾的滲透液；6是用ZwittergentTM3-14/0.5M NaCl進(jìn)行滲濾的滲透液；7是用TrisTM緩沖液進(jìn)行滲濾的滲透液；8是用Sarcosyl進(jìn)行滲濾的滲透液。
圖4描述了脂化rP6抽提法第二部分期間取自滲透流液樣品的SDS-PAGE分析，如下面的實(shí)施例3所述。泳道1是標(biāo)記物12標(biāo)準(zhǔn)品；2是用TrisTM緩沖液進(jìn)行滲濾的滲透液；3是在室溫用ZwittergentTM3-12進(jìn)行滲濾的滲透液；4是用TrisTM緩沖液進(jìn)行滲濾的滲透液；5是濃縮步驟的滲透液；6是在55℃用ZwittergentTM3-12進(jìn)行滲濾的滲透液；7是在55℃用TrisTM緩沖液進(jìn)行滲濾的滲透液；8是在55℃用ZwittergentTM3-12進(jìn)行滲濾的滲透液。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明抽提膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的方法較其它方法有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，本發(fā)明將澄清和抽提合并在一項(xiàng)操作中。僅采用一步滲濾過程將產(chǎn)物從細(xì)胞中抽提出來并與細(xì)胞碎片分離。其它的方法通常需要一步抽提操作和第二步澄清操作。第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)是膜蛋白質(zhì)以半純化狀態(tài)被抽提出來，這簡(jiǎn)化了下游的加工步驟。最后，本發(fā)明方法非常容易放大規(guī)模，因?yàn)樗蟮膬H僅是膜的表面積隨著細(xì)胞的數(shù)量成比例地增加。
在開始本發(fā)明抽提方法之前，先采用常規(guī)的方法在同源或異源細(xì)菌宿主細(xì)胞中表達(dá)從革蘭陰性菌的膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，或者先分離得到天然的細(xì)菌。將發(fā)酵培養(yǎng)液通過勻漿器使其裂解，開始抽提過程。在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，勻漿器是一種微流化器(microfluidizer)。
然后采用切向流動(dòng)滲濾技術(shù)裂解的發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行不同去污劑抽提。在這個(gè)方法中，使用包含確定的截留值或孔徑大小的滲透膜的切向流動(dòng)系統(tǒng)，按特定的順序加入緩沖液滲濾裂解的細(xì)胞。選擇緩沖液的使用順序以首先溶解內(nèi)膜蛋白質(zhì)，然后溶解外膜蛋白質(zhì)。滲濾期間，小于此膜的分子量截留值的較小溶解蛋白質(zhì)隨著滲透液穿過了膜，而較大的分子和不溶的蛋白質(zhì)則被保留。
然后改變緩沖液，并加入去污劑以溶解和抽提外膜蛋白質(zhì)?？刂凭彌_液和去污劑的加入順序，以選擇性方式抽提所需的外膜蛋白質(zhì)。然后采用常規(guī)方法如離子交換層析純化抽提得到的蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明的抽提方法可選擇性溶解革蘭陰性菌的內(nèi)膜和外膜蛋白質(zhì)。溶解的蛋白質(zhì)隨著滲透液通過超濾膜，而不溶的蛋白質(zhì)則被膜所保留。
可使用本發(fā)明方法從任何合適的革蘭陰性菌中抽提天然的膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，這些細(xì)菌包括但不限于流感嗜血桿菌(如P4和P6蛋白)、卡他性莫拉菌(Moraxellacatarrhalis，例如UspA1和UspA2蛋白)和B群奈瑟腦膜炎球菌。
采用本發(fā)明方法抽提得到的重組膜內(nèi)在蛋白質(zhì)可在任何含有一重組載體的合適的細(xì)菌宿主細(xì)胞中表達(dá)，這種表達(dá)進(jìn)而又使該細(xì)胞中含有編碼所需重組膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的核苷酸序列。這些細(xì)菌宿主細(xì)胞的例子包括但不限于大腸桿菌、沙門菌、志賀菌和枯草桿菌(B.subtilis)。
不能用該膜抽提具有大的接近膜截留值的單體、多體或凝聚體大小的天然或重組蛋白質(zhì)。然而，在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)的革蘭陰性菌蛋白質(zhì)(如淋球菌蛋白或腦膜炎球菌蛋白)也可采用本方法抽提。包涵體比膜的截留值大因而被膜保留，而其它蛋白質(zhì)則被抽提。然后加入尿素或類似的變性劑溶解該包涵體。然后采用常規(guī)方法抽提、復(fù)性和純化所需的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的抽提方法是以在大腸桿菌宿主細(xì)胞中表達(dá)的流感嗜血桿菌P4和P6蛋白的重組形式為例進(jìn)行描述的。
流感嗜血桿菌的P4蛋白(也稱為e蛋白)的分子量大約為30KD，在美國(guó)專利5601831中有所描述，本文納入該文作為參考。天然形式的P4蛋白是脂化的。為了重組表達(dá)脂化的P4蛋白，從細(xì)菌獲得P4基因，并將其插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。在下面的實(shí)施例1和2中使用了表達(dá)載體pBAD18-Cm〔L.-M.Guzman等人，J.Bacteriol.，177，4121-4130(1995)〕。這個(gè)載體含有一阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和其它適當(dāng)?shù)目刂圃Ｈ缓髮⒃摫磉_(dá)載體插入合適的細(xì)菌宿主細(xì)胞中。在下面的實(shí)施例1和2中，宿主細(xì)胞是大腸桿菌BLR菌株(Novagen，Madison，WT)。如果使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，則加入了誘導(dǎo)物，引起宿主細(xì)胞表達(dá)所需的蛋白質(zhì)。在下面的實(shí)施例1和2中，誘導(dǎo)物是L-阿拉伯糖。
流感嗜血桿菌的P6蛋白(也稱為PBOMP-1和PAL)的分子量大約為15KD，在美國(guó)專利5110908中有所描述。P4蛋白的天然形式是脂化的。然而，先前試圖重組表達(dá)脂化的rP4結(jié)果是產(chǎn)生低水平的表達(dá)。待授權(quán)的共同享有的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/141067描述了一種產(chǎn)生脂化rP6的表達(dá)系統(tǒng)。為了重組表達(dá)脂化的rP6蛋白，從細(xì)菌中獲得P6基因，并將其插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。在下面的實(shí)施例3和4中再次使用表達(dá)載體pBAD18-CM。將這個(gè)表達(dá)載體插入合適的細(xì)菌宿主細(xì)胞中，在下面的實(shí)施例3和4中，該宿主細(xì)胞還是大腸桿菌BLR菌株。如果使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，則加入誘導(dǎo)物以引起宿主細(xì)胞表達(dá)所需的蛋白質(zhì)。在下面的實(shí)施例3和4中，誘導(dǎo)物是L-阿拉伯糖。
在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，滲濾膜購(gòu)自Millipore(Bedford，MA)。該膜由再生纖維素制成，截留值為1000KD，表面積為0.002m2/克濕重細(xì)胞。
任何可溶解蛋白質(zhì)的去污劑可用于此抽提方法中，包括但不限于ZwittergentTM化合物(如ZwittergentTM3-12和ZwittergentTM3-14)、非離子性TritonTM化合物(如TritonTMX-100)、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷(如辛基葡糖苷、壬基葡糖苷或十二烷基麥芽苷、膽酸、脫氧膽酸或十二烷基麥芽苷)。在較佳實(shí)施例中，對(duì)于本文所述的具體步驟，去污劑是ZwittergentTM3-12、TritonTMX-100和十二烷基肌氨酸鈉。
可使用各種化合物作為抽提過程中的緩沖液，只要該化合物不被滲濾膜保留即可。這些緩沖液包括但不限于Hepes、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉。在較佳實(shí)施例中，對(duì)于本文所述的具體步驟，緩沖液是Hepes、TrisTM和磷酸鈉。
在一些抽提步驟中使用了螯合劑，以防止蛋白質(zhì)水解和/或螯合二價(jià)陽離子。較佳的螯合劑是EDTA。二價(jià)陽離子在一些抽提步驟中使用到，以穩(wěn)定或溶解外膜蛋白質(zhì)。二價(jià)陽離子包括金屬離子如Mg2+和Ca2+，Mg2+最佳。氯化鈉是抽提脂化rP6的鹽破壞步驟中優(yōu)選的鹽。
可修改抽提過程使其包括至少一個(gè)使用具有不同截留分子量的滲濾膜的操作，這樣首先使裂解產(chǎn)物通過較大截留分子量的膜，任何再通過較小截留分子量的膜。這樣的膜滲透順序使得能在同一輪滲濾的不同階段(裂解產(chǎn)物)分別純化兩種或多種膜內(nèi)在蛋白質(zhì)。
對(duì)于采用不同去污劑切向流滲濾，分別從細(xì)菌或含有重組載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞中抽提得到天然的或重組表達(dá)的革蘭陰性菌內(nèi)膜蛋白質(zhì)的方法，它包括(a)裂解發(fā)酵培養(yǎng)液中的細(xì)菌或含有重組載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發(fā)酵培養(yǎng)液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內(nèi)和胞外性污染物，并用螯合劑防止蛋白質(zhì)水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產(chǎn)物，其中，所述去污劑溶解并取出內(nèi)膜蛋白質(zhì)，并使用二價(jià)陽離子穩(wěn)定外膜蛋白質(zhì)，防止它們?nèi)芙?；?d)收集(c)步取得的內(nèi)膜蛋白質(zhì)。
對(duì)于采用不同去污劑切向流滲濾，分別從細(xì)菌或含有重組載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞中抽提得到天然的或重組表達(dá)的革蘭陰性菌外膜蛋白質(zhì)的方法，它包括(a)裂解發(fā)酵培養(yǎng)液中的細(xì)菌或含有重組載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發(fā)酵培養(yǎng)液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內(nèi)和胞外性污染物，用螯合劑防止蛋白質(zhì)水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產(chǎn)物，其中，所述去污劑溶解并去除內(nèi)膜蛋白質(zhì)，并使用二價(jià)陽離子穩(wěn)定外膜蛋白質(zhì)，從而防止它們的溶解；(d)用(c)步的緩沖液滲濾從(c)得到的裂解產(chǎn)物，并且使用不含去污劑的(c)步的二價(jià)陽離子，以降低(c)步的去污劑濃度；(e)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(d)得到的裂解產(chǎn)物，并用螯合劑和去污劑溶解和取出外膜蛋白質(zhì)；(f)收集(e)步取得的外膜蛋白質(zhì)。
如果需要，在上述步驟之后，可進(jìn)一步進(jìn)行以下抽提步驟(g)使用(e)步中除去去污劑以外的其余試劑滲濾從(e)得到的裂解產(chǎn)物，以減少去污劑的濃度；(h)用(e)步試劑滲濾從(g)得到的裂解產(chǎn)物；和(i)收集(h)步取得的外膜蛋白質(zhì)。
對(duì)于采用不同去污劑切向流滲濾，從細(xì)菌宿主細(xì)胞中抽提出流感嗜血桿菌脂化重組外膜蛋白質(zhì)P4(脂化rP4)的方法，它包括(a)裂解發(fā)酵培養(yǎng)液中的細(xì)菌宿主細(xì)胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發(fā)酵培養(yǎng)液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內(nèi)和胞外性污染物，并用螯合劑防止蛋白質(zhì)水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產(chǎn)物，其中，所述去污劑溶解并去除內(nèi)膜蛋白質(zhì)，并使用二價(jià)陽離子穩(wěn)定外膜蛋白質(zhì)，從而防止它們的溶解；(d)用(c)步的緩沖液滲濾從(c)得到的裂解產(chǎn)物，并且用不含去污劑的(c)步得到的二價(jià)陽離子，以降低(c)帶來的去污劑濃度；(e)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(d)得到的裂解產(chǎn)物，用螯合劑和去污劑溶解外膜蛋白質(zhì)；(f)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(e)得到的裂解產(chǎn)物，使用螯合劑和去污劑抽提和取出脂化rP4；和(g)收集(f)步取得的脂化rP4。
如果需要，在上述步驟之后，可進(jìn)一步進(jìn)行以下抽提步驟(h)使用(f)步除去污劑外的其余試劑滲濾從(f)得到的裂解產(chǎn)物，以減少去污劑的濃度；(i)用(f)步試劑滲濾從(h)得到的裂解產(chǎn)物以抽提和取出脂化rP4；和(j)收集(i)步取得的脂化rP4。
如果還需要，在上述步驟之后，還可進(jìn)一步進(jìn)行以下抽提步驟(k)使用(f)步除去污劑外的其余試劑滲濾從(j)得到的裂解產(chǎn)物，以減少去污劑的濃度；(l)用(f)步的試劑滲濾從(k)得到的裂解產(chǎn)物以抽提和取出脂化rP4；和(m)收集(l)步取得的脂化rP4。
如果還需要，還可進(jìn)一步進(jìn)行脂化rP4抽提的循環(huán)。
對(duì)于采用不同去污劑切向流滲濾，從細(xì)菌宿主細(xì)胞中抽提得到流感嗜血桿菌脂化重組外膜蛋白質(zhì)P6(脂化rP6)的方法，它包括(a)裂解發(fā)酵培養(yǎng)液中的細(xì)菌宿主細(xì)胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發(fā)酵培養(yǎng)液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內(nèi)和胞外性污染物，并使用螯合劑防止蛋白質(zhì)水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產(chǎn)物，其中，所述去污劑溶解并去除內(nèi)膜蛋白質(zhì)，并使用二價(jià)陽離子穩(wěn)定外膜蛋白質(zhì)，從而防止它們的溶解；(d)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(c)得到的裂解產(chǎn)物，使用螯合劑螯合二價(jià)陽離子并防止蛋白質(zhì)水解，使用去污劑以溶解和去除除了脂化rP6外的外膜蛋白質(zhì)；(e)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(d)得到的裂解產(chǎn)物，用螯合劑防止蛋白質(zhì)水解、用去污劑去除其他外膜蛋白質(zhì)以及用鹽破壞膜/外膜蛋白質(zhì)復(fù)合體；(f)用(e)步試劑(除了去污劑和鹽外)滲濾從(e)得到的裂解產(chǎn)物，以減少去污劑的濃度；(g)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(f)得到的裂解產(chǎn)物，其中，所述去污劑溶解和去除結(jié)合于細(xì)胞外膜的其他蛋白質(zhì)，用螯合劑防止蛋白質(zhì)水解；(h)用(g)步緩沖液和(g)步螯合劑滲濾從(g)得到的裂解產(chǎn)物，以減少?gòu)?g)帶來的去污劑的濃度；(i)用磷酸鹽化合物和去污劑滲濾從(h)得到的裂解產(chǎn)物，以溶解和去除結(jié)合于細(xì)胞外膜的其他蛋白質(zhì)；(j)用磷酸鹽化合物滲濾從(i)得到的裂解產(chǎn)物，以降低(i)帶來的去污劑濃度；
(k)加熱(j)步的裂解產(chǎn)物，以從膜中取出脂化rP6，同時(shí)用磷酸鹽化合物和去污劑滲濾該裂解產(chǎn)物以溶解、抽提和取出脂化rP6；(l)收集(k)步取得的脂化rP6。
如果需要，可修改抽提脂化rP6的方法，在進(jìn)行(k)步之前濃縮(j)步得到的裂解產(chǎn)物。
為了更好地理解本發(fā)明，給出了下列實(shí)施例。這些實(shí)施例僅僅是闡述性的，而不是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1不同去污劑膜抽提脂化rP4從細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌細(xì)胞)中抽提脂化的rP4的整個(gè)過程涉及顯微流化作用(microfluidization)或細(xì)胞裂胞和膜不同去污劑抽提。收集發(fā)酵培養(yǎng)液，加入5mMEDTA，以抑制可能的金屬蛋白酶引起的蛋白質(zhì)降解。然后將該培養(yǎng)液稀釋至低于5％(w/v)的細(xì)胞濕重濃度，用高壓微流化器(Microfluidics，Newton，MA)裂解。使用包括表面積為0.002m2/g濕重細(xì)胞的1000KD再生纖維素Millipore膜的切向流動(dòng)系統(tǒng)，按特定的順序加入緩沖液滲濾裂解的細(xì)胞。選擇緩沖液加入的順序，以首先溶解內(nèi)膜蛋白質(zhì)，接著溶解包括rP4的外膜蛋白質(zhì)。滲濾期間，小于膜的截留分子量的適當(dāng)大小的溶解蛋白質(zhì)通過了膜，而較大的分子和不溶的蛋白質(zhì)則被保留。滲濾步驟的順序如下(1)用10mM Hepes/1mM EDTA/pH8.0、體積是滯留物體積3倍的溶液滲濾裂解的發(fā)酵培養(yǎng)液，以通過滲透去除胞內(nèi)和胞外性污染物。
(2)用10mM Hepes/1mM MgCl2/1％TritonTMX-100、pH8溶液滲濾該裂解產(chǎn)物5次，溶解和取出膜內(nèi)在蛋白質(zhì)。Mg2+離子穩(wěn)定了外膜，因此，外膜蛋白質(zhì)在TritonTMX-100中是不溶的。
(3)用10mM/Hepes/1mM MgCl2/pH8溶液滲濾裂解產(chǎn)物3次，以減少TritonTMX-100的濃度。
(4)用50mM TrisTM/5mM EDTA/1％ZwittergentTM3-12/pH8溶液滲濾裂解產(chǎn)物3次，以溶解外膜蛋白質(zhì)，包括脂化的rP4，然后開始從外膜抽提和收集脂化的rP4。
(5)用50mM TrisTM/5mM EDTA/pH8溶液滲濾裂解產(chǎn)物3次。此步不使用ZwittergentTM3-12，因?yàn)閆wittergentTM化合物不像較小的化合物(如氯化鈉)那樣容易地通過截留分子量為1000KD的膜；此步起著降低膜中ZwittergentTM濃度的作用，否則步驟(4)的ZwittergentTM濃度會(huì)減少下面的步驟(6)和(8)通過膜的流速。
(6)用50mM TrisTM/5mM EDTA/1％ZwittergentTM3-12/pH8溶液滲濾裂解產(chǎn)物2次，以繼續(xù)從外膜抽提和收集脂化的rP4。
(7)用50mM TrisTM/5mM EDTA/pH8溶液滲濾裂解產(chǎn)物2次，以繼續(xù)降低ZwittergentTM濃度。
(8)用50mM TrisTM/5mM EDTA/1％ZwittergentTM3-12/pH8溶液滲濾裂解產(chǎn)物2次，以繼續(xù)從外膜抽提和收集脂化的rP4。
(9)用50mM TrisTM/5mM EDTA/pH8溶液滲濾裂解產(chǎn)物2次，以再次減少ZwittergentTM的濃度。
在滲濾步驟中，跨膜壓力維持在大約5psi，流量維持在150升/m2膜面積/小時(shí)(lmh)。滲濾過程在室溫中進(jìn)行。滲透流量的范圍為30-40lmh，這對(duì)于該抽提方法的實(shí)際應(yīng)用和大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)是足夠高的。
抽提期間，在不同點(diǎn)采集用于分析的樣品，通過SDS-PAGE評(píng)估不同滲濾步驟對(duì)蛋白質(zhì)抽提的影響。加入酒精沉淀樣品，離心，然后以SDS樣品制備緩沖液中重新溶解至原始體積的20％。這種制備樣品的方法濃縮了樣品并減少樣品的TritonTM或ZwittergentTM3-12濃度。這兩種物質(zhì)會(huì)干擾SDS與樣品的結(jié)合，并降低對(duì)凝膠條帶的分辨。將10μl各樣品加樣到Novex(Encinitas，CA)10％丙烯酰胺凝膠上，然后在125V電壓下電泳60-90分鐘。
圖1顯示了抽提脂化的rP4期間取自滲透液的樣品的典型SDS-PAGE分析。脂化的rP4在這些凝膠上以大約30KD的分子量運(yùn)行。該凝膠顯示了滲濾期間一些污染蛋白質(zhì)被裂解緩沖液(泳道5)和含有TritonTMX-100的緩沖液(泳道6)去除。在這些滲濾步驟中損失的脂化rP4很少。在使用ZwittergentTM3-12的滲濾步驟中，脂化的rP4以部分純化的狀態(tài)被抽提(泳道8)。在最后的ZwittergentTM3-12滲濾步驟中，滲透液中存在非常少的脂化的rP4(泳道9)。這表明大多數(shù)溶解的脂化rP4已通過滲透被回收。其它試驗(yàn)顯示，抽提完成后在滯留物中不溶的脂化rP4非常少(數(shù)據(jù)未給出)。通過Western分析發(fā)現(xiàn)ZwittergentTM3-12抽提的30KD條帶是脂化的rP4(數(shù)據(jù)未給出)。
實(shí)施例2脂化rP4的另一種抽提法本實(shí)施例給了由脂化rP4的其他四種抽提方法得到的數(shù)據(jù)。在各個(gè)操作中，首先將5mM EDTA加到重組大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液中，以抑制可能的金屬蛋白酶引起的蛋白質(zhì)降解。然后將該發(fā)酵培養(yǎng)液的濕細(xì)胞濃度調(diào)整到10％，通過Microfluidics微流化器裂解。然后將此細(xì)胞裂解液分成含有500g細(xì)胞的等量份，-70℃冷凍。
將500克等份的裂解大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液移出-70℃，放到溫度不超過40℃的水浴中解凍。然后將該細(xì)胞裂解液稀釋到5％的細(xì)胞濕重。然后如實(shí)施例1所述采用切向流動(dòng)滲濾法將此5％細(xì)胞裂解液進(jìn)行不同去污劑抽提。僅在步驟(4)中有輕微的差別，在該步驟中，滲濾了2次而不是3次。
將抽提期間不同點(diǎn)采得的樣品作SDS-PAGE分析，得到了與圖1所示可比較的結(jié)果(數(shù)據(jù)未給出)。計(jì)算出4輪中各輪回收的脂化rP4的量。在抽提之前和之后通過SDS-PAGE凝膠電泳然后使用光密度計(jì)掃描測(cè)定細(xì)胞裂解液中的脂化rP4的百分比。這個(gè)數(shù)據(jù)表明，抽提前后細(xì)胞裂解液中脂化rP4蛋白質(zhì)平均減少了78％(以克計(jì))。這個(gè)數(shù)據(jù)還表明，抽提合并物中脂化rP4蛋白質(zhì)的總回收與細(xì)胞裂解液的比是18％。
其結(jié)果列在表1中表1

圖2闡述了此滲濾方法的再現(xiàn)性。監(jiān)測(cè)了抽提過程中4次運(yùn)行的滲透液流量。整個(gè)過程中流動(dòng)速率相似，證明該抽提方法是可控制的和可再現(xiàn)的。
為了純化抽提得到的脂化rP4，將含有脂化rP4的細(xì)胞裂解液通過由DEAESepharoseTMFast Flow柱和SP SepharoseTMFast Flow柱(Pharmacia&Upjohn，Piscataway，NJ)組成的串聯(lián)離子交換柱。用另外的平衡緩沖液洗滌層析柱，然后從流程(process stream)中移去DEAE柱。然后用20柱體積的平衡緩沖液洗滌SP柱，隨后用NaCl梯度洗脫，得到純化的脂化rP4 30K蛋白質(zhì)。用濃度為20mM的NaCl洗脫脂化rP4蛋白質(zhì)的純化凝集形式(形式I)。用濃度為140mM的NaCl洗脫脂化rP4蛋白質(zhì)的凝集和非凝集形式的混合物(形式II)。
然后將形式II的脂化rP4 30K蛋白質(zhì)進(jìn)行受控制的緩慢冷卻處理，使其轉(zhuǎn)變?yōu)楦鄣男问絀狀態(tài)?？煞謩e純化兩種純化形式，然后保存，或者可分別純化然后合并。轉(zhuǎn)變方法如下(1)獲得脂化rP4形式II的無菌過濾等份；(2)慢慢冷凍至-6℃。
實(shí)施例3不同去污劑膜抽提脂化rP6抽提脂化rP6的方法與抽提脂化rP4的方法類似。但是，滲濾過程需要更多步驟，因?yàn)橹痳P6與肽聚糖緊密結(jié)合在一起。用10mM EDTA處理表達(dá)脂化rP6的大腸桿菌細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)液，然后在進(jìn)行均質(zhì)化之前先將其稀釋成細(xì)胞濕重/體積為10％以下。然后用高壓微流化器裂解細(xì)胞，在室溫下使用跨線流通膜過濾裝置按順序用緩沖液進(jìn)行滲濾。測(cè)定了允許有效質(zhì)量的溶解蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)通過膜的最小膜面積大約是0.002m2/g細(xì)胞濕重。尺寸小于此膜1000KD截留分子量的溶解蛋白質(zhì)與滲透液一起通過了膜，而較大的分子和不溶解蛋白質(zhì)則被保留。滲濾的步驟如下(1)以體積為滯留物3倍的10mM Hepes/1mM EDTA/pH8.0(裂解緩沖液)滲濾裂解的發(fā)酵培養(yǎng)液，以通過滲透去除胞內(nèi)和胞外性污染物。
(2)用10mM Hepes/1mM MgCl2/0.2％TritonTMX-100溶液滲濾裂解產(chǎn)物2次，以溶解和取出內(nèi)膜蛋白質(zhì)。Mg2+離子穩(wěn)定了外膜，因此，外膜蛋白質(zhì)不溶解在TritonTMX-100中。
(3)用50mM TrisTM/5 mM EDTA/0.2％ZwittergentTM3-14溶液滲濾裂解產(chǎn)物3次，以溶解和去除其它的外膜蛋白質(zhì)(但不包括rP6)。EDTA螯合步驟(2)中的Mg2+離子，并防止蛋白質(zhì)水解。
(4)用50mM TrisTM/5mM EDTA/0.5M NaCl/0.2％ZwittergentTM3-14滲濾裂解產(chǎn)物3次，以溶解和去除其他蛋白質(zhì)。此步驟的緩沖液中加入NaCl，以破壞膜蛋白質(zhì)和膜之間的離子性相互作用。進(jìn)行這一步是因?yàn)橹痳P6是肽聚糖結(jié)合脂蛋白，鹽起著去除膜/外膜蛋白復(fù)合體中的膜結(jié)合蛋白質(zhì)(不包括脂化的rP6)的作用(脂化的rP4不這樣結(jié)合，因而在抽提rP4時(shí)不進(jìn)行這一步驟)。繼續(xù)以滯留物3倍體積的50mM TrisTM/5mM EDTA滲濾，以降低滯留物中ZwittergentTM的濃度。
(5)用50mM TrisTM/5mM EDTA/0.2％十二烷基肌氨酸鈉滲濾裂解產(chǎn)物3次，去除其他膜結(jié)合蛋白質(zhì)(但不包括脂化的rP6)，然后用50mM TrisTM/5mM EDTA滲濾3次，減少滯留物中十二烷基肌氨酸鈉的濃度。
(6)用10mM磷酸鈉/0.2％ZwittergentTM3-12滲濾裂解產(chǎn)物3次，去除其他膜結(jié)合蛋白質(zhì)(但不包括脂化的rP6)，然后用10mM磷酸鈉滲濾3次，減少滯留物中ZwittergentTM3-12的濃度。
(7)將裂解產(chǎn)物濃縮到其原體積的20％，然后55℃用10mM磷酸鈉/0.2％ZwittergentTM3-12滲濾3次，溶解脂化的rP6，通過滲透收集該蛋白質(zhì)。滲濾之前進(jìn)行濃縮，以增加滲透液中脂化rP6的濃度。55℃繼續(xù)用體積為其余滯留物3倍的10mM磷酸鈉滲濾，減少滯留物中ZwittergentTM3-12的濃度。進(jìn)行這個(gè)加熱步驟是因?yàn)椤踩缟鲜霾襟E(4)〕脂化的rP6是一種肽聚糖結(jié)合脂蛋白，加熱可從膜/膜蛋白復(fù)合體中取出脂化的rP6(脂化的rP4不這樣結(jié)合，因而在抽提rP4時(shí)不進(jìn)行這一步驟)。最后，55℃用滯留物3倍體積的10mM磷酸鈉結(jié)束滲濾。
滲濾期間，跨膜壓力維持在大約10psi，流量維持在大約120-180lmh。所有的滲濾過程在室溫中進(jìn)行，除了最后的55℃抽提步驟外，因?yàn)樵摬襟E在較高溫度進(jìn)行可溶解脂化的rP6。滲透液流量范圍為30-50lmh，這對(duì)于該抽提方法的實(shí)際應(yīng)用和大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)是足夠高的。
抽提期間，采取自不同的點(diǎn)的樣品作SDS-PAGE分析，以評(píng)估不同滲濾步驟對(duì)蛋白質(zhì)抽提的效果。如實(shí)施例1所述制備樣品和進(jìn)行凝膠電泳。
圖3和4顯示了脂化rP6抽提期間取自滲透液樣品的典型SDS-PAGE分析。脂化的rP6以大約15KD在這些凝膠上運(yùn)行。該凝膠顯示了滲濾期間一些污染蛋白質(zhì)被裂解緩沖液(圖3，泳道2)和含有不同去污劑的緩沖液(圖3，泳道5和6；圖4，泳道3)所去除。在這些滲濾步驟中脂化的rP6的損失很少。在最后55℃ZwittergentTM3-12滲濾期間，脂化的rP6以部分純化的狀態(tài)被抽提得到(圖4，泳道6)。在第二次55℃ ZwittergentTM3-12滲濾步驟結(jié)束時(shí)，滲透液中的脂化rP6非常少(圖4，泳道8)。這表明大多數(shù)溶解的脂化rP6已通過滲透被回收。其它實(shí)驗(yàn)也顯示滲濾過程完成后滯留物中殘留的不溶解的脂化rP6非常少(數(shù)據(jù)未給出)。Westem分析顯示，ZwittergentTM3-12/55℃抽提物的15KD條帶是脂化的rP6(數(shù)據(jù)未給出)。
重復(fù)上述方法，以從另一大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液中抽提脂化的rP6。SDS-PAGE分析得到與圖3和4類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未給出)，且Western分析也顯示ZwittergentTM3-12/55℃抽提物的15KD條帶是脂化的rP6(數(shù)據(jù)未給出)。
實(shí)施例4脂化rP6的另外抽提法這個(gè)實(shí)施例所給的數(shù)據(jù)得自脂化的rP6的3次另外抽提步驟。在各步驟中，使用實(shí)施例3中所述的方法從重組大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液中抽提得到脂化的rP6。
其結(jié)果列在表2中表2

權(quán)利要求
1.一種通過不同去污劑切向流滲濾，從細(xì)菌或含有重組載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞中抽提得到天然或重組表達(dá)的革蘭陰性菌內(nèi)膜蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，該方法包括(a)裂解發(fā)酵培養(yǎng)液中的細(xì)菌或含有重組載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發(fā)酵培養(yǎng)液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內(nèi)和胞外性污染物，并用螯合劑防止蛋白質(zhì)水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產(chǎn)物，其中，所述去污劑溶解并取出內(nèi)膜蛋白質(zhì)，并使用二價(jià)陽離子穩(wěn)定外膜蛋白質(zhì)，防止它們?nèi)芙?；?d)收集(c)步取得的內(nèi)膜蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，(a)步的裂解發(fā)生在微流化器中；在(b)步中，緩沖液選自Hepes、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉；在(c)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷，二價(jià)陽離子選自Mg2+和Ca2+。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在(b)步中，緩沖液是Hepes，螯合劑是EDTA；在(c)步中，緩沖液是Hepes，去污劑是TritonTMX-100，二價(jià)陽離子是Mg2+。
4.一種通過不同去污劑切向流滲濾，從細(xì)菌或含有重組載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞中抽提得到天然或重組表達(dá)的革蘭陰性菌外膜蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，該方法包括(a)裂解發(fā)酵培養(yǎng)液中的細(xì)菌或含有重組載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發(fā)酵培養(yǎng)液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內(nèi)和胞外性污染物，并用螯合劑防止蛋白質(zhì)水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產(chǎn)物，其中，所述去污劑溶解并去除內(nèi)膜蛋白質(zhì)，并使用二價(jià)陽離子穩(wěn)定外膜蛋白質(zhì)，防止它們?nèi)芙猓?d)用(c)步的緩沖液滲濾從(c)得到的裂解產(chǎn)物，并且使用(c)步不含去污劑的二價(jià)陽離子，以降低(c)步的去污劑濃度；(e)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(d)得到的裂解產(chǎn)物，并用螯合劑和去污劑溶解和取出外膜蛋白質(zhì)；(f)收集(e)步取得的外膜蛋白質(zhì)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，(a)的裂解發(fā)生在微流化器中；在(b)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉；在(c)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷，二價(jià)陽離子選自Mg2+和Ca2+；在(d)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，二價(jià)陽離子選自Mg2+和Ca2+；在(e)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在(b)步中，緩沖液是Hepes，螯合劑是EDTA；在(c)步中，緩沖液是Hepes，去污劑是TritonTMX-100，二價(jià)陽離子是Mg2+；在(d)步中，緩沖液是Hepes，二價(jià)陽離子是Mg2+；在(e)步中，緩沖液是TrisTM，螯合劑是EDTA，去污劑是ZwittergentTM3-12。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法還包括(g)使用(e)步除去污劑外的其余試劑滲濾從(e)得到的裂解產(chǎn)物，以減少去污劑的濃度；(h)用(e)步試劑滲濾從(g)得到的裂解產(chǎn)物；和(i)收集(h)步取得的外膜蛋白質(zhì)。
8.一種通過不同去污劑切向流滲濾，從細(xì)菌宿主細(xì)胞中抽提得到流感嗜血桿菌脂化重組外膜蛋白質(zhì)P4(rP4)的方法，其特征在于，該方法包括(a)裂解發(fā)酵培養(yǎng)液中的細(xì)菌宿主細(xì)胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發(fā)酵培養(yǎng)液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內(nèi)和胞外性污染物，并使用螯合劑防止蛋白質(zhì)水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產(chǎn)物，其中，所述去污劑溶解并去除內(nèi)膜蛋白質(zhì)，并使用二價(jià)陽離子穩(wěn)定外膜蛋白質(zhì)，防止它們?nèi)芙猓?d)用(c)步的緩沖液滲濾從(c)得到的裂解產(chǎn)物，并且使用不含去污劑的(c)步二價(jià)陽離子，降低(c)步的去污劑濃度；(e)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(d)得到的裂解產(chǎn)物，用螯合劑和去污劑溶解外膜蛋白質(zhì)；(f)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(e)得到的裂解產(chǎn)物，用螯合劑和去污劑抽提和取出脂化rP4；和(g)收集(f)步取得的脂化rP4。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，(a)的裂解發(fā)生在微流化器中；在(b)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉；在(c)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷，二價(jià)陽離子選自Mg2+和Ca2+；在(d)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，二價(jià)陽離子選自Mg2+和Ca2+；在(e)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷；在(f)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，在(b)步中，緩沖液是Hepes，螯合劑是EDTA；在(c)步中，緩沖液是Hepes，去污劑是TritonTMX-100，二價(jià)陽離子是Mg2+；在(d)步中，緩沖液是Hepes，二價(jià)陽離子是Mg2+；在(e)步中，緩沖液是TrisTM，螯合劑是EDTA，去污劑是ZwittergentTM3-12；在(f)步中，緩沖液是TrisTM，螯合劑是EDTA，去污劑是ZwittergentTM3-12。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，該方法還包括(h)使用不含去污劑的(f)步試劑滲濾從(f)得到的裂解產(chǎn)物，以減少去污劑的濃度；(i)用(f)步試劑滲濾從得到(h)的裂解產(chǎn)物，抽提和取出脂化rP4；和(j)收集(i)步取得的脂化rP4。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法還包括(k)使用不含去污劑的(f)步試劑滲濾從(j)得到的裂解產(chǎn)物，以減少去污劑的濃度；(l)用(f)步試劑滲濾從(k)得到的裂解產(chǎn)物，抽提和取出脂化rP4；和(m)收集(l)步取得的脂化rP4。
13.一種通過不同去污劑切向流滲濾，從細(xì)菌宿主細(xì)胞中抽提得到流感嗜血桿菌脂化重組外膜蛋白質(zhì)P6(rP6)的方法，其特征在于，該方法包括(a)裂解發(fā)酵培養(yǎng)液中的細(xì)菌宿主細(xì)胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發(fā)酵培養(yǎng)液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內(nèi)和胞外性污染物，并用螯合劑防止蛋白質(zhì)水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產(chǎn)物，其中，所述去污劑溶解并去除內(nèi)膜蛋白質(zhì)，并使用二價(jià)陽離子穩(wěn)定外膜蛋白質(zhì)，防止它們?nèi)芙猓?d)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(c)得到的裂解產(chǎn)物，使用螯合劑螯合二價(jià)陽離子防止蛋白質(zhì)水解，使用去污劑溶解和去除除脂化rP6外的外膜蛋白質(zhì)；(e)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(d)得到的裂解產(chǎn)物，用螯合劑防止蛋白質(zhì)水解、去污劑去除其他外膜蛋白質(zhì)以及用鹽破壞膜/外膜蛋白質(zhì)復(fù)合物；(f)用不含去污劑和鹽的(e)步試劑滲濾從(e)得到的裂解產(chǎn)物，以減少去污劑的濃度；(g)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(f)得到的裂解產(chǎn)物，其中，所述去污劑溶解和去除結(jié)合于細(xì)胞外膜的其他蛋白質(zhì)，使用螯合劑防止蛋白質(zhì)水解；(h)用(g)步緩沖液和(g)步螯合劑滲濾從(g)得到的裂解產(chǎn)物，以降低(g)步的去污劑濃度；(i)用磷酸鹽化合物和去污劑滲濾從(h)得到的裂解產(chǎn)物，溶解和去除結(jié)合于細(xì)胞外膜的其他蛋白質(zhì)；(j)用磷酸鹽化合物滲濾從(i)得到的裂解產(chǎn)物，以降低(i)步的去污劑濃度；(k)加熱(j)步的裂解產(chǎn)物，以從膜中取出脂化rP6，同時(shí)用磷酸鹽化合物和去污劑滲濾該裂解產(chǎn)物以溶解、抽提和取出脂化rP6；(l)收集(k)步取出的脂化rP6。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，(a)的裂解發(fā)生在微流化器中；在(b)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，二價(jià)陽離子選自Mg2+和Ca2+；在(c)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷，二價(jià)陽離子選自Mg2+和Ca2+；在(d)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷；在(e)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，鹽是鈉鹽，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷；在(f)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉；在(g)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷；在(h)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉；在(i)中，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷；在(k)步中，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，在(b)步中，緩沖液是Hepes，螯合劑是EDTA；在(c)步中，緩沖液是Hepes，去污劑是TritonTMX-100，二價(jià)陽離子是Mg2+；在(d)步中，緩沖液是Hepes，螯合劑是EDTA，去污劑是ZwittergentTM3-14；在(e)步中，緩沖液是Hepes，螯合劑是EDTA，鹽是鈉鹽，去污劑是ZwittergentTM3-14；在(f)中，緩沖液是TrisTM，螯合劑是EDTA；在(g)步中，緩沖液是TrisTM，去污劑是十二烷基肌氨酸鈉，螯合劑是EDTA；在(h)步中，緩沖液是TrisTM，螯合劑是EDTA；在(i)步中，去污劑是ZwittergentTM3-12，磷酸鹽是磷酸鈉；在(j)中，磷酸鹽是磷酸鈉；在(k)步中，去污劑是ZwittergentTM3-12。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，在進(jìn)行步驟(k)之前先濃縮(j)步的裂解產(chǎn)物。
全文摘要
描述了采用不同去污劑切向流滲濾,從細(xì)菌或含有重組載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞中抽提得到革蘭陰性菌膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的方法。該方法與其它方法相比有一些優(yōu)點(diǎn)。首先,本發(fā)明將澄清和抽提過程合并在一項(xiàng)操作中。從細(xì)胞中抽提產(chǎn)物,接著僅采用一連續(xù)滲濾過程將其與細(xì)胞碎片分開。其次,膜蛋白質(zhì)以半純化狀態(tài)被抽提,這簡(jiǎn)化了下游的加工步驟。第三,本發(fā)明基于規(guī)?；?因?yàn)樗蟮膬H僅是膜的表面積隨著細(xì)胞的數(shù)量成比例地增加。
文檔編號(hào)C07K1/34GK1358196SQ00809425
公開日2002年7月10日 申請(qǐng)日期2000年6月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月25日
發(fā)明者S·拉科蒂亞, M·R·比爾 申請(qǐng)人:美國(guó)氰胺公司