從細(xì)胞中有效提取蛋白質(zhì)的方法發(fā)明背景在許多診斷方法中，從受試者中獲取細(xì)胞并將其存放在含有固定劑的液體培養(yǎng)基中。將細(xì)胞固定在培養(yǎng)基中，并通過(guò)細(xì)胞學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行檢查，從而提供診斷。例如，檢測(cè)子宮頸組織中的癌前或癌細(xì)胞通常通過(guò)顯微鏡評(píng)估剝離的子宮頸細(xì)胞進(jìn)行。這種由GeorgeN.Papanicolaou開(kāi)發(fā)并稱為“Pap”檢驗(yàn)的方法包括利用取樣裝置從女性子宮頸剝離細(xì)胞，將剝離的細(xì)胞存放在含有固定劑的運(yùn)送培養(yǎng)基中，然后將該細(xì)胞放置在載玻片上。然后，染色細(xì)胞，并由受過(guò)訓(xùn)練的醫(yī)學(xué)專業(yè)人員通過(guò)光學(xué)顯微鏡法檢查細(xì)胞的異常性。僅在美國(guó)，每年進(jìn)行超過(guò)五千五百萬(wàn)次的Pap檢驗(yàn)。盡管該細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)很成功，但是該檢驗(yàn)容易出錯(cuò)。例如，估計(jì)多至40％的常規(guī)Pap檢驗(yàn)受到存在污染物諸如粘液、血細(xì)胞和不明顯的炎性細(xì)胞的危害。這些污染物引起假陰性結(jié)果、假陽(yáng)性結(jié)果、和非常大量的后繼工作量。參見(jiàn)，例如，Koss，L.G.(1989)，用于子宮頸癌檢測(cè)的巴帕尼科拉烏試驗(yàn)：成功和災(zāi)難(ThePapanicolaouTestforCervicalCancerDetection：ATriumphandaTragedy)，JAMA261：737-743；還參見(jiàn)DeMay，“Pap涂片解釋中的問(wèn)題”(″ProblemsinPapSmearInterpretation″)，病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)紀(jì)錄(Arch.Pathol.Lab.Med.)121：229-23(1997)。鑒于上述內(nèi)容，存在著對(duì)用于分析在含有固定劑的液體培養(yǎng)基中存在的細(xì)胞的補(bǔ)充分子診斷方法的需要。然而，該方法不是直接的，因?yàn)椴豢偸强赡茉诠潭ǖ募?xì)胞上進(jìn)行該方法。例如，某些固定劑(例如，THINPREPTM或SUREPATHTM檢驗(yàn)系統(tǒng)中使用的那些運(yùn)送培養(yǎng)基)可以導(dǎo)致特定的細(xì)胞蛋白沉淀或聚集，由此使得那些蛋白質(zhì)不能溶解并難于或不可能通過(guò)常規(guī)方法，例如利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)或其他免疫學(xué)檢驗(yàn)，而得到可靠的檢測(cè)。因此，存在著對(duì)從固定的細(xì)胞和未固定的細(xì)胞中，以這樣的方式提取蛋白質(zhì)的方法和組合物的巨大需要，所述方式容許提取的蛋白質(zhì)適合于在分子檢測(cè)測(cè)定，例如免疫學(xué)檢測(cè)測(cè)定中使用。本文描述的發(fā)明滿足了這一需要以及其他需要。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于從細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物的方法。概括地，該方法包括：使細(xì)胞樣品與包含聚氧乙烯烷基醚(例如，BrijTM35)的高pH(至少約pH10)提取試劑接觸，從而產(chǎn)生中間組合物，然后，在存在中和試劑的條件下，中和所述中間組合物的pH，例如，至pH值約為6-9，任選地至pH值為7-8.5，從而產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)提取物。在某些實(shí)施方案中，提取試劑和中和試劑中之一或二者包含聚氧乙烯烷基醚。細(xì)胞可以是固定的或未固定的剝離的子宮頸細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，該方法包括從細(xì)胞樣品中提取靶病毒蛋白，如HPVE6蛋白。本發(fā)明還提供用于檢測(cè)蛋白如靶病毒蛋白的存在的方法，其包括按照上述方法從固定的或未固定的細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)提取物，并且檢測(cè)所述蛋白在所述蛋白質(zhì)提取物中的存在。另外，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)提取物的系統(tǒng)，其包括：a)包含固定的或未固定的細(xì)胞的細(xì)胞樣品；b)pH至少約為10.0的提取試劑，和c)中和試劑，其中所述提取試劑和所述中和試劑之一或二者含有聚氧乙烯烷基醚，并且其中所述提取試劑和中和試劑可以用在上述方法中以產(chǎn)生適用于結(jié)合測(cè)定的蛋白質(zhì)提取物。此外，本發(fā)明提供用于從固定的或未固定的細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)提取物的試劑盒。所述試劑盒還可以包括用于檢測(cè)所述蛋白質(zhì)提取物中的靶蛋白的成分和/或試劑。附圖簡(jiǎn)述圖1A顯示使用與某些添加劑組合的具有高pH的提取試劑對(duì)檢測(cè)提取的HPV16E6蛋白的增效作用。按照本文所述的流程，將預(yù)先純化的重組HPV16E6蛋白(MBP-E6)懸浮在提取試劑中，然后用中和試劑中和。E6蛋白用本文所述的側(cè)向流動(dòng)(LF)測(cè)定法捕獲并用UMM讀取儀檢測(cè)。圖1B支持在中和階段引入添加劑對(duì)檢測(cè)提取的HPV16E6蛋白的影響不如在提取階段過(guò)程中引入的影響強(qiáng)。圖2顯示在提取試劑中使用多種添加劑檢測(cè)由表達(dá)HPV16的SiHa細(xì)胞提取的HPV16E6蛋白。圖3顯示滴定細(xì)胞濃度對(duì)提取的HPV16E6蛋白的檢測(cè)的影響。使用兩種HPV-陽(yáng)性和一種HPV-陰性細(xì)胞系。圖4顯示從摻有表達(dá)HPV16的SiHa細(xì)胞的未固定的陰性臨床樣品提取HPV16E6蛋白。圖5顯示當(dāng)提取試劑中BrijTM35濃度增加時(shí)和當(dāng)BrijTM35與其他非離子洗滌劑如TritonTMX-100或TweenTM-20組合時(shí)對(duì)提取的HPV16E6蛋白的檢測(cè)的影響。圖6顯示當(dāng)使用不同的提取和/或中和時(shí)間時(shí)對(duì)提取的HPV16E6蛋白的檢測(cè)的影響。圖7顯示使用4％BrijTM35/高pH緩沖液2提取源自HPV毒株18和45的E6蛋白。圖8顯示對(duì)來(lái)源于HPV毒株16和18的E6蛋白的檢測(cè)的劑量-反應(yīng)影響。圖9顯示對(duì)提取試劑中BrijTM35濃度(有或無(wú)其他非離子添加劑)的進(jìn)一步優(yōu)化。圖10顯示對(duì)提取試劑中BrijTM35濃度(有或無(wú)其他非離子添加劑)的進(jìn)一步優(yōu)化，和對(duì)由摻有表達(dá)HPV的細(xì)胞的未固定的臨床陰性樣品提取HPV16E6蛋白的影響。圖11顯示檢測(cè)由表達(dá)HPV的SiHa細(xì)胞提取的HPV16E6蛋白的細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列(CBA)形式。圖12顯示在由固定的或未固定的細(xì)胞提取HPV16E6蛋白中使用4％BrijTM35/高pH緩沖液2。圖13顯示樣品通過(guò)5.0mmMilliporePVDF注射器濾器過(guò)濾不顯著減小樣品的信號(hào)。定義除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中普通技術(shù)人員的通常理解相同的含義。盡管如此，為了清楚和容易參考起見(jiàn)，在下文中定義了某些要素。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞樣品(cellularsample)”或“細(xì)胞樣品(cellsample)”涉及含有一種或多種目的細(xì)胞的液體組合物。細(xì)胞樣品可以是含有從個(gè)體取出(例如，切除或剝離)的細(xì)胞的臨床樣品，所述細(xì)胞包括但不僅限于，例如，來(lái)自血漿、血清、脊髓液、精液、淋巴液、皮膚表面部分(externalsections)、呼吸道、腸道、和生殖泌尿道、淚液、唾液、乳汁、血細(xì)胞、腫瘤、或器官的細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞樣品可以包含體外生長(zhǎng)的細(xì)胞(包括但不僅限于在細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞、病毒感染的細(xì)胞、重組細(xì)胞等)。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞樣品可以包含最容易被HPV感染的細(xì)胞。在這些實(shí)施方案中，可以從子宮頸、外陰、陰道、肛門(mén)、陰莖、口腔或喉嚨中獲得細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞來(lái)自粘膜，并可以是上皮來(lái)源的。除剝離或切除的細(xì)胞外，細(xì)胞樣品可以或可以不包含污染物。例如，粘液細(xì)胞、或細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或血細(xì)胞可以存在于細(xì)胞樣品中。“HPV”是人乳頭瘤病毒屬(Papillomavirus)，其包括但不限于HPV毒株4、6、11、20、24、28、36、48、50、16、18、31、35、30、39、45、51、52、56、59、58、33、66、68、69、26、53、73、和82。“致癌HPV毒株”是已知為如由國(guó)家癌癥研究所(NCI，2001)確定的引起子宮頸癌的HPV毒株。“致癌E6蛋白”是由致癌HPV毒株編碼的E6蛋白。示范性的致癌毒株是：HPV26、HPV53、HPV66、HPV73、HPV82、HPV16、HPV18、HPV31、HPV35、HPV30、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV59、HPV58、HPV33、HPV66、HPV68、HPV69、和HPV82。致癌E6蛋白的氨基酸序列存放在NCBI基因庫(kù)(NCBI′sGenBank)數(shù)據(jù)庫(kù)中。雖然不希望受到理論的限制，但是通常認(rèn)為HPV毒株4、11、20、24、28、36、48、和50不是致癌的。術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用。術(shù)語(yǔ)“多肽”包括這樣的多肽和肽，在所述多肽中用非-天然存在的或合成的主鏈替換常規(guī)主鏈，且在所述肽中用一個(gè)或多個(gè)非-天然存在的或合成的氨基酸替換一個(gè)或多個(gè)常規(guī)氨基酸。術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”或其語(yǔ)法等價(jià)物指包括許多多肽成分的蛋白質(zhì)，所述多肽成分在不以它們的天然狀態(tài)附著時(shí)，由它們各自的氨基和羧基末端通過(guò)肽鍵連接，從而形成單一連續(xù)多肽。融合蛋白可以是2種、3種或甚至4種以上不同蛋白質(zhì)的組合。術(shù)語(yǔ)多肽包括融合蛋白，其包括但不僅限于具有異源氨基酸序列的融合蛋白，融合體，具有異源和同源前導(dǎo)序列，具有或不具有N-末端的甲硫氨酸殘基；免疫學(xué)標(biāo)記的蛋白質(zhì)；具有能檢測(cè)的融合配偶體的融合蛋白，例如包括熒光蛋白、β-半乳糖苷酶、熒光素酶等作為融合配偶體的融合蛋白。通常，多肽可以是任意長(zhǎng)度，例如多于2個(gè)氨基酸，多于4個(gè)氨基酸，多于約10個(gè)氨基酸，多于約20個(gè)氨基酸，多于約50個(gè)氨基酸，多于約100個(gè)氨基酸，多于約300個(gè)氨基酸，通常至多約500或1000個(gè)以上氨基酸?！半摹蓖ǔ槎嘤?個(gè)氨基酸，多于4個(gè)氨基酸，多于約10個(gè)氨基酸，多于約20個(gè)氨基酸，通常至多約50個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，肽長(zhǎng)度為5-30個(gè)氨基酸。多肽可以是天然的，因?yàn)樗鼈兛梢杂缮矬w或病毒的基因組編碼，或是非-天然的，因?yàn)樗鼈兪欠翘烊淮嬖诘?。術(shù)語(yǔ)“捕獲劑”指通過(guò)這樣的相互作用結(jié)合蛋白質(zhì)的試劑，所述相互作用足以允許該試劑結(jié)合并且濃縮來(lái)自不同蛋白的均勻混合物中的蛋白質(zhì)。因此，術(shù)語(yǔ)“捕獲劑”指這樣的分子或多分子復(fù)合物，其能夠以低于約10-6M的解離常數(shù)(KD)，特異性結(jié)合分析物，例如，特異性結(jié)合關(guān)于所述捕獲劑的分析物，而不結(jié)合其他靶標(biāo)。該結(jié)合相互作用可以由捕獲劑的親合區(qū)域介導(dǎo)。代表性的捕獲劑包括抗體(包括其片段和模擬體)和含有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)等。術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”指捕獲劑優(yōu)先結(jié)合不同蛋白質(zhì)的均勻混合物中存在的特定蛋白質(zhì)的能力。在某些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合相互作用應(yīng)該區(qū)樣品中的特定蛋白質(zhì)和其他蛋白質(zhì)，在一些實(shí)施方案中，超過(guò)約10-100倍以上(例如，超過(guò)約1000-或10,000-倍)。術(shù)語(yǔ)“捕獲劑/蛋白質(zhì)復(fù)合物”是由捕獲劑與蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合產(chǎn)生的復(fù)合物，即“結(jié)合配偶體對(duì)”。捕獲劑和關(guān)于該捕獲劑的蛋白質(zhì)在“適合于特異性結(jié)合的條件”下，彼此特異性結(jié)合，其中所述條件是容許在處于溶液中的捕獲劑和待結(jié)合的蛋白質(zhì)之間發(fā)生結(jié)合的那些條件(在鹽濃度、pH、洗滌劑、蛋白質(zhì)濃度、溫度等方面)。該條件，特別是關(guān)于抗體和它們的抗原，是本領(lǐng)域中眾所周知的(見(jiàn)，例如，Harlow和Lane，抗體：冷泉港實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Antibodies：ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratory)，冷泉港(ColdSpringHarbor)，紐約(1989))。在某些實(shí)施方案中，在捕獲劑/蛋白質(zhì)復(fù)合物中特異性結(jié)合的捕獲劑和蛋白質(zhì)之間的親和性由KD(解離常數(shù))表征，所述KD低于10-6M，低于10-7M，低于10-8M，低于10-9M，或低于約10-10M?！敖Y(jié)合配偶體”和等價(jià)物指能夠存在于捕獲劑/分析物復(fù)合物中的，即表現(xiàn)出彼此間特異性結(jié)合的分子對(duì)。術(shù)語(yǔ)“抗體”和“免疫球蛋白”在本文中可互換使用，指至少具有抗體的表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域的捕獲劑。這些術(shù)語(yǔ)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，且指含有一種或多種與抗原特異性結(jié)合的多肽。一種抗體形式構(gòu)成抗體的基本結(jié)構(gòu)單位。該形式是四聚物，且由兩對(duì)相同的抗體鏈對(duì)組成，每對(duì)具有一條輕鏈和一條重鏈。在每對(duì)中，輕鏈和重鏈可變區(qū)共同負(fù)責(zé)與抗原的結(jié)合，且恒定區(qū)負(fù)責(zé)抗體效應(yīng)子功能。識(shí)別的免疫球蛋白多肽包括κ和λ輕鏈和α、γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)、δ、ε和μ重鏈或其他物種中的等價(jià)物。全長(zhǎng)免疫球蛋白“輕鏈”(約25kDa或約214個(gè)氨基酸)包括位于NH2-末端的約110個(gè)氨基酸的可變區(qū)和位于COOH-末端的κ和λ恒定區(qū)。全長(zhǎng)免疫球蛋白“重鏈”(約50kDa或約446個(gè)氨基酸)，類似地包括可變區(qū)(約116個(gè)氨基酸)和上述重鏈恒定區(qū)之一，例如γ(約330個(gè)氨基酸)。術(shù)語(yǔ)“抗體”和“免疫球蛋白”包括任何同種型的抗體和免疫球蛋白，保持與抗原特異性結(jié)合的抗體片段，其包括但不僅限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體、以及包括抗體的抗原-結(jié)合部分和非-抗體蛋白的融合蛋白?？梢岳缋梅派湫酝凰?，產(chǎn)生可檢測(cè)產(chǎn)物的酶、熒光蛋白等，可檢測(cè)地標(biāo)記所述抗體?？贵w可以進(jìn)一步與其他結(jié)構(gòu)部分，諸如特異性結(jié)合對(duì)成員，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特異性結(jié)合對(duì)的成員)等綴合。抗體還可以與固相支持體結(jié)合，所述固相支持體包括但不僅限于聚苯乙烯平板或珠，金膠粒等。該術(shù)語(yǔ)還包括Fab′、Fv、F(ab′)2和或其他保持與抗原特異性結(jié)合的抗體片段。抗體還可以與可擴(kuò)增的檢測(cè)顆粒聯(lián)合使用。抗體可以以多種其他形式存在，所述其它形式包括例如，F(xiàn)v、Fab、和(Fab′)2、以及雙-功能(即，雙-特異性)雜種抗體(Lanzavecchia等，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)17，105(1987))，和以單鏈存在(例如，Huston等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，85，5879-5883(1988)和Bird等，科學(xué)(Science)，242，423-426(1988)，將其引入本文作為參考)。(通常參見(jiàn)，Hood等，“免疫學(xué)”(″Immunology″)，Benjamin，N.Y.，第2版.(1984)，和Hunkapiller和Hood，自然(Nature)，323，15-16(1986))。單克隆抗體和“噬菌體展示”抗體在本領(lǐng)域中眾所周知，且包含在術(shù)語(yǔ)“抗體”中。術(shù)語(yǔ)“評(píng)估”包括任何形式的測(cè)量，并包括確定元素是否存在。術(shù)語(yǔ)“確定”、“測(cè)量”、“評(píng)價(jià)”、“評(píng)估”和“測(cè)定”可互換使用，并且可以包括定量和/或定性的確定。評(píng)估可以是相對(duì)的或絕對(duì)的。“評(píng)估……的存在”包括確定某物存在的量，和/或確定其是存在還是不存在?！斑h(yuǎn)程位置”意指除了獲得細(xì)胞并將其存放在含有固定劑的液體中的位置以外的位置。例如，遠(yuǎn)程位置可能是在獲得細(xì)胞的同一建筑物中的不同房間(例如，另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室)，在與獲得細(xì)胞的同一建筑群中的不同建筑物，或同一城市、州或國(guó)家中不同的位置，等等。例如，當(dāng)顯示細(xì)胞樣品是從遠(yuǎn)程位置“接收”的時(shí)，該細(xì)胞樣品可以從遠(yuǎn)程位置獲得，或從遠(yuǎn)程位置交送、郵寄或信使遞送?！皞鬟_(dá)”信息指使所述信息從一個(gè)位置到達(dá)另一個(gè)位置的任何方法，無(wú)論是通過(guò)實(shí)體傳送包含該信息的打印材料或計(jì)算機(jī)可讀媒體(例如，通過(guò)郵寄)，還是通過(guò)傳輸信息。如果傳輸信息，則通過(guò)合適的通訊通道(例如，私人的、公共的或無(wú)線網(wǎng)絡(luò))傳輸代表該信息的數(shù)字或模擬信號(hào)(例如，電磁信號(hào)，諸如光或電信號(hào))?？梢允褂萌魏伪憷姆椒▊鬏敂?shù)據(jù)，例如傳真、調(diào)制解調(diào)器、因特網(wǎng)、電子郵件、等等。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“運(yùn)送培養(yǎng)基”用于描述適合于收集細(xì)胞和以某種方式保存那些細(xì)胞的液體，所述方式是容許它們適合于基于-液體的細(xì)胞學(xué)研究。Pap檢驗(yàn)中普遍使用運(yùn)送培養(yǎng)基。存放在運(yùn)送培養(yǎng)基中的細(xì)胞可以或可以不在該培養(yǎng)基中，被從一個(gè)位置運(yùn)輸?shù)搅硪粋€(gè)位置。運(yùn)送培養(yǎng)基含有固定劑。將細(xì)胞存放在運(yùn)送培養(yǎng)基中固定該細(xì)胞，從而產(chǎn)生固定的細(xì)胞。典型的運(yùn)送培養(yǎng)基包括SUREPATHTM或PRESERVCYTTM運(yùn)送培養(yǎng)基。“固定的細(xì)胞”是用化學(xué)固定劑處理并通過(guò)化學(xué)固定劑進(jìn)行細(xì)胞學(xué)保存的細(xì)胞。固定的細(xì)胞通常適合于染色和隨后通過(guò)光學(xué)顯微鏡法進(jìn)行的形態(tài)學(xué)和/或細(xì)胞學(xué)分析。作為參考的引入以如同每篇單獨(dú)出版物或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)貏e和分別指出進(jìn)行參考引用的相同的程度，通過(guò)參考將本說(shuō)明書(shū)提及的所有出版物和專利申請(qǐng)引入本文。發(fā)明詳述盡管在本文中顯示和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是所述實(shí)施方案僅以舉例的方式提供，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯然的。現(xiàn)在，在不偏離本發(fā)明的條件下，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該想到許多變體、改變、和替換。應(yīng)該理解本文中所述發(fā)明的實(shí)施方案的不同備選方案可以用于實(shí)施本發(fā)明。下列權(quán)利要求意欲定義本發(fā)明的范圍，且這些權(quán)利要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)以及它們的等價(jià)物包括在其中。本發(fā)明提供了用于從固定的或未固定的細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物的方法。概括地，該方法包括：使細(xì)胞樣品與包含聚氧乙烯烷基醚(例如，BrijTM35)的高pH(至少約pH10.0)的提取試劑接觸，從而產(chǎn)生中間組合物，并且然后，在中和試劑的存在下，中和中間組合物的pH，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物。所述提取試劑和中和試劑之一或二者含有聚氧乙烯烷基醚。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可以是固定的或未固定的剝離的子宮頸細(xì)胞。本發(fā)明還提供了用于實(shí)施本主題方法的試劑盒和組合物。本主題方法用于多種不同的應(yīng)用，包括在由此產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提取物中檢測(cè)特殊蛋白質(zhì)的診斷檢驗(yàn)中。進(jìn)一步描述本發(fā)明前，應(yīng)該理解本發(fā)明不受限于以下所述的本發(fā)明的特殊實(shí)施方案，因?yàn)榭梢援a(chǎn)生所述特殊實(shí)施方案的變體，并且其仍然屬于所附權(quán)利要求的范圍。還應(yīng)該理解，所使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特殊實(shí)施方案的目的，且不意欲進(jìn)行限制。替代地，本發(fā)明的范圍應(yīng)該由所附權(quán)利要求確定。在該說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求中，單數(shù)形式“一”(″a″)、“一”(″an″)和“這”(″the″)包括復(fù)數(shù)涵義，除非上下文另外明確指示。在提供數(shù)值范圍時(shí)，除非上下文另外明確指示，應(yīng)該理解為本發(fā)明包括在該范圍上限和下限之間的每個(gè)介于其間的數(shù)值，直到下限單位的1/10，和該指定范圍內(nèi)的任何其他指定的或介于其間的數(shù)值。這些較小范圍的上限和下限可以獨(dú)立地包括在該較小的范圍內(nèi)，并也包括在本發(fā)明內(nèi)，服從于該指定范圍內(nèi)的任何明確排除的界限。當(dāng)該指定范圍包括所述界限之一或二者時(shí)，排除那些包括的界限之一或二者的范圍也包括在本發(fā)明中。除非另外定義，本文中使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員普遍理解的相同的含義。盡管類似于或等價(jià)于本文所述內(nèi)容的任何方法、裝置和材料能夠用在本發(fā)明的實(shí)踐或檢驗(yàn)中，現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置和材料。出于描述和公開(kāi)在出版物中所描述的、可以與本文所述的發(fā)明聯(lián)合使用的要素的目的，將本文提及的全部出版物引入本文作為參考。如上總結(jié)，本主題發(fā)明提供用于從固定的或未固定的細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物的方法和組合物。在對(duì)本發(fā)明更詳細(xì)的描述中，首先描述了該方法，隨后描述在實(shí)踐本主題方法中使用的試劑盒和系統(tǒng)。蛋白質(zhì)提取方法如上所示，本發(fā)明提供用于從固定的或未固定的細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物的方法。通常，該方法包括兩個(gè)步驟：a)使所述固定的或未固定的細(xì)胞與具有高于約pH10.0的pH的提取試劑相接觸，從而產(chǎn)生中間組合物，和b)使所述中間組合物與中和試劑相接觸。所述提取試劑和/或中和試劑含有聚氧乙烯烷基醚。由此產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提取物含有聚氧乙烯烷基醚，并具有中性pH(即，約pH7.0-約pH8.0)。該方法通常產(chǎn)生含有這樣的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)提取物，所述蛋白質(zhì)可以容易地通過(guò)利用有關(guān)那些蛋白質(zhì)的捕獲劑檢測(cè)。同樣地，由本方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提取物通常適合用于為了檢測(cè)那些蛋白質(zhì)的結(jié)合測(cè)定，例如免疫學(xué)測(cè)定。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括：a)使細(xì)胞與包含聚氧乙烯烷基醚和高pH的提取試劑相接觸，從而產(chǎn)生具有至少約pH10.0的pH的中間組合物；和b)使所述中間組合物與中和試劑相接觸，從而中和所述中間組合物的所述pH并產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物。由于，如上所述，聚氧乙烯烷基醚可以存在于提取試劑或中和試劑的任一種中(或提取試劑和中和試劑二者中)，所以本方法的某些實(shí)施方案包括a)和b)使所述中間組合物與包含聚氧乙烯烷基醚的中和試劑相接觸，從而中和所述中間組合物的所述pH并產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物。在某些實(shí)施方案中，與利用其他方法，例如不使用：高pH提取步驟(即，增高pH至高于約pH10.0或pH11.0的步驟)、中和步驟(即，調(diào)節(jié)pH至約pH6.0-約pH9.0的步驟)和聚氧乙烯烷基醚的方法生成的蛋白質(zhì)提取物相比，由本方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提取物可以含有更多易受捕獲劑影響的蛋白質(zhì)。單獨(dú)的高pH和單獨(dú)的聚氧乙烯烷基醚都不產(chǎn)生這樣的蛋白質(zhì)提取物。在特殊的實(shí)施方案中，高pH提取試劑溶解固定的或未固定的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，而聚氧乙烯烷基醚防止中間組合物中溶解的蛋白質(zhì)在中和所述中間組合物的pH時(shí)再-聚集或沉淀。以下更詳細(xì)地描述了本方法中使用的試劑和由本方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提取物，也更詳細(xì)描述了可以如何使用所述試劑產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物。如下文中所討論地，本方法中使用的試劑的最適濃度和pH可以根據(jù)使用哪種試劑而變化。然而，試劑的最適濃度和pH容易通過(guò)試驗(yàn)或憑經(jīng)驗(yàn)確定。通過(guò)利用本發(fā)明的方法從中提取蛋白質(zhì)的細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明的方法學(xué)能夠用于從細(xì)胞樣品中提取靶蛋白或目的蛋白。細(xì)胞樣品可以是同源細(xì)胞群、或不同類型細(xì)胞的異源混合物。細(xì)胞樣品還可以含有“污染物”，諸如粘液、血液細(xì)胞和炎性細(xì)胞，所述污染物對(duì)于靶蛋白提取目的不重要或不含有靶蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述靶蛋白是在受到病毒、優(yōu)選地病理學(xué)病毒感染的細(xì)胞中存在的病毒蛋白，并且所述細(xì)胞優(yōu)選地是從哺乳動(dòng)物如人中分離的細(xì)胞。致病病毒可以是在人或其他動(dòng)物中引起致病作用或疾病的任何致病病毒。所述致病病毒可以是人免疫缺陷病毒(HIV)的各種毒株，諸如HIV-1和HIV-2。病毒蛋白可以是HIV糖蛋白(或表面抗原)諸如HIVGP120和GP41，或衣殼蛋白(或結(jié)構(gòu)蛋白)諸如HIVP24蛋白。致病病毒可以是依波拉或馬爾堡病毒。病毒蛋白可以是依波拉糖蛋白或表面抗原，諸如依波拉GP1或GP2蛋白。致病病毒可以是肝炎病毒，諸如甲型、乙型、丙型、丁型或戊型肝炎病毒。例如，病毒蛋白可以是乙型肝炎病毒的表面抗原或核心蛋白，諸如小乙型肝炎表面抗原(SHBsAg)(也稱為澳大利亞抗原(Australiaantigen))，中乙型肝炎表面抗原(MHBsAg)和大乙型肝炎表面抗原(LHBsAg)。病毒抗原可以是丙型肝炎病毒的表面抗原或核心蛋白，諸如NS3、NS4和NS5抗原。致病病毒可以是呼吸道合胞病毒(RSV)。例如，RSV病毒蛋白可以是RSV的糖蛋白(G-蛋白)或融合蛋白(F-蛋白)。致病病毒可以是單純皰疹病毒(HSV)，諸如HSV-1和HSV-2。例如，HSV病毒抗原可以是來(lái)自HSV-2的糖蛋白D。靶蛋白可以是腫瘤抗原，諸如乳腺癌細(xì)胞的Her2和淋巴瘤細(xì)胞上的CD20，病毒致癌基因諸如人乳頭瘤病毒的E6和E7，或是細(xì)胞致癌基因諸如突變的ras。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞樣品含有其中存在靶蛋白的固定的細(xì)胞。本方法中使用的固定的細(xì)胞通常通過(guò)將細(xì)胞樣品(例如，通過(guò)切除、剝離或灌洗從受試者摘除細(xì)胞而獲得)存放在液體培養(yǎng)基中獲得。可以將細(xì)胞樣品存放在已經(jīng)包含化學(xué)固定劑的液體培養(yǎng)基中，或可以在將細(xì)胞置于所述培養(yǎng)基后，向所述液體培養(yǎng)基中添加化學(xué)固定劑。含有固定劑和固定的細(xì)胞的液體培養(yǎng)基以及未固定的細(xì)胞包含在本文中術(shù)語(yǔ)″細(xì)胞樣品″的含義內(nèi)。本方法中可以使用的代表性化學(xué)固定劑包括：醇(例如，甲醇或乙醇)，醛(例如，戊二醛(gluteraldehyde)或甲醛)和酮(例如，丙酮)，以及四氧化鋨，乙酸，苦味酸(picricacid)和重金屬離子鹽。本方法可以使用的固定劑的其他實(shí)例包括基于亞硫酸氫鹽(bi-sulfite)的固定劑(其可以還包括乙酸)，基于PVP的固定劑(其可以還含有丙二醇和甲醇)以及美國(guó)專利號(hào)3,546,334、4,578,282、4,857,300、5,104,640、5,256,571、5,432,056和5,196,182中記述的那些。本方法可能使用的固定劑的實(shí)例，包括那些固定劑的工作濃度，可以在Baker，(生物學(xué)顯微技術(shù)原理：固定和染色的研究(PrinciplesofBiologicalMicrotechnique：AStudyofFixationandDyeing)，1959)和Williams(“用于免疫細(xì)胞化學(xué)的組織制備”(″Tissuepreparationforimmunocytochemistry″)，臨床病理學(xué)雜志(JClinPathol)199750：422)中找到。本方法中特別感興趣的是被稱為″運(yùn)送培養(yǎng)基″并作為婦科檢查一部分常規(guī)用于收集、保存(即，固定)和運(yùn)送子宮頸陰道細(xì)胞(例如，剝離的子宮頸細(xì)胞)的液體培養(yǎng)基。FDA批準(zhǔn)的運(yùn)送培養(yǎng)基是特別感興趣的?？梢允褂玫目缮藤?gòu)運(yùn)送培養(yǎng)基的實(shí)例包括：例如，基于甲醇的PRESERVCYTTM運(yùn)送培養(yǎng)基(其作為Mass.莫爾伯勒(Marlborough)Cytyc公司(Cytyc，Inc.)的THINPREPTM婦科取樣試劑盒的一部分出售)，基于乙醇的、正式稱為CYTORICHTM的SUREPATHTM運(yùn)送培養(yǎng)基(TriPath公司(TriPath，Inc.)Burlington，N.C.)，和基于甲醇的CYTOLYTTM運(yùn)送培養(yǎng)基(Cytyc，公司，莫爾伯勒(Marlborough)，Mass.).可以通過(guò)任何常規(guī)方法，包括但不僅限于剝離(例如，刮)、切除和灌洗，而獲得細(xì)胞。特別感興趣的是子宮頸來(lái)源的上皮細(xì)胞，該細(xì)胞典型地是通過(guò)利用適合的刷子、藥簽、抹刀或刮刀的剝離方法獲得的，并將其存放在含有或不含有固定劑的液體培養(yǎng)基中。提取試劑本方法中使用的提取試劑含有以這樣的量存在的成分，所述量在濃度上足以在將該提取試劑加入到細(xì)胞中時(shí)，產(chǎn)生具有至少pH10.0的pH的蛋白質(zhì)提取物。因此，所述提取試劑通常具有至少約pH10.0的pH。使提取試劑與細(xì)胞相接觸，從而產(chǎn)生中間組合物。提取試劑和由此產(chǎn)生的中間組合物的pH通常是至少約pH10.0，例如，在約pH10.0-約pH13.0或約pH12.0-約pH13.0的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，提取試劑可以具有約pH10.0-約pH10.5、pH10.5-約pH11.0、pH11.0-約pH11.5、pH11.5-約pH12.0、pH12.0-約pH12.5或pH12.5-約pH13.0的pH。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，提取試劑具有約pH12.5-約pH12.9的pH。例如，提取試劑可以利用任何合適的氫氧離子來(lái)源，例如氫氧化鈉或氫氧化鉀，或碳酸鈣制成。在某些實(shí)施方案中，提取試劑可以含有緩沖劑，從而將該試劑維持在所需的pH。如果本主題提取試劑中存在緩沖劑，則該緩沖劑在25℃，可以具有約9.0-約12.5范圍內(nèi)的pKα。可以在主題蛋白質(zhì)提取試劑中使用的示范性緩沖劑包括例如，CABS、哌啶、磷酸鹽、CAPS、甘氨酸或乙醇胺。本發(fā)明所用的提取試劑包含以這樣的量存在的成分，所述量在濃度上足以在將該提取試劑加入到固定的或未固定的細(xì)胞中時(shí)，產(chǎn)生具有至少pH10.0的pH的蛋白質(zhì)提取物。因此，所述提取試劑通常具有至少約pH10.0的pH。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提取試劑包含檸檬酸三鈉和NaOH。例如，提取試劑可以包含0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.0或2.0NNaOH。示例性的提取試劑包含約0.1NNaOH，約50mM檸檬酸三鈉，且pH為12.5-12.9。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，使樣品達(dá)到目標(biāo)pH如大于pH10的pH所需要的提取試劑的量或pH應(yīng)該在添加提取試劑前憑經(jīng)驗(yàn)預(yù)先確定。在這樣的實(shí)施方案中，將憑經(jīng)驗(yàn)確定的提取試劑添加到細(xì)胞樣品中。在其他實(shí)施方案中，在加入提取試劑后，測(cè)量中間組合物的pH。在該測(cè)量步驟之后，如果需要，調(diào)節(jié)pH，以達(dá)到目標(biāo)pH。提取試劑還可以包含下列各項(xiàng)中的一種或多種、或其混合物：HEPES，TritonTMX-100，NaCl，甘油和EGTA。示例性的提取試劑可以包含約50mMHEPES，pH約pH7.5，約1.1％TritonTMX-100，約150mMNaCl，約10％甘油，和約1mMEGTA。在某些實(shí)施方案中，除了具有至少10.0的pH，提取試劑還可以包含式為CH3(CH2)n1CH2(OCH2CH2)n2OH的聚氧乙烯烷基醚。所述聚氧乙烯烷基醚，也稱為聚氧乙烯醇，在工業(yè)、化妝品和藥學(xué)應(yīng)用上通常用作乳化劑，濕潤(rùn)劑，增溶劑，脫泡劑，洗滌劑和/或潤(rùn)滑劑。(參見(jiàn)，例如，默克索引(TheMerckIndex).第13版，7659)。在某些實(shí)施方案中，聚氧乙烯烷基醚是BrijTM表面活性劑如BrijTM35或本文所述的其他BrijTM家族成員。BrijTM35CAS[9002-92-0]是一種非離子表面活性劑，其通常用在高效液相色譜法(HPLC)應(yīng)用中，用于分離膜復(fù)合物。其通常用來(lái)防止與色譜支持體的非特異性結(jié)合。其具有16.9的親水-親脂平衡數(shù)值(HLB)，這表明其為一種能夠用作增溶劑，如膜蛋白的非變性增溶，或用作乳化劑的親水化合物。(參見(jiàn)，例如，Umbreit，J.N.，和Strominger，J.L.1973.洗滌劑HLB數(shù)值與來(lái)自枯草芽胞桿菌膜的D-丙氨酸羧肽酶的增溶和穩(wěn)定作用的關(guān)系(RelationofdetergentHLBnumbertosolubilizationandstabilizationofD-alaninecarboxypeptidasefromBacillussubtillismembreanes).美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)70，2997)。BrijTM35，包含一個(gè)月桂基(CH3(CH2)10CH2)和23個(gè)乙烯氧基(OCH2CH2)單位，且具有化學(xué)式CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)23OH。其他化學(xué)同義詞包括：聚氧乙烯月桂醚(polyoxyethylenelaurylether)；LAURETH-23；聚氧乙烯(23)月桂醚C12E23；聚氧乙烯二醇十二烷醚(Polyoxyethyleneglycoldodecylether)；月桂醇環(huán)氧乙烷(LaurylAlcoholEthyleneOxide)，乙氧基化月桂醇(EthoxylatedLaurylAlcohol)，月桂醇，乙氧基化的(Laurylalcohol，ethoxylated)，；月桂基聚乙二醇醚(laurylpolyethyleneglycolether)；α-十二烷基-ω-羥基-聚氧乙烯(alpha-Dodecyl-omega-hydroxy-polyoxyethylene)；聚乙二醇，單十二烷醚(PolyethyleneGlycols，monododecylether)；十二烷醇乙氧基化物(Dodecanolethoxylate)；十二烷醇，聚氧乙基化的(Dodecanol，polyethoxylated)；十二烷基聚(氧乙烯)醚(Dodecylpoly(oxyethylene)ether)；Lauromacrogol；月桂基聚(氧乙烯)醚(Laurylpoly(oxyethylene)ether)；氧乙烯基化的十二烷醇(Oxyethylenateddodecylalcohol)；聚(環(huán)氧乙烷)十二烷醚(Poly(ethyleneoxide)dodecylether)；α-十二烷基-ω-羥基-聚(氧-1，2-乙二基)(alpha-dodecyl-omega-hydroxy-Poly(oxy-1，2-ethanediyl))；聚(氧乙烯)單月桂醚(Poly(oxyethylene)monolaurylether)；聚乙氧基化的十二烷醇(Polyethoxylateddodecanol)；聚乙二醇十二烷醚(Polyethyleneglycoldodecylether)；聚乙二醇月桂醚(Polyethyleneglycollaurylether)；聚氧乙烯十二烷醇(Polyoxyethylenedodecanol)；聚氧乙烯月桂酸醇(Polyoxyethylenelauricalcohol)；和聚氧乙烯月桂醇(Polyoxyethylenelaurylalcohol.)；3，6，9，12，15，18，21，24，27-Nonaoxanonatriacontan-1-ol；十二烷醇，乙氧基化的(Dodecylalcohol，ethoxylated)；；Laureth4[USAN]；Laureth9[USAN]；Laureth-11；Lauromacrogol400[INN]；PEG-11月桂醚(PEG-11Laurylether)；Polidocanol，40L(聚醚)；ActinolL7；ActinolL3；AdekaCarpolM2；AdekaCarpolMBF100；AdekatolLA1275；乙氧硬化醇(Aethoxysklerol)；AkyporoxRLM160；AkyporoxRLM22；AkyporoxRLM230；AkyporoxRLM40；AldosperseL9；AlkasurfLAN1；AlkasurfLAN3；Arapol0712；AtlasG2133；AtlasG3705；AtlasG3707；AtlasG4829；AtlasG-2133；AtlasG-3705；B205；堿(BASE)LP12；BL9；BL9(聚乙二醇)；堿(BASE)LP12；BrijTM22；BrijTM23；BrijTM30；BrijTM30ICI；BrijTM30SP；BrijTM35；BrijTM35L；BrijTM36T；CCRIS3397；Calgene40L；CarsonolL2；CarsonolL3；ChemalLA23；ChimipalAE3；Cimagel；Conion275-100；Conion275-20；Conion275-30；Conion275-80；Conion2P80；十二烷醇聚氧乙烯醚(Dodecylalcoholpolyoxyethyleneether)；DuPontWK；EthosperseLA12；EthosperseLA23；；G3707；乙二醇，聚乙烯，單十二烷醚(Glycols，polyethylene，monododecylether)；HSDB4351；羥基聚乙氧基十二烷(Hydroxypolyethoxydodecane)；LA(醇)；LA7；Laureth；Laureth9；Lipal4LA；Lubrol12A9；LubrolPX；Marlipal1217；MergitalLM11；NCI-C54875；Newcol1203；NikkolBL；NoigenET160；NoigenET170；NoigenYX500；NonioliteAL20；PegnolL12；；聚(氧-1，2-乙二基)，α-十二烷基-ω-羥基-(Poly(oxy-1，2-ethanediyl)，alpha-dodecyl-omega-hydroxy-)；聚乙二醇單十二烷醚(Polyethyleneglycolmonododecylether)；聚乙二醇單十二烷醚，名稱之后接著數(shù)字(400)，其近似對(duì)應(yīng)于聚乙二醇部分的平均分子量；聚乙二醇單月桂醚(Polyethyleneglycolmonolaurylether)；聚氧乙烯月桂醚(Polyoxyethylenelaurylether)；RokanolL；RomopalLN；SimulsolP23；SimulsolP4；SiponicL；SlovasolS；StandamulLA2；Stmer135；表面活性劑WK；TexoforB9；Thesat；Thesit；α-十二烷基-ω-羥基聚(氧-1，2-乙二基)(alpha-Dodecyl-omega-hydroxypoly(oxy-1，2-ethanediyl))；或α-十二烷基-ω-羥基聚(氧乙烯)(alpha-Dodecyl-omega-hydroxypoly(oxyethylene))。其他BrijTM聚氧乙烯烷基醚包括：BrijTM30聚氧乙烯(4)月桂醚CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)nOH，n～4)；BrijTM52，聚氧乙烯(2)十六烷醚C16H33(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM56聚氧乙烯(10)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM58，聚氧乙烯(20)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM72聚氧乙烯(2)十八烷醚，(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM76，聚氧乙烯(10)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM78聚氧乙烯(20)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM92，聚氧乙烯(2)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM93，聚氧乙烯(2)油基醚；(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM97，聚氧乙烯(10)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM98，聚氧乙烯(20)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM700，聚氧乙烯(100)十八烷醚，C18H37(OCH2CH2)21OH，n～100；和BrijTM721，聚氧乙烯(21)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～21)。聚氧乙烯烷基醚，如果存在的話，可以以不顯著降低將來(lái)測(cè)定的靈敏性的濃度存在。聚氧乙烯烷基醚的濃度，在某些實(shí)施方案中，可以在樣品處理過(guò)程中減小，例如，通過(guò)用中和緩沖液稀釋該聚氧乙烯烷基醚或通過(guò)在使用前向蛋白質(zhì)提取物加入稀釋劑，如緩沖液或水。取決于所用的聚氧乙烯烷基醚的強(qiáng)度和提取緩沖液的pH，聚氧乙烯烷基醚可以在提取緩沖液中以約0.05％-約0.1％，約0.1％-0.5％，約0.5％-約1％，約1％-約5％，約5％-約10％，或約10％-約20％的濃度(v/v)存在。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚氧乙烯烷基醚，例如BrijTM35，在提取試劑中以約2％-約10％的濃度(v/v)存在。在其他實(shí)施方案中，所述聚氧乙烯烷基醚存在于中和試劑中。在其他實(shí)施方案中，所述聚氧乙烯烷基醚存在于提取試劑和中和試劑二者中。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，提取試劑和/或中和試劑除聚氧乙烯烷基醚外還包括其他非離子型洗滌劑。所述非離子型洗滌劑可以存在于提取試劑或中和試劑中，或者存在于提取試劑和中和試劑二者中。在某些實(shí)施方案中，使用的非離子型洗滌劑可以是諾乃洗滌劑(Nonidet)P-40、n-辛基葡萄糖苷(n-octylglucoside)、TRITONTM洗滌劑諸如TRITONTMX-100、辛基β-硫葡糖吡喃糖苷(octylβ-thioglucopyranoside)、TWEENTM洗滌劑諸如Tween-20、或NP-40。根據(jù)所用洗滌劑的強(qiáng)度，洗滌劑可以以約0.01M-約0.05M、約0.05M-約0.1M、01M-約0.2M、約0.2M-約0.5M、約0.5M-約1.0M、約1.0M-約2.0M、約2.0M-約4.0M、或約4.0M-約8.0M的濃度存在于提取緩沖液或中和緩沖液中。洗滌劑可以以約0.1％-20％，優(yōu)選0.5％-10％，1％-6％或2％-5％的濃度存在于提取緩沖液中。美國(guó)專利6,488,671的第7和8欄中列出了可以在本方法中使用的其他洗滌劑，該專利的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。示例性的洗滌劑及其在所述中和試劑和/或提取試劑中的濃度包括：TritonX-100：約0.1％至約10％，例如，約1％，NP40：約0.1％至約10％，例如，約1％和Tween-20：約0.1％至約10％，例如，約1％，重量/體積。在優(yōu)選實(shí)施方案中，提取試劑和/或中和試劑包括與其他非離子型洗滌劑組合的聚氧乙烯烷基醚。所述聚氧乙烯烷基醚可以是BrijTM表面活性劑且可以與TweenTM洗滌劑或TritionTM洗滌劑中的一種或兩種組合。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述BrijTM表面活性劑為與下述非離子型洗滌劑中的一種或多種組合的BrijTM35：TweenTM-20，約0.1％-約10％，例如，約2％；或TritionTMX-100，約0.1％-約10％，例如，約2％。在某些實(shí)施方案中，提取試劑可以不含有顯著量的變性劑。然而，在其他實(shí)施方案中，除了具有至少10.0的pH和聚氧乙烯烷基醚如BrijTM35外，提取試劑還可以含有變性劑，例如，離子型洗滌劑，諸如十二烷基硫酸鈉(SDS)或十二烷基肌氨酸鈉，或離液劑如尿素。在這些實(shí)施方案中，變性劑，如果存在的話，可以以這樣的濃度存在，所述濃度不顯著降低將來(lái)測(cè)定的靈敏性。變性劑的濃度，在某些實(shí)施方案中，可以在樣品處理過(guò)程中降低，例如，通過(guò)用中和緩沖液稀釋該變性劑或在使用前對(duì)蛋白質(zhì)提取物添加稀釋劑，例如緩沖液或水。變性劑也可以在不存在聚氧乙烯烷基醚的情況下單獨(dú)存在。根據(jù)所使用的變性劑的強(qiáng)度和提取緩沖液的pH，變性劑可以以約0.01M-約0.05M、約0.05M-約0.1M、0.1M-約0.2M、約0.2M-約0.5M、約0.5M-約1.0M、約1.0M-約2.0M、約2.0M-約4.0M、或約4.0M-約8.0M的濃度存在于提取緩沖液中。變性劑，如果存在于提取試劑中的話，可以以這樣的濃度存在，所述濃度充分低于使蛋白質(zhì)變性典型使用的變性劑濃度。換言之，提取試劑可以含有處于這樣濃度的變性劑，所述濃度容許在按照本主題方法產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物后，利用關(guān)于該蛋白質(zhì)的捕獲劑檢測(cè)蛋白質(zhì)。所使用的變性劑濃度通常足以產(chǎn)生含有這樣的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)提取物，所述蛋白質(zhì)是在使用捕獲劑的結(jié)合測(cè)定，例如在抗體檢測(cè)測(cè)定中可容易檢測(cè)的。示范性變性劑及其在本提取試劑中的濃度：十二烷基硫酸鈉(SDS)：約0.01％-約2％，例如，0.05％，十二烷基肌氨酸鈉(Sarkosyl)：約0.01％-約5％，例如，0.5％，胍：約0.1M-約6M，例如，約0.5M，和尿素：約0.1M-約8M，例如，約0.5M，重量/體積。典型地使用濃度為0.1％-0.5％的SDS變性蛋白質(zhì)，典型地使用濃度為2％w/v的十二烷基肌氨酸鈉變性蛋白質(zhì)，典型地使用濃度為2M-8M的尿素變性蛋白質(zhì)，典型地使用濃度為3M-8M的鹽酸胍變性蛋白質(zhì)，典型地使用濃度為5％w/v的N-十六烷基三甲基銨氯化物(N-cetyltrimethylammoniumchloride)變性蛋白質(zhì)，且典型地使用濃度為2％，w/v的N-辛基葡萄糖苷變性蛋白質(zhì)(見(jiàn)蛋白質(zhì)純化手冊(cè)(ProteinpurificationHandbook)，安瑪西亞法瑪西亞生物技術(shù)(AmershamPharmaciaBiotech)，第71頁(yè)(1999))。除上述成分外，本主題蛋白質(zhì)提取試劑可以含有其他成分，例如鹽離子螯合劑、蛋白酶抑制劑、等。蛋白質(zhì)提取試劑可以是液體或固體組合物，并且在某些實(shí)施方案中，可以含有不同變性劑的組合。本提取緩沖液中可以使用的變性劑通常是強(qiáng)變性劑，且包括但不僅限于：離液劑(例如，尿素、鹽酸胍、或硫氰酸鹽諸如硫氰酸鈉或硫氰酸胍、碘化鈉、高氯酸鈉等；參見(jiàn)K.Hamaguchi等，國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(ProcNatl.Acad.Sci.)62：1129-1136，1962)和離子型洗滌劑(例如，十二烷基硫酸鈉(SDS)，十二烷基肌氨酸鈉或N-十六烷基三甲基銨氯化物)，其包括陽(yáng)離子、陰離子和兩性離子洗滌劑(諸如CHAPS或CHAPSO)。本方法中可以使用的其他變性劑列在美國(guó)專利6,488,671的第7和8欄中，將其全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。在某些實(shí)施方案中，在提取緩沖液中不使用弱變性劑，諸如LiCl、LiClO4、LiBr、CaCl2或NaCl作為變性劑，盡管在提取緩沖液或蛋白質(zhì)提取物中除了前段列出的變性劑外，可以存在這樣的化合物。如上所示，使提取試劑與固定的或未固定的細(xì)胞相接觸(例如，與之組合或混合)。在某些實(shí)施方案中，可以將含有細(xì)胞的細(xì)胞樣品(例如，含有固定的細(xì)胞的運(yùn)送培養(yǎng)基)直接加入到提取試劑中。在其他實(shí)施方案中，可以在向蛋白質(zhì)提取試劑添加細(xì)胞之前，從細(xì)胞樣品中分離(例如，通過(guò)沉降、離心、過(guò)濾或親合方法)細(xì)胞。在將細(xì)胞加入到提取試劑中前，可以洗滌細(xì)胞，或使細(xì)胞與其他試劑相接觸。全部或一部分可用的固定的或未固定的細(xì)胞可以與提取試劑相組合。例如，在某些實(shí)施方案中，一部分細(xì)胞可以在細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)中使用，并且一部分細(xì)胞可以與提取試劑相接觸，從而產(chǎn)生中間組合物。細(xì)胞和提取試劑可以組合并溫育或被維持在合適的溫度(例如，冰上，在約室溫下或在約37℃)并且持續(xù)合適的時(shí)間(例如，10秒-24小時(shí))，從而產(chǎn)生中間組合物。例如，細(xì)胞和提取試劑可以組合至少1，2，3，4，5，10，15，30分鐘或1，2，3，4，5，10，15小時(shí)。作為另一個(gè)實(shí)例，細(xì)胞和提取試劑可以組合5分鐘-10小時(shí)或10分鐘-1小時(shí)或10-30分鐘。在某些實(shí)施方案中，在使細(xì)胞與提取試劑相接觸后，立即使中和試劑和中間組合物相接觸。細(xì)胞和中和試劑可以組合并溫育或被維持在合適的溫度(例如，冰上，在約室溫下或在約37℃)并且持續(xù)合適的時(shí)間(例如，10秒-24小時(shí))，從而產(chǎn)生中間組合物。例如，細(xì)胞和中和試劑可以組合至少1，2，3，4，5，10，15，30分鐘或1，2，3，4，5，10，15小時(shí)。作為另一個(gè)實(shí)例，細(xì)胞和中和試劑可以組合5分鐘-10小時(shí)或10分鐘-1小時(shí)或10-30分鐘。中和試劑本方法中使用的中和試劑具有在與所述中間組合物相接觸時(shí)，足以中和上述中間組合物pH的pH。換言之，中和試劑具有這樣的pH，所述pH在該中和試劑與上文討論的中間組合物相混合時(shí)，足以中和該中間組合物的pH。如在下文中更詳細(xì)描述地，在某些實(shí)施方案中，中和試劑可以含有聚氧乙烯烷基醚或其他非離子型洗滌劑或洗滌劑混合物。中和試劑的pH足以中和通過(guò)使固定的或未固定的細(xì)胞與主題提取試劑相接觸產(chǎn)生的中間組合物。根據(jù)提取試劑的pH和是否使用緩沖劑，中和試劑的pH可以是pH4.0-pH8.0。在某些實(shí)施方案中，中和試劑可以具有約pH4.0-約pH4.5、pH4.5-約pH5.0、pH5.0-約pH5.5、pH5.5-約pH60、pH6.0-約pH6.5、pH6.5-約pH7.0或pH7.0-約pH7.5的pH。例如，中和試劑可以是利用任何合適的氫離子來(lái)源，例如鹽酸或乙酸制成的。在某些實(shí)施方案中，中和試劑可以具有低于pH4.0的pH。中和試劑可以是緩沖的或非緩沖的。例如，如果所述中和試劑是緩沖的，則所述中和試劑可以是利用具有約6-約8的pKa的任何緩沖劑，例如，tris，hepes或tricine來(lái)緩沖的。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，中和試劑包含2MTris-HCl，pH約為pH6.0。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，中和試劑包含0.9MTris-HCl，pH約為pH7.8。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在加入中和試劑之前，憑經(jīng)驗(yàn)預(yù)先確定使得樣品達(dá)到目標(biāo)pH，例如約pH6.0-9.0，或pH7.0-8.5或pH7.5-8.5或pH8.0-8.5的pH所需要的中和試劑的量或pH。在這樣的實(shí)施方案中，將憑經(jīng)驗(yàn)確定的中和試劑添加到細(xì)胞樣品中。在其他實(shí)施方案中，在加入中和試劑后，測(cè)量被中和的樣品的pH。在該測(cè)量步驟之后，如果需要，調(diào)節(jié)pH，以達(dá)到目標(biāo)中性pH。在其他實(shí)施方案中，中和試劑包含下列各項(xiàng)中的一種或多種、或其混合物：HEPES，TritonTMX-100，NaCl，甘油和EGTA。示例性的中和試劑包含約50mMHEPES，pH約為pH7.5，約1.1％TritonTMX-100，約150mMNaCl，約10％甘油，和約1mMEGTA。另一種示例性的中和緩沖液包含：約20mMTris，pH8，約2％BSA，約1％TritonTMX-100，約2％TweenTM-20，約0.2％肌氨酸，約250mMNaCl，和約50mMEDTA(或EGTA)。如上所示，提取試劑和/或中和試劑可以含有非離子型洗滌劑或表面活性劑，其包括但不限于式為CH3(CH2)n1CH2(OCH2CH2)n2OH的聚氧乙烯烷基醚。示例性的聚氧乙烯烷基醚為BrijTM表面活性劑，其包括以下一種或多種：BrijTM35，聚氧乙烯(23)月桂醚(CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)nOH，n～23)；BrijTM30聚氧乙烯(4)月桂醚(CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)nOH，n～4)；BrijTM52，聚氧乙烯(2)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM56聚氧乙烯(10)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM58，聚氧乙烯(20)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM72聚氧乙烯(2)十八烷醚，(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM76，聚氧乙烯(10)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM78聚氧乙烯(20)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM92，聚氧乙烯(2)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM93，聚氧乙烯(2)油基醚；(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM97，聚氧乙烯(10)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM98，聚氧乙烯(20)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM700，聚氧乙烯(100)十八烷醚，C18H37(OCH2CH2)21OH，n～100；或BrijTM721，聚氧乙烯(21)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～21)。取決于所用的聚氧乙烯烷基醚的強(qiáng)度和提取緩沖液的pH，聚氧乙烯烷基醚可以在提取緩沖液中以約0.05％-約0.1％，約0.1％-0.5％，約0.5％-約1％，約1％-約5％，約5％-約10％，或約10％-約20％的濃度(v/v)存在。在某些實(shí)施方案中，使用的非離子型洗滌劑可以是諾乃洗滌劑(Nonidet)P-40、n-辛基葡萄糖苷、TRITONTM洗滌劑諸如TRITONTMX-100、辛基β-硫葡糖吡喃糖苷、TWEENTM洗滌劑諸如Tween-20、或NP-40。根據(jù)所用洗滌劑的強(qiáng)度，洗滌劑可以以約0.01M-約0.05M、約0.05M-約0.1M、01M-約0.2M、約0.2M-約0.5M、約0.5M-約1.0M、約1.0M-約2.0M、約2.0M-約4.0M、或約4.0M-約8.0M的濃度存在于提取緩沖液或中和緩沖液中。美國(guó)專利6,488,671的第7和8欄中列出了可以在本方法中使用的其他洗滌劑，將該專利的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。在某些實(shí)施方案中，洗滌劑可以存在于提取和中和緩沖液二者中。示范性洗滌劑及其在該中和試劑和/或提取試劑中的濃度包括：TritonX-100：約0.1％-約10％，例如，約1％，NP40：約0.1％-約10％，例如，約1％，和Tween-20：約0.1％-約10％，例如，約1％，重量/體積。如上所示，聚氧乙烯烷基醚或其他非離子型洗滌劑可以單獨(dú)地、組合地存在于中和試劑中，或不存在于中和試劑中。聚氧乙烯烷基醚可以是BrijTM表面活性劑，且可以與TweenTM洗滌劑或TritionTM洗滌劑之一或二者組合。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，BrijTM表面活性劑為與下述非離子型洗滌劑中的一種或多種組合的BrijTM35：TweenTM-20，約0.1％-約10％，例如約2％；或TritionTMX-100，約0.1％-約10％，例如約2％。如上所示，使中和試劑與中間組合物相接觸(例如，與之組合或混合)，從而產(chǎn)生具有中性pH(即，在約pH6.5-約pH8.0范圍內(nèi)，例如，在約pH7.0-約pH7.8范圍內(nèi)的pH)的蛋白質(zhì)提取物。蛋白質(zhì)提取物還含有來(lái)自固定的或未固定的細(xì)胞的蛋白質(zhì)、處于以上列出的濃度的聚氧乙烯烷基醚，和在某些實(shí)施方案中，用于將蛋白質(zhì)提取物維持在特定pH范圍內(nèi)的緩沖劑和/或其他非離子型洗滌劑。如果將變性劑加入到固定的或未固定的細(xì)胞中，則蛋白質(zhì)提取物還可以含有該變性劑。pH、洗滌劑的選擇和所用洗滌劑的濃度(和，如果使用變性劑，則變性劑的身份(identity)和濃度)足以容許蛋白質(zhì)提取物直接用于結(jié)合測(cè)定，從而檢測(cè)在蛋白質(zhì)提取物中存在的蛋白質(zhì)。細(xì)胞提取物的中和還可以通過(guò)使該提取物流經(jīng)充滿中和試劑的過(guò)濾器或過(guò)濾嘴而實(shí)現(xiàn)。在提取物流過(guò)過(guò)濾材料時(shí)，中和試劑被溶解，且該提取物的pH接近中性。用于中和細(xì)胞提取物的備選方法是使所述提取物流過(guò)經(jīng)處于中性pH的溶液預(yù)平衡的BioSpin柱(BioRad)。還可以將提取物置于容納含有中和劑的凝膠(或過(guò)濾材料)的注射器或相似的裝置中，并通過(guò)正壓使其從所述注射器中釋放出來(lái)。在某些實(shí)施方案中，本主題蛋白質(zhì)提取物含有溶解的HPVE6蛋白(特別是來(lái)自HPV致癌毒株的E6蛋白質(zhì))，所述HPVE6蛋白在對(duì)蛋白質(zhì)提取物不進(jìn)行進(jìn)一步處理的條件下(例如，在不進(jìn)一步加入變性劑、改變pH或加熱的條件下)，容易被捕獲劑接近和容易檢測(cè)。蛋白質(zhì)提取物還可以含有溶解的或不可溶的膜、除HPVE6蛋白外的蛋白質(zhì)、和其他細(xì)胞內(nèi)容物諸如DNA、RNA、碳水化合物、等等。還可以存在其他污染物，諸如源自原始細(xì)胞樣品的mucal污染的那些。蛋白質(zhì)提取物組成通常不含有完整的(即，細(xì)胞學(xué)完整)細(xì)胞。蛋白質(zhì)提取物可以立即使用，或在使用前，例如，以冷凍形式對(duì)其進(jìn)行保存。在特殊的實(shí)施方案中，由上述方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提取物可以用在蛋白質(zhì)檢測(cè)方法中，下文中更加詳細(xì)地描述了該方法。如由上文明顯地，在上述試劑中可以使用多種不同的變性劑、洗滌劑、緩沖劑、pH和組分濃度。任何試劑中的最佳變性劑、洗滌劑、緩沖劑或pH、或組分濃度是容易利用常規(guī)方法確定的。在中和細(xì)胞提取物后，通過(guò)用含有關(guān)于E6的粘合劑的粒子溫育該提取物，可以從所述細(xì)胞提取物中濃縮E6蛋白。該粘合劑可以包括PDZ、E6關(guān)聯(lián)蛋白(E6AP)或其片段、或E6結(jié)合蛋白(E6BP)或其片段。在E6被該粒子捕獲后，洗滌該粒子，并且然后通過(guò)用pH高于10的緩沖液溫育，將E6從所述粒子中釋放出來(lái)。將粒子從洗脫溶液中分離出來(lái)，并且然后通過(guò)前述過(guò)程中和剩余的溶液。備選地，可以在不從所述捕獲粒子中釋放出來(lái)的條件下，檢測(cè)E6蛋白。美國(guó)專利6,488,671的第7和8欄中列出了可以在本方法中使用的其他洗滌劑，該專利的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。在某些實(shí)施方案中，洗滌劑可以存在于提取和中和緩沖液二者中。在其他實(shí)施方案中，樣品可以在中和步驟后稀釋。示例性的稀釋劑可以包括：約50mMHEPES，pH約為pH7.5，約1.1％TritonTMX-100，約150mMNaCl，約10％甘油，和約1mMEGTA。另一種示例性的稀釋劑可以包括：約50mMTris，pH8.2，約2％BSA，約2％TritonTMX-100，約0.1％肌氨酸，約150mMNaCl，和約50mMEDTA(或EGTA)。蛋白質(zhì)檢測(cè)方法由上述方法制成的蛋白質(zhì)提取物可以直接或間接地(即，添加其他試劑后)用于評(píng)估該蛋白質(zhì)提取物中存在一種或多種蛋白質(zhì)的方法中。蛋白質(zhì)檢測(cè)法通常涉及特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的捕獲劑。在進(jìn)行所述方法時(shí)，待檢測(cè)蛋白質(zhì)的身份可以是已知的(即，預(yù)-確定的)或未知的身份。可以利用本主題蛋白質(zhì)檢測(cè)方法檢測(cè)的蛋白質(zhì)包括這樣的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)是疾病或病癥，例如癌癥、炎性疾病、或由例如病毒、細(xì)菌或真菌引起的感染的診斷標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，利用本主題方法檢測(cè)的蛋白質(zhì)是常規(guī)不可檢測(cè)的，除非使用本主題蛋白質(zhì)提取物方法?？梢岳帽痉椒z測(cè)的示范性蛋白質(zhì)包括由傳染性介質(zhì)，諸如人乳頭瘤病毒(HPV)編碼的蛋白質(zhì)。在特殊的實(shí)施方案中，本方法可以用于檢測(cè)HPV的E6蛋白質(zhì)，其是被證明在由固定的細(xì)胞制成的蛋白質(zhì)提取物中通過(guò)其他方法很難或不可能檢測(cè)的蛋白質(zhì)。概括地，蛋白質(zhì)檢測(cè)方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，且包括結(jié)合測(cè)定，即，檢測(cè)蛋白質(zhì)和關(guān)于該蛋白質(zhì)的捕獲劑之間的結(jié)合的測(cè)定。所述測(cè)定包括免疫學(xué)測(cè)定，即，使用與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體的結(jié)合測(cè)定，包括但不僅限于，利用諸如下列技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)和非競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定系統(tǒng)：僅指出一些，蛋白質(zhì)印跡法、放射免疫測(cè)定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、″夾心″免疫測(cè)定、酶免疫測(cè)定、細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列(CBA)、多元珠測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡法、免疫組織化學(xué)測(cè)定、免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定、免疫沉淀測(cè)定、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測(cè)定、凝集測(cè)定、補(bǔ)體-結(jié)合測(cè)定、免疫放射測(cè)定、熒光免疫測(cè)定、和蛋白質(zhì)A免疫測(cè)定。所述測(cè)定是本領(lǐng)域中常規(guī)的和眾所周知的(見(jiàn)，例如，Ausubel等，編，1994，分子生物學(xué)中的通用方案(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，卷1，JohnWiley和Sons，公司，紐約，將其全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考)。以下簡(jiǎn)要描述示范性免疫測(cè)定。利用E6BP或AP肽、特異性抗體、或PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白的捕獲或釋放可以用作濃縮HPVE6的提取后測(cè)定前方法。備選地，可以使用二元單克隆抗體形式。免疫沉淀方案通常包括產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物，向蛋白質(zhì)提取物中添加捕獲劑如抗體，和在一段合適的時(shí)間和溫度下，溫育所述蛋白質(zhì)提取物和捕獲劑。捕獲劑然后與固相支持體，例如，親合基底諸如與蛋白質(zhì)A和/或蛋白質(zhì)G相連的珠子相結(jié)合，并溫育和洗滌該混合物。將固相支持體重新混懸在樣品緩沖液中，并可以通過(guò)例如，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)目的蛋白質(zhì)。ELISA可以包括制備蛋白質(zhì)提取物，連接蛋白質(zhì)提取物和固相支持體(例如，多孔微量滴定平板的孔)，使該支持體-結(jié)合的蛋白質(zhì)提取物與捕獲劑例如抗體相接觸，和檢測(cè)所述捕獲劑和所述蛋白質(zhì)之間的結(jié)合。在某些ELISA方法中，在使捕獲劑與支持體-結(jié)合的蛋白質(zhì)提取物相接觸前，可以用可檢測(cè)結(jié)構(gòu)部分如酶底物(例如，辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶)可檢測(cè)地標(biāo)記捕獲劑。然而，在其他實(shí)施方案中，可以通過(guò)可檢測(cè)的第二捕獲劑(例如，第二抗體)，檢測(cè)捕獲劑與蛋白質(zhì)提取物的結(jié)合，所述第二捕獲劑結(jié)合與所述蛋白質(zhì)提取物相接觸的捕獲劑。在其它ELISA測(cè)定中，捕獲劑可以與固相支持體相連接，且蛋白質(zhì)提取物和與固相支持體-結(jié)合的捕獲劑相接觸。利用關(guān)于該蛋白質(zhì)的第二捕獲劑，可以檢測(cè)蛋白質(zhì)提取物中的蛋白質(zhì)和固相-支持體抗體的結(jié)合。所述“夾心測(cè)定”是本領(lǐng)域中眾所周知的。在其他測(cè)定中，在捕獲劑的表面固定前，可以在溶液中發(fā)生該捕獲劑和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合。特別地，本方法可以用于檢測(cè)來(lái)自HPV致癌毒株的E6蛋白。在這些實(shí)施方案中，該檢測(cè)方法中使用的捕獲劑可以是，例如，包括與E6蛋白中包含的PDZ配體(即，關(guān)于PDZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點(diǎn))結(jié)合的PDZ結(jié)構(gòu)域的抗體或多肽。例如，本E6檢測(cè)結(jié)合方法可以使用包含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)含有MAGI-1的第二PDZ、或DLG或TIP1的PDZ結(jié)構(gòu)域，等等，如在公開(kāi)的申請(qǐng)US20040018487(2004年1月29日公開(kāi))中所述，并將其全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。示范性的包含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)和PDZ結(jié)構(gòu)域序列顯示在申請(qǐng)US20040018487的表2和實(shí)施例4中。術(shù)語(yǔ)″PDZ結(jié)構(gòu)域″還包括該序列的變體(例如，天然存在的變體)(例如，多形變體，具有保守取代的變體、等)和來(lái)自備選物種(例如，小鼠、大鼠)的結(jié)構(gòu)域。典型地，PDZ結(jié)構(gòu)域與美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)09/724,553中顯示的那些基本相同，將該申請(qǐng)引入本文作為參考，例如，當(dāng)為了最大對(duì)應(yīng)性而進(jìn)行比較和比對(duì)時(shí)，至少約70％，至少約80％，或至少約90％的氨基酸殘基相同。本領(lǐng)域中認(rèn)識(shí)到能夠突變PDZ結(jié)構(gòu)域，從而提供能夠加強(qiáng)或削弱結(jié)合的氨基酸變化和改變特異性，但它們保持PDZ結(jié)構(gòu)域(Schneider等，1998，自然生物技術(shù)(Nat.Biotech.)17：170-5)。除非另外指出，引用特殊PDZ結(jié)構(gòu)域(例如，MAGI-1結(jié)構(gòu)域2)意欲包括該特殊PDZ結(jié)構(gòu)域及其HPVE6-結(jié)合變體。換言之，如果對(duì)特殊PDZ結(jié)構(gòu)域作出引用，則也對(duì)結(jié)合HPV的致癌E6蛋白質(zhì)的PDZ結(jié)構(gòu)域的變體作出引用，如下所述。在這方面，注意到蛋白質(zhì)中PDZ結(jié)構(gòu)域的編號(hào)可以改變。例如，如本文中所引用的MAGI-1結(jié)構(gòu)域2(氨基酸序列為PSELKGKFIHTKLRKSSRGFGFTVVGGDEPDEFLQIKSLVLDGPAALDGKMETGDVIVSVNDTCVLGHTHAQWKIFQSIPIGASVDLELCRGYPLPFDPDDPN的)，在其他文獻(xiàn)中可以被引用為MAGI-1結(jié)構(gòu)域1。同樣地，當(dāng)在本申請(qǐng)中引用蛋白質(zhì)的特殊PDZ結(jié)構(gòu)域時(shí)，應(yīng)該鑒于如本文，特別是在申請(qǐng)US20040018487的序列列表表2中所述的該結(jié)構(gòu)域的序列，對(duì)該引用進(jìn)行理解，當(dāng)合適時(shí)，申請(qǐng)US20040018487的序列列表表2顯示了所述序列列表的序列和關(guān)于不同結(jié)構(gòu)域的名稱和Genbank編號(hào)之間的關(guān)系。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)″PDZ蛋白質(zhì)″指天然存在的含有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。示范性PDZ蛋白質(zhì)包括CASK，MPP1，DLG1，DLG2，PSD95，NeDLG，TIP-33，SYN1a，TIP-43，LDP，LIM，LIMK1，LIMK2，MPP2，NOS1，AF6，PTN-4，prIL16，41.8kD，KIAA0559，RGS12，KIAA0316，DVL1，TIP-40，TIAM1，MINT1，MAGI-1，MAGI-2，MAGI-3，KIAA0303，CBP，MINT3，TIP-2，KIAA0561，和TIP-1。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)″PDZ-結(jié)構(gòu)域多肽″指含有PDZ結(jié)構(gòu)域的多肽，諸如包括PDZ結(jié)構(gòu)域序列的融合蛋白、天然存在的PDZ蛋白質(zhì)、或分離的PDZ結(jié)構(gòu)域肽。因此，PDZ-結(jié)構(gòu)域多肽可以是約60或更多個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度、約70或更多個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度、約80或更多個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度、約90或更多個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度、約100或更多個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度、約200或更多個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度、約300或更多個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度、約500或更多個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度、約800或更多個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度、約1000或更多個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，通常至多約2000或更多個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度、約50-2000個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度、約50-1500個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度、約50-1000個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度、約60-1000個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度、約70-1000個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。PDZ結(jié)構(gòu)域肽通常不多于約200個(gè)氨基酸(例如，50-200個(gè)氨基酸、60-180個(gè)氨基酸、80-120個(gè)氨基酸、或90-110個(gè)氨基酸)，并編碼PDZ結(jié)構(gòu)域。例如，適合于檢測(cè)HPV的E6蛋白質(zhì)的抗體記述在20050142541(2005年6月30日公開(kāi)的)中。在公開(kāi)的美國(guó)專利申請(qǐng)US20040018487中找到用于識(shí)別來(lái)自HPV致癌毒株的E6蛋白的詳細(xì)方法，將該方法的全部?jī)?nèi)容引入本文。這些公開(kāi)的方法易于適合在本方法中使用。在某些實(shí)施方案中，抗-E6抗體可以與固相支持體結(jié)合，并且由本主題方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提取物和與固相支持體結(jié)合的抗體相接觸。所述固相支持體在本領(lǐng)域中是公知的，且可以包括但不限于：膠體金粒子，化學(xué)發(fā)光粒子，染色的膠乳粒子，或SERS拉曼粒子，例如，具有報(bào)告染料的硅石-包被的金核或銀核。在某些實(shí)施方案中，抗-E6抗體可以綴合到熒光標(biāo)記上。利用包含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，可以檢測(cè)蛋白質(zhì)提取物中的致癌E6蛋白的結(jié)合。在其他實(shí)施方案中，包含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可以與固相支持體結(jié)合，并且由本主題方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提取物和與固相支持體結(jié)合的包含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相接觸。利用抗-E6抗體，可以檢測(cè)蛋白質(zhì)提取物中的致癌E6蛋白的結(jié)合。在備選的方法中，在包含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的抗體之間的結(jié)合可以發(fā)生在溶液中(即，在缺乏抗體或包含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)與固相支持體結(jié)合的條件下)，并且，結(jié)合后，該抗體或包含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可以與固相支持體(例如，珠或類似物，諸如上述那些)結(jié)合。在這些實(shí)施方案中，包含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可以是具有親合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，所述親合結(jié)構(gòu)域與固相支持體相結(jié)合。利用識(shí)別E6蛋白的第二捕獲劑，能夠檢測(cè)E6蛋白的存在。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用側(cè)向流動(dòng)(LF)測(cè)定、免疫色譜測(cè)定、浸染棒檢測(cè)(dipsticktests)或流過(guò)免疫測(cè)定(flow-throughimmunoassays)來(lái)檢測(cè)提取的、捕獲的E6蛋白。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將包括包含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白的“捕獲區(qū)”的側(cè)向流動(dòng)(LF)條帶置于含有提取的樣品的小瓶或孔中，其中已經(jīng)加入了第二捕獲劑如與金顆粒綴合的抗-HPVE6單克隆抗體(mAb)。然后允許該金顆粒和樣品通過(guò)毛細(xì)管作用在條帶上遷移?？梢詫⑽綁|附著在遠(yuǎn)端以促進(jìn)液體在條帶上流動(dòng)。在樣品在條帶上遷移的過(guò)程中，捕獲區(qū)中的PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白可以與E6蛋白結(jié)合。如果溶液中存在金綴合的mAb的結(jié)合，則抗-E6-金綴合物可以結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白。備選地，E6蛋白可以結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白，然后捕獲E6金綴合物。在任一種情形中，成功的捕獲可以導(dǎo)致在LF條帶上形成可視和可檢測(cè)的線條。在優(yōu)選實(shí)施方案中，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列(CBA)輔助檢測(cè)捕獲的E6蛋白。CBA，還稱為多元珠測(cè)定，是一系列可以用于捕獲和定量可溶分析物的光譜離散性顆粒。然后，通過(guò)檢測(cè)基于熒光的發(fā)射的檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)分析來(lái)測(cè)量分析物。BectonDickinson(BD)TMCBA產(chǎn)生與基于ELISA的測(cè)定相當(dāng)?shù)摹⒌浴岸嘣被蛲瑫r(shí)方式的數(shù)據(jù)。如使用任一種夾心形式的測(cè)定相同，未知分析物濃度的計(jì)算通常通過(guò)使用已知的標(biāo)準(zhǔn)物且將未知物針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪圖而進(jìn)行。有效用于檢測(cè)捕獲的E6蛋白的儀器室本領(lǐng)域中公知的。例如，可以使用反射計(jì)儀器或UMN讀取儀來(lái)檢測(cè)LF條帶上得到的線條。備選地，如果使用熒光標(biāo)記的抗E6mAb捕獲E6蛋白，則可以使用熒光計(jì)讀取儀。還可以使用其中結(jié)合探測(cè)粒子作為裝置的固有部分的裝置。備選地，本發(fā)明的提取方法可以產(chǎn)生由E6結(jié)構(gòu)部分單獨(dú)地或與特異性抗體、肽或蛋白(與粒子附著或不附著的)復(fù)合組成的輸入樣品。所述輸入樣品可以引入到特異性捕獲或基于非特異性膜的流過(guò)檢測(cè)裝置中，并且隨后通過(guò)酶或基于粒子的系統(tǒng)或放大檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。可以利用多種方法提高信號(hào)檢測(cè)。一種這樣的方法利用綴合至金粒子上的酶綴合的(例如，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP))單克隆抗體(mAbs)與沉淀底物結(jié)合。具有多個(gè)生物素接著鏈霉抗生物素蛋白金粒子的抗體也可以導(dǎo)致放大的信號(hào)。生物素酪胺可以用來(lái)在檢測(cè)線條周圍沉積更多生物素，然后是鏈霉抗生物素蛋白-綴合的金來(lái)進(jìn)行放大和檢測(cè)。備選地，信號(hào)增強(qiáng)可能由使用雙重方法導(dǎo)致，所述雙重方法包括由生物素和特異性mAb-共綴合的金粒子(或熒光標(biāo)記的粒子)組成的一級(jí)粒子，其后是與鏈霉抗生物素蛋白綴合的二級(jí)粒子。一級(jí)粒子可以是特異性E6重復(fù)標(biāo)記的粒子，其后是抗-標(biāo)記的二級(jí)粒子。一級(jí)粒子還可以是能夠與來(lái)源于一些、許多或全部致癌HPV毒株的E6蛋白和/或與該E6蛋白的一個(gè)或多個(gè)表位反應(yīng)的抗體的混合物。所述抗體混合物可以被生物素?；?、綴合至固相支持體(例如，金粒子)上、或熒光標(biāo)記；并且本文所述的多種方法可以與所述混合物聯(lián)合使用以檢測(cè)E6蛋白。在某些實(shí)施方案中，可以增加提取緩沖液中的活性成分，以增加臨床樣本的溶解。這樣增加的溶解可以消除對(duì)澄清樣品的需要，并且減少測(cè)定中的一個(gè)步驟。還可以可能地沉淀抗-E6-mAb-金復(fù)合物，并且在小體積中重建，從而濃縮樣品，由此富集E6蛋白且提高測(cè)定的靈敏性。可以在檢測(cè)之前過(guò)濾樣品，以去除可能干擾樣品流動(dòng)和檢測(cè)的不需要的物質(zhì)。過(guò)濾可以降低樣品的粘度，導(dǎo)致樣品提高的流速。這可以提高將樣品濃縮為樣品膜的效率或在側(cè)向流動(dòng)裝置上的流速。另外，通過(guò)減少樣品中較大粒徑的物質(zhì)，可以降低樣品的粘度，這導(dǎo)致樣品提高的流速。這可以增加將樣品濃縮為樣品膜的效率或在側(cè)向流動(dòng)裝置上的流速?？梢允褂脧V泛多樣的天然的和合成的有機(jī)和無(wú)機(jī)聚合物來(lái)過(guò)濾樣品。示例性的聚合物包括聚乙烯，聚丙烯，聚(4-甲基丁烯)，聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯，聚(對(duì)苯二甲酸乙二酯)(poly(ethyleneterephthalate))，人造絲，尼龍，聚(丁酸乙烯酯)，聚偏二氟乙烯(polyvinylidenedifluoride)(PVDF)，硅氧烷，聚甲醛，纖維素，醋酸纖維素，硝化纖維素，玻璃纖維濾紙，聚氯乙烯，聚乙酸乙烯酯(polyvinylacetate)，乙酸乙烯酯和氯乙烯的共聚物，聚酰胺，聚碳酸酯，奧綸(orlon)，聚酯，聚苯乙烯，等等，或者還可以使用摻合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，濾器的孔徑允許樣品蛋白通過(guò)而防止其他物質(zhì)(例如，細(xì)胞碎片)通過(guò)。例如，濾器孔徑可以在例如0.1μm-50.0μm范圍內(nèi)。優(yōu)選地，孔徑在0.5-25μm，1.0-20μm，2.0-15μm，3.0-10μm，或4.0-6.0μm范圍內(nèi)。例如，在通過(guò)使細(xì)胞與本發(fā)明的提取試劑接觸然后與本發(fā)明的中和試劑接觸進(jìn)行的蛋白提取步驟后，樣品可以通過(guò)孔徑為0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0或8.0μm的濾器。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，基于待過(guò)濾的樣品，可能需要不同的孔徑?？梢云仁箻悠吠ㄟ^(guò)濾器(例如，通過(guò)包含膜濾器孔的注射器或使用通過(guò)濾器的真空吸力)。存在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種過(guò)濾樣品的方法。樣品過(guò)濾可以導(dǎo)致樣品的提高的流速。在一些情形中，相比于不過(guò)濾的樣品，樣品的流速可以提高5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％或50％。適當(dāng)?shù)臑V器尺寸可以在信號(hào)檢測(cè)沒(méi)有任何可評(píng)估的損失的條件下引起流速的提高。可以將獲自上述測(cè)定方法的結(jié)果與獲自合適的對(duì)照，例如，陽(yáng)性對(duì)照(其中，可以使用已知含有與捕獲劑結(jié)合的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)提取物)或陰性對(duì)照(例如，其中可以使用不與細(xì)胞樣品相接觸的蛋白質(zhì)提取試劑)的結(jié)果進(jìn)行比較。獲自上述測(cè)定方法的結(jié)果可以顯示在蛋白質(zhì)提取物中蛋白質(zhì)的存在、缺乏，或在某些實(shí)施方案中，顯示在蛋白質(zhì)提取物中蛋白質(zhì)的量。在某些實(shí)施方案中，可以將獲自上述測(cè)定方法的結(jié)果傳達(dá)回遠(yuǎn)程位置，例如，通過(guò)電話、傳真、電子郵件、郵寄或任何其他方式。例如，可以將所述結(jié)果傳達(dá)給受試者或受試者的醫(yī)生。以上蛋白質(zhì)檢測(cè)方法可以與不同的檢驗(yàn)，諸如細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)，例如用于確定癌或癌前子宮頸細(xì)胞的Pap檢驗(yàn)、或其他分子檢驗(yàn)聯(lián)合進(jìn)行。在這些實(shí)施方案中，在使用前，可以將細(xì)胞樣品分為幾部分。第一部分可以在細(xì)胞學(xué)測(cè)定中使用，且第二部分可以在上述方法中使用。依照以上內(nèi)容，本發(fā)明的某些實(shí)施方案還提供了用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物的系統(tǒng)。該系統(tǒng)通常含有：a)包含固定的或未固定的細(xì)胞的細(xì)胞樣品；b)具有至少約pH10.0的pH的提取試劑；和c)中和試劑，其中所述固定的或未固定的細(xì)胞、提取試劑和中和試劑可以在以上方法中使用，從而產(chǎn)生適合于在結(jié)合測(cè)定中使用的蛋白質(zhì)提取物。所述提取試劑和/或中和試劑含有聚氧乙烯烷基醚。試劑盒在另一方面中，本發(fā)明提供用于實(shí)施本主題方法的試劑盒，例如，用于從固定的或未固定的細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物的試劑盒，在某些實(shí)施方案中，用于檢驗(yàn)蛋白質(zhì)提取物中蛋白質(zhì)的存在的試劑盒。本主題試劑盒至少包括具有至少約pH10.0的pH的提取試劑，和中和試劑。所述提取試劑和/或中和試劑含有聚氧乙烯烷基醚。另外，該試劑盒可以包括用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的捕獲劑，和，在某些實(shí)施方案中，用于利用捕獲劑檢測(cè)蛋白質(zhì)的試劑(例如，緩沖劑和檢測(cè)試劑)。以上成分可以存在于分別的容器中或可以將一種或多種成分組合到一個(gè)容器，例如玻璃或塑料瓶中。除以上成分外，本主題試劑盒還可以包括用于實(shí)施本主題方法的說(shuō)明書(shū)。這些說(shuō)明書(shū)可以以多種形式出現(xiàn)在本主題試劑盒中，在試劑盒中可以存在一份或多份說(shuō)明書(shū)。這些說(shuō)明書(shū)可以出現(xiàn)的一種形式是作為在試劑盒包裝中、在包裝插頁(yè)等中的合適媒介或基底上印刷的信息，例如在一張或數(shù)張?jiān)谄渖嫌∷⒘嗽撔畔⒌募埳系挠∷⒌男畔ⅰＡ硪环N方式是其上記錄了該信息的計(jì)算機(jī)可讀媒體，例如，磁盤(pán)、CD、等。再一種可以出現(xiàn)的方式是可以用來(lái)通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)訪問(wèn)處于遠(yuǎn)端的信息的網(wǎng)站地址。該試劑盒中可以存在任何便利的方式。效用上述方法和系統(tǒng)易于用于多種研究和診斷方法，包括診斷特殊疾病或病癥、或由傳染性媒介諸如病毒或細(xì)菌引起的感染的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本方法用作檢測(cè)HPV感染的細(xì)胞的診斷的一部分。由于HPV的致癌毒株的存在與癌細(xì)胞和癌前細(xì)胞相關(guān)，所以本方法可以用于檢測(cè)癌或癌前子宮頸細(xì)胞。已知HPV是下列疾病中的病原體：疣狀表皮發(fā)育不良(epidermodysplasiaverruciformis)(EV)，即導(dǎo)致皮膚(例如，鱗狀細(xì)胞的(squamocelllar))癌高風(fēng)險(xiǎn)的終身皮膚病癥；子宮頸瘤形成(cervicalneoplasias)，諸如子宮頸上皮內(nèi)瘤形成(cervicalintraepithelialneoplasia)(CIN)和侵入性子宮頸癌(invasivecervicalcarcinoma)(ICC)；陰道瘤形成(viginalneoplasias)，諸如陰道上皮內(nèi)瘤形成(vaginalintraepithelialneoplasia)(VAIN)和陰道癌(vaginalcarcinoma)(VC)；外陰瘤形成(vulvalneoplasias)，諸如外陰上皮內(nèi)瘤形成(vulvarintraepithelialneoplasia)(VIN)和外陰癌(vulvarcarcinoma)；陰莖癌(penilecarcinoma)(包括，退行發(fā)育丘疹病(Bowenoidpapulosis))；肛門(mén)(AC)和肛周癌(PC)(anal(AC)andperianalcarcinomas(PC))；口咽癌(oropharyngealcarcinomas)(OS)；食管癌(esophagealcarcinomas)(EC)；非-黑素瘤皮膚癌(non-melanomaskincancers)(例如，基細(xì)胞癌(basalcellcarcinoma)-BCC和鱗狀細(xì)胞癌(squamouscellcarcinoma)-SCC)；和黑素瘤(melanoma)。同樣，在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法可以用作對(duì)任何這些疾病的診斷。在一個(gè)實(shí)施方案中，從受試者獲得(例如，剝離或切除)細(xì)胞，并將其存放在含有固定劑的液體培養(yǎng)基中，在某些實(shí)施方案中，所述含有固定劑的液體培養(yǎng)基可以是用于細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)的運(yùn)送培養(yǎng)基。通常在醫(yī)生的辦公室或診室中獲得細(xì)胞，將細(xì)胞樣品轉(zhuǎn)送到檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)并且由其接收，在所述機(jī)構(gòu)中，進(jìn)行上述蛋白質(zhì)檢測(cè)方法和，任選地，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)測(cè)定。將來(lái)自該檢驗(yàn)的結(jié)果傳達(dá)給受試者，在一些實(shí)施方案中，通過(guò)醫(yī)生及其同事傳達(dá)。其細(xì)胞被采用的受試者可以是哺乳動(dòng)物，例如，狗或貓，嚙齒動(dòng)物(例如，小鼠、豚鼠、或大鼠)，或靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如，人、黑猩猩、或猴)。在許多實(shí)施方案中，受試者應(yīng)該是人，具體地，男性或女性。在某些實(shí)施方案中，受試者可以表現(xiàn)出HPV感染的癥狀(例如，可以在身體的一處或多處具有疣)，可以被懷疑受到HPV的感染(例如，可以含有與所述感染在細(xì)胞學(xué)上一致的細(xì)胞)或可以已被檢驗(yàn)出HPV陽(yáng)性。在某些實(shí)施方案中，受試者可以不具有HPV感染的適應(yīng)證，且以上方法可以用作常規(guī)篩查的一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法可以用于檢測(cè)致癌HPV的任何毒株，例如，HPV26，HPV53，HPV66，HPV73，HPV82，HPV16，HPV18，HPV31，HPV35，HPV30，HPV39，HPV45，HPV51，HPV52，HPV56，HPV59，HPV58，HPV33，HPV66，HPV68或HPV69，(特別地，任何最普遍的HPV毒株，例如，HPV16、HPV18、HPV31、HPV33和HPV45)，其通過(guò)檢測(cè)來(lái)自所述毒株的E6蛋白而進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本方法的起始點(diǎn)，尚不知固定的或未固定的細(xì)胞是否含有致癌E6蛋白或致癌E6蛋白來(lái)自哪種毒株。如果檢測(cè)測(cè)定顯示出在細(xì)胞中存在致癌E6蛋白，則感染那些細(xì)胞的HPV毒株的身份能夠通過(guò)其他分子測(cè)定或通過(guò)病毒DNA測(cè)序而確定，所述分子測(cè)定例如使用對(duì)特殊E6蛋白或由病毒編碼的其他蛋白質(zhì)特異的抗體的那些。通過(guò)舉例說(shuō)明而非限制的方式，提供了以下實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)施例1：提取摻加的(spiked)臨床樣品將受HPV16E6基因(C33A+)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用THINPREPTM培養(yǎng)基固定，并如下所列出地，將其添加(即，“摻加”)到部分THINPREPTM-固定的臨床樣品中。將細(xì)胞摻加到5種臨床樣品中每一種的一半中(每一半臨床樣品具有兩千萬(wàn)個(gè)C33A+細(xì)胞)。提取方案：C33A(+)ThinPrep細(xì)胞/20M細(xì)胞/ml1-將20MC33A(+)ThinPrep細(xì)胞添加到1/2臨床陰性#229(1.0ml提取物)中2-將20MC33A(+)ThinPrep細(xì)胞添加到1/2臨床陰性#230(1.0ml提取物)中3-將20MC33A(+)ThinPrep細(xì)胞添加到1/2臨床陰性#231(1.0ml提取物)中4-將20MC33A(+)ThinPrep細(xì)胞添加到1/2臨床陰性#232(1.0ml提取物)中5-將20MC33A(+)ThinPrep細(xì)胞添加到1/2臨床陰性#233(1.0ml提取物)中6-20MC33A(+)ThinPrep細(xì)胞(1.0ml提取物)提取試劑：TritonX-100/Lot092K0171-(1％＝250μl)5MNaCl/Lot5701-53-(0.15M＝750μl)0.5MTris堿/Lot5708-20-(0.1M＝5ml)05M甘氨酸/Lot5708-9-(0.1M＝5ml)10％SDS/Lot5708-8-(0.05％＝125μl)8M尿素/Lot5678-83-(0.25M＝781μl)加入RO/DI至20ml-(8.1ml)5NNaOH/LotA09522-(525μl)加入RO/DI至25ml-(4.475ml)最終pH-11.48最終制劑：0.1MTris/0.1M甘氨酸/0.15MNaCl/1％TritonTMX-100/0.05％SDS/0.25M尿素pH11.48蛋白質(zhì)提取程序：1.將細(xì)胞混懸液加入到50ml離心管中2.在3000rpm旋轉(zhuǎn)10-15分鐘3.小心地去除上清液4.將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到1.5mlnunc管中5.在3000rpm旋轉(zhuǎn)10-15分鐘6.小心地去除上清液7.向沉淀加入需要量的提取試劑8.重新混懸，從而打碎細(xì)胞沉淀a.添加劑(處于1∶100的DTT)9.檢查pH，調(diào)節(jié)到11.510.在RT(或?qū)μ崛『线m的溫度)下混合30分鐘11.在14,000rpm旋轉(zhuǎn)10-15分鐘12.去除澄清的上清液13.加入處于1∶100的DTT14.用5NHCl中和到pH8.0，并在ELISA中檢驗(yàn)(用31.0μl5NHCl/1ml中和到pH8.0)100mMDTT/NR5701-90/DOM2/7/05ELISA方法1-用5ug/ml處于PBS(lot021405)中的GST-Magi-PDZ(lot88.18/0.65ug/ul)包被平板(Nunc439454MaxisorpF96/lot542043)-100ul/孔11mlx5ug/ml＝55ugx1ul/0.65ug＝84.6ulGST-Magi-PDZ2-在4℃溫育過(guò)夜3-用平板清洗劑清洗3次(TBS-Tween)4-用250ul封閉緩沖液(lot033005)封閉平板5-在25℃溫育2小時(shí)6-用平板清洗劑清洗3次(TBS-Tween)7-將100ulMBP-E6/溶解產(chǎn)物樣品加入到合適的孔中8-在25℃溫育1小時(shí)9-用平板清洗劑清洗3次(TBS-Tween)10-將100ul處于5ug/ml的抗-E6抗體(4C6-2.85mg/ml-lot02)加入到處于2％BSAHNTG緩沖液(lot031805B)中的合適孔中。將N-末端肽(HPV16E6lot#PN3952-2)以10ug/ml加入到合適的樣品中，從而證實(shí)信號(hào)的特異性(在加入前，用抗-E6抗體預(yù)培養(yǎng)肽45分鐘)11-在25℃溫育2小時(shí)12-用平板清洗劑清洗3次(TBS-Tween)13-在2％BSA/0.05％Tween20緩沖液(lot040505)中制備山羊抗-小鼠IgG-HRP(杰克遜(Jackson)GxMIgG-HRP/目錄#115-035-062/lot60988)的1∶5000稀釋液。10.0mlx1/5000＝0.002mlx1000ul/ml＝2.0ul山羊抗-小鼠IgG-HRP14-將100ul1∶5000山羊抗-小鼠IgG-HRP稀釋液加入到合適的孔中(去除TMB底物并置于室溫下)15-在25℃溫育1小時(shí)16-用平板清洗劑清洗5次(TBS-Tween)17-加入100ulNeogenK-藍(lán)TMB底物(lot041018)18-在25℃溫育30分鐘19-加入100ul終止溶液(lot030705)并讀取A450制劑：2％BSA/0.05％Tween緩沖液-(lot040505)2％BSA封閉劑lot033005(49.975ml)Tween20lotA016759301(0.025ml)結(jié)果如能夠從上表中所示結(jié)果看到地，對(duì)所有摻加的臨床樣品檢測(cè)到E6結(jié)合。實(shí)施例2：高pH緩沖液加添加劑對(duì)MBP-E6檢測(cè)的影響圖1所述的實(shí)施例舉例說(shuō)明不同組成的緩沖液對(duì)重組麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)-E6蛋白的檢測(cè)的影響。通常，應(yīng)該使用本文所述的提取緩沖液從細(xì)胞中提取蛋白。然而，此處，使用預(yù)先純化的重組蛋白以最優(yōu)化條件。簡(jiǎn)言之，圖1A所述的實(shí)驗(yàn)包括將MBP-E6蛋白懸浮在新鮮制備的、在添加劑含量和pH方面不同的提取緩沖液中。該“提取”步驟之后是中和步驟，在中和步驟中，樣品的pH被調(diào)節(jié)至中性pH。然后，使用側(cè)向流動(dòng)測(cè)定檢測(cè)MBP-E6蛋白。緩沖液的組成本文所述的實(shí)驗(yàn)中所用的緩沖液來(lái)源于兩種緩沖液之一，一種為較低pH緩沖液，即“緩沖液1”，另一種為較高pH緩沖液，即“緩沖液2”。緩沖液1(pH約為11.5)由下列組成：約100mMTris/甘氨酸，約50mMHepes，約150mMNaCl，約1mMEGTA，約1.1％TritonTMX-100，和約0.125-0.14NNaOH。緩沖液2(pH約為12-13)由下列組成：約0.1NNaOH和約50mM檸檬酸三鈉。然后用或不用“低量”或“高量”圖1A所示的添加劑補(bǔ)充每種緩沖液。添加劑在低-添加劑緩沖液中的濃度為約：0.25M尿素；0.05％SDS；2％TweenTM-20；2％BrijTM35(西格瑪(Sigma))；2％皂苷(saponin)；2％TergitolNP40；或10mMEDTA，pH8。添加劑在高-添加劑緩沖液中的濃度為約2M尿素；0.5％SDS；4％TweenTM-20；4％BrijTM35；4％皂苷；4％TergitolNP40；或50mMEDTA，pH8。如上文所示，緩沖液1具有1.1％TritonTMX-100的儲(chǔ)備水平，其用于低的和高的樣品二者。對(duì)于緩沖液2，TritonTMX-100的濃度為2％(低)或4％(高)。在本文所述的大部分實(shí)施例中，緩沖液，包括各種添加劑，在即將加入至樣品之前制備。然而，在某些情形中，在向樣品中引入一種或多種添加劑之前，首先用緩沖液處理該樣品。檢測(cè)MBP-E6蛋白在圖1A所述的實(shí)驗(yàn)中，將520pgMBP-E6懸浮在1.03-1.13ml用所示添加劑新鮮配制的所示提取緩沖液中。然后，將該混懸液在RT下輕輕混合(末端-對(duì)-末端)約30分鐘。對(duì)于中和步驟，使用約2MTris將該混懸液調(diào)節(jié)至較低的pH(約7.8-8)，并且再在RT下旋轉(zhuǎn)30分鐘。將約150-200ul樣品通過(guò)本文所述的側(cè)向流動(dòng)(LF)測(cè)定進(jìn)行分析，以檢測(cè)MBP-E6重組蛋白。側(cè)向流動(dòng)(LF)測(cè)定的描述本文所述的側(cè)向流動(dòng)(LF)測(cè)定也稱為免疫色譜測(cè)定或浸染棒測(cè)定(dipstickassay)。簡(jiǎn)言之，本文的LF測(cè)定包括將金-粒子結(jié)合的病毒蛋白捕獲在LF棒上存在的“捕獲區(qū)”上。成功的捕獲導(dǎo)致在LF條帶上出現(xiàn)可視且可檢測(cè)的線條。材料：20％(w/v)BSA0.22μm過(guò)濾的(西格瑪(Sigma)A7906)；膠體金8G11(BBI)；側(cè)向流動(dòng)條帶，PDZ捕獲。方法：1)將約150-200μl樣品一式兩份置于96孔平板的兩個(gè)孔中。2)向每個(gè)孔中加入約20μl20％BSA，并且用移液管吸頭混合。3)向每個(gè)孔中加入約10μl8G11-綴合的膠體金，并且用移液管吸頭混合。8G11是識(shí)別HPV16E6蛋白的單克隆抗體(mAb)。4)將LF條帶置于每個(gè)孔中約120分鐘，以允許樣品通過(guò)毛細(xì)管作用在該條帶上遷移?？梢栽谶h(yuǎn)端附著有吸附墊，以促進(jìn)液體在條帶上流動(dòng)。在樣品遷移過(guò)程中，HPV16E6蛋白可以與附著在膠體金粒子上的mAb結(jié)合。E6蛋白還被LF條帶上包含多種攜帶PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白的區(qū)域所捕獲，所述多種攜帶PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白能夠識(shí)別E6蛋白。所述捕獲導(dǎo)致在LF條帶上出現(xiàn)可視且可檢測(cè)的紅線。5)然后通過(guò)UMM儀器分析該LF條帶，所述UMM儀器為能夠量化可視信號(hào)輸出的測(cè)量反射系數(shù)的讀取儀。所獲得的值是相對(duì)的反射系數(shù)值。結(jié)果圖1所示的實(shí)施例表明組合某些添加劑和高pH提取緩沖液(緩沖液2，pH12.9)對(duì)MBP-E6蛋白的檢測(cè)產(chǎn)生協(xié)同作用。例如，當(dāng)在不存在添加劑條件下比較緩沖液1和緩沖液2時(shí)，似乎提高的pH對(duì)重組MBP-E6蛋白的檢測(cè)沒(méi)有影響(圖1A，后4列)。某些添加劑，特別是SDS，TWEENTM-20，BrijTM35和TergitolNP40，在甚至使用較低pH的緩沖液，即緩沖液1，pH11.5時(shí)，的確提高M(jìn)BP-E6蛋白的檢測(cè)(圖1A)。然而，當(dāng)將添加劑與較高pH緩沖液(緩沖液2)組合時(shí)，在SDS，TWEENTM-20，TritonTMX100，和BrijTM35樣品中，極大提高了重組蛋白的檢測(cè)。例如，當(dāng)提高pH時(shí)，在TritonTMX-100處理的樣品中的蛋白檢測(cè)由0躍至高于～2.4UMM的讀數(shù)。因此，有可能推論在“提取”步驟中組合高pH與某些添加劑對(duì)E6蛋白的檢測(cè)產(chǎn)生協(xié)同作用。圖1B描述了與在1A中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)相似的實(shí)驗(yàn)。然而，圖1B中，是在中和步驟而不是之前的“提取”步驟過(guò)程中向樣品中引入添加劑。與在提取步驟過(guò)程中引入添加劑時(shí)相比，這一方法產(chǎn)生低得多的信號(hào)強(qiáng)度。因此，在中和步驟引入添加劑不是最理想的方法。實(shí)施例3：添加劑對(duì)由細(xì)胞提取E6蛋白的影響圖2所示的實(shí)施例評(píng)價(jià)了不同百分?jǐn)?shù)的緩沖液添加劑對(duì)由細(xì)胞提取E6蛋白的影響。在該實(shí)施例中，蛋白提取自表達(dá)HPV16E6基因的SiHa細(xì)胞或提取自C33A-細(xì)胞，C33A-細(xì)胞為非HPV感染的子宮頸癌細(xì)胞系。提取步驟對(duì)于提取步驟，首先從-80℃冰箱中取出包含約一千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞沉淀物，并且允許在RT下解凍約10分鐘。然后，向大部分樣品中加入約750μl實(shí)施例2所述的緩沖液2。還向指定的樣品中引入添加劑，如BrijTM35，TweenTM-20，或TritonTMX-100。這些添加劑以2％或4％(v/v)的終濃度存在。作為對(duì)照，一些樣品用緩沖液673提取，緩沖液673為一種中性pH緩沖液，其包含20mMTrispH8，2％BSA，1％TritonTM-X100，2％TweenTM-20，0.2％肌氨酸，250mMNaCl，和50mMEDTA。將樣品短時(shí)渦旋振蕩，然后在RT下旋轉(zhuǎn)30分鐘。中和步驟對(duì)于中和步驟，加入約140-180ul的2MTris，pH6.0，以將每份樣品的pH減小為約pH7.8-8。中和樣品的pH所需要的Tris，pH6.0的體積預(yù)先憑經(jīng)驗(yàn)確定。在加入Tris和短時(shí)渦旋后，將樣品在RT下旋轉(zhuǎn)30分鐘。然后，通過(guò)以14Krpm離心10分鐘而澄清樣品。然后，在通過(guò)實(shí)施例2所述的LF測(cè)定進(jìn)行分析之前，將澄清的溶解產(chǎn)物(終體積約為1.09)轉(zhuǎn)移至干凈管中。結(jié)果當(dāng)在提取步驟中使用含有4％BrijTM35的緩沖液2時(shí)，最好地檢測(cè)到HPV16E6蛋白(圖2)，另外，比較來(lái)自SiHa細(xì)胞與HPVE6-陰性C33A-細(xì)胞的信號(hào)，表明這種條件還極大地提高了所述測(cè)定的信噪比(圖2)。實(shí)施例4：在用4％BrijTM35/緩沖液2提取后HPV-16E6蛋白的劑量響應(yīng)檢測(cè)在該實(shí)施例中，用實(shí)施例2和3中所述的4％BrijTM35/緩沖液2提取漸增數(shù)量的表達(dá)HPV-16E6的SiHa和Caski細(xì)胞。提取方法與實(shí)施例3所述的方法相似，并且使用約9.2X106細(xì)胞/ml的起始濃度。然而，LF測(cè)定的不同在于，每個(gè)LF條帶使用遞增的細(xì)胞數(shù)目。如圖3所示，LF測(cè)定中所用的每個(gè)條帶的細(xì)胞數(shù)目為約31,000；約62,000；約125,000；約250,000；約500,000；約1,000,000；或約1,700,000。陰性對(duì)照包括用中性pH的緩沖液673提取這些細(xì)胞(實(shí)施例3所述)和用4％BrijTM35/緩沖液2或緩沖液673提取HPV-陰性C33A細(xì)胞。如圖3所示，當(dāng)使用C33A細(xì)胞時(shí)不存在劑量響應(yīng)，當(dāng)使用中性pH緩沖液673時(shí)僅有有限的劑量響應(yīng)。然而，由于使用了漸增的細(xì)胞數(shù)目，在兩種表達(dá)HPV-16E6的細(xì)胞系(SiHa和Caski)中檢測(cè)到漸增量的E6蛋白。這些結(jié)果表明該測(cè)定以劑量-響應(yīng)方式檢測(cè)HPV-16E6蛋白。實(shí)施例5：在由摻加的臨床樣品提取HPV-16E6蛋白中使用4％BrijTM35/緩沖液2圖4所示的實(shí)施例舉例說(shuō)明在來(lái)自已經(jīng)組合或“摻加”了表達(dá)HPV-16E6的SiHa細(xì)胞的PAP正常臨床樣品的提取物中檢測(cè)HPV-16E6蛋白。本實(shí)施例中所用的臨床樣品是傳統(tǒng)Pap涂片檢測(cè)為陰性的未固定的、子宮頸刷拭樣品(brushsample)。首先將該樣品由-80℃冰箱取出，并且允許在RT下解凍約10分鐘。然后用小剪鉗剪掉每個(gè)刷子，然后將其置于含有約一千萬(wàn)個(gè)SiHa細(xì)胞的冷凍細(xì)胞沉淀物的微量離心管中。以與實(shí)施例3和4所述的那些相似的方式進(jìn)行樣品的提取、中和和LF測(cè)定。對(duì)于這一實(shí)驗(yàn)，在提取步驟過(guò)程中使用4％BrijTM35/緩沖液2或中性緩沖液673(二者均在前述實(shí)施例中描述過(guò))。兩種緩沖液的提取體積約為1ml。在5份使用4％BrijTM35/緩沖液2提取的SiHa-細(xì)胞-摻加的臨床樣品中檢測(cè)到非常大量的HPV16E6蛋白(圖4)。相反，5份非-SiHa摻加樣品的提取產(chǎn)生較低的信號(hào)。類似地，使用緩沖液673提取每種細(xì)胞類型也產(chǎn)生較低的信號(hào)。這些結(jié)果表明，在將來(lái)可以成功地使用BrijTM35/緩沖液2來(lái)檢測(cè)臨床樣品中的HPV16E6蛋白。實(shí)施例6：進(jìn)一步優(yōu)化用于蛋白提取的BrijTM35/緩沖液2該實(shí)施例舉例說(shuō)明使用不同百分比的BrijTM35和/或不同的添加劑組合進(jìn)一步優(yōu)化BrijTM35提取。此處，使用含有不同BrijTM35水平的緩沖液2(實(shí)施例2所述)輔助由SiHa細(xì)胞提取HPV16E6，SiHa細(xì)胞為轉(zhuǎn)染了HPV16E6的基因的細(xì)胞系(圖5)。另外，還檢測(cè)了含有與其他添加劑如EDTA，TweenTM-20，或TritonTMX-100組合的BrijTM35的緩沖液2。對(duì)于這一實(shí)驗(yàn)，提取、中和和LF測(cè)定步驟與實(shí)施例2和3所述的那些相似，區(qū)別在于提取緩沖液中所用的添加劑水平不同。提取緩沖液中所用的添加劑的量為：4％BrijTM35，5％BrijTM35，6％BrijTM35，4％BrijTM35+10mMEDTA，2％BrijTM35+2％Tween-20，2％BrijTM35+2％TritonTMX-100，2％BrijTM35+2％TweenTM-20+2％TritonTMX-100，或2％BrijTM35+2％TweenTM-20+10mMEDTA。作為對(duì)照，一些樣品用中性pH緩沖液673提取。每個(gè)LF條帶的近似細(xì)胞數(shù)目為約1,300,000。如圖5所示，BrijTM35百分?jǐn)?shù)由4％增加至6％導(dǎo)致對(duì)HPV16E6蛋白的提高的檢測(cè)。該測(cè)定還通過(guò)向BrijTM35緩沖液中添加TritonTMX-100和/或TweeTMn-20而改善。實(shí)施例7：提取和/或中和步驟的時(shí)間對(duì)HPV16E6蛋白檢測(cè)的影響本實(shí)施例舉例說(shuō)明提取和/或中和步驟的時(shí)間對(duì)HPVE6蛋白的最終檢測(cè)所具有的影響。在本實(shí)施例中，通常按照實(shí)施例3所述的步驟，同樣從SiHa細(xì)胞提取E6蛋白。然而，在該實(shí)施例中，提取和/或中和步驟的溫育時(shí)間改變(圖6)。SiHa細(xì)胞以約10,000,000細(xì)胞/ml提取30分鐘或10分鐘，并且中和30分鐘或10分鐘，如圖6所示。中和步驟的終止時(shí)間由澄清步驟的離心時(shí)間所確定。另外，對(duì)于LF測(cè)定，每個(gè)條帶使用1,700,000或500,000個(gè)SiHa細(xì)胞。當(dāng)使用不同的提取或中和溫育時(shí)間時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到HPV-16E6蛋白的顯著不同(圖6)。因此，本實(shí)施例表明，當(dāng)提取和/或中和溫育步驟的時(shí)間由30分鐘改變?yōu)?0分鐘時(shí)，所述測(cè)定沒(méi)有受到不利的影響。實(shí)施例8：使用4％BrijTM35/緩沖液2提取E6蛋白的HPV18和HPV45變體本實(shí)施例舉例說(shuō)明實(shí)施例2和3中所述的4％BrijTM35/緩沖液2提取系統(tǒng)提取不同HPV毒株的E6蛋白的應(yīng)用(圖7)。E6蛋白提取自表達(dá)HPV18的HeLa細(xì)胞或表達(dá)HPV45的MS751細(xì)胞。HPV陰性C33A-細(xì)胞系用作陰性對(duì)照。提取和中和步驟與實(shí)施例2和3所述的那些相似。對(duì)于LF測(cè)定，每個(gè)LF條帶使用相等的約1,700,000個(gè)各種類型的細(xì)胞。此外，LF測(cè)定中所用的膠體金與識(shí)別HPV毒株18和45的E6蛋白的F82-5A2單克隆抗體綴合。如圖7所表明的，4％BrijTM35/緩沖液2提取系統(tǒng)可以成功地用于提取HPV18E6蛋白和HPV45E6蛋白。實(shí)施例9：使用4％BrijTM35/緩沖液2提取E6蛋白的HPV16和HPV18變體本實(shí)施例比較了HPV16E6蛋白的和HPV18E6蛋白的4％BrijTM35/緩沖液2提取。關(guān)于圖8所述實(shí)驗(yàn)的提取和中和步驟以與實(shí)施例8的那些相似的方式進(jìn)行。然而，本實(shí)施例使用的是表達(dá)的HPV16的SiHa細(xì)胞和表達(dá)HPV18的HeLa細(xì)胞。同前，將C33A-細(xì)胞用作陰性對(duì)照。對(duì)于LF測(cè)定，每個(gè)LF條帶使用漸增數(shù)量的細(xì)胞(與實(shí)施例4相同的范圍)。另外，在SiHa細(xì)胞提取物的LF測(cè)定中使用抗-HPV16金，而在HeLa細(xì)胞提取物的LF測(cè)定中使用抗-HPV18金.在來(lái)自HeLa和SiHa細(xì)胞的提取物中檢測(cè)到E6蛋白(圖9)。HPV16E6蛋白和HPV18E6蛋白二者的檢測(cè)以劑量-響應(yīng)方式發(fā)生(圖9)。實(shí)施例10：進(jìn)一步優(yōu)化BrijTM35/緩沖液2系統(tǒng)本實(shí)施例舉例說(shuō)明將緩沖液2(實(shí)施例2所述)中的BrijTM35水平由約4％改變?yōu)榧s10％的影響。對(duì)于圖9所述的實(shí)驗(yàn)，提取和中和步驟與實(shí)施例3的那些相似。如在該實(shí)施例中，起始細(xì)胞為HPV16-感染的SiHa細(xì)胞或HPV-陰性C33A-細(xì)胞。然而，此處，在提取時(shí)存在的BrijTM35百分比不同。更具體地，所用的BrijTM35百分比為：約4％，約6％，約8％或約10％。另外，還檢測(cè)了2％BrijTM35/2％TweenTM20和2％BrijTM35/2％TweenTM-20/10mMEDTA。LF測(cè)定如本文所述那樣進(jìn)行。每個(gè)LF條帶使用約170萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。如圖9所示，來(lái)自SiHa細(xì)胞提取物的陽(yáng)性信號(hào)隨著B(niǎo)rijTM35濃度增加而增加。然而，在由HPV-陰性C33A-細(xì)胞制備的提取物中，信號(hào)也增加，這導(dǎo)致在較高的BrijTM百分比處的減小的信噪比。然而，當(dāng)使用4％或6％BrijTM時(shí)，該測(cè)定的信噪比似乎得到改善。另外，組合BrijTM與TweenTM-20也似乎改善了信噪比。實(shí)施例11：優(yōu)化由SiHa-摻加的陰性臨床樣品的提取本實(shí)施例舉例說(shuō)明改變提取條件對(duì)由SiHa-摻加的陰性臨床樣品提取E6蛋白的影響。此處所用的樣品制備以及提取和中和步驟與實(shí)施例5所用的那些相似。然而，在本實(shí)施例中，陰性臨床樣品(NCS)存在于藥簽上而不是刷子上。另外，在本實(shí)驗(yàn)中改變提取條件，從而包括具有4％BrijTM35；2％BrijTM35/2％TweenTM-20，或；2％BrijTM35/2％TweenTM-20/10mMEDTA的緩沖液2(圖10)。如所示，對(duì)于LF測(cè)定使用約170萬(wàn)個(gè)SiHa細(xì)胞/條帶。如圖10所示的結(jié)果所示，由于SiHa-摻加的樣品產(chǎn)生相對(duì)一致的陽(yáng)性信號(hào)，而陰性樣品產(chǎn)生相對(duì)較低的信號(hào)(圖10)，所以4％BrijTM35/緩沖液2條件可能是檢測(cè)臨床樣品中的HPV16E6蛋白的優(yōu)越條件。實(shí)施例12：在存在HPV-陰性細(xì)胞的條件下由SiHa細(xì)胞提取HPV16E6蛋白本實(shí)施例舉例說(shuō)明在存在HPV-陰性C33A-細(xì)胞的條件下由SiHa細(xì)胞提取HPV16E6蛋白。對(duì)于本實(shí)施例，將漸增量的SiHa提取物滴定至含有固定量(約1百萬(wàn)/ml)C33A-細(xì)胞的緩沖液中(圖11)。對(duì)于這一實(shí)驗(yàn)，每種細(xì)胞系分別使用4％BrijTM35/緩沖液2或ArborVita溶胞緩沖液(AVLB)提取。AVLB由下列組成：約50mMHEPES，pH約為pH7.5，約1.1％TritonTMX-100，約150mMNaCl，約10％甘油和約1mMEGTA。提取和中和步驟以與實(shí)施例3相似的方式進(jìn)行。然而，在這一實(shí)驗(yàn)中，制備由AVLB或中和的4％BrijTM35/緩沖液2組成的稀釋劑。然后，將C33A-提取物以約1百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml的水平摻加至每種緩沖液中。然后，將SiHa細(xì)胞提取物連續(xù)稀釋至所示的包含C33A-的緩沖液中。樣品通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列(CBA)分析，并由熒光計(jì)進(jìn)行讀數(shù)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果揭示檢測(cè)E6蛋白的最佳條件為4％BrijTM35/緩沖液2提取和中和然后稀釋在AVLB緩沖液中(圖11)。另外，檢測(cè)E6蛋白的水平似乎為約5000個(gè)細(xì)胞/ml或500個(gè)細(xì)胞/孔(圖11)。實(shí)施例13：由固定在ThinPrepTM或SurePathTM固定劑中的SiHa細(xì)胞提取HPV16E6蛋白本實(shí)施例舉例說(shuō)明緩沖液2/4％BrijTM35提取系統(tǒng)可以用于從固定的細(xì)胞提取蛋白。在圖12所述的實(shí)驗(yàn)中，將一千萬(wàn)個(gè)HPV16陽(yáng)性SiHa或HPV-陰性C33A-細(xì)胞添加至1ml所示的固定劑或DMEM培養(yǎng)基中在RT下1小時(shí)。然后，將細(xì)胞以1000RPM離心15分鐘，沉淀，并且重懸在1ml實(shí)施例3所述的4％BrijTM35/緩沖液2中。然后，對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)施例3所述的提取、中和和LF測(cè)定。如圖12所示，在提取步驟中使用4％BrijTM35/緩沖液2時(shí)，成功地檢測(cè)到ThinPrepTM-和SurePathTM-固定的SiHa細(xì)胞二者中存在的E6蛋白。由以上結(jié)果和討論證明本主題方法為固定的或未固定的細(xì)胞的分子分析提供許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。具體地，本方法提供用于從固定的或未固定的細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物的常規(guī)方法，其中蛋白質(zhì)提取物中的蛋白質(zhì)是可以在結(jié)合測(cè)定中檢測(cè)的。由于通常很難檢測(cè)固定的或未固定的細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)，所以，本主題發(fā)明表現(xiàn)出對(duì)本領(lǐng)域的顯著貢獻(xiàn)。實(shí)施例14：通過(guò)膜濾器過(guò)濾蛋白質(zhì)提取物對(duì)樣品流速的影響在本實(shí)施例中，蛋白提取自表達(dá)HPV16E6蛋白的SiHa細(xì)胞或提取自C33A-細(xì)胞，C33A-細(xì)胞為非HPV感染的子宮頸癌細(xì)胞系，并且在評(píng)估得到的樣品的流速之前使其通過(guò)過(guò)濾膜運(yùn)行。提取步驟對(duì)于提取步驟，首先從-80℃冰箱中取出包含約一千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞沉淀物，并且允許在RT下解凍約10分鐘。然后，向大部分樣品中加入約750μl實(shí)施例2所述的緩沖液2。還向指定的樣品中引入添加劑，如BrijTM35，TweenTM-20，或TritonTMX-100。這些添加劑以2％或4％(v/v)的終濃度存在。將樣品短時(shí)渦旋，然后在RT下旋轉(zhuǎn)30分鐘。中和步驟對(duì)于中和步驟，加入約140-180ul0.9MTris，pH7.8，以將每份樣品的pH減小為約pH8.5。中和樣品的pH所需要的Tris，pH7.8的體積預(yù)先憑經(jīng)驗(yàn)確定。在加入Tris和短時(shí)渦旋后，將樣品在RT下旋轉(zhuǎn)30分鐘。然后，通過(guò)以14Krpm離心10分鐘而澄清樣品。過(guò)濾步驟將澄清的溶解產(chǎn)物(終體積約為1.09)通過(guò)5.0μmMilliporePVDF注射器濾器過(guò)濾。然后，使樣品通過(guò)樣品流通裝置運(yùn)行，并且測(cè)量運(yùn)行整份樣品所需要的時(shí)間。還評(píng)估樣品的免疫測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度，并且在視覺(jué)上或用CAMAG密度計(jì)進(jìn)行讀數(shù)。HPVE6的存在視覺(jué)上以0-4等級(jí)計(jì)分。結(jié)果樣品通過(guò)5.0μmPVDF注射器濾器的流動(dòng)時(shí)間減少，在一些情形中，減少幾乎50％。數(shù)據(jù)顯示在下表1中。另外，通過(guò)視覺(jué)讀取評(píng)估樣品表明在通過(guò)5.0μm注射器濾器過(guò)濾后SiHa信號(hào)沒(méi)有顯著損失(圖13)。表1.過(guò)濾后樣品的流動(dòng)評(píng)估樣品池樣品流動(dòng)時(shí)間(未過(guò)濾的)(分鐘)樣品流動(dòng)時(shí)間(過(guò)濾的)(分鐘)樣品池樣品流動(dòng)時(shí)間(未過(guò)濾的)(分鐘)樣品流動(dòng)時(shí)間(過(guò)濾的)(分鐘)110:418:521012:2310:10219:129:37118:216:4633:333:2212＞30分鐘15:45419:4612:13134:124:055＞30分鐘27:3614＞30分鐘16:4164:264:2015＞30分鐘28:12711:568:24500KSiHa3:513:42825:1214:34500KC33A-3:573:37917:5810:40將本說(shuō)明書(shū)中引用的全部出版物和專利申請(qǐng)引入本文作為參考，如同將每篇單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)貏e地和個(gè)別地指定引入作為參考。任何出版物的引用是關(guān)于其在提交日前的公開(kāi)，并且不應(yīng)該將其解釋為承認(rèn)本發(fā)明沒(méi)有資格通過(guò)在先的發(fā)明先于所述出版物。盡管為了清楚理解的目的，通過(guò)舉例說(shuō)明或?qū)嵤├敿?xì)描述了前述發(fā)明，但是對(duì)于本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員明顯地是，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，在不偏離所附權(quán)利要求的精神或范圍的條件下，可以對(duì)其進(jìn)行某些改變和改進(jìn)。