專利名稱：透明質(zhì)酸分離純化的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種分離純化透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，簡稱HA)的方法。
背景技術：
HA是一種由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺為雙糖單位聚合而成的大分子生物多糖。HA有生物相容性、生物降解性及光學活性等。HA主要用于臨床治療、化妝品、醫(yī)療用品研究等方面。在生物分離工程領域，尋求生物物質(zhì)分離新技術、新方法是長期以來關注的重點之一。對HA分離純化方法的研究從1952年以來不斷有相關的論文發(fā)表和專利報道。
用活性炭和粉末纖維素吸附劑對微生物發(fā)酵HA提取物的分離純化方法(Biochimica et Biophysica Acta，1957.Vol.24397-400)。該方法的最大缺點是隨著蛋白質(zhì)被吸附劑的除去，部分HA隨之帶入而損失掉。此外，由于動物組織中的HA是以與蛋白質(zhì)聚糖的形式存在，在對動物源HA分離純化中，用此法會在除去蛋白質(zhì)的過程中損失大量的HA。因此該法不宜用于動物源HA的分離純化。
用氯仿結合膜濾法從牛眼球玻璃體中分離純化HA的方法(U.S.Pat.No4,141,973)，該法的最大缺點是分離過程中使用常規(guī)方法不易得到的DNase及RNase兩類核酸酶。
用胰蛋白酶水解法從牛關節(jié)液中制取HA的方法(WO 86/06728)。該法的最大缺點是分離過程中多次在磷酸鹽溶液中進行酶分解及其附屬過程，因此，操作過程復雜。
用溴化十六烷基三甲銨(CTAB)從發(fā)酵液中分離HA的方法(U.S.No.4,782,046)；一種用超濾與氯化十六烷基吡啶(CPC)沉淀結合的方法從發(fā)酵液中分離HA的方法(WO 92/08799)。該類方法最大的缺點是在實施用CTAB或CPC分離純化HA過程中，要經(jīng)過多次CTAB或CPC沉淀HA及鹽溶過程，操作過程繁雜。有的得到的HA產(chǎn)物既含有蛋白質(zhì)又含有核酸(WO 92/08799)。
用CPC結合DEAE-纖維素從人臍帶、牛眼玻璃體、雞冠中分離純化HA的方法(生物化學雜志，1996年第12卷第2期)。該方法的最大缺點是分離純化過程中在除去蛋白質(zhì)的同時造成大量HA的損失。此外，操作復雜。
用氯仿、鏈霉蛋白酶及CPC從雞冠中制備HA的方法(醫(yī)藥工業(yè)，1986，17.7)。該法的最大缺點是由于先在pH4.5-5.0之間，用氯仿變性除去蛋白質(zhì)造成HA隨部分蛋白質(zhì)的除去而損失及HA分子發(fā)生降解。此外，由于使用CPC，操作過程復雜。
一種利用離子交換樹脂層析分離純化HA的方法(離子交換與吸附1999.15.4)及(中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，.2001.32.17)。該類方法目前僅處于實驗室研究階段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種透明質(zhì)酸分離純化的方法，該方法操作步驟少，操作簡便；成本費用低；產(chǎn)品質(zhì)量好。
本發(fā)明解決的技術問題的技術方案是它包括以下步驟(1)將得到的透明質(zhì)酸提取物加入到堿性緩沖水溶液中，并加入胰蛋白酶，在常溫下攪拌；(2)向上述混合液中加入鹵苯，攪拌，然后離心抽取上清液；
(3)向上述清液中加入0.15mol/L-0.25mol/L的氯化鈉，并攪拌溶解，然后加至少2.5倍體積的95％以上的乙醇并攪動，靜置至沉淀發(fā)生后離心，沉淀物既為分解蛋白質(zhì)的透明質(zhì)酸；(4)加分解蛋白質(zhì)的透明質(zhì)酸到離子溶液中攪拌溶解，然后加至少2.5倍體積的95％以上的乙醇并攪動，靜置至沉淀發(fā)生后離心，沉淀物為固性物中含至少42％的透明質(zhì)酸；(5)將步驟(4)的沉淀物加入離子溶液中攪拌溶解，然后加入活性炭，或活性炭和高嶺土，攪拌、離心，上清液經(jīng)濾膜抽濾，濾液既為透明質(zhì)酸溶液，然后加至少2.5倍體積的95％以上的乙醇并攪動，靜置至沉淀發(fā)生后離心，沉淀物為透明質(zhì)酸含量((以絕干物計))至少60％。
本發(fā)明根據(jù)不同要求可以制備不同純度的產(chǎn)品。因此它還包以下步驟(6)將步驟(5)的上清液經(jīng)濾膜抽濾后的透明質(zhì)酸溶液用35000Da透析袋在去離子水透析3-4h，然后，向透析后的溶液中加羧甲基纖維素并攪拌，最后離心或抽濾；羧甲基纖維素的使用量為10～30g/l；(7)將上述濾液，冷凍，真空干燥，得無色透明片狀透明質(zhì)酸產(chǎn)物，或向其中加氯化鈉至0.15mol/L～0.25mol/L，加至少2.5倍體積的95％以上的乙醇并攪動，靜置至沉淀發(fā)生后離心，沉淀物經(jīng)冷凍，真空干燥，得到白色粉末狀透明質(zhì)酸產(chǎn)物。
所述將步驟(1)堿性緩沖水溶液是由NaHCO3和Na2CO3或NaHCO3和NaOH，NaHCO3的使用量為0.01～120g/l，碳酸鈉Na2CO3的用量為0～100g/l，或NaOH為0～1g/l；所述碳酸氫鈉及碳酸鈉最佳濃度是1～10g/L。
所述步驟(1)所用的胰蛋白酶為粗制胰蛋白酶或精制胰蛋白酶，用量范圍為透明質(zhì)酸提取物中每毫克蛋白質(zhì)用2～100個活力單位的酶量，酶的分解溫度為20～42℃，分解時間為0.5～90h；酶的分解溫度范圍是30～33℃，酶加量是透明質(zhì)酸提取物中每毫克蛋白質(zhì)用8～25個活力單位的酶量，時間是24h以內(nèi)。
所述步驟(2)加入鹵苯是氯苯、溴苯、氟苯或碘苯，最好是氯苯、溴苯；加入的體積比為5～25％。
所述步驟(3)離子溶液為含鹽的磷酸鹽緩沖液的鹽，鹽為NaCl，其濃度為5.8～18g/l，磷酸鹽為NaH2PO4和Na2HPO4，NaH2PO4的濃度為0.0110g/l，Na2HPO4的濃度為0.01g/l。
所述步驟(5)中活性炭用量范圍為10～120g/l，最佳為30～60g/l；高嶺土的使用量為1～100g/l，最佳為10～30g/l；活性炭與高嶺土的比為1∶0～2。
所述步驟(5)的濾膜孔徑為不小與0.45μm，最好是0.22μm及其以下。
本發(fā)明的有益效果是利用碳酸鹽控制水溶液的pH，用胰蛋白酶水解HA提取物中的蛋白質(zhì)，然后把經(jīng)乙醇回收的分解蛋白質(zhì)后的HA，加到含氯化鈉、磷酸二氫鈉及磷酸氫二鈉的溶液中形成一種離子溶液，向該離子溶液加入乙醇，大量的蛋白質(zhì)成分不但不沉淀反而溶解，從而一次分離去除大量蛋白質(zhì)，并為以后的HA高回收率創(chuàng)造了條件。此后，經(jīng)過活性碳混合高嶺土吸附，殘留的大量蛋白質(zhì)成分被去除及微量核酸被全部除去。最后，經(jīng)過透析及羧甲基纖維素處理，微量蛋白質(zhì)成分進一步減少。結果，發(fā)酵源HA提取物經(jīng)本發(fā)明方法分離純化純度達到99.97％以上，動物源的達到99.5％以上。
與本發(fā)明相比，目前普遍使用的CPC等季胺鹽類沉淀HA法，要達到99.5％以上純度，至少需要三次CPC反復沉淀和溶解(朱宛中等，眼用透明質(zhì)酸制備工藝改進，中國生物制品學雜志，1996年第3期)，酶水解后需要2-3次氯仿處理；這些在操作步驟上及操作難度上均超過本發(fā)明。本發(fā)明在操作步驟上及操作方便上均有優(yōu)勢。
本發(fā)明方法中使用的碳酸鹽及磷酸鹽均是普通化學試劑，價格低，使用量少，及本發(fā)明在穩(wěn)定條件下操作；而使用季胺鹽方法中的CPC等的價格很高，多次使用，用量較大，加之CPC類方法操作難度大。這使得本發(fā)明在生產(chǎn)成本上占有優(yōu)勢。
本發(fā)明操作均在pH≥7及溫和條件下進行，避免對HA長鏈分子造成不良影響的操作的被使用。
依據(jù)本發(fā)明方法，最終產(chǎn)物的摻雜物蛋白質(zhì)達到瑞典Headon小于0.5％的要求。特別是本發(fā)明的發(fā)酵源HA純度達到高純度99.99％以上。本發(fā)明的產(chǎn)物之一，具體步驟(5)的結果，發(fā)酵源純度可達到99.6％以上，動物源純度可達90.8％以上，因此，可根據(jù)化妝品及藥品對HA純度要求的不同制備不同純度的產(chǎn)品。
此外，本發(fā)明中使用了鹵苯，不但在于鹵苯對蛋白質(zhì)的變性及溶解脂的能力與通常使用的氯仿相近，而且氯苯的沸點比氯仿高。這樣使用氯苯比使用氯仿自然揮發(fā)量少的多，因此既減少了試劑的用量，又減少了對環(huán)境的污染。
動物源HA及發(fā)酵源HA提取物主要分離純化步驟后的結果，分別見表1及表2表1 來自牛眼玻璃體的HA提取物主要分離純化步驟后的結果

注①*表示絕干物。
②純化倍數(shù)系純化前后單位體積或質(zhì)量中HA與蛋白質(zhì)之比的比的倒數(shù)。
表2 來自發(fā)酵HA提取物主要分離純化步驟后的結果

具體實施方式
本發(fā)明的具體步驟如下(1)將得到的HA提取物加入到堿性緩沖水溶液中，并加入胰蛋白酶，在一定溫度下攪拌一定時間。
(2)向上述攪拌液中加入鹵苯，然后強烈攪拌30min，最后，離心并抽取上清液。
(3)向上述清液中加氯化鈉至0.2mol/L并攪拌溶解，然后加2.5倍以上體積的95％以上的乙醇或無水乙醇并攪動，靜置沉淀發(fā)生后離心。沉淀物既為分解蛋白質(zhì)的HA。
(4)加分解蛋白質(zhì)的HA到一種離子溶液中攪拌溶解，然后加至少2.5倍體積的95％以上的乙醇并攪動，靜置至沉淀發(fā)生后離心，沉淀物既為分解蛋白質(zhì)的透明質(zhì)酸；(5)將分解蛋白質(zhì)的透明質(zhì)酸溶入與(4)相同的離子溶液中，然后加入活性炭及高嶺土，攪拌1h后離心，上清液經(jīng)濾膜抽濾。濾液既為HA溶液(加乙醇回收可得HA含量60％以上的產(chǎn)物)。
(6)將步驟(5)的HA溶液用35000Da透析袋在去離子水透析3-4h，然后，向透析后的溶液中加羧甲基纖維素并攪拌，最后離心或抽濾(加乙醇回收可得HA含量90％以上的產(chǎn)物)。
(7)將上述濾液，冷凍，真空干燥，得無色透明片狀透明質(zhì)酸(HA)產(chǎn)物。或向其中加氯化鈉至0.15mol/L～0.25mol/L，加至少2.5倍體積的95％以上的乙醇并攪動，靜置至沉淀發(fā)生后離心，沉淀物經(jīng)冷凍，真空干燥，得到白色粉末狀透明質(zhì)酸產(chǎn)物。
所述將步驟(1)堿性緩沖水溶液是由NaHCO3和Na2CO3或NaHCO3和NaOH，NaHCO3的使用量為0.01～120g/l，碳酸鈉Na2CO3的用量為0～100g/l，或NaOH為0～1g/l；所述碳酸氫鈉及碳酸鈉最佳濃度是1-10g/L。
本發(fā)明所用的堿性緩沖水溶液是指由碳酸氫鈉和碳酸鈉組成，或碳酸氫鈉和氫氧化鈉組成(或相應的鉀鹽)，這里碳酸氫鈉的使用量為0.01～120g/L，碳酸鈉的用量為0～100g/L，氫氧化鈉的用量為0～1g/L。
本發(fā)明所用的胰蛋白酶為粗制胰蛋白酶(生物化學實驗指導，清華大學出版社.2004年1月1版199～202頁)或精制胰蛋白酶。用量為HA提取物中每毫克蛋白質(zhì)加2～100活力個單位的量(pH7.5，溫度為37℃條件，每分鐘分解產(chǎn)生1μg酪氨酸為1個單位)，酶的分解溫度為20～42℃，分解時間為0.5～90h，較好的溫度范圍是30～33℃，較好的酶加量是HA提取物中每毫克蛋白質(zhì)加8～25個活力單位的酶量，時間最好控制24h以內(nèi)。
為了減少試劑用量和減少環(huán)境污染，本發(fā)明向酶水解液中加入的非極性溶劑鹵苯是氯苯或溴苯以代替通常的氯仿。這一步的離心，工業(yè)化時可用碟片式離心機半連續(xù)工作。
本發(fā)明溶解純化產(chǎn)物I的離子溶液為由氯化鈉及磷酸二氫鈉(或鉀)和磷酸氫二鈉(或鉀)組成的溶液。氯化鈉較好的濃度范圍為5～18g/L，磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀較好的濃度范圍0.01～0.5g/L，磷酸氫二鈉或磷酸氫二鉀較好的濃度為0.1～2.5g/L。
本發(fā)明向HA水溶液中加入的活性炭、高嶺土及羧甲基纖維素介質(zhì)均經(jīng)過稀鹽酸浸泡、稀堿浸泡、抽濾、用去離子水洗至中性和干燥過程處理?；钚蕴坑昧枯^好的范圍為30～150g/L；高嶺土的使用量為40～80g/L。羧甲基纖維素較好的用量范圍為1～5g/L。
HA的定量分析法用咔唑法(Analytical Biochemistry.1962.4330～334)，分子量用粘度法(Biochem.Biophys.1960.42.476～486)，蛋白質(zhì)的測定用Folin-酚法，核酸的檢查用二苯胺法、地衣酚法和紫外掃描。結構檢查用IR。
本發(fā)明不但可以在實驗室實施，而且容易實現(xiàn)工業(yè)化，酶分解及加鹵苯等過程只需一個攪拌釜。
鹵苯與水相的分離只需一臺碟片式離心機。固液分離時需要一臺常用離心過濾機和一個抽濾裝置，透析需要一臺中空纖維透析裝置。所有這些都表明，本發(fā)明是容易實現(xiàn)從實驗室到工業(yè)生產(chǎn)過程的放大。
本發(fā)明HA提取物的取得是由原材料經(jīng)水溶液提取，制得HA提取液后，向提取液中加入氯化鈉、乙醇，經(jīng)沉淀、離心或過濾獲得的。從不同原材料中提取HA提取液的方法是(1)從微生物發(fā)酵液中制取HA提取液參見(無錫輕工大學學報.2000.Vol.19No.5437-439)。(2)從動物眼玻璃體中制取HA提取液剝?nèi)パ矍蛲鈱悠じ锛俺ゾ铙w，加入0.37g/L的EDTA-Na，組織搗碎機搗1～2min，后于2000r/min離心10分鐘或抽濾，得HA提取液。(3)從人臍帶中制取HA提取液取冷凍人臍帶切片后，按重量的4～6倍加入去離子水，并按0.37g/L的濃度加入EDTA-Na，緩慢攪拌2～3h，離心或過濾得HA提取液。(4)從雞冠中制取HA提取液新鮮公雞冠冷凍后切成片，加入6倍體積的無水乙醇或95％的乙醇，攪拌10～20min，離心或抽濾，按重量向離心得到的固體物中加入5-8倍的去離子水，并按0.37g/L的濃度加入EDTA-Na，攪拌3～4h，離心或抽濾，得HA提取液。
本發(fā)明所用的HA提取物均為從提取液中直接分離得到的濕樣固體物，所用的水都為去離子水，所有數(shù)據(jù)都是三次測定的平均值。百分比是以質(zhì)量計的。最終HA產(chǎn)品的IR譜圖與相同來源的生化試劑HA的IR譜圖在波形及吸收峰上是一致的；濃度1-3g/L的HA水溶液的核酸測定的吸收值均為零，紫外區(qū)掃描均無核酸吸收峰。
通過下面的從HA提取物中分離純化HA的過程概要及詳細實施例中，能更好地理解本發(fā)明，它們敘述了從發(fā)酵液、牛眼玻璃體、人臍帶及公雞冠HA提取物中分離純化HA的具體過程。但本發(fā)明并不僅適用于從上述四種原料中分離純化HA。
從HA提取物中分離純化HA過程概要具體步驟(1)中，在不同的堿性緩沖溶液中酶解蛋白質(zhì)，其它條件相同而結果是不同的。例如，使用0.01～0.1mol/L的磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉組成的緩沖溶液酶解牛鹽源HA提取物中蛋白質(zhì)，結果步驟(4)HA的純度僅19～25％；步驟(5)HA純度僅35～40％，蛋白質(zhì)的去除率60～65％，HA的損失率20～33％。使用碳酸氫鈉與碳酸鈉，或碳酸氫鈉和氫氧化鈉，或單一碳酸氫鈉，或碳酸氫鈉和乙酸(調(diào)pH)組成的緩沖溶液，結果步驟(4)HA的純度為40～68％之間，步驟(5)HA的純度為60～98％之間。其中效果最好的是碳酸氫鈉與碳酸鈉組成的堿性緩沖溶液。例如，在碳酸氫鈉濃度為0.3g/L，碳酸鈉濃度為0.7g/L時，步驟(4)HA的純度為45％，HA的損失率12％；步驟(5)HA的純度為76％，HA的損失率6％。又例如，碳酸氫鈉濃度為30g/L，碳酸鈉濃度為70g/L時，步驟(4)HA的純度為50％，HA的損失率12％；步驟(5)HA的純度為66％，HA的損失率4％。效果較好的濃度是1～10g/L的碳酸氫鈉及碳酸鈉濃度，實例見后面實施例。
具體步驟(1)中，酶的加量、酶水解的溫度及水解的時間是分離純化HA要選取的條件之一，選取這些條件不同結果不同。例如，對牛眼源HA的分離純化，酶的加量選每毫克蛋白質(zhì)加2個活力單位的酶量，酶的水解溫度選37℃，水解時間選60h，步驟(4)HA的純度為48％，HA的損失率13％；步驟(5)HA的純度為78％，HA的損失率5％。酶的加量選每毫克蛋白質(zhì)加60個活力單位的酶量，酶的水解溫度選30℃，水解時間選10h，步驟(4)HA的純度為58％，HA的損失率10％；步驟(5)HA的純度為94％，HA的損失率4％。三者協(xié)調(diào)較好的是酶的加量選用HA提取物中每毫克蛋白質(zhì)，加12個活力單位的酶量，酶的水解溫度選33℃，水解時間選20h，結果見后面詳細實例。
具體步驟(2)中，使用氯苯或溴苯，用量可以在0.2-0.3倍體積的水解液量范圍。對發(fā)酵源HA提取物的純化，步驟(5)純度要求≤99.3％及純化產(chǎn)物III純度要求≤99.65％的，具體步驟(2)可以跳過。
具體步驟(4)中，離子溶液中各種離子的濃度不同時純化的結果不同。例如，氯化鈉的濃度為5.8g/L，磷酸氫二鈉的濃度為0.15g/L，磷酸氫二鈉的濃度為0.02g/L時，源自牛眼玻璃體HA提取物的純化結果是純化I的純度為58％及回收率為86％，純化II的純度為91％及回收率為90％。又例如，氯化鈉的濃度為17.4g/L，磷酸氫二鈉的濃度為1.5g/L，磷酸氫二鈉的濃度為0.4g/L時，源自牛眼玻璃體HA提取物的純化結果是步驟(4)的純度為63％及回收率為87％，步驟(5)的純度為93％及回收率為95％。最佳的離子溶液濃度為氯化鈉的濃度為12.4g/L，磷酸氫二鈉的濃度為0.5g/L，磷酸氫二鈉的濃度為0.1g/L，結果見后面詳細實例。
具體步驟5中，活性炭起吸附核酸及殘余蛋白質(zhì)作用，高嶺土其輔助作用，這一步采用離心過濾，高嶺土可不加。若前述的具體步驟(1)中酶水解不好時，這一步的HA回收率低，這是由于仍有較多的HA與蛋白質(zhì)共價相連。這一步中，活性炭的加量根據(jù)步驟(5)中蛋白質(zhì)的含量及HA的濃度變化，0.1％～0.3％的動物源HA加8～12％的活性炭，發(fā)酵源HA加3～5％的活性炭，活性炭超過15％不利于這一步的HA回收率。較好加量見詳細實施例。
具體步驟(6)中，透析時間發(fā)酵源HA采用3h，動物源HA采用4h，透析時間長HA純度不增加，HA回收率有所降低。例如透析6h，發(fā)酵源HA的回收率為93％，動物源HA的回收率為90％。羧甲基纖維素對HA純度的提高有一定作用，尤其對動物源HA。對于要求純度99.95％的發(fā)酵源HA還可以不加羧甲基纖維素，這一步羧甲基纖維素的加量為1～2g/L，HA的純度可以提高0.02％以上。動物源HA，這一步加量為1～2g/L的羧甲基纖維素，HA的純度提高0.02％以上。動物源HA，這一步加量為3～4g/L的羧甲基纖維素，HA的純度提高0.18％。較好的加量和結果見下面詳細實施例。
實施例實施例1從牛眼玻璃體HA提取物中分離純化操作條件較好時的一例步驟1、取10g(未干燥樣)牛眼源HA提取物，加濃度為8g/L的碳酸氫鈉(NaHCO3)水溶液450ml和濃度為2.6g/L的碳酸鈉(Na2CO3)水溶液50ml，再加入0.25g的胰蛋白酶，在33℃、120r/min下攪拌20h。
步驟2、向上述溶液中加入150ml氯苯于1000r/min攪拌30min，然后與2500r/min離心20min，抽取上清液。
步驟3、然后加入5g氯化鈉，攪拌溶解，再加入1500ml的無水乙醇或95％的乙醇，攪動混合，靜置1h，后于2000rin/min離心10min，得到粗品HA。
步驟4、粗品HA加入到氯化鈉濃度為10.6g/L、磷酸氫二鈉濃度為0.2g/L、磷酸二氫鈉的濃度為0.06g/L的500ml水溶液中，攪拌溶解，再向其中加入1500ml無水乙醇，攪動混合，靜置1h，后于2000rin/min離心10min，并用75％的乙醇50ml洗滌沉淀HA(即純化產(chǎn)物I)。
步驟5、將上述沉淀HA溶于100ml的氯化鈉磷酸鹽溶液(濃度同步驟4)中，攪拌溶解，再向溶液中加入4g活性炭和8g高嶺土，攪拌1h，然后經(jīng)0.22μm的濾膜抽濾，收集濾液。
步驟6、將上述濾液于35000Da的透析袋中于500ml去離子水中透析4h，然后保留中加入0.3g羧甲基纖維素，攪拌混合30min，經(jīng)0.22μm的濾膜抽濾，收集濾液。
步驟7、向濾液中加入1g氯化鈉，攪拌溶解，然后再加入3倍體積的95％的乙醇，攪動混合，靜置1h，抽濾，并用20ml丙酮洗滌固體HA。將固體HA經(jīng)冷凍，真空干燥，得到白色粉末狀HA產(chǎn)物。這一實施例的純化效果見表1。最終結果如下(本發(fā)明所提純度指透明質(zhì)酸與蛋白質(zhì)相加透明質(zhì)酸之后比值的百分數(shù))HA純度99.63％收得率83.81％分子量6.1×105實施例2從發(fā)酵HA提取物中分離純化操作條件較好時的一例改變實施例1中步驟(1)的酶加量為0.15g及水解時間12h；步驟(5)的氯化鈉磷酸鹽溶液的量為500ml，活性炭的量為25g和高嶺土的量為40g；步驟(6)的透析用離子水為1500ml，透析時間為3h；步驟(7)的氯化鈉為4g。這一實施例的純化效果見表2。最終結果如下HA純度99.96％收得率90.6％分子量5.8×105實施例3從人臍帶HA提取物中分離純化HA步驟及操作同實施例1，結果如下HA純度99.51％
收得率97.17％分子量4.5×105實施例4從公雞HA提取物中分離純化操作條件較好時的一例改變實施例1中步驟(1)碳酸氫鈉的濃度為10g/L，碳酸鈉的濃度為1.6g/L；步驟(4)的氯化鈉濃度為11.6g/L、磷酸氫二鈉濃度為0.15g/L、磷酸二氫鈉的濃度為0.10g/L；步驟(5)的活性炭的量為10g和高嶺土的量為20g；步驟(6)的羧甲基纖維素的量為0.5g。結果如下HA純度99.52％收得率83.6％分子量4.8×105本發(fā)明堿性緩沖水溶液中鹽可以為相應的鉀鹽，堿性緩沖水溶液還可以是乙酸鈉與碳酸氫鈉組成的溶液。
權利要求
1.一種透明質(zhì)酸分離純化的方法，其特征是它包括以下步驟(1)將得到的透明質(zhì)酸提取物加入到堿性緩沖水溶液中，并加入胰蛋白酶，在常溫下攪拌；(2)向上述混合液中加入鹵苯，攪拌，然后離心抽取上清液；(3)向上述清液中加入0.15mol/L～0.25mol/L的氯化鈉，并攪拌溶解，然后加至少2.5倍體積的95％以上的乙醇并攪動，靜置至沉淀發(fā)生后離心，沉淀物既為分解蛋白質(zhì)的透明質(zhì)酸；(4)加分解蛋白質(zhì)的透明質(zhì)酸到離子溶液中攪拌溶解，然后加至少2.5倍體積的95％以上的乙醇并攪動，靜置至沉淀發(fā)生后離心，沉淀物為固性物中含至少42％的透明質(zhì)酸；(5)將步驟(4)的沉淀物加入離子溶液后攪拌溶解，然后加入活性炭，或活性炭和高嶺土，攪拌、離心，上清液經(jīng)濾膜抽濾，濾液既為透明質(zhì)酸溶液，然后加至少2.5倍體積的95％以上的乙醇并攪動，靜置至沉淀發(fā)生后離心，沉淀物中透明質(zhì)酸含量至少60％。
2.根據(jù)權利要求1所述的透明質(zhì)酸分離純化的方法，其特征是它還包以下步驟(6)將所述步驟(5)的經(jīng)濾膜抽濾后所得的透明質(zhì)酸溶液用35000Da透析袋在去離子水中透析3～4h，然后，向透析后的透明質(zhì)酸溶液中加羧甲基纖維素并攪拌，最后離心或抽濾；羧甲基纖維素的使用量為10～30g/l；(7)將上述濾液，冷凍，真空干燥，得無色透明片狀透明質(zhì)酸產(chǎn)物，或向其中加氯化鈉至0.15mol/L～0.25mol/L，加至少2.5倍體積的95％以上的乙醇并攪動，靜置至沉淀發(fā)生后離心，沉淀物經(jīng)冷凍，真空干燥，得到白色粉末狀透明質(zhì)酸產(chǎn)物。
3.根據(jù)權利要求1所述的透明質(zhì)酸分離純化的方法，其特征是所述步驟(1)的堿性緩沖水溶液化學藥品是由NaHCO3和Na2CO3或NaHCO3和NaOH組成，NaHCO3的使用量為0.01～120g/L，碳酸鈉Na2CO3的用量為0～100g/L，或NaOH為0～1g/L。
4.根據(jù)權利要求3所述的透明質(zhì)酸分離純化的方法，其特征是所述碳酸氫鈉及碳酸鈉的最佳濃度是1～10g/L。
5.根據(jù)權利要求1所述的透明質(zhì)酸分離純化的方法，其特征是所述步驟(1)所用的胰蛋白酶為粗制胰蛋白酶或精制胰蛋白酶，用量范圍為透明質(zhì)酸提取物中每毫克蛋白質(zhì)用2～100個活力單位的酶量，酶的分解溫度為20～42℃，分解時間為0.5～90h。
6.根據(jù)權利要求5所述的透明質(zhì)酸分離純化的方法，其特征是酶的分解溫度范圍是30～33℃，酶加量是按透明質(zhì)酸提取物中每毫克蛋白質(zhì)用8～25個活力單位的酶量計，時間是24h以內(nèi)。
7.根據(jù)權利要求1所述的透明質(zhì)酸分離純化的方法，其特征是所述步驟(2)加入鹵苯是氯苯、溴苯、氟苯或碘苯，最好是氯苯、溴苯；加入的體積比為5～25％。
8.根據(jù)權利要求1所述的透明質(zhì)酸分離純化的方法，其特征是所述步驟(4)的離子溶液為含鹽的磷酸鹽緩沖液，鹽為NaCl，其濃度為5.8～18g/l，磷酸鹽為NaH2PO4和Na2HPO4，NaH2PO4的濃度為0.01～10g/l，Na2HPO4的濃度為0.01g/l。
9.根據(jù)權利要求1所述的透明質(zhì)酸分離純化的方法，其特征是所述步驟(5)中活性炭用量范圍為10～120g/l，最佳為30～60g/l；高嶺土的使用量為1～100g/l，最佳為10～30g/l；活性炭與高嶺土的比為1∶0～2。
10.根據(jù)權利要求1所述的透明質(zhì)酸分離純化的方法，其特征是所述步驟(5)的濾膜的孔徑為不小于0.45μm，最好是0.22μm及以下孔徑的濾膜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種透明質(zhì)酸分離純化的方法，將得到的透明質(zhì)酸提取物加入到堿性緩沖水溶液中，并加入胰蛋白酶，在常溫下攪拌；向上述混合液中加入鹵苯，攪拌，然后離心抽取上清液；向上述清液中加入0.15mol/L－0.25mol/L的氯化鈉，并攪拌溶解，然后加至少2.5倍體積的95％以上的乙醇并攪動，靜置至沉淀發(fā)生后離心，沉淀物既為分解蛋白質(zhì)的透明質(zhì)酸。本發(fā)明方法操作步驟少，操作簡便；生成的產(chǎn)品成本費用低，產(chǎn)品質(zhì)量好。
文檔編號C08B37/08GK101045754SQ20071001775
公開日2007年10月3日 申請日期2007年4月28日 優(yōu)先權日2007年4月28日
發(fā)明者郭育濤, 江元汝, 陳斌, 李東亮 申請人:西安建筑科技大學