專利名稱：具有芳族系聚酯降解能力的微生物以及使用該微生物的芳族系聚酯的降解方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有降解芳族系聚酯的能力的微生物、以及使用該微生物的芳族系聚酯的降解方法。
背景技術(shù)：
近年來，脂族系聚酯通過通常的土壤微生物或脂肪酶等已知的酶來降解，從而作為生物降解性聚合物進行了研究開發(fā)。
對于對苯二甲酸、對羥基苯甲酸等具有芳族成分的聚酯，已知當(dāng)含有的芳族成分為少量或耐熱性顯著降低時，可被通常土壤中或活性污泥中的微生物或已知酶生物降解。但是，對于降解象聚對苯二甲酸乙二醇酯(以下可簡稱為PET)這樣的以芳族成分為主要成分的芳族系聚酯的微生物和酶則幾乎尚未知曉，僅僅了解到有人提出通過用酶處理PET纖維或PBT織布來進行提高親水性等的表面改性(參照日本特表2000-502412號公報和日本特表2001-502014號公報)。但是，明確顯示PET被降解的數(shù)據(jù)則沒有。
由此，降解PET時，通常采用的是在以高濃度氫氧化鈉水溶液為代表的強堿性下進行加熱處理的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供具有降解芳族系聚酯的能力的微生物、以及使用該微生物的芳族系聚酯的降解方法。
本發(fā)明人為實現(xiàn)上述目的，對于通過生物功能降解芳族系聚酯的方法進行了深入地研究，結(jié)果成功地分離出降解芳族系聚酯的微生物，完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明的目的通過屬于根瘤菌屬(Rhizobium)并具有降解芳族系聚酯的能力的微生物實現(xiàn)。
本發(fā)明的另一目的通過芳族系聚酯的降解方法實現(xiàn)，其特征在于使屬于根瘤菌屬并具有降解芳族系聚酯的能力的微生物與芳族系聚酯接觸，降解該芳族系聚酯。
根據(jù)本發(fā)明，通過使用具有降解芳族系聚酯的能力、例如具有特異性降解的能力的微生物，可在溫和的條件下安全、低成本、比較迅速地降解芳族系聚酯。
附圖簡述

圖1是通過掃描電子顯微鏡(株式會社日立制作所制造“SEM-2400”)拍照的根瘤菌亞種OKH-03(Rhizobium sp.OKH-03)的照片(放大倍率20,000倍)。
圖2是通過掃描電子顯微鏡(株式會社日立制作所制造“SEM-2400”)拍照的由實施例1的操作最終得到的PET薄膜的表面的照片圖(放大倍率500倍)。
圖3是通過掃描電子顯微鏡(株式會社日立制作所制造“SEM-2400”)拍照的由比較例1的操作最終得到的PET薄膜的表面的照片圖(放大倍率500倍)。
實施發(fā)明的最佳方式以下詳細(xì)說明本發(fā)明。
本發(fā)明中，芳族系聚酯可以是以芳族成分作為重復(fù)單元、例如含有50重量％或以上的聚對苯二甲酸乙二醇酯的聚酯。特別優(yōu)選含有95重量％或以上的對苯二甲酸乙二醇酯重復(fù)單元。此時，作為可共聚的成分，例如作為除對苯二甲酸以外的二羧酸成分可舉出鄰苯二甲酸、間苯二甲酸、聯(lián)苯二羧酸、二苯氧基乙烷二羧酸、2，6-萘二甲酸之類的芳族二羧酸及其衍生物，如琥珀酸、己二酸、壬二酸、癸二酸、癸烷二羧酸之類的脂族二羧酸及其衍生物。
乙二醇以外的二醇成分例如有二甘醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、丙二醇、1，5-戊二醇、1，6-己二醇、1，10-癸二醇等。
該芳族系聚酯的形狀例如是纖維狀、薄膜狀、塊狀、它們的混合體等，可以是任何形態(tài)。
本發(fā)明的微生物只要是屬于根瘤菌屬、并具有降解芳族聚酯的能力的微生物即可，可以是任何微生物，特別優(yōu)選根瘤菌亞種OKH-03(菌種保藏號FERM P-19483)。
上述菌株是本發(fā)明人在日本國內(nèi)的土壤中新分離出的菌株，具有以下的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)。該菌株(桿菌)的SEM照片如圖1所示。
表1

化學(xué)分類學(xué)性質(zhì)·核蛋白體DNA的序列如SEQ ID N0.1所示。
基于這些性質(zhì)，與《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》(Bergey′s manualof systematic bacteriology)等比對，結(jié)果確認(rèn)是屬于根瘤菌屬的微生物，但不是屬于該屬的公知菌株，因此，作為新發(fā)現(xiàn)菌株，于2003年8月11日，將該菌株保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(茨城縣筑波市東1-1-1中央第6)(保藏號FERM P-19483)。屬于根瘤菌屬的微生物為生物安全性級別I，沒有病原性，因此通過使用該菌株，可以進行生物學(xué)上安全的操作。
接著，對屬于根瘤菌屬、具有降解芳族系聚酯的能力的微生物的分離方法進行說明。
降解芳族系聚酯的微生物在土壤中或其它場所認(rèn)為均存在，因此，從土壤、海洋等中取樣，將其用公知的方法進行篩選，即可分離出具有降解芳族系聚酯的能力的微生物。特別優(yōu)選從芳族系聚酯廢棄物集中存放處或垃圾箱等中取樣。
接著，使用含有芳族系聚酯作為唯一碳源的培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基(以下也將該培養(yǎng)基稱為芳族系聚酯培養(yǎng)基)。
其它氮源、礦物質(zhì)源等例如可以使用硫酸銨、硝酸銨等無機銨鹽，硫酸鐵、硫酸銅、硫酸鋅、硫酸錳、硫酸鎂等金屬鹽及其水合物。
培養(yǎng)方法例如有振蕩培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)等。為了從微生物的混合系統(tǒng)中獲得特定的微生物，優(yōu)選振蕩培養(yǎng)，其中特別優(yōu)選與限定營養(yǎng)源進行培養(yǎng)的濃縮(集積)培養(yǎng)法結(jié)合使用。
將從土壤等中取樣的樣品在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔規(guī)定時間添加培養(yǎng)基，使有用細(xì)菌濃集。
對培養(yǎng)時間沒有特別限定，例如優(yōu)選1-2個月左右。接著取出濃縮培養(yǎng)液中的芳族系聚酯，評價微生物對芳族系聚酯的降解活性。評價方法沒有特別限定，例如通過掃描電子顯微鏡進行的表面觀察，這既簡便準(zhǔn)確性又高，優(yōu)選。
將上述具有芳族系聚酯降解能力的樣品適當(dāng)稀釋，涂抹于LE瓊脂培養(yǎng)基(LE培養(yǎng)基中進一步添加瓊脂的培養(yǎng)基)等，形成菌落，進行分離(一次篩選)。
接著，再從經(jīng)過一次篩選的菌株中篩選芳族系聚酯降解能力高的菌株(二次篩選)。即，通過使上述菌體增殖到對數(shù)增殖期、將濃集的大量菌體接種到芳族系聚酯培養(yǎng)基中等的方法進行培養(yǎng)，然后確認(rèn)其芳族系聚酯降解能力，可得到具有芳族系聚酯降解能力的菌株。
將具有芳族系聚酯降解能力的菌株單獨或組合使用，則可以安全且低成本地降解芳族系聚酯。
該降解方法可通過使上述微生物與芳族系聚酯接觸而容易地進行。
這里，上述微生物與芳族系聚酯的接觸優(yōu)選通過將作為降解對象的芳族系聚酯浸泡在存在上述微生物的水溶液中來進行。
可以使用只有芳族系聚酯作為唯一的碳源的培養(yǎng)基作為該水溶液，并沒有特別的限制，但優(yōu)選芳族系聚酯以外的有機營養(yǎng)源的存在量為0.2重量％或以下，使用LE培養(yǎng)基，更優(yōu)選使用在該LE培養(yǎng)基中添加無機化合物的培養(yǎng)基。這里所述的LE培養(yǎng)基是含有萵苣和蛋黃的提取液的培養(yǎng)基，可按照以下的方法制備。將3g在110℃干燥5小時的萵苣葉和3g煮蛋的蛋黃分別用1L離子交換水煮10分鐘，冷卻至室溫后，用濾紙過濾。將這些濾液混合，以所得作為LE培養(yǎng)基。
這里所添加的無機化合物例如有硫酸銨、硝酸銨等無機銨鹽，硫酸鐵、硫酸銅、硫酸鋅、硫酸錳、硫酸鎂等金屬鹽及其水合物。
使微生物和芳族系聚酯接觸的溫度條件低于40℃，例如優(yōu)選20-37℃的范圍，進一步優(yōu)選25-35℃，特別優(yōu)選30℃。
接觸時的pH優(yōu)選6-9的范圍。為了使pH在該范圍內(nèi)，例如將芳族系聚酯浸泡在水溶液中進行接觸時，可以使用如鹽酸、硫酸的無機酸，如氫氧化鈉、氫氧化鉀的無機堿及其水溶液對該水溶液進行調(diào)節(jié)。也可以使用如磷酸緩沖液的各種緩沖液進行調(diào)節(jié)。
最優(yōu)選的條件是在20-37℃、在pH為6-9范圍的LE培養(yǎng)基中，使本發(fā)明的微生物與芳族系聚酯接觸。不過，通過其它方法，只要微生物與芳族系聚酯接觸、芳族系聚酯可被降解，則也可以采用。
本發(fā)明的微生物與芳族系聚酯接觸時，優(yōu)選使微生物吸附于芳族系聚酯，在芳族系聚酯表面形成生物膜。這里所述的生物膜指的是微生物與其排泄物構(gòu)成的層狀物質(zhì)，由此，本微生物與芳族系聚酯牢固粘附，并且形成降解芳族系聚酯的場所。
本發(fā)明的微生物與芳族系聚酯接觸的時間是至少24小時即可，根據(jù)目標(biāo)芳族系聚酯的降解量，可以設(shè)定任意的時間。接觸時間達到2周或以上時，最好每2周將水溶液更換為新的水溶液。
通過上述方法，可以以0.5-4個月左右這樣短的時間進行在自然界中幾乎不降解的芳族系聚酯的降解。已確認(rèn)生成二氧化碳作為降解產(chǎn)物。
實施例以下，通過實施例進一步具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明不由此受任何限定。
實施例1將PET膜在0.1當(dāng)量的鹽酸水溶液中浸泡3小時，然后在70重量％的乙醇水溶液中浸泡12小時以上，通過在無菌狀態(tài)下干燥，進行滅菌處理，準(zhǔn)備尺寸1.4cm×2.0cm、重量60.7mg這種PET膜作為芳族系聚酯。將該PET膜與10ml由表2記載的成分構(gòu)成的pH7.0的水溶液培養(yǎng)基、1ml含有根瘤菌屬亞種OKH-03(保藏號FERM P-19483)的培養(yǎng)液一起密封在帶有有機硅栓的內(nèi)徑18mm的試管中。
表2

保持好氧條件，使用橫向振動的振蕩培養(yǎng)機，在30℃、300行程/分鐘的條件下進行振蕩，每2周將試管內(nèi)的溶液更換成新溶液，共進行55天的振蕩培養(yǎng)。
從試管內(nèi)取出PET膜，在70重量％的乙醇溶液中超聲波處理20分鐘，除去由附著于膜表面的菌體和菌體排泄物形成的生物膜。
接著將該PET膜在室溫、真空下干燥24小時，然后測定重量，降解處理后的PET膜的重量是56.2mg，減量率為7.4％，降解速度為0.015mg/cm2·天。降解處理后，如圖2所示，通過電子顯微鏡目視觀察，可見表面被降解。
比較例1實施例1中，不添加含有根瘤菌屬亞種OKH-03(保藏號FERM P-19483)的培養(yǎng)液，除此之外進行同樣的操作，PET膜的重量是60.7mg，未見顯著的重量減少。如圖3所示，通過電子顯微鏡目視觀察，可見表面未被降解。
序列表<110>京都工藝?yán)w維大學(xué)長帝人株式會社<120>具有芳族系聚酯降解能力的微生物以及使用該微生物的芳族系聚酯的降解方法<130>P37008<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>469<212>DNA<213>根瘤菌sp.OKH-03<400>1tggagagttt gatcctggct cagaacgaac gctggcggca ggcttaacac atgcaagtcg 60agcgcatcgc aagatgagcg gcagacgggt gggtaacgcg tgggaatcta ccgtgcccta120cggaatagct ccgggaaact ggaattaata ccgtatacgc ccttcggggg aaagatttat180cggggtatga tgagcccgcg ttggattagc tagttggtgg ggtaaaggcc taccaaggcg240acgatccata gctggtctga gaggatgatc agccacattg ggactgagac acggcccaaa300ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt ggacaatggg cgcaagcctg atccagccat360gccgcgtgag tgatgaaggc cttagggttg taaagctctt tcaccggtga agataatgac420ggtaaccgga gaagaagccc cggctaactt cgtgccagca gccgcggta469
權(quán)利要求
1.微生物，該微生物屬于根瘤菌屬并具有降解芳族系聚酯的能力。
2.權(quán)利要求1的微生物，該微生物被命名為根瘤菌屬亞種OKH-03(Rhizobium sp.OKH-03)，以保藏號FERM P-19483保藏。
3.芳族系聚酯的降解方法，其特征在于使權(quán)利要求1的微生物與芳族系聚酯接觸，降解該芳族系聚酯。
4.權(quán)利要求3的方法，其中芳族系聚酯含有95重量％或以上的對苯二甲酸乙二醇酯重復(fù)單元。
5.權(quán)利要求3的方法，其中微生物與芳族系聚酯的接觸在LE培養(yǎng)基中進行。
6.權(quán)利要求3的方法，其中微生物與芳族系聚酯的接觸在20℃-37℃的范圍進行。
7.權(quán)利要求3的方法，其中微生物與芳族系聚酯的接觸在pH6-9的范圍進行。
8.權(quán)利要求3的方法，其中使微生物與芳族系聚酯的接觸在微生物在芳族系聚酯的表面形成生物膜的狀態(tài)下進行。
全文摘要
本發(fā)明提供屬于根瘤菌屬(Rhizobium)并具有降解芳族系聚酯的能力的微生物、使用該微生物進行的芳族系聚酯的降解方法，通過該方法，可以安全且低成本、并且較迅速地降解芳族聚酯。
文檔編號C08J11/10GK1871339SQ20048003082
公開日2006年11月29日 申請日期2004年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月22日
發(fā)明者小田耕平, 木村良晴, 平賀和三, 前田康人, 豐原清綱, 峰松宏昌 申請人:帝人株式會社