專(zhuān)利名稱(chēng)：新的氨基甲酸酯鍵降解細(xì)菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的微生物以及通過(guò)使用這種微生物進(jìn)行生物處理降解聚氨酯的方法。
背景技術(shù)：
近幾年，塑料廢物處置成為一個(gè)問(wèn)題。用于塑料廢物處置的主要方法是焚化和回收。然而，焚化是有缺陷的，因?yàn)樗铀俚厍蜃兣?，而回收遇到了例如缺少用于回收的填埋土地等?wèn)題。例如，全世界每年消耗聚氨酯的比率約為6,000,000噸，日本每年的消耗率約550,000噸。其中，用聚氨酯制作的泡沫軟墊材料作為保溫材料大規(guī)模使用，例如由于其卓越的熱絕緣性而用于冰箱。目前，聚氨酯廢物常常作為不可燃垃圾填埋處理，但是伴隨這樣的處理產(chǎn)生了問(wèn)題，例如缺少填埋土地，和環(huán)境污染。而從保護(hù)自然環(huán)境的觀點(diǎn)看，微生物的生物降解可用做優(yōu)選的處理方法，問(wèn)題是聚氨酯不是可生物降解的。
聚氨酯在其分子中包含氨基甲酸酯鍵以及酯或醚鍵，通過(guò)切割這些鍵進(jìn)行降解。據(jù)報(bào)道，多元醇單元中的酯鍵由真菌和/或細(xì)菌切割。Dardy等(Darby R.T.和Kaplan A.M.，聚氨酯的真菌敏感性，Appl.Microbiol.，16，900-905(1968))對(duì)多種聚氨酯進(jìn)行了真菌降解試驗(yàn)。它們報(bào)道酯基的聚氨酯對(duì)降解的敏感性高于醚基的聚氨酯，并降解特性依賴(lài)于異氰酸酯和/或多元醇的類(lèi)型而改變。Kay等(Kay，M.J.，McCabe，R.W.，Morton，L.H.G.，聚酯聚氨酯生物降解過(guò)程中發(fā)生的化學(xué)和物理變化Int.Biodeterio.Biodegrad.，31，209-225(1991)，分離了能夠降解酯-基的聚氨酯的15個(gè)菌株，并報(bào)道了尋找具有強(qiáng)降解能力的棒狀桿菌菌株降解特性的結(jié)果。
然而，幾乎沒(méi)有關(guān)于聚氨酯中氨基甲酸酯鍵降解的知識(shí)或信息。盡管一些報(bào)道表明氨基甲酸酯鍵在微生物降解過(guò)程中被水解，但在氨基甲酸酯鍵切割和微生物之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明確的因果關(guān)系(B.Jansen等，表皮葡萄球菌降解合成的聚氨酯的證據(jù)，Zentralbl Bakteriol.，276，36(1991)；Darby R.T.和Kaplan A.M.，聚氨酯的真菌敏感性，Appl.Microbiol.，16，900-905(1968))。
另一方面，已報(bào)道低分子氨基甲酸酯化合物經(jīng)歷微生物降解，已知這種降解由酯酶催化。然而，這些報(bào)道中的絕大部分涉及改進(jìn)酒精飲料或降解/去除氨基甲酸酯殺蟲(chóng)劑(JP 01-300892 A，JP 01-240179 A，JP02-128689 A，JP 03-175985 A，JP 04-104784 A，JP 04-325079 A)；這些技術(shù)中沒(méi)有任何一種可適用于聚氨酯的降解。真菌降解被報(bào)道為用于降解可用做聚氨酯原料的物質(zhì)的技術(shù)(JP 09-192633 A)，但該技術(shù)不使用易于適應(yīng)大規(guī)模培養(yǎng)的細(xì)菌。
關(guān)于固體聚氨酯降解細(xì)菌，已知下列菌株降解聚酯基聚氨酯解淀粉類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus amylolyticus)株TB-13(日本專(zhuān)利申請(qǐng)2002-334162)和食酸叢毛單胞菌(Comamonas acidovorans)株TB-35(T.Nakajima-Kambe，F(xiàn).Onuma，N.Kimpara和T.Nakahara，利用聚酯聚氨酯作為唯一碳和氮源的細(xì)菌分離和表征，F(xiàn)EMS MicrobiologyLetters，129卷，39-42，1995)。然而，雖然這些菌株降解氨基甲酸酯中的酯鍵，它們基本上不降解氨基甲酸酯鍵。因此，為了確保聚氨酯的完全細(xì)菌降解，需要能夠降解氨基甲酸酯鍵的細(xì)菌。
發(fā)明公開(kāi)本發(fā)明的目的是提供一種能夠降解氨基甲酸酯化合物的新微生物和使用這種微生物降解氨基甲酸酯化合物的方法。更具體地，本發(fā)明目的在于提供能夠降解用做聚氨酯原料的氨基甲酸酯化合物的微生物以及使用這種微生物降解聚氨酯的方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明人篩選了降解用做聚氨酯合成原料的低分子量氨基甲酸酯的微生物，并發(fā)現(xiàn)屬于紅球菌屬(Rhodococcus)的微生物具有降解氨基甲酸酯化合物的能力。應(yīng)該注意到以前不知道屬于紅球菌屬的微生物具有任何降解氨基甲酸酯化合物的能力。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)使用屬于紅球菌屬的微生物降解聚氨酯的方法。
也就是說(shuō)，本發(fā)明提供了一種屬于紅球菌并具有降解氨基甲酸酯化合物能力的微生物，該氨基甲酸酯化合物特別是用做聚氨酯合成原料的低分子量氨基甲酸酯化合物，本發(fā)明還提供使用屬于紅球菌屬的微生物降解聚氨酯的方法。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1顯示用于篩選氨基甲酸酯-鍵-降解細(xì)菌的合成的氨基甲酸酯化合物的結(jié)構(gòu)。
圖2顯示包括已知菌株的基于rDNA序列的樹(shù)形圖。
圖3顯示各自培養(yǎng)條件下剩余的氨基甲酸酯化合物I的測(cè)定量的結(jié)果。
圖4顯示測(cè)定各自培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的二胺的測(cè)定量的結(jié)果。
圖5顯示測(cè)定各自培養(yǎng)條件下細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)定量的結(jié)果。
發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明提供了屬于紅球菌屬并具有降解氨基甲酸酯化合物能力的微生物，具體地，該氨基甲酸酯化合物是用做聚氨酯合成原料的低分子量氨基甲酸酯化合物，本發(fā)明也提供了使用屬于紅球菌屬的微生物降解聚氨酯的方法。
屬于紅球菌屬并具有降解氨基甲酸酯化合物能力的微生物可以是已知的或新篩選的微生物。通過(guò)舉例，篩選微生物可如下完成。將從各個(gè)地區(qū)收集的土壤樣品加入含有添加了用做聚氨酯合成原料的低分子量氨基甲酸酯化合物的培養(yǎng)基的試管中，隨后30℃振動(dòng)培養(yǎng)。每周重復(fù)傳代培養(yǎng)后，挑選在培養(yǎng)液中顯示渾濁或變色的那些樣品，將其培養(yǎng)上清稀釋并加到NB瓊指平板上，隨后在30℃培養(yǎng)1-3天。挑取生長(zhǎng)的菌落并定義為氨基甲酸酯鍵降解細(xì)菌的候選菌株。然后在含有作為碳源的通過(guò)甲苯二異氰酸酯和丁醇之間反應(yīng)獲得的低分子量氨基甲酸酯化合物(氨基甲酸酯化合物I)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的候選菌株，隨后在其培養(yǎng)液中挑選顯示產(chǎn)生甲苯二胺(氨基甲酸酯化合物I的氨基甲酸酯鍵水解產(chǎn)物)的菌株。
本發(fā)明的微生物不以任何方式受到限制，只要它屬于紅球菌屬并具有降解包含氨基甲酸酯鍵的化合物的能力。更具體地，典型的例子包括2004年1月24日由德國(guó)保藏機(jī)構(gòu)DSMZ(德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)中心)，Mascheroder Weg 1 B，D-38124 Braunschweig，德國(guó))國(guó)際保藏的馬紅球菌(Rhodococcus equi)TB-60-DSMZ 16175，它是盡管在2003年2月26日申請(qǐng)保藏但沒(méi)有被國(guó)際專(zhuān)利生物保藏機(jī)構(gòu)(日本先進(jìn)工業(yè)科技國(guó)家機(jī)構(gòu)(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology in Japan))接受的馬紅球菌菌株TB-60。紅球菌菌株的真菌學(xué)特性可在伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)(1卷，1984，2卷，1986，3卷，1989，4卷，1989)中找到。
此外，本發(fā)明的微生物可以是野生型或突變株，只要它是具有降解氨基甲酸酯鍵能力的紅球菌菌株。
突變株可通過(guò)用甲磺酸乙酯(一種常規(guī)經(jīng)常使用的誘變劑)誘變、用其它化學(xué)物質(zhì)處理(例如亞硝基胍、甲磺酸甲酯)、紫外輻射或不使用任何誘變劑的所謂自發(fā)突變獲得。
培養(yǎng)屬于紅球菌屬的微生物可使用的任何培養(yǎng)基沒(méi)有特別限制，只要它允許屬于紅球菌屬的微生物生長(zhǎng)。例子包括但不限于，LB培養(yǎng)基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl)。更具體地，用于本發(fā)明微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基可包含可由本發(fā)明微生物同化的碳源(例如，葡萄糖)和可由本發(fā)明微生物同化的氮源。這種氮源包括有機(jī)氮源例如蛋白胨、肉提取物、酵母提取物或玉米漿，和無(wú)機(jī)氮源例如硫酸銨或氯化銨。如果需要，培養(yǎng)基可進(jìn)一步包含由陽(yáng)離子(例如鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子)和陰離子(例如硫酸根離子、氯離子、磷酸根離子)等組成的鹽。此外，培養(yǎng)基還可添加痕量成分例如維生素和核酸。碳源的濃度范圍從例如約0.1％-10％，而氮源的濃度依賴(lài)于其類(lèi)型而改變，其范圍從例如約0.01％-5％。無(wú)機(jī)鹽的濃度范圍從例如約0.001％-1％。
不以任何方式限制可在本發(fā)明中降解的氨基甲酸酯化合物，只要在其分子結(jié)構(gòu)中包含氨基甲酸酯鍵。非限制的例子包括，甲苯-2，4-氨基甲酸二丁酯、甲苯-2，6-二氨基甲酸二丁酯、亞甲基雙苯基二氨基甲酸二丁酯、亞己基-二氨基甲酸二丁酯、降冰片烯二氨基甲酸二丁酯，以及用這些物質(zhì)合成的聚氨酯。
術(shù)語(yǔ)“聚氨酯”是在其分子中具有氨基甲酸酯鍵(-NHCOO-)的高分子化合物的總稱(chēng)，其是指具有例如酯、醚、酰胺、脲和/或氨基甲酸酯等基團(tuán)的聚合物，其可通過(guò)多官能異氰酸酯和含羥基化合物之間的反應(yīng)獲得。當(dāng)改變羥基或異氰酸酯基團(tuán)的官能性時(shí)，可制備各種分支的或交聯(lián)的聚合體。根據(jù)使用的多元醇的類(lèi)型可將它們大致分為酯基和醚基的聚氨酯。由于它們良好的特性例如易加工性、抗腐敗、抗酸敗和低密度，聚氨酯具有廣泛的用途，包括彈性材料、泡沫材料、粘合劑、包裝材料、纖維和合成革，還可廣泛地用做汽車(chē)元件。對(duì)可通過(guò)本發(fā)明降解方法處理的聚氨酯樹(shù)脂的數(shù)均分子量沒(méi)有具體限制。
另外，本發(fā)明提供通過(guò)微生物的作用降解含氨基甲酸酯鍵的化合物的方法。該方法基于在微生物生長(zhǎng)過(guò)程中氨基甲酸酯鍵作為營(yíng)養(yǎng)源被降解和消耗的現(xiàn)象，或基于微生物酶降解氨基甲酸酯鍵的作用，也就是基于成熟的微生物細(xì)胞(例如靜止細(xì)胞)的使用。換句話(huà)說(shuō)，準(zhǔn)備處理氨基甲酸酯化合物前，這些細(xì)胞可以常規(guī)方式凍干得到細(xì)胞干粉，并可進(jìn)一步與各種維生素、礦物質(zhì)和必需的營(yíng)養(yǎng)源(例如酵母提取物、酪蛋白氨基酸、蛋白胨)混合配制形成包括片劑的固體制劑。另外，菌株本身也可用做活化的污泥和肥料的成分。
待降解的氨基甲酸酯化合物可以乳劑或粉末形式加入液體培養(yǎng)基或可以塊狀形式例如薄膜或顆粒加入。應(yīng)當(dāng)注意，加入培養(yǎng)基的氨基甲酸酯化合物的量?jī)?yōu)選地為重量的0.01％-10％。微生物可以很少的量加入；考慮到降解效率，優(yōu)選地以相對(duì)于氨基甲酸酯化合物重量的0.1％或更多(濕重)的量使用微生物。被降解的氨基乙酸乙酯化合物可單獨(dú)或組合提供。
在基于微生物生長(zhǎng)過(guò)程中氨基甲酸酯鍵作為營(yíng)養(yǎng)源被降解和消耗的現(xiàn)象的實(shí)施方案中，氨基甲酸酯化合物可作為唯一碳源或作為唯一的碳和氮源，或與其它碳和/或氮源一起提供。適于使用的培養(yǎng)基可包含氨基甲酸酯化合物或葡萄糖等作為碳源，以及可由本發(fā)明的微生物同化的氮源，包括有機(jī)氮源(例如蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米漿)或無(wú)機(jī)氮源(例如硫酸銨、氯化銨)。如果需要，培養(yǎng)基可進(jìn)一步包含由陽(yáng)離子(例如鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子)和陰離子(例如硫酸根離子、氯離子、磷酸根離子)等組成的鹽。此外，培養(yǎng)基還可添加痕量成分例如維生素和核酸。碳源的濃度范圍從例如約0.1％-10％，而氮源的濃度依賴(lài)于其類(lèi)型而改變，其范圍從例如約0.01％-5％。無(wú)機(jī)鹽的濃度范圍從例如約0.001％-1％。
在使用微生物酶的作用降解氨基甲酸酯鍵的實(shí)施方案中，即在使用成熟的微生物細(xì)胞例如靜止細(xì)胞的實(shí)施方案中，既然在氨基甲酸酯鍵降解過(guò)程中不需要微生物生長(zhǎng)，那么培養(yǎng)基可以是包含氨基甲酸酯化合物的緩沖液，它可進(jìn)一步添加氮源、無(wú)機(jī)鹽、維生素等。緩沖液的例子包括磷酸緩沖液。
降解氨基甲酸酯化合物所需的時(shí)間依賴(lài)于待降解的氨基甲酸酯化合物的類(lèi)型、組成、形狀和量、使用的微生物的類(lèi)型和量(相對(duì)于氨基甲酸酯化合物)、以及各種培養(yǎng)條件等而變化。
本發(fā)明中，當(dāng)在需氧條件下對(duì)上述微生物進(jìn)行靜置培養(yǎng)、搖床培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)時(shí)可觀察到氨基甲酸酯化合物的降解。優(yōu)選的是回轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)，其轉(zhuǎn)速范圍可以是每分鐘30-250轉(zhuǎn)。關(guān)于培養(yǎng)條件，培養(yǎng)溫度可以是10℃-50℃，特別優(yōu)選30℃左右。培養(yǎng)基的pH范圍可以是4-10，優(yōu)選7左右。
例如通過(guò)測(cè)定降解造成的氨基甲酸酯化合物的重量損失、通過(guò)使用高效液相層析(HPLC)測(cè)定剩余的氨基甲酸酯化合物的量、或通過(guò)測(cè)定二胺化合物的產(chǎn)生(氨基甲酸酯鍵水解產(chǎn)物)可證實(shí)培養(yǎng)基中氨基甲酸酯化合物的降解。例如使用預(yù)測(cè)將要產(chǎn)生的二胺化合物作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過(guò)薄層層析、或通過(guò)氣相層析可證實(shí)二胺化合物的產(chǎn)生。
在降解固體聚氨酯的方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)使用已知降解聚酯基聚氨酯中酯鍵的解淀粉類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus amylolyticus)菌株TB-13(保藏號(hào)FERM P-19104，見(jiàn)日本專(zhuān)利申請(qǐng)2002-334162)和/或食酸叢毛單胞菌(Comamonas acidovorans)菌株TB-35，結(jié)合本發(fā)明具有降解氨基甲酸酯鍵能力的微生物，完成聚氨酯的降解。
實(shí)施例本發(fā)明將通過(guò)下列實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述，這不意味著限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1篩選氨基甲酸酯鍵降解細(xì)菌氨基甲酸酯化合物合成步驟合成的氨基甲酸酯化合物(圖1)用于篩選氨基甲酸酯鍵降解細(xì)菌。這些化合物是通過(guò)將丁醇與用做聚氨酯的工業(yè)原料的5種典型的異氰酸酯反應(yīng)制備的氨基甲酸酯化的產(chǎn)物，這5種典型的異氰酸酯包括甲苯二異氰酸酯(TDI)、亞甲基雙苯基二異氰酸酯(MDI)、亞己基二異氰酸酯(HDI)和降冰片烯異氰酸酯(NBDI)。這些化合物(氨基甲酸酯化合物I-V，見(jiàn)圖1)是在其分子中各個(gè)都具有氨基甲酸酯鍵的物質(zhì)，它在室溫下是固體并不溶于水。
培養(yǎng)基用于篩選氨基甲酸酯鍵降解細(xì)菌的篩選培養(yǎng)基如下制備。配制10ml顯示于表1中的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，加入內(nèi)徑為22mm的大試管中，然后分別添加氨基甲酸酯化合物I-V(約0.1g)作為碳源，隨后在121℃滅菌20分鐘。用于制備培養(yǎng)基的所有試劑都是具有試劑級(jí)別或同等質(zhì)量的，從Wake Pure Chemical Industries，Ltd.，日本購(gòu)買(mǎi)。
表1 篩選培養(yǎng)基

PH7.0

篩選將從日本的各個(gè)地區(qū)收集的土壤樣品(350個(gè)樣品)用做篩選源。50個(gè)試管用于各個(gè)氨基甲酸酯化合物I-V(共250個(gè)試管)。這些土壤樣品以20個(gè)樣品每組混合物在一起，并以每試管0.2g的量加入包含上述篩選培養(yǎng)基的試管中。各個(gè)試管在30℃、125osc/分用搖床培養(yǎng)，每周將各個(gè)試管的上清液(0.5ml)轉(zhuǎn)移到新鮮的篩選培養(yǎng)基中。重復(fù)這一步驟3次后，選擇培養(yǎng)液中顯示渾濁或變色的26個(gè)試管的樣品，其培養(yǎng)上清用生理鹽水稀釋并加到NB瓊脂平板上，隨后在30℃培養(yǎng)1-3天。一個(gè)一個(gè)地收集長(zhǎng)成的菌落并用做氨基甲酸酯鍵降解細(xì)菌的候選菌株。在NB瓊脂平板上30℃培養(yǎng)后，細(xì)菌細(xì)胞懸浮于20％的甘油溶液中并在-80℃貯存。
這樣獲得的候選菌株在含有氨基甲酸酯化合物I作為碳源的液體篩選培養(yǎng)基中以30℃、125osc/分培養(yǎng)，然后通過(guò)薄層層析證實(shí)其培養(yǎng)液中甲苯二胺(氨基甲酸酯化合物I的氨基甲酸酯鍵水解產(chǎn)物)的產(chǎn)生。用等量的乙酸乙酯提取各個(gè)培養(yǎng)上清(0.5ml)，獲得的乙酸乙酯層(60μl)在薄層平板上(Merck，Kieselgel 60F254)打點(diǎn)。將乙酸乙酯、甲醇和水的比為80∶35∶3的混合物用做展開(kāi)劑。由于在UV輻射下吸收產(chǎn)生黑點(diǎn)，甲苯二胺作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也被打點(diǎn)并用于Rf值的確認(rèn)。結(jié)果，獲得了顯示甲苯二胺(氨基甲酸酯鍵水解產(chǎn)物)產(chǎn)生的一個(gè)菌株。該菌株被定義為菌株TB-60并貯存于-80℃。應(yīng)該注意該菌株從使用化合物I的篩選系統(tǒng)獲得。
實(shí)施例2鑒別氨基甲酸酯鍵降解菌株TB-60依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行生理試驗(yàn)。通過(guò)參考伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology，BaltimoreWILLIAMS& WILKINS Co.，(1984))，連同使用微生物鑒定系統(tǒng)(Microlog 3，BIOLOG，USA)完成鑒別。通過(guò)使用能夠擴(kuò)增幾乎全長(zhǎng)的真細(xì)菌16SrDNA的引物組27F和1492R的直接PCR進(jìn)行16srDNA的測(cè)序和分析。
形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特性試驗(yàn)表2顯示了檢驗(yàn)菌株TB-60各種形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特性的結(jié)果。該菌株是革蘭氏陽(yáng)性棒狀細(xì)菌并顯示即無(wú)游動(dòng)性又無(wú)孢子形成。此外，該菌株形成極其富含水的白色半液體菌落。該菌株在氧化酶試驗(yàn)中呈陰性，在過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)中呈陽(yáng)性，在OF試驗(yàn)中呈陰性。
表2氨基甲酸酯降解菌株TB-60的真菌學(xué)特性

用BIOLOG鑒別系統(tǒng)鑒別作為使用BIOLOG細(xì)菌鑒別系統(tǒng)鑒別試驗(yàn)的結(jié)果，該菌株以95％的概率被鑒定為馬紅球菌(Rhodococcus equi)。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其它菌株具有50％或更多的相似性。
表3使用BIOLOG鑒定菌株TB-60的結(jié)果

16SrDNA核苷酸序列幾乎全長(zhǎng)的16SrDNA通過(guò)集落直接PCR從這一菌株擴(kuò)增，并測(cè)定535bp上游區(qū)域(SEQ ID NO1)和497bp下游區(qū)域(SEQ ID NO2)的序列。
當(dāng)基于得到的序列進(jìn)行BLAST同源性檢索時(shí)，該菌株被認(rèn)為是具有在上游區(qū)域98％匹配和在下游區(qū)域100％匹配的馬紅球菌。圖2顯示了以序列為基礎(chǔ)的包括已知菌株的樹(shù)形圖。
這些結(jié)果鑒定該菌株為馬紅球菌。
實(shí)施例3使用馬紅球菌菌株TB-60對(duì)氨基甲酸酯化合物進(jìn)行降解試驗(yàn)試驗(yàn)菌株使用作為氨基甲酸酯化合物降解細(xì)菌獲得的馬紅球菌菌株TB-60。
培養(yǎng)基和試劑除上述篩選培養(yǎng)基外，實(shí)驗(yàn)中使用包含除氮源外相同成分的培養(yǎng)基，以在氨基甲酸酯化合物I作為碳源或作為碳/氮源存在的情況下培養(yǎng)菌株。試驗(yàn)中使用的所有試劑都具有試劑級(jí)別或同等質(zhì)量，購(gòu)自WakoPure Chemical Industries，Ltd.，日本。
培養(yǎng)條件以2％溶解于乙醚的氨基甲酸酯化合物I配制成0.1ml，加入內(nèi)徑為16mm的小試管中，放置于通風(fēng)室中使乙醚充分揮發(fā)，然后加入2ml培養(yǎng)基后，在高壓滅菌器中120℃滅菌20分鐘。馬紅球菌菌株TB-60懸浮于O.D.660＝0.2的無(wú)菌生理鹽水中，并以100μl的體積接種到各個(gè)試管中，隨后在30℃以300rpm用回轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)0-10天。使用未接種的試管作為對(duì)照對(duì)于各種情況進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)。
測(cè)定長(zhǎng)成的細(xì)菌細(xì)胞量通過(guò)用吸光計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液的O.D.660確定長(zhǎng)成的細(xì)菌細(xì)胞量。使用吸光計(jì)V-550(JASCO Engineering Co.Ltd.，日本)測(cè)定吸光度。
測(cè)定氨基甲酸酯降解的程度殘余的氨基甲酸酯化合物I的量通過(guò)高效液相層析(HPLC)測(cè)定。加入2ml乙腈后，將各個(gè)培養(yǎng)液攪勻，并放置20分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到微試管中并在4℃下以12,000rpm離心。獲得的上清液進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到2ml的小管中，并作為樣品以10μl的體積用于HPLC。使用的層析柱是TSK-GEL ODS-80TM(4.6mm×15cm，Tosoh Corporation，日本)，并使用70％的乙腈作為流動(dòng)相以0.6ml/分的流速進(jìn)行分析。UV檢波器(240nm)用做檢測(cè)器。
測(cè)定產(chǎn)生的二胺的量氨基甲酸酯鍵降解產(chǎn)生的甲苯二胺的量通過(guò)氣相層析(GC)定量。完成培養(yǎng)后，各個(gè)培養(yǎng)上清(0.5ml)轉(zhuǎn)移到微管中，補(bǔ)加包含100ppm二苯胺作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的乙酸乙酯溶液(0.5ml)，然后攪拌10分鐘。4℃下，12,000rpm離心后，將上層溶液轉(zhuǎn)移到新的微管中，用無(wú)水硫酸鈉(約80mg)脫水，并作為樣品以2μl的體積用于GC。用GC-2010(Shimadzu Corporation，Japan)進(jìn)行GC分析，且二苯胺用做濃度計(jì)算的內(nèi)標(biāo)。使用的層析柱是DB-1(0.25mm×30m，J&W)。層析柱溫度設(shè)定為180℃，注入器溫度設(shè)定為300℃。FID檢測(cè)器用于檢測(cè)。
結(jié)果圖3顯示各個(gè)培養(yǎng)條件下測(cè)定殘余氨基甲酸酯化合物I的量的結(jié)果。接受氨基甲酸酯化合物I作為碳源的系統(tǒng)顯示培養(yǎng)開(kāi)始后10天氨基甲酸酯化合物I的量下降約60％。相反，在補(bǔ)加了氨基甲酸酯化合物I作為碳/氮源的培養(yǎng)基中，氨基甲酸酯化合物I的量?jī)H非常少量地下降。
產(chǎn)生的二胺的量圖4顯示測(cè)定產(chǎn)生的二胺的量的結(jié)果。接受氨基甲酸酯化合物I作為碳源的系統(tǒng)顯示在10天的培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生約150ppm的甲苯二胺。相反，在補(bǔ)加了氨基甲酸酯化合物I作為碳/氮源的培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)明顯產(chǎn)生了二胺，但隨后僅少量產(chǎn)生。
長(zhǎng)成的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量圖5顯示測(cè)定長(zhǎng)成的細(xì)菌細(xì)胞量的結(jié)果。接受氨基甲酸酯化合物I作為碳源的系統(tǒng)顯示在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)顯著生長(zhǎng)。相反，在補(bǔ)加了氨基甲酸酯化合物I作為碳/氮源的培養(yǎng)基中，3天后繼續(xù)溫和生長(zhǎng)。
工業(yè)適用性可預(yù)期本發(fā)明中獲得的菌株適合于氨基甲酸酯化合物(特別是聚氨酯)的各種處理，包括使用該菌株的純培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行集約降解、在土壤或肥料中降解、作為肥料再循環(huán)等。此外，該菌株是細(xì)菌菌株，因此就成本來(lái)說(shuō)用于微生物降解也是優(yōu)選的，因?yàn)橥ǔ＜?xì)菌比其它微生物更易于適合大規(guī)模培養(yǎng)。當(dāng)本發(fā)明的微生物與能夠降解氨基甲酸酯中的酯鍵的細(xì)菌例如解淀粉類(lèi)芽孢桿菌菌株TB-13和食酸叢毛單胞菌菌株TB-35結(jié)合使用時(shí)，能夠完成聚氨酯的細(xì)菌降解。
序列表<110>Japan Science and Technology Agency<120>新的氨基甲酸酯鍵降解細(xì)菌<130>022987<160>2<210>1<211>535<212>DNA<213>馬紅球菌TB-60<400>1tagagtttga tcctggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cttaacacat gcaagtcgag 60cggtaaggcc cttcggggta cacgagcggc gaacgggtga gtaacacgtg ggtgatctgc 120cctgcactct gggataagcc tgggaaactg ggtctaatac cggatatgag ctcctgtcgc 180atggcggggg ttggaaaggt ttactggtgc aggatgggcc cgcggcctat cagcttgttg 240gtggggtaat ggcctaccaa ggcgacgacg ggtagccggc ctgagagggc gaccggccac 300actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa 360tgggcgaaag cctgatgcag cgacgccgcg tgagggatga cggccttcgg gttgtaaacc 420tctttcagca gggacgaagc gaaagtgacg gtacctgcag aagaagcacc ggccaactac 480gtgccagcag cccgcggtaa tacgtagggt gcgagcgttg tccggaatta ctggg 535<210>2<211>497<212>DNA<213>馬紅球菌TB-60<400>2ccttgtggtc ggtatacagg tggtgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 60gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt cctgtgttgc cagcgcgtaa tggcggggac 120tcgcaggaga ctgccggggt caactcggag gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgc 180cccttatgtc cagggcttca cacatgctac aatggccggt acagagggct gcgataccgt 240gaggtggagc gaatccctta aagccggtct cagttcggat cggggtctgc aactcgaccc 300cgtgaagtcg gagtcgctag taatcgcaga tcagcaacgc tgcggtgaat acgttcccgg 360gccttgtaca caccgcccgt cacgtcatga aagtcggtaa cacccgaagc cggtggccta 420acccttgtgg agggagccgt cgaaggtggg atcggcgatt gggacgaagt cgtaacaagg 480tagcctcagt cagtcaa49權(quán)利要求
1.一種屬于紅球菌屬(Rhodococcus)并具有降解氨基甲酸酯鍵能力的微生物，或其突變株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其中屬于紅球菌屬的微生物是馬紅球菌(Rhodococcus equi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物，其中屬于馬紅球菌的微生物是馬紅球菌菌株TB-60。
4.一種降解氨基甲酸酯化合物的方法，包括使氨基甲酸酯化合物與根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所述的微生物接觸的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述氨基甲酸酯化合物是用做聚氨酯生產(chǎn)原料的化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述氨基甲酸酯化合物是聚氨酯。
7.一種降解聚氨酯的方法，包括如下步驟使聚氨酯與根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所述的微生物接觸；和使聚氨酯與具有降解聚氨酯中酯鍵能力的微生物接觸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述具有降解聚氨酯中酯鍵能力的微生物是解淀粉類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus amylolyticus)菌株TB-13和食酸叢毛單胞菌(Comamonas acidovorans)菌株TB-35。
全文摘要
從自然環(huán)境的觀點(diǎn)來(lái)看優(yōu)選的塑料處理方法包括利用微生物的生物降解方法。在此方面，存在的問(wèn)題是塑料通常是不可生物降解的。本發(fā)明提供了能夠降解氨基甲酸酯化合物的微生物以及使用所述微生物降解氨基甲酸酯化合物的方法。更具體地，本發(fā)明提供了能夠降解用做聚氨酯原料的氨基甲酸酯化合物的微生物，以及使用所述微生物降解聚氨酯的方法。
文檔編號(hào)C08J11/10GK1723276SQ20048000186
公開(kāi)日2006年1月18日 申請(qǐng)日期2004年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月3日
發(fā)明者神戶(hù)敏明, 茂野雪枝 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)