專利名稱：酶解制備靈芝多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于真菌發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域，特別是涉及利用酶法處理靈芝深層發(fā)酵液，以提高活性靈芝多糖含量的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
靈芝[Ganoderema lucidum(Leyss ex Fr.)karst]，又稱靈芝草，屬擔(dān)子菌亞門、多孔菌目、靈芝科、靈芝屬。歷代的醫(yī)典把靈芝歸位于“上上藥”，其排位在人參之前?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》記載，靈芝可明目、補(bǔ)肝氣、安神、益精、益心氣、益脾氣、益肺氣、益腎氣、通九竅、耳聰、目明、利關(guān)節(jié)、利尿、養(yǎng)顏美容，是上好的滋補(bǔ)佳品。
靈芝多糖能促進(jìn)蛋白質(zhì)、核酸的合成，對(duì)血清、肝臟及骨髓細(xì)胞蛋白質(zhì)或核酸的更新、合成有促進(jìn)作用，它是靈芝扶正固本的主要有效成分之一。靈芝多糖主要存在于靈芝真菌子實(shí)體、菌核、菌絲體或發(fā)酵液中。分子量在6000-50000之間的靈芝多糖，其生物活性較高，靈芝多糖分子為分支結(jié)構(gòu)，糖苷鍵以β-1，4鍵為主，β-1，6鍵為輔。靈芝菌絲體中大分子的靈芝多糖(聚合度多達(dá)數(shù)百萬)與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和果膠質(zhì)相互交聯(lián)，結(jié)構(gòu)致密。因此，如何切除與靈芝多糖交聯(lián)的一部分或全部蛋白質(zhì)以及果膠成分，并將靈芝多糖大分子有效地降解，從而提高分子量在6000-50000之間的活性靈芝多糖的含量，是亟待解決的一個(gè)問題。
目前，國內(nèi)外相關(guān)研究主要集中在靈芝多糖的純化提取和功能性研究方面。而以酶法特別是通過菌絲體自身酶系和外加酶系處理發(fā)酵液(含菌絲體)，用以提高活性靈芝多糖含量的研究尚無報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種酶解制備靈芝多糖的方法。通過對(duì)靈芝真菌發(fā)酵液(含菌絲體)的酶法處理，有效地提高活性靈芝多糖的含量。
本發(fā)明酶解制備靈芝多糖的方法概述如下(1)發(fā)酵液的獲得采用斜面菌種逐級(jí)擴(kuò)培獲得靈芝真菌液體深層發(fā)酵液；(2)菌絲體自身酶系酶解調(diào)節(jié)步驟(1)得到的含有菌絲體的發(fā)酵液，使其pH為5～7，在30～70℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間30～100分鐘，攪拌速度10～100轉(zhuǎn)/分；(3)外加酶酶解將步驟(2)中得到的發(fā)酵液分別調(diào)整溫度和pH，使溫度為30～65℃，pH為5～7，發(fā)酵液中加入混合酶，混合酶與發(fā)酵液的重量百分比為0.03～0.05％，混合酶按重量百分比組成為纖維素酶5～95％、β-葡聚糖酶5～80％、果膠酶0～70％、中性蛋白酶0～70％，酶解時(shí)間0.3～8小時(shí)，酶解過程中開啟攪拌，攪拌速度10～100轉(zhuǎn)/分；(4)滅酶酶控制反應(yīng)結(jié)束后，將發(fā)酵液升溫到90～100℃，保持10～30分鐘，進(jìn)行滅酶；(5)過濾酶處理工藝結(jié)束之后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行固液分離，可選用的設(shè)備有板框式壓濾機(jī)或離心機(jī)等；
(6)濃縮將濾液濃縮至原體積的1/5～1/10，濃縮所用方法可以是單效、多效真空濃縮和冷凍濃縮；(7)醇沉向濃縮濾液中加入70～100％的乙醇進(jìn)行醇沉，其體積比為1∶3～4；(8)離心分離沉淀物為靈芝多糖。
在菌絲體自身酶系酶解步驟中以pH 5.5～6為宜，酶解溫度最好選45～50℃，酶解時(shí)間最好選60～70分鐘，攪拌速度最好選20～60轉(zhuǎn)/分。
在外加酶酶解步驟中加入混合酶的溫度以50～55℃為宜，pH最好選5.5～6，酶解時(shí)間最好選2～2.5小時(shí)，攪拌速度最好選20～50轉(zhuǎn)/分。
本發(fā)明中靈芝真菌液體深層發(fā)酵液的培養(yǎng)見徐錦堂編《中國藥用真菌學(xué)》。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明在培養(yǎng)得到的靈芝真菌發(fā)酵液的基礎(chǔ)上，巧妙地利用菌絲體自身酶系和外加的混合酶在適宜的條件下對(duì)真菌發(fā)酵液進(jìn)行酶解，酶解后粗產(chǎn)品靈芝多糖中靈芝多糖含量為35-60％。靈芝多糖中分子量在6000-50000之間的活性靈芝多糖占70-90％。粗靈芝多糖產(chǎn)量可以達(dá)到10-17.5公斤/噸發(fā)酵液。
本發(fā)明適用于各種規(guī)模深層發(fā)酵法培養(yǎng)靈芝發(fā)酵液并采用酶法制備靈芝多糖的生產(chǎn)。


圖1為葡聚糖凝膠層析測定方法中的藍(lán)色葡聚糖洗脫曲線；圖2為葡聚糖凝膠層析測定方法中的洗脫特征標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例110噸發(fā)酵液靈芝多糖酶處理方法(1)采用斜面菌種逐級(jí)擴(kuò)培獲得靈芝液體深層發(fā)酵液將靈芝斜面菌種接入裝有100毫升培養(yǎng)基的500毫升搖瓶中進(jìn)行一級(jí)種子培養(yǎng)，培養(yǎng)條件旋轉(zhuǎn)式搖床150轉(zhuǎn)/分，28℃培養(yǎng)50小時(shí)。然后將一級(jí)搖瓶種子以10％接種量接入裝有100毫升培養(yǎng)基的500毫升搖瓶中進(jìn)行二級(jí)種子培養(yǎng)，按照與一級(jí)搖瓶相同的條件進(jìn)行培養(yǎng)。然后再以10％的接種量將二級(jí)種子轉(zhuǎn)接入裝有1000毫升培養(yǎng)基的5000毫升搖瓶中進(jìn)行三級(jí)種子培養(yǎng)，培養(yǎng)條件旋轉(zhuǎn)式搖床180轉(zhuǎn)/分，28℃培養(yǎng)50小時(shí)。然后再以10％的接種量把三級(jí)種子接入裝有0.1噸發(fā)酵培養(yǎng)基的總?cè)莘e為0.15噸的一級(jí)種子罐。培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度150轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量(V/V)1∶0.5，罐壓0.05Mpa，培養(yǎng)48小時(shí)。同樣將一級(jí)種子罐的菌液以10％的接種量轉(zhuǎn)接入裝有1噸發(fā)酵培養(yǎng)基的總?cè)莘e為1.5噸二級(jí)種子罐中，二級(jí)種子罐與一級(jí)種子罐的培養(yǎng)條件相同。最后以10％的接種量將二級(jí)種子罐種子接入裝有10噸發(fā)酵培養(yǎng)基的總?cè)莘e為15噸的發(fā)酵罐中。發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量(V/V)1∶0.5，罐壓0.05Mpa，培養(yǎng)120小時(shí)。
(2)菌絲體自身酶系酶解發(fā)酵液達(dá)到放罐標(biāo)準(zhǔn)后用蒸氣將發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵液升溫到50℃，用10％NaOH調(diào)節(jié)PH到6.0，借助靈芝菌絲體自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間60分鐘，攪拌速度30轉(zhuǎn)/分；(3)外加酶酶解在55℃，pH為6的條件下，向經(jīng)步驟(2)得到的10噸發(fā)酵液中加入纖維素酶2.5公斤，β-葡聚糖酶1公斤，果膠酶1公斤，中性蛋白酶0.5公斤，酶解時(shí)間3小時(shí)，酶解過程中開啟攪拌，攪拌速度30轉(zhuǎn)/分；(4)滅酶外加酶酶解結(jié)束后，將發(fā)酵液升溫到95℃，30分鐘，進(jìn)行滅酶；(5)過濾將發(fā)酵液進(jìn)行板框壓濾，收集濾液；(6)濃縮減壓濃縮濾液體積到1噸；(7)醇沉加入3.8噸95％的乙醇，醇析12小時(shí)；(8)離心分離采用臥式離心機(jī)3500rpm離心60分鐘，用蒸餾水溶解沉淀，后經(jīng)真空干燥工藝制備，獲得粗靈芝多糖干粉110公斤。其中靈芝多糖含量為45％，活性靈芝多糖(分子量在6000-50000)占靈芝多糖的80％，比例見表1。
本發(fā)明中靈芝菌種購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌號(hào)CICC 14005。
本例中斜面培養(yǎng)基組成馬鈴薯(煮汁)20％，葡萄糖2％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.15％，瓊脂2.0％。
本例中各級(jí)種子和發(fā)酵生產(chǎn)所用培養(yǎng)基組成為蔗糖4％，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，脫脂大豆蛋白粉2.0％，磷酸氫二鉀0.2％，硫酸鎂0.1％，維生素B12PPm，PH6.0。
本例中用苯酚硫酸法測定靈芝多糖含量，測定方法如下精確量取樣品1克，置100毫升容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，然后再取1毫升加入100毫升容量瓶用蒸餾水定容至刻度。吸取1毫升稀釋液置10毫升量瓶中并補(bǔ)加水至2毫升，精密加入5％苯酚試液1毫升混勻，迅速加入硫酸5.0毫升，振搖5分鐘，置水浴100℃中放置15分鐘后，于冷水中冷卻30分鐘，加水至刻度，搖勻，在490納米波長處測定吸收度，同時(shí)做空白對(duì)照。
按照公式計(jì)算多糖含量。
P＝(0.289x-0.0131)*d*f/(1000*W)*100。
x是吸光值d供試樣品溶液的稀釋因子，f為換算系數(shù)0.9，W為樣品重量，P為樣品中多糖含量。
本例中用葡聚糖凝膠層析法測定靈芝多糖分子量，測定方法如下凝膠層析柱經(jīng)平衡后，待洗脫液流至床面以下1-2毫米時(shí)，關(guān)閉出口，用加樣器吸取一定量(約0.3毫升)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，自加樣口加至床表面，打開出口，安裝接受管，待標(biāo)液透入床內(nèi)，小心加入適量洗脫液，接上恒壓洗脫瓶，開始層析，并分部收集，每管收集3毫升，流速0.5毫升/分鐘。從每管中吸取0.5毫升，以苯酚硫酸法測定。以吸光值對(duì)收集管數(shù)作圖得葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品洗脫曲線(見圖1)，從而得到洗脫體積Ve。同樣以藍(lán)色葡聚糖測外水體積Vo，最后以Ve/Vo對(duì)分子量的對(duì)數(shù)繪制特征標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)。典型的洗脫特征標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝-0.95X+5.84。
稱取多糖提取物樣品1g，以熱洗脫液溶解，保溫0.5小時(shí)，冷卻定容到50毫升(一定體積)。取上清液0.3-0.5毫升上層析柱進(jìn)行層析分離，求得洗脫體積Ve，然后以Ve/Vo值查洗脫特征標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出分子量。對(duì)不同分子量范圍的多糖采用苯酚-硫酸法測定其多糖含量。
表1靈芝多糖中活性靈芝多糖分子量分布及比例

實(shí)施例2(發(fā)酵液10噸)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為5.5，在45℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解70分鐘，攪拌速度40轉(zhuǎn)/分；在外加酶酶解過程中，在50℃，pH為5.5的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶0.15公斤、β-葡聚糖酶1.2公斤、果膠酶0.9公斤、中性蛋白酶0.75公斤，酶解時(shí)間2小時(shí)，攪拌速度40轉(zhuǎn)/分；在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到90℃，10分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至2噸；在醇沉過程中，加入6噸70％的乙醇進(jìn)行醇沉。
實(shí)施例3(發(fā)酵液10噸)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為5，在30℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解30分鐘，攪拌速度60轉(zhuǎn)/分；在外加酶酶解過程中，在30℃，pH為6.0的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶0.2公斤、β-葡聚糖酶1.6公斤、果膠酶1.2公斤、中性蛋白酶1公斤，酶解時(shí)間2.5小時(shí)，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到100℃，30分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至1噸；在醇沉過程中，加入4噸100％的乙醇進(jìn)行醇沉。
實(shí)施例4(發(fā)酵液10噸)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為7，在70℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解100分鐘，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分；在外加酶酶解過程中，在65℃，pH為5的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶2.0公斤、β-葡聚糖酶1.0公斤、果膠酶1.5公斤、中性蛋白酶0.5公斤，酶解時(shí)間0.3小時(shí)，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分；
在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到95℃，20分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至1.5噸；在醇沉過程中，加入4.5噸75％的乙醇進(jìn)行醇沉。
實(shí)施例5(發(fā)酵液10噸)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為6，在50℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解65分鐘，攪拌速度10轉(zhuǎn)/分；在外加酶酶解過程中，在50℃，pH為7的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶0.25公斤、β-葡聚糖酶2.0公斤、果膠酶1.5公斤、中性蛋白酶1.25公斤，酶解時(shí)間8小時(shí)，攪拌速度10轉(zhuǎn)/分；在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到95℃，20分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至1.2噸；在醇沉過程中，加入4噸78％的乙醇進(jìn)行醇沉。
實(shí)施例6(發(fā)酵液10噸)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為6，在50℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解65分鐘，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在外加酶酶解過程中，在50℃，pH為6的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶2.85公斤、β-葡聚糖酶0.15公斤，酶解時(shí)間2.5小時(shí)，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到95℃，20分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至1.5噸；在醇沉過程中，加入4.5噸75％的乙醇進(jìn)行醇沉。
實(shí)施例7(發(fā)酵液10噸)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為6，在50℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解65分鐘，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在外加酶酶解過程中，在50℃，pH為6的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶3.8公斤、β-葡聚糖酶0.2公斤，酶解時(shí)間2.5小時(shí)，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到95℃，20分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至1.5噸；在醇沉過程中，加入4.5噸75％的乙醇進(jìn)行醇沉。
實(shí)施例8(發(fā)酵液10噸)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1
在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為6，在50℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解65分鐘，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在外加酶酶解過程中，在50℃，pH為6的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶4.75公斤、β-葡聚糖酶0.25公斤，酶解時(shí)間2.5小時(shí)，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到95℃，20分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至1.5噸；在醇沉過程中，加入4.5噸75％的乙醇進(jìn)行醇沉。
實(shí)施例9(發(fā)酵液10噸)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為6，在50℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解65分鐘，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在外加酶酶解過程中，在50℃，pH為6的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶2.4公斤、β-葡聚糖酶0.3公斤、中性蛋白酶0.3公斤，酶解時(shí)間2.5小時(shí)，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到95℃，20分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至1.5噸；在醇沉過程中，加入4.5噸75％的乙醇進(jìn)行醇沉。
實(shí)施例10(發(fā)酵液10噸)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為6，在50℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解65分鐘，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在外加酶酶解過程中，在50℃，pH為6的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶3.2公斤、β-葡聚糖酶0.4公斤、中性蛋白酶0.4公斤，酶解時(shí)間2.5小時(shí)，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到95℃，20分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至1.5噸；在醇沉過程中，加入4.5噸75％的乙醇進(jìn)行醇沉。
實(shí)施例11(發(fā)酵液10噸)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為6，在50℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解65分鐘，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在外加酶酶解過程中，在50℃，pH為6的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶4公斤、β-葡聚糖酶0.5公斤、中性蛋白酶0.5公斤，酶解時(shí)間2.5小時(shí)，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；
在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到95℃，20分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至1.5噸；在醇沉過程中，加入4.5噸75％的乙醇進(jìn)行醇沉。
實(shí)施例12(發(fā)酵液10噸)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為6，在50℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解65分鐘，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在外加酶酶解過程中，在50℃，pH為6的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶0.3公斤、β-葡聚糖酶2.4公斤、果膠酶0.3公斤，酶解時(shí)間2.5小時(shí)，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到95℃，20分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至1.5噸；在醇沉過程中，加入4.5噸75％的乙醇進(jìn)行醇沉。
實(shí)施例13(發(fā)酵液10噸)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為6，在50℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解65分鐘，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在外加酶酶解過程中，在50℃，pH為6的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶0.4公斤、β-葡聚糖酶3.2公斤、果膠酶0.4公斤，酶解時(shí)間2.5小時(shí)，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到95℃，20分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至1.5噸；在醇沉過程中，加入4.5噸75％的乙醇進(jìn)行醇沉。
實(shí)施例14(發(fā)酵液10噸)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為6，在50℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解65分鐘，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在外加酶酶解過程中，在50℃，pH為6的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶0.5公斤、β-葡聚糖酶4公斤、果膠酶0.5公斤、中性蛋白酶0.32公斤，酶解時(shí)間2.5小時(shí)，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到95℃，20分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至1.5噸；在醇沉過程中，加入4.5噸75％的乙醇進(jìn)行醇沉。
實(shí)施例15(發(fā)酵液10噸)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為6，在50℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解65分鐘，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在外加酶酶解過程中，在50℃，pH為6的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶0.3公斤、β-葡聚糖酶0.3公斤、果膠酶2.1公斤、中性蛋白酶0.3公斤，酶解時(shí)間2.5小時(shí)，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到95℃，20分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至1.5噸；在醇沉過程中，加入4.5噸75％的乙醇進(jìn)行醇沉。
實(shí)施例16(發(fā)酵液10噸)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為7，在60℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解55分鐘，攪拌速度10轉(zhuǎn)/分；在外加酶酶解過程中，在50℃，pH為6的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶0.4公斤、β-葡聚糖酶0.4公斤、果膠酶2.8公斤、中性蛋白酶0.4公斤，酶解時(shí)間2.5小時(shí)，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到95℃，20分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至1.5噸；在醇沉過程中，加入4.5噸75％的乙醇進(jìn)行醇沉。
實(shí)施例17(發(fā)酵液10噸)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為6，在50℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解65分鐘，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在外加酶酶解過程中，在50℃，pH為6的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶0.5公斤、β-葡聚糖酶0.5公斤、果膠酶3.5公斤、中性蛋白酶0.5公斤，酶解時(shí)間2.5小時(shí)，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到95℃，20分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至1.5噸；在醇沉過程中，加入4.5噸75％的乙醇進(jìn)行醇沉。
實(shí)施例18(發(fā)酵液10噸)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為6，在50℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解65分鐘，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；
在外加酶酶解過程中，在50℃，pH為6的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶0.3公斤、β-葡聚糖酶0.3公斤、果膠酶0.3公斤、中性蛋白酶2.1公斤，酶解時(shí)間2.5小時(shí)，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到95℃，20分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至1.5噸；在醇沉過程中，加入4.5噸75％的乙醇進(jìn)行醇沉。
實(shí)施例19(發(fā)酵液10噸)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為7，在50℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解60分鐘，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分；在外加酶酶解過程中，在50℃，pH為6的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶0.4公斤、β-葡聚糖酶0.4公斤、果膠酶0.4公斤、中性蛋白酶2.8公斤，酶解時(shí)間2.5小時(shí)，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到95℃，20分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至1.5噸；在醇沉過程中，加入4.5噸75％的乙醇進(jìn)行醇沉。
實(shí)施例20(10噸發(fā)酵液)一種酶解制備靈芝多糖的方法，它的步驟同實(shí)施例1在菌絲體自身酶系酶解過程中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使其pH為6，在50℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解65分鐘，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在外加酶酶解過程中，在50℃，pH為6的條件下，向發(fā)酵液中加入混合酶纖維素酶0.5公斤、β-葡聚糖酶0.5公斤、果膠酶0.5公斤、中性蛋白酶2.5公斤，酶解時(shí)間2.5小時(shí)，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分；在滅酶過程中，將發(fā)酵液升溫到95℃，20分鐘，進(jìn)行滅酶；在濃縮過程中，將濾液濃縮至1.5噸；在醇沉過程中，加入4.5噸75％的乙醇進(jìn)行醇沉。
權(quán)利要求
1.一種酶解制備靈芝多糖的方法，其特征在于它包括如下步驟(1)發(fā)酵液的獲得采用斜面菌種逐級(jí)擴(kuò)培獲得靈芝液體深層發(fā)酵液；(2)菌絲體自身酶系酶解調(diào)節(jié)步驟(1)得到的含有菌絲體的發(fā)酵液，使其pH為5～7，在30～70℃，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間30～100分鐘，攪拌速度10～100轉(zhuǎn)/分；(3)外加酶酶解在30～65℃，pH為5～7的條件下，向經(jīng)步驟(2)得到的發(fā)酵液中加入混合酶，所述混合酶與發(fā)酵液的重量百分比為0.03～0.05％，所述混合酶按重量百分比包括纖維素酶5～95％、β-葡聚糖酶5～80％、果膠酶0～70％、中性蛋白酶0～70％，酶解時(shí)間0.3～8小時(shí)，酶解過程中開啟攪拌，攪拌速度10～100轉(zhuǎn)/分；(4)滅酶酶控反應(yīng)結(jié)束后，將發(fā)酵液升溫到90～100℃，10～30分鐘，進(jìn)行滅酶；(5)過濾；(6)濃縮將濾液濃縮至原體積的1/5～1/10；(7)醇沉向濃縮濾液中加入70～100％的乙醇進(jìn)行醇沉，其體積比為1∶3～4；(8)離心分離沉淀物為靈芝多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶解制備靈芝多糖的方法，其特征在于所述菌絲體自身酶系酶解步驟中pH為5.5～6，所述酶解溫度為45～50℃，所述酶解時(shí)間為60～70分鐘，所述攪拌速度20～60轉(zhuǎn)/分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶解制備靈芝多糖的方法，其特征在于所述外加酶酶解步驟中加入混合酶的溫度為50～55℃，pH為5.5～6，所述酶解時(shí)間2～2.5小時(shí)，所述攪拌速度20～50轉(zhuǎn)/分。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酶解制備靈芝多糖的方法，它包括如下步驟采用斜面菌種逐級(jí)擴(kuò)培獲得靈芝真菌發(fā)酵液，調(diào)節(jié)含有菌絲體的發(fā)酵液pH值及溫度，借助靈芝菌絲體內(nèi)存在的自身酶系對(duì)發(fā)酵液中的靈芝菌絲體進(jìn)行酶解，再向發(fā)酵液中加入纖維素酶、β－葡聚糖酶、果膠酶及中性蛋白酶，進(jìn)行酶解，再經(jīng)滅酶、過濾、濃縮、醇沉及分離等步驟得到靈芝多糖，本發(fā)明巧妙地利用菌絲體自身酶系和外加的混合酶系在適宜的條件下對(duì)靈芝真菌發(fā)酵液進(jìn)行酶解，酶解后靈芝粗多糖產(chǎn)品中靈芝多糖含量為35－60％，靈芝多糖中分子量在6000－50000之間的活性靈芝多糖占70－90％。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1569903SQ20041001909
公開日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2004年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月28日
發(fā)明者蔡永峰, 程池, 黃宇彤, 岳國海, 李勣 申請(qǐng)人:中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院