專(zhuān)利名稱(chēng)：用絲素蛋白修飾聚羥基酯生物材料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用絲素蛋白修飾聚羥基酯生物材料的方法。屬于生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用的聚羥基酯材料的改性技術(shù)。
組織工程是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，研究和開(kāi)發(fā)、修復(fù)和改善損傷組織和功能的生物替代物的一門(mén)科學(xué)，它是在組織水平上操作的生物工程，主要致力于組織和器官的形成和再生。生物材料在組織工程中作為三維支架，起著如下三個(gè)主要作用一、限定和釋放細(xì)胞到體內(nèi)特定位置；二、維持和提供新組織形成的三維空間及組織結(jié)構(gòu)形狀；三、引導(dǎo)和發(fā)展具有適當(dāng)功能的新組織[Kim B S,Mooney D J.Development of biocompatible synthticextracellular matrices for tissue engineering.Trends Biotechnol.,1998；16:224-230]。在組織工程領(lǐng)域，用作細(xì)胞外基質(zhì)三維支架材料主要有天然聚合物(諸如膠原、硫酸軟骨素)和合成高聚物兩大類(lèi)。前者具有特異性細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，但卻有力學(xué)性能差，加工過(guò)程中批與批間力學(xué)性能也有較大差異等缺點(diǎn)；而后者具有力學(xué)性能好，降解速率和力學(xué)強(qiáng)度可控等優(yōu)點(diǎn)，但缺乏細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)，植入體內(nèi)易導(dǎo)致排異反應(yīng)。因此，組織工程對(duì)生物材料的要求同時(shí)包括力學(xué)強(qiáng)度和生理響應(yīng)兩個(gè)方面。近三十年來(lái)，合成聚合物生物材料的研究取得了較大發(fā)展，但大多致力于力學(xué)強(qiáng)度(模量、柔韌性等)的提高和降解速率的可控性方面，卻忽略了生物材料的生理響應(yīng)，因而能用于臨床的合成材料甚少[A.Maureen Rouhi.Contempory Biomaterials,Understanding surfaces is the key to the design of clinically useful materials.Chemical EngineeringNews.1999；77(3):51-59]。聚羥基酯類(lèi)合成材料，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)等，是美國(guó)FDA批準(zhǔn)的少數(shù)用于臨床的合成生物材料，但他們?nèi)匀狈?xì)胞結(jié)合位點(diǎn)。因此，如何調(diào)控生物材料/細(xì)胞相互作用以產(chǎn)生期望的生理響應(yīng)是生物材料研究的重要前提，也是組織工程面臨的挑戰(zhàn)之一[David Puleo,Key C Dee,Rena Bizios.Current challenges in cell-biomaterial interactions.Biomaterials,1999；20:220l]。
生物材料的表面修飾提供了一條既不影響基材力學(xué)強(qiáng)度而又能改善合成材料缺乏細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的途徑。本發(fā)明以不同分子量的絲素蛋白(分子量約為1×104,3×104及10×104，分另記為SF-1,SF-3和SF-10)修飾聚羥基酯材料表面，達(dá)到了改善材料表面親/疏水平衡，提高其生物相容性的目的。絲素蛋白是源于蠶絲的一種蛋白，富含丙氨酸-甘氨酸(Ala-Gly)等氨基酸序列。Matteo等證實(shí)，絲素蛋白僅具有有限的炎癥響應(yīng)[Matteo S,Antonella M.,Giuliano F and Mario C.In vitro evaluation of the inflammatory potential of the silk fibroin.J.Biomed.Mater.Res.,1999；46(3):382-389]。曾有人報(bào)道以絲素蛋白、明膠和殼聚糖三元復(fù)合物涂覆纖維來(lái)作為細(xì)胞載體[Kimura et al,Nonwowen fabric coated with a mixture of silk fibroin,gelatin and insolubilized chitosan for use as a carrier for animal cells,US Patent 5,385,836]。Minoura等研究了聚乙二醇－絲素蛋白配合體與L-929細(xì)胞的相互作用[Yohko G.,Masuhiro T,Norhiko M,Yohji I.Synthesis of poly(ethylene glycol)-silk fibroi conjugates and surface interactionbetween L-929 cells andthe conjugates.Biomaterials,1997；18(3):267-271]。但都尚未涉及用絲素蛋白來(lái)修飾聚羥基酯生物材料表面。本發(fā)明在未改變聚羥基酯材料力學(xué)性能的前提下，以絲素蛋白修飾聚羥基酯材料表面，引入了細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)，改變了其與細(xì)胞接觸的界面相互作用。本發(fā)明在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，絲素蛋白用于修飾聚羥基酯材料，能提高成骨細(xì)胞的粘附、增殖和分化功能，為骨組織工程的研究提供了光明的前景。
本發(fā)明的目的在于提供一種用絲素蛋白修飾聚羥基酯生物材料的方法。依該方法修飾后聚羥基酯生物材料，與聚羥基酯材料比較，不但改善了材料的親/疏水平衡性，而且提高了材料的表面的細(xì)胞親和性，從而能促進(jìn)骨細(xì)胞的生長(zhǎng)。
為達(dá)到上述目上的，本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的。以聚乳酸溶液為原料制備聚乳酸薄膜，薄膜經(jīng)水解處理及膜表面的羧基活化處理后，將膜浸入絲素蛋白溶液中，最后經(jīng)過(guò)水洗、干燥密封、滅菌制得絲素蛋白修飾的聚羥基酯生物材料，其特征在于，聚乳酸溶液為2-10％mol/L，水解處理是采用0.5-2.0mol/L的NaOH，在30-55℃下水解0.5-2小時(shí)，活化劑采用0.05-2％(w/v)的水溶性碳二亞胺水溶液，絲素蛋白水溶液為4-8wt％，在4-20℃浸泡時(shí)間為24-96小時(shí)。
本發(fā)明修飾的聚羥基酯生物材料，不但保持了原聚羥基酯材料的良好力學(xué)強(qiáng)度。而且有效地改善了聚羥基酯材料表面的親水/疏水平衡，明顯提高了材料的表面與生物(細(xì)胞)的親和性，特別有利于成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)。
下面以實(shí)施例對(duì)本發(fā)明加以進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例一配制5％的聚乳酸溶液以蒸發(fā)法制備聚乳酸薄膜，以1.0mol/L的NaOH在50℃下水解1小時(shí)，用稀酸沖洗調(diào)pH值為中性后，再以去離子水沖洗5次備用。將水解后的聚乳酸薄膜浸入0.1％(w/v)的水溶性碳二亞胺溶液中，并調(diào)pH值至4.65，在4℃下活化聚乳酸薄膜表面的羧基24小時(shí)。以去離子水沖洗10次后，將表面羧基已被活化的聚乳酸薄膜浸入6(wt)％絲素蛋白水溶液，在4℃下浸泡48小時(shí)進(jìn)行固定化反應(yīng)。固定反應(yīng)結(jié)束后，以蒸餾水沖洗5次，在37℃下真空干燥。干燥后的聚乳酸薄膜取出后用聚乙烯薄膜密封，再以Co60射線照射，累計(jì)1.5Mrad劑量的輻射以達(dá)到滅菌的目的，備用。
實(shí)施例二配制8％的聚乳酸溶液以蒸發(fā)法制備聚乳酸薄膜，以1.0mol/L的NaOH在45℃下水解1.5小時(shí)，用稀酸沖洗調(diào)pH值為中性后，再以去離子水沖洗5次備用。將水解后的聚乳酸薄膜浸入0.5％(w/v)的水溶性碳二亞胺溶液中，并調(diào)pH值至5，在4℃下活化聚乳酸薄膜表面的羧基48小時(shí)。以去離子水沖洗10次后，將表面羧基已被活化的聚乳酸薄膜浸入6(wt)％絲素蛋白水溶液，在4℃下浸泡48小時(shí)進(jìn)行固定化反應(yīng)。固定反應(yīng)結(jié)束后，以蒸餾水沖洗5次，在37℃下真空干燥。干燥后的聚乳酸薄膜取出后用聚乙烯薄膜密封，再以Co60射線照射，累計(jì)1.5Mrad劑量的輻射以達(dá)到滅菌的目的，備用。
實(shí)施例三配制10％的聚乳酸溶液以蒸發(fā)法制備聚乳酸薄膜，以1.0mol/L的NaOH在40℃下水解2小時(shí)，用稀酸沖洗調(diào)pH值為中性后，再以去離子水沖洗5次備用。將水解后的聚乳酸薄膜浸入0.1％(w/v)的水溶性碳二亞胺溶液中，并調(diào)pH值至5.5，在20℃下活化聚乳酸薄膜表面的羧基36小時(shí)。以去離子水沖洗10次后，將表面羧基已被活化的聚乳酸薄膜浸入4(wt)％絲素蛋白水溶液，在4℃下浸泡72小時(shí)進(jìn)行固定化反應(yīng)。固定反應(yīng)結(jié)束后，以蒸餾水沖洗5次，在37℃下真空干燥。干燥后的聚乳酸薄膜取出后用聚乙烯薄膜密封，再以Co60射線照射，累計(jì)1.0Mrad劑量的輻射以達(dá)到滅菌的目的，備用。
下面以圖表通過(guò)對(duì)比手段看本發(fā)明的積極效果。圖表1所示是細(xì)胞粘附情況，反映了細(xì)胞和生物材料表面接觸的短期細(xì)胞行為，以絲素蛋白修飾后的聚乳酸更有利于細(xì)胞粘附，和未修飾的聚乳酸(參照組Control)相比有顯著差異性(P＜0.05)(星號(hào)所示)，圖表2表示細(xì)胞接種在材料表面的增殖行為，結(jié)果顯示SF-3修飾的聚乳酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用(星號(hào)所示)，圖表3反映了細(xì)胞活力情況，同樣是SF-3修飾的聚乳酸能大大提高細(xì)胞活力(P＜0.01)，圖表4表示細(xì)胞分化功能，同未修飾的聚乳酸相比，SF-1和SF-3修飾后的聚乳酸都能提高細(xì)胞的分化功能。
權(quán)利要求
1．一種用絲素蛋白修飾聚羥基酯生物材料的方法，它是以聚乳酸溶液為原料制備聚乳酸薄膜，薄膜經(jīng)水解處理及膜表面的羧基活化處理后，將膜浸入絲素蛋白溶液中，最后經(jīng)過(guò)水洗、干燥密封、滅菌制得絲素蛋白修飾的聚羥基酯生物材料，其特征在于聚乳酸溶液為2-10％mol/L，水解處理是采用0.5-2.0mol/L的NaOH，在30-55℃下水解0.5-2小時(shí)，活化劑采用0.05-2％(w/v)的水溶性碳二亞胺水溶液，絲素蛋白水溶液為4-8wt％，在4-20℃浸泡時(shí)間為24-96小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用絲素蛋白修飾聚羥基酯材料的方法。以水溶性碳二亞胺(WSC)將絲素蛋白固定在聚羥基酯材料表面,實(shí)現(xiàn)對(duì)其表面修飾。該應(yīng)用改進(jìn)了聚羥基酯材料表面的親/疏水平衡,同時(shí)引入了與細(xì)胞特異生相互作用位點(diǎn),提高了聚羥基酯材料的細(xì)胞親和性。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了絲素蛋白用于聚羥基酯材料表面修飾能促進(jìn)細(xì)胞粘附、擴(kuò)展、增殖和分化等功能。
文檔編號(hào)C08G63/00GK1302825SQ0110005
公開(kāi)日2001年7月11日 申請(qǐng)日期2001年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月8日
發(fā)明者姚康德, 蔡開(kāi)勇 申請(qǐng)人:天津大學(xué)