專利名稱：抑制受磷蛋白活性以治療心臟病和心力衰竭的方法
本申請申明享有于1998年11月2日登記的美國專利臨時申請No.60/106,718和于1999年7月27日登記的美國專利臨時申請No.60/145,883的優(yōu)先權，本文將它們全部納入作為參考。
背景技術：
發(fā)明領域本發(fā)明主要涉及治療心力衰竭的方法，具體的說涉及抑制受磷蛋白(PLB)活性來治療心肌功能紊亂。
背景信息在美國和其他發(fā)達國家中心力衰竭是導致發(fā)病率和死亡率的主要原因。充血性心力衰竭的特點是心臟收縮減少和舒張遲緩，然而充血性心力衰竭病理生理學途徑的基本分子機制很大程度上還是未知的。當今治療心臟病的方法主要是姑息性的，并沒有針對被認為導致心肌紊亂發(fā)作和發(fā)展的基本生物途徑。
心肌衰竭是一種復雜的、綜合的、多因素疾病，其中賦予易感性的遺傳學途徑與伴隨心臟損傷、壓力和血量超負荷的生物力學應力的環(huán)境刺激以及細胞骨架成分的遺傳性缺陷相交織。在對生物力學應力的反應中，一系列平行和匯聚的信號傳遞途徑被激活，導致代償性肥大的適應性反應。隨后，就可能發(fā)生心室擴張和泵功能衰竭(與活的心肌細胞損失相關)的轉變、收縮成分的減少、肌絲紊亂和間質纖維化。
最近，觸發(fā)編程性細胞死亡發(fā)作的信號轉導途徑的激活已意味著將促進心力衰竭病理轉變以及gp130依賴性心肌細胞存活途徑(可阻斷細胞凋亡途徑的活化并防止心力衰竭和心肌痛的早期發(fā)作)。除了這些心肌細胞適應的外來與應力相關的途徑外，還必定存在內在的信號傳遞途徑，它導致心臟興奮收縮(EC)偶聯(lián)的損傷和相關的心臟收縮性能的嚴重缺陷(這是心力衰竭表型發(fā)展的臨床標志)。
肌質網(wǎng)(SR)在協(xié)調胞質(cytostolic)Ca2+通過心臟組織的移動中起著整合作用。在由Mercadier等人(J.Clin.Invest.，1990；85305-309)、Arai等人(Circ.Res.，1993；72463-469)、de la Bastie等人(Circ.Res.，1990；66554-564)和Feldman等人(Circ.Res.，1993；73184-192)獨立的研究中，對人衰竭的心臟和心力衰竭的動物模型研究表明SR減少攝取胞質Ca2+導致心臟舒張延長。SR中儲存的Ca2+釋放入胞質液激活心肌收縮，隨著Ca2+的再累積致使舒張。心臟SR的Ca2+ATP酶(SERCA2a)的活性是Ca2+再攝入SR的速率決定因素，且SERCA2a活性本身受到受磷蛋白(一種52-氨基酸的心肌特異性SR磷蛋白)的調節(jié)。
在Tada等人(J.Biol.I Chem.，1974；2496174-6180)的研究中首先鑒定出受磷蛋白(PLB)是SR膜中磷酸化的主要目標，且看來在其未磷酸化的形式時為SERCA2a活性的強抑制劑。細胞內鈣的增加或PLB的磷酸化(在對β-腎上腺素能刺激的反應中)將降低PLB對SERCA2a的抑制作用。PLB主要以五聚體形式存在，當處于高溫時，會分離成五個相等的單體。
可將單體PLB的氨基酸分成三個物理和功能域。在α-螺旋中富含Ia和II結構域，與結構較簡單的Ib結構域相連。Ia結構域由氨基酸1-20構成的，這些氨基酸的大多數(shù)呈α-螺旋構型，帶有凈正電荷。Ib結構域由21-30氨基酸殘基構成，并構成該單體的胞漿部分。結構域II由氨基酸31-52構成，代表跨膜部分，只由不帶電荷的、負責穩(wěn)定五聚體形成的殘基構成。
PLB是兒茶酚胺通過cAMP級聯(lián)系統(tǒng)(cascade)調節(jié)心肌功能中的一種介質。在Ia結構域中的Ser(16)和Thr(17)分別是cAMP-依賴性蛋白激酶(PKA)和Ca/鈣調蛋白-依賴性蛋白激酶的確認的結合位點，其功能是催化PLB磷酯的磷酸化，進而解除PLB對SERCA2a活性的抑制作用。由于Ser(16)和Thr(17)可以被激酶磷酸化，此二氨基酸的凈電荷可從陽性轉變成中性，甚至陰性。與帶電荷的SERCA2a殘基一起，PLB的Ia結構域中電荷的這種轉變可導致PLB-SERCA2a系統(tǒng)中蛋白質-蛋白質相互作用的深刻變化。II結構域也含有一些對PLB功能表達起關鍵作用的氨基酸，因此在II結構域螺旋一面的這些氨基酸與SERCA2a的跨膜區(qū)域相結合。
PLB調節(jié)Ca2+-ATP酶的活性有兩種途徑1)迅速起作用的短期機制，包括PLB磷酸化和鈣泵活性的抑制，和2)緩慢起作用的但長期過程，包括通過控制基因表達引起PLB與Ca2+-ATP酶分子比例的變化。在生理條件下，PKA在Ser(16)上的磷酸化是導致Ca2+攝入SR的速度成比例增加和加速心室松弛的主要事件。PLB與SERCA2a相對比例的增加在試驗性和人心力衰竭中是SR功能紊亂的重要決定因素。另外，PKA對PLB磷酸化的減弱可能導致心衰心臟舒張功能損傷和Ca2+瞬間轉移的延長，由此β-腎上腺素能受體-cAMP系統(tǒng)活動受到增強的交感神經(jīng)緊張性(sympathetic tone)的嚴重下調。
Toyofuku等人(J.Biol.chem.，1994；2693088-3094)對誘變的詳盡研究表明，PLB胞漿區(qū)域的幾個氨基酸對其抑制功能非常重要。該研究顯示當某些氨基酸突變成帶不同電荷的氨基酸時，在HEK293細胞中PLB突變體喪失了它們對共轉染的SERCA2的抑制作用。然而，攜帶這些突變的PLB是否能對內源性野生型PLB起支配性負作用并隨后刺激心肌細胞中的內源性SERCA2a仍不清楚。另外，不清楚如何將這些PLB點突變轉移入心肌細胞缺口胞質膜屏障以影響內源性SERCA2a活性的機制。
Arber等人(Cell，88393-403；1997)的擴張心肌病的基因工程小鼠模型提供了如下證據(jù)心室擴張和心力衰竭的發(fā)展取決于心肌質網(wǎng)中特異性Ca2+循環(huán)缺陷。在小鼠模型中，除去受磷蛋白(PLB)拯救了類似心力衰竭的結構、功能和分子表型譜。另外，通過PLB點突變被動的體內過量表達解放的受磷蛋白-SERCA2a相互作用，主要激活心室肌細胞的收縮能力。所以，干擾PLB-SERCA2a相互作用可能為預防心力衰竭提供一種新型的治療方法。
因此可理解干擾PLB-SERCA2a相互作用可作為治療心力衰竭的潛在治療目標，但活心肌細胞內化外源分子以提高心肌收縮力仍舊是未解決的課題。必須有一種方法將治療劑直接輸送到心肌細胞的細胞質和細胞核中。滲透素(penetratin)是一類具有輸送特性的肽，具有攜帶親水性化合物透過質膜的能力。Schwarze等人的研究(Science 2851569-1572；1999)證明了一種用滲透素為基礎(penetratin-based)的融合蛋白進行蛋白質轉導的方法，該融合蛋白具有變性HIV TAT蛋白質的NH2-端11-氨基酸的蛋白質轉導區(qū)域(Genebank Accession No.AFO33819)。用這種非細胞類型的特異性轉移系統(tǒng)能將寡肽和寡核苷酸直接靶向細胞質和細胞核。一種最具有優(yōu)良轉運特征的肽是相應于果蠅轉錄因子蛋白(antennapedia)43到58殘基(一種果蠅轉錄因子)的肽。據(jù)信此轉運肽與細胞膜外側帶電荷磷脂相互反應。該雙層的不穩(wěn)定導致形成了含有此肽的反向微膠粒，其穿過細胞膜并最終到細胞質一側展開。雖然用轉運肽將“貨物”分子移入細胞并非新發(fā)現(xiàn)的，但至今未證實轉運肽能否在心肌細胞中很好運作。
所以依舊需要一種方法通過利用PLB的突變體或小分子抑制劑抑制PLB，以操縱心肌細胞中PLB/SERCA2a的相互作用，以及將這些PLB突變體或小分子抑制劑轉運穿過肌質網(wǎng)膜屏障進入心肌細胞的細胞質的方法，來治療心臟病和心力衰竭。本發(fā)明滿足了這種需要并且還提供了相關的優(yōu)點。
發(fā)明概述本發(fā)明的優(yōu)點是提供了一種通過抑制受磷蛋白對心臟組織攝入Ca2+的作用，治療心力衰竭的方法。
本發(fā)明的另一優(yōu)點是提供短肽復合物和重組蛋白，它們的作用是抑制心肌細胞中受磷蛋白和肌質網(wǎng)Ca2+ATP酶(SERCA2a)之間的相互作用，而提高受損心臟的收縮能力和降低高血壓個體的血壓。
本發(fā)明的另一優(yōu)點是提供由共價連接于野生型、突變型或截短的PLB的轉運肽組成的一類化合物。
在本發(fā)明的第一個示范性實施例中，將重組腺病毒工程改造成強制表達野生型或突變型PLB，其具有選擇性阻斷PLB和SERCA2a之間正常抑制性相互作用的能力，從而大大激活了心臟收縮能力。
在本發(fā)明的第二個示范性實施例中，收縮蛋白(contractilin)，即一種PLB的重組腺病毒突變體(K3E/R14E)，結合于受磷蛋白并模仿受磷蛋白的磷酸化。這導致肌質網(wǎng)鈣泵的激活，從而增加了心臟的收縮能力。
在本發(fā)明的第三個示范性實施例中，以受體依賴性方式，將由融合的1)16-殘基的轉運肽和2)截短的受磷蛋白或類似的肽構成的化合物運輸過細胞膜。一旦進入心肌細胞的細胞質內側，截短的受磷蛋白或類似的肽將作為內源性受磷蛋白的競爭性抑制劑與SERCA2a相互作用。
附圖簡述

圖1是心力衰竭發(fā)展中PLB-SERCA2a相互作用工作模式的說明圖。
圖2顯示了對DKO小鼠(a-d)體內心臟紊亂拯救的血液動力學分析和β-腎上腺素能對進行性輸入多巴酚丁胺(e-h)反應的血液動力學評估，其中圖2a顯示了LV壓力的最大一階導數(shù)(LV dP/dtmax)圖。圖2b顯示了LV壓力的最小一階導數(shù)(LV dP/dtmax)圖。圖2c顯示了LV末期舒張壓圖。圖2e顯示了LV壓力最大一階導數(shù)(LV dP/dtmax)圖。圖2f顯示了LV壓力最小一階導數(shù)(LV dP/dtmin)圖。圖2g顯示了LV末期舒張壓圖。圖2h顯示了心率圖。
圖3顯示了分析DKO肌細胞中生理性鈣信號傳遞缺陷得到拯救的數(shù)據(jù)繪圖，其中圖3a是一系列WT、MLPKO和DKO心肌細胞中代表性胞內Ca2+瞬間變化圖。圖3b是Ca2+瞬間變化幅度的柱狀圖。圖3c是心舒張期胞內Ca2+濃度的柱狀圖。圖3d是SR Ca2+含量的柱狀圖。圖3e是MLP缺陷的免疫印跡。
圖4a顯示了在DKO小鼠中拯救心力衰竭表型胚胎基因標記的斑點印跡分析。圖4b是比較野生型、MLPKO和DKO心肌細胞中mRNA相對誘生的柱狀圖。
圖5顯示了對PLB和SERCA2a相互作用的抑制，其中圖5a是顯示心肌細胞長度變化的一系列圖。圖5b是細胞長度變化數(shù)據(jù)的概括。
圖6a是用Western印跡分析了含表達有義PLB(sPLB)、反義PLB(asPLB)、E2A、R14E、S16N、和K3E/R14E抗單克隆PLB的腺病毒轉基因的心肌細胞。圖6b是Western印跡所顯示的PLB、sPLB和K3E/R14E感染細胞的結果。圖6c顯示了PLB感染Sole8細胞的Western印跡分析。
圖7顯示了受表達所指示基因的腺病毒感染的新生大鼠心肌細胞勻漿中攝入的SR Ca2+圖。
圖8顯示了自indo1熒光-心肌細胞的Ca2+瞬間變化得到的數(shù)據(jù)圖。
優(yōu)選實施例詳述為了直接評估Ca2+循環(huán)缺陷在心力衰竭轉變中的作用，通過除去編碼PLB的基因來逆轉肌肉特異性LIM蛋白質(MLP)-缺陷型小鼠的心肌病。在分子、細胞和生理水平上，去除MLP的小鼠表現(xiàn)出許多人類擴張心肌病的表型特征。擴張心肌病晚期的一致特征為心壁應力明顯增加，伴隨有心室壁變薄和心臟收縮能力和舒張降低。由于鈣循環(huán)對心臟舒張和收縮都是非常重要的，控制肌質網(wǎng)攝入和釋放鈣途徑中的缺陷是造成心力衰竭發(fā)展的主要原因。
產(chǎn)生具有PLB缺陷和MLP缺陷的小鼠，其表現(xiàn)出人類心力衰竭特征的所有表型(通常見于MLP單敲除(MLPKO)小鼠)。為了確定這種功能獲益是否與MLPKO小鼠中PLB切除(特異性反映了PLB和SERCA2a之間直接相互作用的喪失)相關聯(lián)，本發(fā)明的申請人在PLB基因中加入點突變，其阻斷了PLB和SERCA2a之間功能性抑制作用。通過產(chǎn)生編碼PLB中點突變的重組腺病毒，證明心力衰竭激動一收縮偶聯(lián)中的進行性缺陷是與PLB對SERCA2a的抑制增強相關的，且將受磷蛋白缺陷導入心臟肥大轉基因模式中結果挽救了心臟功能。這些結果得到以下事實分別支持具有導致心臟特異性過量表達SERCA2a轉基因的MLP-缺陷型小鼠，也表現(xiàn)出心肌病表型的拯救。綜上所述，這些結果提供了明確的證據(jù)肌質網(wǎng)鈣循環(huán)對心力衰竭的發(fā)展至關重要，且指出在心力衰竭發(fā)展中PLB對SERCA2a活性的抑制起著關鍵性調節(jié)作用。所以將PLB準確定為治療的關鍵靶標。
對MLP-PLB敲除(DKO)小鼠的進一步研究表明在心肌病突變的基礎上誘導PLB缺陷，可最大程度刺激心臟收縮。在最大程度β-腎上腺素能刺激后，將基線水平的DKO心臟收縮能力與野生型心臟的收縮能力相比較。結果表明除去了PLB對SR鈣泵功能的強烈抑制后，必然會“超常挽救”心肌病心臟的心臟收縮功能。由于PLB是環(huán)狀AMP-依賴性蛋白激酶A和鈣/鈣調蛋白依賴性激酶磷酸化的直接底物，可通過磷酸化PLB，以cAMP-依賴性刺激調節(jié)心臟收縮能力，從而防止發(fā)生與SERCA2a的抑制性相互作用。
基于PLB磷酸化的此種理論，在PLB-缺陷基礎上“超常挽救”心肌病MLP-缺陷型小鼠至超過正常的水平，可能僅反映去除了心臟收縮功能張力性抑制中的限速步驟(rate limiting step)。Rockman等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA957000-7005；1998)的研究與此理論相一致證明在MLP-缺陷型小鼠中免除β-腎上腺素能脫敏作用，也可能導致顯著拯救擴張的心肌病表型。由于PLB是一種與至少三種調節(jié)成分(cAMP-依賴性蛋白激酶、鈣/鈣調蛋白-依賴性激酶和蛋白質磷酸酶)反應的SR蛋白質，故應確定去除PLB對改進心臟收縮性能的主要作用是否反映PLB與SERCA2a的慢性相互作用，或這種挽救作用是否與PLB和其他已知的或新發(fā)現(xiàn)的心臟蛋白質間的相互作用有關。
采用強制表達野生型和突變型PLB的重組腺病毒，本發(fā)明在PLB中提供了點突變，從而可選擇性阻斷PLB和SERCA2a之間的正常抑制性相互作用，且能夠在無兒茶酚胺時優(yōu)勢激活心室肌細胞的心臟收縮功能。圖1顯示了在DKO小鼠中觀察到的挽救作用的機制。PLB和MLP都是肌肉特異性蛋白質，因此必然有一條肌細胞自主途徑(發(fā)展和挽救表型所需要的)，以對抗促進或抑制心肌細胞存活途徑的外應力信號。由于在蛋白質水平上PLB和MLP不直接反應(這排除了PLB和MLP之間的直接相互作用作為挽救的基礎)，與生化調節(jié)途徑(將PLB調節(jié)途徑與擴張的心肌病發(fā)病相連)相反，這必然是生理性的途徑。如圖1所示，在正常的心臟中，通過SERCA2a活性(將鈣攝入SR，從而維持正常的心臟舒張和降低心壁應力)維持SR-鈣儲備。由此，通過鈣釋放通道，SR釋放鈣導致正常的量子鈣釋放，隨后激活心臟肌絲，引起心肌收縮。因此，SR中Ca2+含量的增加，導致Ca2+釋放的增加和心臟收縮力相應的增加。
SERCA2a的活性受到PLB與SERCA2a直接相互作用的抑制作用的調節(jié)，這種抑制作用可通過輸送β-腎上腺素能刺激后PLB的cAMP-依賴性磷酸化而減輕。在心力衰竭基礎上，由于PLB的抑制作用(由遲鈍的β-腎上腺素能反應性所引起)SERCA2a的功能相對降低。結果PLB較少磷酸化，且通過SERCA2a與PLB的緩慢性相互作用，組成性抑制了SERCA2a，從而與正常水平相比導致SR鈣含量相對減少。鈣儲備的這種減少轉化為通過鈣釋放通道鈣量子釋放的減少，從而導致單個細胞中鈣瞬間變化和體內心臟收縮力的降低。在DKO小鼠中，如圖1所示除去了PLB的抑制作用，從而減輕了該系統(tǒng)中PLB對SR鈣泵的下游抑制作用，從而維持了SR的鈣攝入并降低心壁壓力(至正常水平)。同時這增加了SR鈣含量，從而維持了正常的鈣量子釋放，因而能夠維持心臟的正常收縮和舒張。
敲除肌肉特異性LIM蛋白質和雙敲除小鼠采用含純合的去除兩個獨立肌肉特異性基因的雙敲除(DKO)小鼠模型進行了本發(fā)明的測試。為此目的，將敲除PLB(PLBKO)的小鼠與具有敲除MLP(MLPKO)背景的小鼠(后者具有擴張心肌病體內心力衰竭復合表型的分子、結構和生理特征)交配。將這些小鼠的F3代用于實際試驗，從而在觀察DKO系心臟表型時，消除任何潛在的來自PLBKO或MLPKO系的背景作用。
與年齡和性別相匹配的野生型小鼠(4.60±0.21mg/g，n＝7；p＜0.001)相比，MLPKO小鼠表現(xiàn)出心臟/體重比率明顯增加(6.34±0.22mg/g，n＝8)。DKO小鼠的心臟/體重比率(5.13±0.19mg/g，n＝9)顯著小于MLPKO小鼠的(p＜0.01)，而與野生型的無統(tǒng)計學差異。為了評價DKO小鼠心臟重量的減少是否與MLPKO小鼠中所見的細胞骨架表型遭破壞的改善有關，對MLPKO和DKO同窩出生的仔鼠(littermate)心臟進行了電子顯微鏡分析。在MLP-/-背景中去除PLB能挽救最初見于MLP缺陷型心臟中的超微結構缺陷的寬頻譜(包括肌原纖維紊亂和塊狀纖維化)。這些數(shù)據(jù)表明去除PLB不僅防止了心臟總重的增加，還防止了MLPKO心肌病小鼠中心肌細胞結構的破壞和纖維化。
為了評估在DKO小鼠中是否挽救了體內所見全心臟功能的顯著減少，用年齡匹配的同窩出生的仔鼠進行超聲波心動描計。如表1所示，在DKO小鼠中證明防止了心室擴張。左心室舒張末期尺寸(LVEDD)和收縮末期尺寸(LVESD)增加顯示MLPKO小鼠具有增大的心室，而DKO小鼠心室的LVEDD在正常范圍。圍繞纖維縮短的平均速度(平均Vcf)和組分縮短的百分比(％FS)(收縮期心臟功能的標志)在年齡匹配的DKO同窩出生的仔鼠中有所改善(如表1所示)。與非同窩出生的野生型小鼠(作為對照)相比，DKO小鼠中大部分超聲波心動描計數(shù)據(jù)與野生型小鼠的那些類似，雖然DKO小鼠中％FS略有減少。另外，6月齡后，DKO小鼠的心臟功能保持在正常范圍內(n＝2)。除了心室擴張減少外，DKO心臟看起來有些肥大。在DKO小鼠中LVEDD與LV后壁厚度的比值明顯降低，表明與MLPKO或野生型小鼠相比DKO小鼠的心壁應力減少。這些結果表明DKO小鼠的全心臟功能保持在與對照心臟的參數(shù)相當?shù)姆秶鷥?。應指出與MLPKO和DKO小鼠相比，PLB缺陷的雜合小鼠表現(xiàn)出功能恢復至中間水平，提示部分去除PLB可明顯改善MLPKO小鼠心力衰竭表型的功能。
表1超聲波心動描計評估
MLPKO對MLPKO/PLBhet或DKO或野生型；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001野生型對MLPKO/PLBhet或DKO；p＜0.05，p＜0.01，§p＜0.001MLPKO/PLBhet對DKO#p＜0.05已證明MLPKO小鼠的β-腎上腺素能反應性顯著遲鈍且腺苷酸環(huán)化酶活性降低。在小鼠中通過同源重組而去除PLB能增強心臟收縮性能達到與正常心臟用最大β-腎上腺素刺激時相當?shù)乃健榱俗C明去除PLB能逆轉血液動力學缺陷和標記的β-腎上腺素能受體脫敏作用(與擴張心肌病相關的)，心導管檢查和評估了麻醉的小鼠。
幾個獨立的血液動力學參數(shù)證明在DKO小鼠中用循環(huán)性充血將嚴重心臟紊亂恢復到正常水平。在基線水平上LV收縮力(由LV dP/dtmax評估)和舒張(由LVdP/dtmin評估)看來比野生型小鼠的高，比得上PLBKO小鼠(如圖2a和2b所示)。在MLPKO心肌病小鼠中觀察到去除PLB逆轉了LV舒張末期壓的明顯提高(如圖2c所示)。
圖2d的分析表明在DKO小鼠中Tau(LV松弛和舒張功能的標志)也正?；?，其與心壁應力的改善相一致。這些數(shù)據(jù)提示在心肌病MLPKO小鼠中去除PLB可挽救收縮和舒張紊亂。在MLPKO小鼠中所見的LV dP/dtmax和LV dP/dtmin對β-腎上腺素能刺激的遲鈍反應(如圖2e和2f所示)表明在MLPKO小鼠中存在著嚴重的β-腎上腺素能脫敏作用。在DKO小鼠中多巴酚丁胺對心臟收縮(LV dP/dtmax)和馳張(LV dP/dtmin)沒有刺激作用(如圖2e和2f所示)。在基礎條件下DKO心臟中這些參數(shù)已被激發(fā)達到它們的最高水平。
用多巴酚丁胺最大刺激野生型心臟后，在無任何兒茶酚胺刺激時，LV dP/dtmax和LV dP/dtmin與DKO小鼠中的這些參數(shù)沒有差異。這一證據(jù)證實PLB和SERCA2a的相互作用抑制了正常和心肌病性心臟的心臟收縮力，且抑制這種相互作用在無兒茶酚胺刺激時可能對心臟發(fā)揮最大功能起顯著作用。圖2h顯示在DKO小鼠和MLPKO小鼠中保持了對多巴酚丁胺的變時性反應性，從而證明β-腎上腺素能反應對心室肌細胞而不是對起博類型細胞的特異性。
為了確定在DKO小鼠中恢復體內心臟功能的機制，評估了幾種Ca2+信號傳遞的獨立參數(shù)。顯然在DKO小鼠中改變Ca2+體內平衡將導致血液動力學變化、胞內Ca2+的瞬間變化和SR中與Ca2+循環(huán)相關的蛋白質的表達。如圖3a-c所示，MLPKO肌細胞表現(xiàn)出Ca2+瞬間變化的幅度與舒張期Ca2+濃度的正常水平相比有所減弱。MLPKO小鼠中衰減速度的略微加速提示在MLPKO小鼠Ca2+攝入末期有代償性機制運作。PLB的去除與Ca2+瞬間變化持續(xù)時間的變短、衰減加速和幅度的保留相關連。圖3d顯示與野生型小鼠相比，MLPKO小鼠中SR Ca2+的含量明顯減少，而在DKO小鼠中卻增加。定量免疫印跡(如圖3e所示)表明MLP缺失與SERCA2a、PLB和集鈣蛋白的蛋白質水平明顯變化不相關，提示與SERCA2a或受磷蛋白蛋白質水平簡單地反射性降低相反，在MLPKO小鼠中Ca2+循環(huán)的缺陷是基于EC偶聯(lián)的功能性損傷而致。
心力衰竭的一個特征是胚胎基因程序的重新活化，其對增加血液動力學負荷的代償性反應可能有貢獻。為了證明DKO小鼠血液動力學改善伴隨有轉錄水平、ANF、α-骨骼肌動蛋白和β-MHC mRNAs表達的改善性變化，檢測了為心力衰竭已建立的胚胎標記。如圖4a和4b所示，MLPKO小鼠的心室表現(xiàn)出ANF增加了26倍，α-骨骼肌動蛋白增加了13倍，β-MHC mRNAs增加了8倍。而DKO小鼠的ANF僅增加了1.9倍，α-骨骼肌動蛋白或β-MHC mRNAs沒有明顯增加。所以，去除PLB大大地抑制了MLPKO小鼠中胚胎基因程序的誘導。
上述研究表明去除PLB能挽救心力衰竭的各個參數(shù)和相關心肌收縮力的缺陷。為了確定這種挽救作用的機制，必須評估PLB和SERCA2a的緩慢性相互作用是否確是正常和肌病心臟心肌收縮力的限制性因素。在最大兒茶酚胺刺激后，將DKO小鼠基礎心臟功能“超-挽救”到與野生型小鼠相當?shù)乃?，提示抑制這種相互作用可在無兒茶酚胺刺激時，對心臟發(fā)揮最大功能起顯著作用。
PLB的重組腺病毒轉基因突變體在維持對SERCA2a抑制作用時需要PLB的某些氨基酸殘基，運用該知識可基因工程制造幾種PLB、V49A(Seq.ID.No.2)、E2A(Seq.ID.No.3)、R14E(Seq.ID.No.6)的單個點突變，PLB、K3E/R14E(Seq.ID.No.6)的雙點突變以及有義和反義性PLB(Seq.ID.No.1)轉基因，以破壞PLB對SERCA2a的抑制作用。采用能使小鼠心臟基因體內轉移的重組腺病毒，與未感染的肌細胞相比，過量表達V49A(一種PLB中的單點突變)的心肌細胞表現(xiàn)出收縮力增加，而過量表達野生型PLB的心肌細胞表現(xiàn)出收縮力降低(如圖5所示)。可以得出以下結論干擾SERCA2a和PLB之間相互作用的可行性和實用性得到了清楚的證明。PLB-SERCA2a的相互作用看來是建立體內基礎心肌收縮力和舒張設置點的限速步驟，破壞這種相互作用能縮短β-腎上腺素能通路的流程。
圖6a顯示了對含有表達有義PLB(sPLB)、反義PLB(asPLB)、E2A、R14E、S16N和K3E/R14E(抗單克隆PLB抗體)(Affinity BioReagents)的腺病毒轉基因的肌細胞作的其他Western印跡分析。對PLB蛋白質含量作定量測定、歸一化成α-肌動蛋白以確定變化量、并與腺病毒/SR對照(無轉基因)相比較，顯示sPLB、E2A和R14E突變體的PLB蛋白質水平分別增加了150％(PLB5+PLB1)、72％和57％。相反肌細胞中asPLB和S16N的PLB蛋白質水平分別減少了54％和33％。引入K3E/R14E轉基因感染肌細胞，導致形成五聚體PLB的不同的帶型。除PLB5(該五聚體)還出現(xiàn)多個PLB條帶。這還伴隨有PLB5豐度的降低(與對照相比)。
通過用PLB-缺陷型So18細胞替代心肌細胞來進一步評估Western印跡帶型的特性。用僅表達轉基因sPLB或K3E/R14E或表達這兩者的重組腺病毒感染So18細胞。如圖6b所示，Western印跡顯示單克隆PLB抗體檢出了受sPLB感染細胞中的PLB但不能檢出K3E/R14E。So18細胞與腺病毒轉基因重組感染導致形成了多個PLB條帶。另外，PLB五聚體豐度減少且同時出現(xiàn)上帶。可以確定PLB與SERCA2a反應并且主要抑制SERCA2a，作為與非抑制性五聚體相平恒存在的單體。根據(jù)這種知識，K3E/R14E和野生型PLB的異源五聚體比野生型PLB的同源五聚體更穩(wěn)定。因此，將異源五聚體分解成抑制SERCA2a的單體是不利的。K3E/R14E與內源性PLB相互反應并形成復合物，并伴隨有同源五聚體形成量的減少。如此，通過封阻SERCA2a反應位點，單體K3E/R14E可作為內源性野生型PLB的非抑制性競爭物。
測定SR的鈣攝取活性，以進一步評估突變型和反義PLB對SERCA2a的影響。測定不同Ca2+濃度時SR攝取Ca2+的初速度可反映SERCA2a的活性。如圖7所示，受重組腺病毒轉基因K3E/R14E和asPLB感染的新生大鼠肌細胞顯示與無轉基因的對照相比，達到相同活性SERCA2a所需的Ca2+濃度降低，表明刺激了SERCA2a的活性。攝取活性為最大值一半時，Ca2+濃度的EC50(單位為μmol/L)無轉基因對照(SR-)為0.20±0.02、K3E/R14E為0.11±0.01、asPLB為0.13±0.01。在成年大鼠心肌細胞中也檢測了K2E/R14E和asPLB對SERCA2a的作用。腺病毒轉基因K3E/R14E明顯降低了EC50(36％)，而asPLB感染所引起的變化卻無統(tǒng)計學顯著性。新生和成年心肌細胞之間作用的明顯差異可能與不同發(fā)育階段心肌細胞中PLB豐度不同有關。PLB在成年心肌中的豐度幾乎是新生心肌的2倍。
為了進一步檢驗K3E/R14E和asPLB對SERCA2a的作用，用indo1熒光指示劑測定新生心肌細胞中胞內Ca2+的瞬間變化。將從各實驗條件得到的indo1輻射測量數(shù)據(jù)分別換算成各收縮期Ca2+瞬間變化的最大值和最小值，然后對比和求平均值。如圖8所示，K3E/R14E和asPLB的衰變曲線移位到LacZ對照的左側。另外，在大部分舒張時間點上，K3E/R14E明顯不同于LacZ，而在幾個舒張時間點asPLB明顯不同于LacZ。測得的LacZ、K3E/R14E和asPLB衰減的半衰期分別為0.28秒(100％)、0.20秒(73％)和0.22秒(79％)。K3E/R14E(73％)和asPLB(79％)的值明顯不同于從LacZ表達病毒得到的值(p＜0.05)。
除采用PLB的各種點突變或PLB的有義或反義序列產(chǎn)生腺病毒轉基因外，也可制備抗PLB肽的抗體然后將其表達為RNA插入腺病毒載體中。為了產(chǎn)生多克隆PLB抗體(“收縮蛋白”，或具有超活性結構域的雞抗體肽)，用代表細胞質結構域的3-19氨基酸的PLB肽反復接種雞。3輪加強接種后(在第15、42和54天接種)，用購得的純化系統(tǒng)(EGGstract IgY Purification System-Promega)從蛋黃純化得到總IgY。證明有陽性免疫應答后，可從脾和骨髓收獲淋巴細胞。從這些細胞可獲得以抗體輕鏈和重鏈超變區(qū)形式的RNA，然后用RT-PCR擴增(該方法是本領域熟知的)。
然后將擴增和純化的超變區(qū)RNA融合入單一cDNA(Seq.ID.No.9)中，隨后克隆入質粒載體讀框中(編碼噬菌體表面蛋白質)。用標準噬菌體展示技術，選擇雞免疫文庫中表達對PLB肽有陽性應答的噬菌體。在一系列富集能特異性結合PLB的噬菌體后，選出20個克隆作ELISA。然后用放射活性Ca2+轉運試驗分析所得的最好的5個結合物。進一步分析2個最好的SR Ca2+轉運激活劑。發(fā)現(xiàn)這兩個克隆都能明顯刺激Ca2+轉運入SR的速率。
為了證明由收縮蛋白(PLB抗體)產(chǎn)生的重組蛋白質在活細胞中也有功能，構建了一表達收縮蛋白的腺病毒載體。Western印跡分析受腺病毒轉基因感染的新生和成年大鼠心肌細胞顯示心臟細胞中能表達該收縮蛋白。用突變型和反義PLB作放射活性Ca2+轉運分析表明收縮蛋白能加速細胞質中Ca2+的移動。
在其他方法中，用質粒轉染而非腺病毒轉染來進行基因送遞。如用共轉染的綠色蛋白監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)相對于腺病毒載體轉染的細胞，K3E/R14E-和asPLB-轉染的肌細胞表現(xiàn)出RT50分別減少了43(p＜0.05)和9％(p＜0.1)。因此，用腺病毒或共-轉染方法，將K3E/R14E和asPLB引入心肌細胞以降低舒張期Ca2+瞬間變化的持續(xù)時間。這些結果似乎反映了MLPKO的發(fā)現(xiàn)與DKO小鼠間的差異，其中Ca2+瞬間值的變化證實去除PLB與Ca2+瞬間變化持續(xù)時間的縮短、衰減加速和保持幅度相關。綜上所述，這些數(shù)據(jù)證明K3E/R14E和asPLB刺激SERCA2a的活性，從而導致加速心肌細胞中Ca2+的瞬間變化。
為了確定由于PLB突變所提高的SERCA2a活性和加速Ca2+瞬變是否導致收縮行為的變化，用邊緣檢測分析了心肌細胞的收縮力。用LacZ、K3E/R14E或asPLB的腺病毒轉基因感染成年兔心肌細胞。培養(yǎng)3天后，不同組間自發(fā)性收縮細胞的數(shù)量有明顯差異(LacZ＜＜asPLB＜K3E/R14E)。表2提供了K3E/R14E和asPLB對心肌細胞收縮能力的作用。如該表所示，與LacZ對照相比，K3E/R14E增加了74％組分性縮短，伴隨RT50減少25％，+dL/dt增加了115％。當asPLB感染后檢驗肌細胞收縮能力時發(fā)現(xiàn)肌細胞組分性縮短增加是顯著的，增加了57％，而RT50和+dL/dt的變化卻不明顯。
表2
*p＜0.05**p＜0.1得到的數(shù)據(jù)表明SERCA2a活性的增加轉化成心肌細胞舒張的加速。K3E/R14E感染的心肌細胞表現(xiàn)出組分性縮短的增加，這提示由于SERCA2a活性的增加使SR負荷Ca2+的量增加。另外，K3E/R14E感染增加了自發(fā)性收縮肌細胞的數(shù)量(一種很可能與SR增加的Ca2+負荷引起的Ca2+振蕩量增加相關的現(xiàn)象)。綜合起來，這些數(shù)據(jù)表明K3E/R14E以顯著減少其對SERCA2a的抑制方式作用于內源性野生型PLB，從而對野生型PLB具有優(yōu)勢抑制作用。
用肽治療來抑制PLB活性另外，本發(fā)明還提供用肽治療來抑制受磷蛋白的活性和送遞這種治療的模式，所根據(jù)的發(fā)現(xiàn)是可用突變體PLB分子來控制內源性PLB，以顯性負方式抑制PLB功能，這種抑制可改善心力衰竭心臟的功能。
對于作用于靶細胞系統(tǒng)的治療劑(如PLB-SERCA2a相互作用的抑制劑)而言，必須有一種裝置通過細胞膜將它們內化入細胞質。轉運抑制劑的方式既可通過以轉運或滲透為基礎的PLB肽的方式，也可包括腺病毒或脂小泡轉移。為了該目的，構建了由轉運肽和PLB蛋白質分子融合組成的一種化合物。該轉運肽包括antennapedia(即果蠅轉錄因子蛋白質)序列的16個殘基。該復合物的第二個肽可以是截短的PLB蛋白質的序列。可用相應于天然PLB蛋白質以及PLB蛋白質突變體或截短形式的肽來實現(xiàn)其他治療作用。
轉運肽-PLB復合物的一個有益的功能是抑制心肌細胞中PLB與SERCA2a間的相互作用，從而提高患病心臟的收縮能力。本發(fā)明還抑制循環(huán)系統(tǒng)動脈/小動脈周圍平滑肌層中PLB與SERCA2a之間的相互作用這將導致血管舒張和血壓降低。所以，在治療心臟病時有雙重有益作用，首先提高心力衰竭心臟的心臟收縮能力，另外可降低高血壓個體的血壓。同樣可以預見還可抑制PLB與其他細胞類型SERCA蛋白質的相互作用，如神經(jīng)組織中SERCA1-PLB的相互作用。
可用位于冠狀動脈中的導管極佳地實現(xiàn)將這種分子引入注入心臟的血流中。當這種分子存在于心肌細胞周圍的細胞外環(huán)境中時，其迅速進入心肌細胞，并抑制PLB與SERCA2a的結合。轉運肽起轉運功能，它表現(xiàn)出迅速將其自身和附著的“貨物”肽以受體非依賴性方式轉運通過細胞膜的能力。一旦處于心肌細胞的細胞質中，PLB片段將作為內源性PLB與SERCA2a相互作用的競爭性抑制劑。
當無PLB結合而發(fā)揮抑制作用時，SERCA2a能更有效地將Ca2+泵送入SR，從而提高心肌細胞更強和更迅速收縮的能力。心肌細胞更強的收縮能力轉化成心臟更有力的收縮能力。在體內，本發(fā)明可作為心力衰竭的治療方法，極易施用，且在心臟需要植入左心室輔助裝置(LVAD)或已植的患者中最有效。
雖然果蠅轉錄因子蛋白的43-58殘基已明確為轉運肽，且在本發(fā)明中作用良好，但本發(fā)明并不限制于這種方法的轉運。其他潛在的轉運方法包括采用8個分支的聚賴氨酸主鏈來連接轉運和貨物肽(cargo peptide)，但也不限于這種多分支結構。還探索了附著于一PLB肽的一種靶肽作為長肽組成的化合物。另外，還制作了大量能在細菌中產(chǎn)生帶六個組氨酸(H6)尾的滲透素和滲透素-PLB重組蛋白質的DNA構建物。將滲透素肽工程改造加工入此蛋白質的氨基酸端或羧基端。
已顯示PLB的胞質片段對SERCA2a的胞質部分具有如同整個PLB分子的強結合親和力。所以，一旦轉運的PLB分子處于心肌細胞的胞質中，預見PLB片段就可作為內源性PLB與SERCA2a相互作用的競爭性抑制劑。
這種形式的治療方法適用于患嚴重心泵功能降低、難用藥物進行治療和需要機械性輔助裝置(等待心臟移植時)的患者。另外，可將PLB突變體的優(yōu)勢負抑制功能的分子機制用于設計和實施抑制性小分子高產(chǎn)率篩選的策略中。
以下實施例用于說明本發(fā)明，但對本發(fā)明無任何限制作用。
實施例1產(chǎn)生用于超聲波心動描計術的敲除小鼠系為了分析在擴張心肌病體內心力衰竭表型復合物的結構和生理特征，產(chǎn)生了以下敲除小鼠品系，用具有純合性缺失兩種非依賴性肌肉特異性基因的雙敲除(DKO)小鼠模型進行。用于該策略，將PLB-/-(受磷蛋白缺陷型)純合小鼠與MLP-/-(肌肉-特異性LIM蛋白質)純合小鼠交配。將MLP-/-×PLB-/-純合雜交產(chǎn)生的F1代交配以產(chǎn)生PLB+/-、PLB+/-雙雜合表型。由PLB+/-/PLB+/-雙雜合交配產(chǎn)生F2代，從而產(chǎn)生了突變體MLP等位基因的純合小鼠和突變體PLB等位基因的雜合小鼠，或是MLP野生型和突變體PLB等位基因的雜合小鼠。從PLB+/+/PLB+/-交配產(chǎn)生的F3代，產(chǎn)生PLB-/-/PLB-/-(DKO)、MLP-/-/PLB+/+(MLPKO)、和MLP+/+/PLB-/-(MLPKO/PLBhet)同窩出生的仔鼠，或從MLP+/+/PLB+/-交配產(chǎn)生MLp+/+/PLB+/-(PLBKO)、MLP+/+/PLB+/+(野生型)和MLP+/+/PLB+/+(PLBhet)同窩出生的仔鼠。用PCR或從尾部活檢樣品分離出的基因組DNA測定了這些靶向基因雜交產(chǎn)生的基因型。
為了評估各種敲除小鼠品系的血液動力學特性，在用阿佛啶(2.5％，20μl/kg體重)或甲苯噻嗪(0.005mg/g)和氯胺酮(0.1mg/g)麻醉的小鼠上進行心導管插入和超聲波心動描計。經(jīng)胸腔M-方式超聲波心動描計示蹤表明MLPKO小鼠有心室擴張伴心壁運動降低，表明抑制了心臟功能增加了心壁應力，而DKO小鼠心室尺寸和心臟功能都正常。圖2a-d顯示了野生型(WT)的基線參數(shù)，n＝7，MLPKO，n＝8，DKO，n＝9，和PLBKO，n＝5。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。MLPKO對其他組；*p＜0.5，**p＜0.001，WT對DKO；#p＜0.01。在圖2e-h中，進行了β-腎上腺素能對多巴酚丁胺的進行性灌注反應的血液動力學評估，其中WT(□)，n＝7只小鼠，MLPKO(●)，n＝8只小鼠，和DKO(○)，n＝9只小鼠。MLPKO對WT或DKO；#p＜0.05，+p＜0.01，*p＜0.001，WT對DKO；3p＜0.01。
實施例2鈣瞬間變化的分析為了評估PLB對SR鈣含量和鈣瞬間變化的抑制作用，從野生型或敲除小鼠的右心室壁分離出心肌細胞。為了監(jiān)測細胞內鈣的變化，將分離的肌細胞室溫與鈣敏感性染料(熒光-3-AM)(1μg/ml)培育30分鐘。然后將肌細胞轉移到倒置顯微鏡載物臺上的組織室內，以1Hz的速率連續(xù)刺激以維持SR鈣負荷一致程度。為了測定細胞熒光，用480nm激發(fā)波長照射心肌細胞。在510nm用顯微熒光計(FM-1000；Solamere Technologies)監(jiān)測熒光的變化，并用Cellsoft(D.BergmanUniversity of Calgary)軟件記錄數(shù)據(jù)供后期分析。用下式標-化熒光值[Ca2+]i＝KD(F-Fmin)/(Fmax-F) (1)式中假定KD為864nM，F(xiàn)是由實驗得到的熒光值。在各個心肌細胞的超融合(superfusion)溶液中加入10μM離子霉素來測定Fmax，在該超融合溶液中加入4mMMnCl2來測定Fmin。
用標準咖啡因脈沖方法評估了分離心肌細胞中SR的鈣含量。在穩(wěn)定記錄鈣瞬間變化后，向心肌細胞施加10mM咖啡因20秒脈沖。該方案導致迅速的咖啡因誘導的Ca2+瞬間變化，然后緩慢衰減回基線值。這種咖啡因誘導的鈣瞬變的積分面積定義為SR鈣含量。圖3a顯示了WT、MLPKO和DKO心肌細胞中代表性胞內鈣瞬變。與舒張期鈣濃度的正常水平相比，MLPKO心肌細胞表現(xiàn)出鈣瞬變幅度減小。DKO心肌細胞表現(xiàn)出鈣瞬變的持續(xù)時間縮短、衰減加速和而幅度保持不變。如圖3b所示，在MLPKO肌細胞中鈣瞬變的幅度明顯降低，而DKO心肌細胞中則恢復。如圖3c所示，在這三種不同的心肌細胞組中，舒張期胞內鈣濃度沒有差異。圖3d所示，與WT小鼠相比，在MLPKO小鼠中SR鈣濃度明顯減少，而DKO小鼠中則增加。如圖3e所示，代表性定量免疫印跡顯示MLP缺陷與SERCA2a、PLB和集鈣蛋白的蛋白質水平的任何明顯變化無關。
實施例3構建突變型PLB腺病毒和基因轉移可從Genome System，Inc.購得編碼人PLB的I.M.A.G.E.聚生體cDNA克隆。將具有完整PLB編碼序列的DNA片段亞克隆入pBluescriptII KS載體(即已知的大腸桿菌克隆載體)(ATCC登錄號No.87047)中。用從Stratagene購得的PCR誘變系統(tǒng)引入有義突變(Val49Ala)。通過質粒pJM17和含RSV啟動子和SV40聚A序列的穿梭質粒之間的同源重組產(chǎn)生表達野生型和突變型人PLB的重組腺病毒。用標準方法滴定濃縮的病毒制劑。將腺病毒載體注射入1日齡的新生小鼠心臟中，進行體內心臟基因的有效轉移。注射入小鼠心臟后4周，分離心肌細胞，測定細胞的縮短。通過共轉染表達GFP(作為標記)的腺病毒載體來鑒定具有突變轉基因的心肌細胞。
實施例4構建PLB抑制劑-轉運肽復合物將轉運肽和PLB蛋白質間接地附著于聚賴氨酸的主鏈上，制備了PLB抑制劑分子。另外，也可將PLB分子制成串聯(lián)附著于貨物肽序列的轉運序列組成的單一長肽。轉運肽由果蠅轉錄因子蛋白的43-58殘基(SEQ ID NO7)(果蠅轉錄因子蛋白質)組成的。用PLB的前16個殘基(SEQ ID NO8)衍生出貨物肽。需要指出此貨物序列可以從野生型PLB或突變型PLB的片段衍生得到。
將4個轉運肽與4個和PLB前16個殘基匹配的肽連接，構建了PLB抑制劑分子。主鏈接頭是8個分支的賴氨酸，通常用于多抗原肽(MAP)的合成。MAP樹脂的前4個支鏈用于合成果蠅轉錄因子蛋白肽。除去另4個支鏈的保護，用作合成PLB貨物肽的起點。所以，這種用于最初特性分析的PLB抑制劑具有4個果蠅轉錄因子蛋白肽支鏈，和4個PLB貨物肽支鏈。另外，可將PLB抑制劑構建成通過一肽鍵將貨物肽和轉運肽彼此連接的一個肽，或通過二硫鍵將貨物肽和轉運肽彼此連接?？捎行У貙LB抑制劑分子轉運入分離的新生大鼠心肌細胞中，且顯示細胞的收縮能力提高，可從圖5a和b看出這些結果。與未感染的心肌細胞相比，過量表達V49A PLB點突變的心肌細胞顯示出收縮能力提高，而過量表達野生型PLB的心肌細胞表現(xiàn)出收縮能力降低。
實施例5滲透素肽TAT和ANT進行了細胞水平的研究來評估兩種滲透素肽、兩種突變型PLB-滲透素肽、和兩種多抗原肽(MAP)增強分離的小鼠心肌細胞收縮周期的能力。兩種滲透素肽包括PLB-ANT(SEQ ID NO10)和TAT-PLB(SEQ ID NO11)，各具有PLB序列的20個殘基部分，附著于ANT的5’端(SEQ ID NO14)或TAT的3’端(SEQ ID NO15)。兩種突變型PLB肽，即突變型PLB-ANT(SEQ ID NO12)和TAT-突變型PLB(SEQ IDNO13)，表現(xiàn)出PLB序列的20殘基中S16E突變。多抗原肽包括具有8個滲透素(ANT)結構域和的MAP和具有4個滲透素結構域和4個PLB結構域的MAP。
評估各滲透素-PLB肽以測定它們增強分離的小鼠心肌細胞收縮周期的能力，思路是滲透素-PLB肽可作為PLB-SERCA2a相互作用的優(yōu)勢負抑制劑。表3顯示了TAT-PLB肽對分離的心肌細胞的結果。對于這些數(shù)據(jù)，在幾組心肌細胞上反復測試以確定有TAT-PLB肽(樣品1-7)和無此肽(對照1-8)時，通過收縮周期的長度相對變化。各樣品加入10μMTAT-PLB肽濃縮液，對照則不加。
表3
每20毫秒進行一次測定，長速單位是任意的，但通常相當于一個完整細胞的長度。以最大長度與最小長度的差除以最大長度來計算收縮百分比。時間對長度作圖得到U形曲線，選出該曲線最線性的節(jié)段，“U”的左側代表收縮，右側代表舒張。r2柱顯示數(shù)據(jù)與曲線擬合多么良好，其中1.0表示完全擬合。
雖然看來肌細胞趨于更大、更迅速的收縮，但由于數(shù)據(jù)的高度變異性T-檢驗分析沒有鑒定出統(tǒng)計學差異。
實施例6六組氨酸標記的滲透素產(chǎn)生了大量DNA構建物以在細菌中生產(chǎn)六組氨酸(H6)標記的滲透素和滲透素-PLB重組蛋白質。用可購得的表達載體pRSET(Invitrogen)產(chǎn)生了重組蛋白質H6-ANT(SEQ ID NO16)。雖然這種重組蛋白質沒有附著PLB，但它被基因工程改造而具有表位標記，當進入心臟后可用于檢測該蛋白質。H6-ANT的變異體也可表達含PLB序列、H6-wtPLB-ANT(SEQ ID NO17)，以及H6-PLB(S16E突變體)-ANT蛋白質和H6-PLB(V49A突變體)-ANT蛋白質(分別為SEQ ID N018和19)。還以較低水平表達了H6-β-半乳糖苷酶-ANT，H6-ANT和H6-β-半乳糖苷酶-TAT(沒有列出序列)。制備了殘基68和67含有兩個突變的無功能ANT-滲透素(其中Trp突變成Phe)作為其他三種滲透素-PLB蛋白質的陰性對照。
為了測定這些重組滲透素蛋白質對心臟收縮能力的作用，對一只小鼠腹腔內注射2mg H6-ANT肽。第二只小鼠腹腔內注射2mg H6-ANT突變型蛋白質。培養(yǎng)3小時后，處死小鼠，取出心臟作分析。通過迫使血流回到主動脈弓來取出心臟中的血液。將各心臟解剖成心房組織、右心室組織和左心室組織。用生理平衡的PBS溶液充分沖洗所有這些組織，在液氮中迅速冷凍。然后將組織在8M尿素、2％氚(triton)-X100中裂解10分鐘，取等量上清液在15％PAGE上進行電泳。將條帶轉移到PVDF膜上。用抗His抗體標記膜，以鑒定裂解液是否含有表位標記的蛋白質。
本文所公開的本發(fā)明提供了幾種通過抑制或改變心肌細胞中受磷蛋白和肌質網(wǎng)Ca2+-ATP酶之間的相互作用治療心力衰竭的方法。雖然本發(fā)明已參考上述實施例進行描述，但可以理解在不脫離本發(fā)明精神時還可有許多改進。另外，本發(fā)明僅受限于附帶的權利要求書。
序列表<110>Kenneth Chien，Wolfgang Dillman，Susumu Minasmiswa，Huaping He，Masahiko Hoshi jima，Markus Meyer，ChristopherScott，Yibin Wang，Gregg Silverman<120>抑制受磷蛋白活性以治療心臟病和心力衰竭的方法<130>6627-9025<140>未知<141>1999年11月2日<150>US60/106，718<151>1998年11月2日<160>9<170>Word Perfect版本8.1<210>1<211>52<212>PRT<213>人受磷蛋白<220>野生型<221>氨基酸序列<222>1...52<400>1Met Glu Lys Val Gln Tyr Leu Thr Arg Ser Ala Ile Arg Arg Ala Ser Thr Ile1 5 10 15Glu Met Pro Gln Gln Ala Arg Gln Lys Leu Gln Asn Leu Phe Ile Ash Phe20 25 30 35Cys Leu Ile Leu Ile Cys Leu Leu Leu Ile Cys Ile Ile Val Met Leu Leu 5240 45 50<210>2<211>52<212>PRT<213>人受磷蛋白<220>Val49Ala突變體<221>氨基酸序列<222>1...52<400>2Met Glu Lys Val Gln Tyr Leu Thr Arg Ser Ala Ile Arg Arg Ala Ser Thr Ile1 5 10 15Glu Met Pro Gln Gln Ala Arg Gln Lys Leu Gln Asn Leu Phe Ile Asn Phe Cys20 25 30 35Leu Ile Leu Ile Cys Leu Leu Leu Ile Cys Ile Ile Ala Met Leu Leu 5240 45 50<210>3<211>52<212>PRT<213>人受磷蛋白<220>Glu2Ala突變體<221>氨基酸序列<222>1...52<400>3Met Ala Lys Val Gln Tyr Leu Thr Arg Ser Ala Ile 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權利要求
1.一種治療心力衰竭的方法，其特征在于，所述的方法包括誘導受磷蛋白缺陷。
2.如權利要求1所述的治療心力衰竭的方法，其特征在于，所述的方法中用外源性受磷蛋白誘導了受磷蛋白缺陷。
3.如權利要求2所述的治療心力衰竭的方法，其特征在于，所述的外源性受磷蛋白選自突變型PLB、有義PLB、反義PLB、截短的PLB、天然PLB和抗PLB抗體。
4.如權利要求3所述的治療心力衰竭的方法，其特征在于，所述的突變型PLB包括PLB的點突變。
5.如權利要求3所述的治療心力衰竭的方法，其特征在于，所述的抗PLB抗體包含收縮蛋白。
6.一種用于抑制受磷蛋白活性的肽治療劑，其特征在于，所述的治療劑由第一種肽和第二種肽組成的復合物，其中第一種肽含有轉運肽，第二種肽含有貨物肽。
7.如權利要求6所述的肽治療劑，其特征在于，所述的轉運肽選自基于滲透素、腺病毒、細菌和脂小泡的轉運肽。
8.如權利要求6所述的肽治療劑，其特征在于，所述的貨物肽選自突變型PLB、有義PLB、反義PLB、截短的PLB和天然PLB蛋白質。
9.如權利要求6所述的肽治療劑，其特征在于，所述的第一種肽能將第二種肽轉運通過細胞膜。
10.如權利要求6所述的肽治療劑，其特征在于，所述的第一種肽和第二種肽通過一共價鍵連接。
11.如權利要求10所述的肽治療劑，其特征在于，該共價鍵由分支聚賴氨酸主鏈、單一肽鍵或二硫鍵構成。
12.一種治療心力衰竭的方法，其特征在于，所述的方法包括通過抑制PLB-SERCA2a之間的相互作用而增強心臟的收縮能力。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，通過抑制PLB對肌質網(wǎng)Ca2+ATP酶的作用，增強心臟的收縮能力。
14.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述的方法用外源性受磷蛋白抑制受磷蛋白缺陷。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述的外源性受磷蛋白選自突變型PLB、有義PLB、反義PLB、截短的PLB、天然PLB和抗PLB抗體。
16.如權利要求15所述的治療心力衰竭的方法，其特征在于，所述的突變型PLB包括PLB的點突變。
17.如權利要求15所述的治療心力衰竭的方法，其特征在于，所述的抗PLB抗體包含收縮蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供一種治療心力衰竭的方法,通過采用短肽復合物和重組蛋白質,它們通過抑制心肌細胞中受磷蛋白和肌質網(wǎng)Ca
文檔編號C07K14/47GK1354671SQ99815335
公開日2002年6月19日 申請日期1999年11月2日 優(yōu)先權日1998年11月2日
發(fā)明者K·基耶, W·迪爾曼, 南沢享, 何華平, 星島正彥, M·邁耶, C·斯科特, 王義斌, G·J·西爾弗曼 申請人:加利福尼亞大學董事會