專利名稱：3－(脂肪酸)－1,2二硫酸甘油酯及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從海鞘中提取分離得到的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯及其制備方法和其作為抗病毒、抗癌藥物的應(yīng)用。
海鞘(Tunicate)是海洋生物中特有的一類與脊椎動物非常類似的原索動物，因其在分類學(xué)上占有特殊的地位，早已成為仿生生物、免疫化學(xué)和生理學(xué)的極好的研究材料。自80年代以來，國外學(xué)者陸續(xù)從海鞘中分離出吲哚、環(huán)肽、生物堿、含氮大環(huán)內(nèi)酯等多種新的化合物，并發(fā)現(xiàn)具有抗病毒、抗癌等多種生理活性，且毒性較低。
海鞘在我國資源相當(dāng)豐富，主要分布在渤海、黃海、東海、南海等海域，在我國已經(jīng)記載有66種，優(yōu)勢品種主要有柄海鞘(Styelaclava)、玻璃海鞘(Ciona intestinalis)等。但我國對海鞘的研究開發(fā)還進(jìn)行得不是很充分。
本發(fā)明的目的是通過對海鞘的系統(tǒng)和充分的研究，從中提取分離出可作為抗病毒、抗癌藥物的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯。
本發(fā)明的第二個目的是提供從海鞘中提取分離得到3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯的方法。
本發(fā)明的第三個目的是開發(fā)3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯作為抗病毒、抗癌藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明從海鞘中提取分離得到了結(jié)構(gòu)式如下式(1)所示的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯， 其中，R1為含有1-30個碳原子的烴基。
按照本發(fā)明的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯，其中，R1為含有1-30個碳原子的烷基。
按照本發(fā)明的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯，其中，R1為含有1-30個碳原子的帶有不飽和雙鍵的烴基。
按照本發(fā)明的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯，其中，R1為在8位具有雙鍵的十七碳烯基。
按照本發(fā)明的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯，其中，R1為含有1-30個碳原子的帶有不飽和三價鍵的烴基。
本發(fā)明還涉及結(jié)構(gòu)式如下式(1)所示的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯的提取制備方法， 其中，R1為含有1-30個碳原子的烴基，包括如下步驟(1)將新鮮海鞘用10-95％的醇水溶液或酮水溶液以1∶6-10的重量比回流提取或浸泡滲透提取至少一次，每次的時間為1-6個小時，將提取液減壓濃縮得到濃縮的海鞘提取液；
(2)將步驟(1)得到的提取液，過濾除去雜質(zhì)后，依次用C6-C7烷烴、鹵代烴、有機(jī)醚、有機(jī)酯和C3-C5脂肪醇提取，分別得到有機(jī)溶劑提取物和水提取物；(3)將步驟(2)得到的乙酸乙酯提取物經(jīng)硅膠柱層析和HPLC層析分離，得到式(1)所示的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯。
按照本發(fā)明的方法，其中，所述的醇為1-4碳醇，所述的酮為丙酮。
按照本發(fā)明的方法，其中，所述的C6-C7烷烴為石油醚、環(huán)己烷、己烷；所述的鹵代烴為二氯甲烷，三氯甲烷、四氯甲烷；所述的有機(jī)醚為乙醚；所述的有機(jī)酯為乙酸乙酯、乙酸丁酯，乙酸戊酯；所述的C3-C5脂肪醇為正丁醇。
按照本發(fā)明的方法，其中，將步驟(3)得到的3-(脂肪酸)-1，2-二硫酸甘油酯用大孔樹脂、硅膠、反相硅膠法進(jìn)行進(jìn)一步純化。
本發(fā)明還涉及結(jié)構(gòu)式如下式(1)所示的 3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯作為抗癌、抗病毒藥物的應(yīng)用。
按照本發(fā)明，其中所述的藥物的劑型為片劑、丸劑、膠囊劑、沖劑、噴霧劑、口服液、混懸液、外用搽劑、透皮吸收劑以及注射劑中的任何一種。
本發(fā)明的發(fā)明人對柄海鞘進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究，從中首次提取分離得到了結(jié)構(gòu)式如下式(1)所示的3-(脂肪酸)-1,2-二硫酸甘油酯 式(1)中，R1為含有1-30個碳原子的烴基，具體地，R1為含有1-30個碳原子的長鏈脂肪烷基，包括直鏈烷基，例如甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基，庚基，辛基，壬基，十一烷基，十二烷基，十四烷基，十六烷基，十八烷基，二十烷基，二十二烷基，二十四烷基，二十六烷基，二十八烷基以及支鏈烷基，例如異丙基、異丁基、異戊基、異己基、異庚基、新戊基、新己基、新庚基等；或者是含有1-30個碳原子的帶有至少一個不飽和雙鍵的烯基，例如丙烯基-1，丁烯基-2，戊烯基-2，己烯基-2,8-十八碳烯基[-(CH2)6CH2CH=CH(CH2)CH3]等，或者是含有1-30個碳原子的帶有至少一個不飽和三價鍵的炔基，例如3-丁炔基，4-戊炔基等。
按照本發(fā)明的第二個方面，本發(fā)明提供了結(jié)構(gòu)式如下式(1)所示的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯的提取制備方法， 其中，R1為含有1-30個碳原子的烴基，包括如下步驟
(1)將新鮮海鞘用濃度為10-95％(重量)的醇水溶液或酮水溶液以1∶6-10的重量比回流提取或浸泡滲透提取至少一次，每次的提取時間為1-6個小時，將提取液減壓濃縮得到濃縮的海鞘提取液；(2)將步驟(1)得到的提取液，過濾除去雜質(zhì)后，依次用C6-C7烷烴、鹵代烴、有機(jī)醚、有機(jī)酯和C3-C5脂肪醇提取，分別得到有機(jī)溶劑提取物和水提取物；(3)將步驟(2)得到的乙酸乙酯提取物經(jīng)硅膠柱層析和HPLC層析分離，得到式(1)所示的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯。
本發(fā)明的方法中，首先將新鮮的海鞘用濃度為10-95％的低碳醇的水溶液或酮的水溶液以1∶6-10的重量比回流提取或浸泡滲透提取。該步驟的回流或浸泡滲透提取至少進(jìn)行一次，優(yōu)選是用不同濃度的醇或酮的水溶液分次提取，例如，先用95％的乙醇水溶液浸泡滲濾提取，然后用80％的乙醇水溶液浸泡滲濾提取，再用60％的乙醇水溶液浸泡滲濾提取，得到提取液后，合并提取液，然后將其減壓濃縮，得到其濃縮液。其中，減壓濃縮時的壓力為0.01～0.03Pa，溫度為25～50℃，所述的醇為C1-C4醇，例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇；所述的酮為丙酮。
然后，將得到的濃縮提取液過濾除去雜質(zhì)后，依次用C6-C7烷烴、鹵代烴、有機(jī)醚、有機(jī)酯和C3-C5脂肪醇提取，分別得到有機(jī)溶劑的提取物和水提取物；其中，所述的C6-C7烷烴為石油醚、環(huán)己烷、己烷；所述的鹵代烴為二氯甲烷，三氯甲烷、四氯甲烷；所述的有機(jī)醚為乙醚，所述的有機(jī)酯為乙酸乙酯、乙酸丁酯，乙酸戊酯，優(yōu)選為乙酸乙酯；所述的C3-C5脂肪醇優(yōu)選為正丁醇。
將得到的乙酸乙酯提取物經(jīng)硅膠柱層析和HPLC層析分離，得到式(1)所示的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯。
本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過充分的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)式如下式(1)所示的 3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯具有良好的抗癌和抗病毒活性，因此進(jìn)一步開發(fā)了其作為抗癌、抗病毒藥物的應(yīng)用。
采用本領(lǐng)域公知的輔劑，可以將本發(fā)明的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯制備成各種不同的藥物劑型，例如片劑、丸劑、膠囊劑、沖劑、噴霧劑、口服液、混懸液、外用搽劑、透皮吸收劑以及注射劑。用于抗癌藥物時，本發(fā)明的化合物的用量為10-30毫克/公斤體重/天；用于抗病毒藥物時，本發(fā)明的化合物的用量為10-25毫克/公斤體重/天。
以下用實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)的說明。但應(yīng)該理解的是，本發(fā)明并不僅僅限于這些實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例。
實(shí)施例13-(8-十八碳烯酸)-1,2-二硫酸甘油酯(SC1)的制備取新鮮海鞘100千克，依次用濃度為95％、80％和50％的乙醇水溶液800千克、500千克和600千克各浸泡2、3和4小時，合并提取液，將其在0.02Pa和40℃下減壓濃縮，得到10千克濃縮液。
將得到的濃縮液過濾除去雜質(zhì)后，依次用10千克石油醚、10千克二氯乙烷、10千克乙醚、30千克乙酸乙酯和10千克正丁醇提取，分別得到石油醚、二氯乙烷、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物。
收集乙酸乙酯提取，在硅膠(200～300目)柱上先用石油醚洗脫，然后用體積比為1∶1∶1的石油醚、乙酸乙酯和丙酮的混合液洗脫。收集用體積比為1∶1∶1的石油醚、乙酸乙酯和丙酮的混合液洗脫后得到的洗脫液，在硅膠(200～300目)柱上先用體積比為20∶1的石油醚和異丙醇混合溶液洗脫，然后用體積比為10∶1的石油醚和異丙醇混合溶液洗脫。收集用體積比為10∶1的石油醚和異丙醇的混合液洗脫后得到的洗脫液，減壓濃縮，分次用HPLC(ODSC18)制備，60％(體積)的甲醇水溶液洗脫，收集Rt=9.00洗脫液部分，減壓濃縮至干，得到1克標(biāo)題化合物，其為白色固體。FAB-MS分子量516分子式C21H40S2O10。1HNMR:δ0.84,t,J=6.3Hz(CH3)；δ1.22,m(n×CH2)；δ1.48,m,(2×H)和δ2.27,t,J=7.2Hz(CH2)；5.30,m(2×H)13CNMR(DMSO)δ:172.61(s,C=0),33.20(t,C-2),31.17(t),28.93-28.17(t,n×CH2),26.49(2×CH2),24.30(t),21.96(t)和13.74(q),129.46(d,2×C)；δ4.12(dd,J=11.8,4.2Hz),δ3.96(dd,J=11.8,8.0Hz),δ3.16(m,2×H),δ70.4(d),66.05(t),64.59(t)。FAB-MS:m/e97；m/z265,167,113實(shí)驗(yàn)例3-(8-十八碳烯酸)-1,2-二硫酸甘油酯(SC1)的藥效學(xué)活性實(shí)驗(yàn)例1抗腫瘤活性一、本發(fā)明化合物(SC1)的抗腫瘤活性1、對小鼠H22肝癌細(xì)胞荷瘤小鼠的抑瘤活性方法常規(guī)藥理實(shí)驗(yàn)方法(見《(藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，徐叔云主編，人民衛(wèi)生出版社，1994)結(jié)果見表1。
表1 SC1對小鼠H22肝癌細(xì)胞荷瘤小鼠的抑瘤活性
注SC0為分離活性產(chǎn)物后剩余產(chǎn)物結(jié)論SC1大、中、小劑量對小鼠肝癌有明顯的抑制作用，抑制率均大于40％，而且呈量效關(guān)系。
2、SC1對小鼠Lewis肺癌的抗腫瘤作用方法常規(guī)藥理實(shí)驗(yàn)方法(見《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，徐叔云主編，人民衛(wèi)生出版社，1994，第1432頁)結(jié)論SC1濃度為20～40mg/Kg/d時，對小鼠Lewis肺癌的抑瘤活性在36-45％左右3、SC1對小鼠S180肉瘤的抗腫瘤作用方法常規(guī)藥理實(shí)驗(yàn)方法(見《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，徐叔云主編，人民衛(wèi)生出版社，1994，第1429頁)結(jié)論SC1濃度為20～40mg/Kg/d時，對S180肉瘤的抑瘤活性在36-45％左右。
4、SC1體外對Hela細(xì)胞、KB細(xì)胞、HCT-8細(xì)胞、KETR3人腎癌細(xì)胞、A549人肺腺癌、Ht29等7株人癌細(xì)胞株的抗腫瘤活性方法常規(guī)藥理實(shí)驗(yàn)方法(見《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，徐叔云主編，人民衛(wèi)生出版社，1994，第1440-1445頁)結(jié)果體外MTT法檢測SC1對Hela細(xì)胞、KB細(xì)胞、HCT-8細(xì)胞、KETR3人腎癌細(xì)胞、A549人肺腺癌、Ht29等7株人癌細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性，IC50為0.05～0.2ug/ml。二、本發(fā)明化合物(SC1)的抗病毒活性1、SC1抗肝炎病毒活性(1)、SC1對2215細(xì)胞表達(dá)HBsAg的抑制活性方法常規(guī)藥理實(shí)驗(yàn)方法(見《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，汪謙主編，人民衛(wèi)生出版社，1997，第196頁)結(jié)果見表2表2SC1對2215細(xì)胞表達(dá)HBsAg的抑制活性
結(jié)論0.15-0.30ug/ml SC1對2215細(xì)胞表達(dá)HbsAg有明顯的抑制作用。(2)、SC1對鴨血清HBV-DNA(DHBV-DNA)復(fù)制抑制活性方法應(yīng)用32P標(biāo)記DHBV-DNA探頭進(jìn)行鴨血清中DHBV-DNA斑點(diǎn)雜交，斑點(diǎn)密度在O.D490nm比色，成組t檢驗(yàn)，分析差異顯著性及抑制率。分析軟件為pharmcologic calculation system-version 4.1版本。
結(jié)論當(dāng)SC1用量為10～20mg/Kg/次時(口服，每天2次)，給藥組在用藥后第5、10天(P＜0.05)和停藥后3天(P＜0.01)＞對鴨血清HBV-DNA復(fù)制的斑點(diǎn)雜交抑制率可達(dá)65-80％左右，對照組為環(huán)鳥苷(抑制率70-88％)和生理鹽水。(3)、SC1口服對接種鴨HBV的肝組織病理學(xué)檢測結(jié)果相對于表2，接種鴨HBV-DNA的鴨在SC1用量為90.4ug/Kg/次，血清斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)表明對鴨HBV-DNA的抑制率為80％左右；肝組織病理切片表明炎癥反應(yīng)輕，其炎癥反應(yīng)似與血清中HBV-DNA的含量呈正相關(guān)，病毒水平下降愈迅速，炎癥病變愈輕。三、本發(fā)明SC1的免疫藥理活性(1)、SC1對對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響方法常規(guī)藥理實(shí)驗(yàn)方法(見《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，徐叔云主編，人民衛(wèi)生出版社，1994，第1233頁)結(jié)果見表3。
表3 SC1對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響
注*P＜0.05,**P＜0.01；CTX=環(huán)磷酰胺0.2ml/dx3結(jié)論SC1大、中、小不同劑量組對由環(huán)磷酰胺造成的免疫抑制有不同程度的增強(qiáng)作用，并呈一定的量效關(guān)系。(2)、SC1對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響方法常規(guī)藥理實(shí)驗(yàn)方法(見《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，徐叔云主編，人民衛(wèi)生出版社，1994，第1233頁)結(jié)果見表4。
表4 SC1對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響
注*P＜0.05,**P＜0.01；CTX=環(huán)磷酰胺0.2ml/dx3結(jié)論不同劑量的SC1對由環(huán)磷酰胺引起的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖抑制有不同程度的升高作用，并呈一定的量效關(guān)系。四、本發(fā)明SC1的毒性試驗(yàn)方法常規(guī)藥理實(shí)驗(yàn)方法(見《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，徐叔云主編，人民衛(wèi)生出版社，1994，第201頁)結(jié)論200～1000mg/Kg/d采用最大容積法，用藥量相當(dāng)于成人用量的20～30倍灌胃，進(jìn)行小鼠毒性耐受測定預(yù)試驗(yàn)，觀察2周，未見毒性反應(yīng)出現(xiàn)。
藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明化合物SC1具有優(yōu)異的抗癌和抗病毒活性，并且毒性很低。
權(quán)利要求
1．結(jié)構(gòu)式如下式(1)所示的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯， 其中，R1為含有1-30個碳原子的烴基。
2．按照權(quán)利要求1所述的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯，其中，R1為含有1-30個碳原子的烷基。
3．按照權(quán)利要1所述的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯，其中，R1為含有1-30個碳原子的帶有不飽和雙鍵的烴基。
4．按照權(quán)利要3所述的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯，其中，R1為在8位具有雙鍵的十七碳烯基。
5．按照權(quán)利要求1所述的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯，其中，R1為含有1-30個碳原子的帶有不飽和三價鍵的烴基。
6．結(jié)構(gòu)式如下式(1)所示的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯的制備方法， 其中，R1為含有1-30個碳原子的烴基，包括如下步驟(1)將新鮮海鞘用10-95％的醇水溶液或酮水溶液以1∶6-10的重量比回流提取或浸泡滲透提取至少一次，每次的時間為1-6個小時，將提取液減壓濃縮得到濃縮的海鞘提取液；(2)將步驟(1)得到的提取液，過濾除去雜質(zhì)后，依次用C6-C7烷烴、鹵代烴、有機(jī)醚、有機(jī)酯和C3-C5的脂肪醇提取，分別得到有機(jī)溶劑提取物和水提取物；(3)將步驟(2)得到的酯提取物經(jīng)硅膠柱層析和HPLC層析分離，得到式(1)所示的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯。
7．如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述的醇為1-4碳醇，所述的酮為丙酮。
8．如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述的C6-C7的烷烴為石油醚、環(huán)己烷、己烷；所述的鹵代烴為二氯甲烷，三氯甲烷、四氯甲烷；所述的醚為乙醚，所述的有機(jī)酯為乙酸乙酯、乙酸丁酯，乙酸戊酯；所述的C3-C5脂肪醇為正丁醇。
9．如權(quán)利要求6所述的方法，其中，將步驟(3)得到的3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯用大孔樹脂、硅膠、反相硅膠法進(jìn)行進(jìn)一步純化。
10．結(jié)構(gòu)式如下式(1)所示的 3-(脂肪酸)-1,2二硫酸甘油酯作為抗癌、抗病毒藥物的應(yīng)用。
11．如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述的藥物的劑型為片劑、丸劑、膠囊劑、沖劑、噴霧劑、口服液、混懸液、外用搽劑、透皮吸收劑以及注射劑中的任何一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了從海鞘中提取分離得到的結(jié)構(gòu)式如下式所示的3－(脂肪酸)－1,2二硫酸甘油酯,式中Rl為含有1一30個碳原子的飽和烴基、或含有不飽和雙鍵或三價鍵的烴基。本發(fā)明還公開了該化合物的制備方法和作為抗癌和抗病毒藥物的應(yīng)用。含有本發(fā)明化合物的藥物體內(nèi)體外均具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性和抗病毒活性。
文檔編號C07C305/04GK1298871SQ9912554
公開日2001年6月13日 申請日期1999年12月3日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月3日
發(fā)明者程云, 林文翰, 雷海民, 高蓉, 董志鋒, 張英起, 李靖, 李伯安, 羅清華 申請人:中國人民解放軍傳染病研究所, 北京醫(yī)科大學(xué)