專利名稱：紫杉醇臭氧處理純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是臭氧處理制備高純度紫杉醇的方法。
紫杉醇(taxol)是從紫杉科樹種中提取出來的天然有機(jī)化合物。1971年Wani(J.Amer.Chem.Soc.，1971，93，2325)等首次報道從印度短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)中分離得到紫杉醇，并確認(rèn)對肺癌、肝癌、乳房癌、白血病等癌細(xì)胞及其它腫瘤細(xì)胞具有廣泛的強(qiáng)殺傷作用，副作用非常小。它的分子式為C47H51NO14，分子量為853，結(jié)構(gòu)(a)如下
(a)Taxol的結(jié)構(gòu) (b)Cephalomannine的結(jié)構(gòu)1979年Schiff等(Nature，1979，277，665)確認(rèn)紫杉醇藥理作用機(jī)理獨(dú)特，既能促進(jìn)微管蛋白的聚合，又能穩(wěn)定微管不致解聚。1983年美國食品醫(yī)藥管理局(FDA)批準(zhǔn)進(jìn)入I期臨床，目前已進(jìn)入第III期臨床，被認(rèn)為是近20年來發(fā)現(xiàn)的最有希望的抗癌新藥。
紫杉醇可以通過杉樹提取法、全合成和半合成法及組織培養(yǎng)法等制備。藥用紫杉醇按中華人民共和國衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)Ws-494(X-429)-97號文，含紫杉醇應(yīng)為標(biāo)示量的90.0-110.0％，無論是杉樹提取法、全合成和半合成法及組織培養(yǎng)法均需最后分離而獲得紫杉醇純品。因此，紫杉醇的分離純化至關(guān)重要。但是，從杉樹中提取的紫杉醇，其伴生物cephalomannine(結(jié)構(gòu)如b)的極性與紫杉醇非常接近，無論是正相色譜法還是反相色譜法均很難一次分離。
Miller(J.Org.Chem.，1981，46，1469)用Taxus wallichiana樹根、樹干和樹葉，經(jīng)甲醇萃取、濃縮至固體，在水和己烷中分配，用氯仿萃取，然后濃縮，用硅膠柱分離；再二次硅膠柱色譜分離；經(jīng)逆流分配，二次逆流分配；最后用制備高效液相色譜分離純化得到259個組分，部分制得的紫杉醇純度很高。整個提取純化過程主要有八個步驟，其中包括兩次正相色譜柱層析和一次高效液相色譜分離。
Senilh(J.Natural Products，1984，47(1)，131)等從歐洲杉(Taxus baccata)提取紫杉醇使用如下步驟用乙醇浸漬萃取樹皮，濃縮，在水和二氯甲烷中分配，“過濾”色譜法分離；硅膠柱色譜分離；氧化鋁柱色譜分離；中壓硅膠柱色譜分離；制備高效液相色譜分離。該過程使用兩次硅膠柱色譜，一次氧化鋁柱色譜和一次制備高效液相色譜分離。
Nair(美國專利5,279,949，1994)使用正相硅膠柱色譜法從Ornamental yew(Taxus Xmedia Hicksii)新鮮杉樹組織分離紫杉醇及其同系物，固體進(jìn)入正相硅膠柱色譜分離。新鮮杉樹組織用乙醇和水的混合物萃取紫杉烷(taxanes)，萃取質(zhì)濃縮除去大部分有機(jī)溶劑，水溶性組分離心與含紫杉醇的沉淀固體分離過濾后的濾液用活性炭脫色用硅藻土過濾，濾液揮發(fā)至干，真空下過硅膠色譜柱液相分離得到產(chǎn)物?；蛘邔⒐柙逋吝^濾的濾液真空下脫乙醇后，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，將萃取液濃縮，用真空液相色譜法經(jīng)過硅膠柱進(jìn)行純化得到產(chǎn)物。Nair(美國專利5,478,736，1995)指出通過改變萃取劑，即用甲醇或丙酮與水的混合溶劑萃取新鮮杉樹組織，經(jīng)過相似過程，亦可得到較高的紫杉醇產(chǎn)量。
Caster等(美國專利5,440,055，1995)利用超臨界法真接處理杉樹葉子組織。因為杉樹葉是可再生資源，利用樹葉對保護(hù)稀有樹種更加有益。該方法使用CoNC流體作為溶劑，使用N2O、CO2、C3H8、Freon-22等作為流體，處理經(jīng)過干燥粉碎后的紫杉樹葉，經(jīng)系統(tǒng)中淋洗液抽提及C18反相色譜柱進(jìn)行分離，得到紫杉醇純品，該方法處理約為每次200mg。
Polysciences Inc.從Taxus brevifolia樹皮中分離紫杉醇，步驟主要有甲醇或乙醇萃取干燥磨碎的樹皮，萃取后濃縮除去大部分醇；濃縮液用二氯甲烷萃取，萃取質(zhì)濃縮干燥至粉末；粉末用丙醇和石油醚(1∶1)溶解，不溶組分過濾除去；含有紫杉醇的濾液濃縮，溶于30％丙醇石油醚溶液，經(jīng)Florisil柱過濾；從柱中流出的紫杉醇組分結(jié)晶純化二次；結(jié)晶的紫杉醇進(jìn)一步在硅膠柱中分離，該步中，最相似的產(chǎn)物cephalomannine從紫杉醇中分離出來；從柱中流出的紫杉醇再結(jié)晶二次；未分離的混合物和其它溶質(zhì)，循環(huán)回收處理得到純紫杉醇。
目前常用的分離和純化步驟為使用甲醇或95％乙醇浸提樹皮，除去溶劑，得浸膏用水溶解，脫脂后用二氯甲烷或三氯甲烷萃?。惠腿〗M分濃縮后，經(jīng)色譜層析得到紫杉烷類化合物的單體或混合物。使用浸提法從樹皮中提取紫杉醇粗產(chǎn)物步驟繁雜，將10～48％的粗產(chǎn)品直接純化得到99.5～99.9％的精產(chǎn)品技術(shù)難度大。另外，溶劑或淋洗劑不經(jīng)回收直接排放，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。
本發(fā)明的目的是建立一種工藝方法簡單、淋洗液或溶劑可回收再使用、便于較大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)且能得到高純度紫杉醇的方法。
本發(fā)明使用市售10～51％紫杉醇粗產(chǎn)品為原料，正構(gòu)烷烴、乙酸乙酯等試劑均為分析純。甲醇、乙腈為高效液相色譜純，水為二次重蒸水，硅膠、活性炭纖維為分析純。原料及產(chǎn)品分析使用的高效液相色譜儀為美國Beckman公司生產(chǎn)，110B雙泵進(jìn)樣，128二極管振列檢測器，檢測波長為227nm，4.6×150mmC18(2)phenomenex色譜柱，HP預(yù)處理柱，流動相為甲醇∶乙腈∶水(30∶30∶40)流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為10μl。奔騰IIMMX266計算機(jī)控制高效液相色譜分析操作。中壓快速分離制備色譜為美國Biotage生產(chǎn)的Flash 150Mi硅膠填充柱色譜，柱長30cm，柱φ15cm。SHZ-D循環(huán)水式真空泵，BS-16A型臭氧發(fā)生器。德國生產(chǎn)的Buchi R-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，KLG-II型冷凍干燥機(jī)，CS501-SP超級數(shù)顯恒溫器，WZZ-2A自動旋光儀，WKS-1A數(shù)字熔點儀。質(zhì)譜分析在美國CE&A公司生產(chǎn)的TOF-2000MIP飛行時間二次離子質(zhì)譜儀上進(jìn)行，電子能量15kev，荷質(zhì)比m/e在0～1000范圍內(nèi)掃描。液-質(zhì)連譜分析在美國惠普HP1100-MS上進(jìn)行，Eclipse XDB-2.1×50mmC18色譜柱，流速為0.8mL/min，進(jìn)樣量為5μl。質(zhì)譜分析電子能量為15kev，APCI源，荷質(zhì)比m/z在30～2000范圍內(nèi)掃描。傅里葉紅外光譜分析在美國Nicolet生產(chǎn)的Avatar360上進(jìn)行。
本發(fā)明提出的制備高純度紫杉醇的純化方法，以紫杉醇粗產(chǎn)品為原料，采用分析純正構(gòu)烷烴、乙酸乙酯為溶劑或淋洗試劑，先將紫杉醇原料溶解于乙酸乙酯溶劑中，然后經(jīng)臭氧處理，再加入硅膠，蒸發(fā)至干，干法上樣后，使用中壓快速分離制備色譜柱分離上述產(chǎn)物，依次經(jīng)過下述4種組分梯度淋洗液進(jìn)行淋洗處理a.100％正己烷，b.正己烷∶乙酸乙酯＝1.5∶1～2∶1，c.正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1～1.5∶1，d.正己烷∶乙酸乙酯＝0.5∶1～0.75∶1。對應(yīng)于各段淋洗餾分分別為A、B、C、D，承接餾分A、B、C、D，經(jīng)常溫真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、濃縮、冷凍至干，從D餾分中獲取高純度紫杉醇，其純度達(dá)99.4～99.9％.本發(fā)明提出的制備高純度紫杉醇的純化方法，按照純化過程中進(jìn)行臭氧處理的階段不同，可分為兩種不同的具體方式直接臭氧法和后臭氧法，其流程如

圖1所示，中壓快速分離制備色譜工作如圖2所示。現(xiàn)分別具體描述如下直接臭氧法稱取10～51％紫杉醇10～30克，溶于200～400mL乙酸乙酯溶劑中，制成1～5.1％紫杉醇溶液。直接通入100～300mL/min流量的臭氧處理3～6小時。集中500～1000mL臭氧處理的溶液，加入60～100克50～100目硅膠，常溫低壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。干法上樣于圖2所示承接器2中。于圖2中淋洗液貯器1中加入淋洗液組分a4～8升，在0.03～0.8Mpa壓力下淋洗。待組分a全部流出后，依次加入淋洗液組分b2-6升.組分c2-16升，組分d4-6升，承接各段餾分A～D。整個淋洗過程約2～3小時。
分別收集各段淋洗液，餾分A～D經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，餾出的溶劑或淋洗液進(jìn)行精餾之后可以反復(fù)使用，避免了排放造成污染。濃縮液經(jīng)-40℃～20℃真空冷凍干燥，分離得到淋洗液A～D中各種化合物。高效液相色譜分析與粗產(chǎn)物各組分相對照，A～B中不含紫杉醇，C中含約1％的紫杉醇，D餾分用部分收集器收集的餾分約40％部分含99.5～99.9％的紫杉醇(高效液相色譜分析結(jié)果如圖5所示)，對產(chǎn)物D的質(zhì)譜分析表明，其質(zhì)量為853.4。分離得到的紫杉醇為白色結(jié)晶狀粉末。熔點為215.6℃，旋光度為-49°(甲醇溶液中)。
后臭氧法10～51％紫杉醇10～30克溶于200～400mL乙酸乙酯，制成1～5.1％紫杉醇溶液。加入10～30克硅膠，常溫低壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，轉(zhuǎn)移至預(yù)處理柱處理，預(yù)處理柱長50～80cm，柱φ2～8cm，下端有聚四氟乙烯活塞，活塞上端填充0.5克玻璃纖維，裝柱采用人工操作。加入填料時敲打柱子使填料均勻裝入，柱內(nèi)填料應(yīng)無明顯的斷層或裂紋。填料硅膠和活性炭纖維尺寸大小分別為50～300目和100～200目，裝柱前經(jīng)110℃活化24小時至3天，使其充分干燥，以除去吸附的過量水分。用1～2升乙酸乙酯淋洗，收集淋洗液，濃縮至300mL左右，通臭氧處理3～6小時。集中1000mL臭氧處理的溶液，加入60～100克50～100目硅膠，常溫低壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。干法上樣于圖2所示承接器2中。于圖2淋洗液貯器1中加入淋洗液組分a4～8升，在0.03～0.8Mpa壓力下淋洗。待組分a全部流出后，依次加入淋洗液組分b2-6升，組分c2-16升，組分d4-6升，承接各段餾分A～D。整個淋洗過程約2～3小時。
分別收集各段淋洗液，餾分A～D經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，餾出的溶劑或淋洗液精餾后可反復(fù)使用，避免直接排放造成污染。濃縮液經(jīng)-40℃～-20℃真空冷凍干燥，分離得到淋洗液A～D中各種化合物。高效液相色譜分析與標(biāo)準(zhǔn)品相對照，A～B中不含紫杉醇，C中含約1％的紫杉醇，D餾分用部分收集器收集的餾分約45％部分含99.5～99.9％的紫杉醇。對產(chǎn)物D的部分一次收集物的質(zhì)譜分析表明，其質(zhì)量為853.4。分離得到的紫杉醇為白色結(jié)晶狀粉末。熔點為215.6℃，旋光度為-49°(甲醇溶液中)。
未經(jīng)臭氧處理的紫杉醇原料的高效液相色譜圖如圖3所示，從中可以觀察到taxol(I)與cephalomannine(II)極性相近，難于分離。經(jīng)過臭氧處理的紫杉醇原料的高效液相色譜圖如圖4所示，從中可以觀察到cephalomannine與臭氧進(jìn)行了反應(yīng)，產(chǎn)物(II)的極性與taxol(I)相差很大，便于分離。D餾分中一次收集高純度紫杉醇的高效液相色譜圖如圖5所示，從中可以觀察到被氧化后的雜質(zhì)完全除去，從而得到了高純度的紫杉醇。經(jīng)過對D餾分中一次所收集的成分進(jìn)行核磁共振分析，可以從結(jié)構(gòu)上確證此產(chǎn)物為紫杉醇。
本方法中，使用過的中壓快速分離制備色譜柱，經(jīng)過18升乙酸乙酯(100％)沖洗，可以連續(xù)使用50次以上。
本方法中，純度較低的紫杉醇組分A、B、C回收后，可繼續(xù)進(jìn)行分離。
本方法中，使用后的硅膠及活性碳纖維從柱中取出分開收集，在馬福爐中110℃下烘干5小時，然后升溫至300℃焙燒48小時。該方法處理的硅膠及活性碳纖維，可反復(fù)使用8次以上。
本方法中，蒸發(fā)收集所得的溶液和淋洗液經(jīng)精餾分離，甲醇、乙酸乙酯、正構(gòu)烷烴可回收利用。
本發(fā)明提出的紫杉醇純化方法，工藝簡單，很容易分離除掉紫杉醇的伴生物，產(chǎn)品純度很高，可適用于較大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
圖1臭氧處理純化紫杉醇的流程2快速分離制備色譜工作示意3未經(jīng)臭氧處理的紫杉醇原料的高效液相色譜4經(jīng)臭氧處理的紫杉醇原料的高效液相色譜5D餾分中一次收集高純度紫杉醇的高效液相色譜中標(biāo)號1為淋洗液存貯器，2為承接器，3為FLASH150I徑向壓縮柱組件，4為部分收集器，5為壓縮空氣，6為壓力指示表。
實施例1稱取51％紫杉醇30.0克，溶于300mL乙酸乙酯溶劑中，配制成5.1％紫杉醇溶液。直接通入200mL/min流量的臭氧處理4小時。集中1000mL臭氧處理的溶液，加入80克50～100目硅膠，常溫低壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。干法上樣于圖2所示承接器“2”中。于圖2中淋洗液貯器“1”中加入淋洗液組分a＝100％正己烷6升，在0.4MPa壓力下淋洗。待組分a全部流出后，依次加入淋洗液組分b(正己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)4升，組分c(正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)8升，組分d(正己烷∶乙酸乙酯＝1∶2)8升，承接后分別對應(yīng)于餾分A～D。整個淋洗過程約2.5小時。
收集各段淋洗液，餾分A～D經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，餾出的溶劑或淋洗液精餾后可反復(fù)使用，避免直接排放造成污染。濃縮液經(jīng)-40℃真空冷凍干燥，分離得到淋洗液A～D中各種化合物。高效液相色譜分析與粗產(chǎn)物各組分相對照，A～B中不含紫杉醇，C中含約1％的紫杉醇，D餾分用部分收集器收集的餾分約28％部分含99.5～99.9％的紫杉醇(如圖5所示)，對產(chǎn)物D的質(zhì)譜分析表明，其質(zhì)量為853.4。分離得到的紫杉醇為白色結(jié)晶狀粉末。熔點為215.6℃，旋光度為-49°(甲醇溶液中)。
實施例2取10％紫杉醇30克溶于300mL乙酸乙酯，配制成1.0％紫杉醇溶液。加入20克硅膠，常溫低壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，轉(zhuǎn)移至自制的預(yù)處理柱處理(預(yù)處理柱長70cm，柱φ6cm，下端有聚四氟乙烯活塞，活塞上端填充0.5克玻璃纖維，裝柱采用人工操作。加入填料時敲打柱子使填料均勻裝入，柱內(nèi)填料應(yīng)無明顯的斷層或裂紋。填料硅膠和活性炭纖維尺寸大小分別為50～300目和100～200目，裝柱前經(jīng)110℃活化24小時至3天，使其充分干燥，以除去吸附的過量水分)。用2升乙酸乙酯淋洗，收集淋洗液，濃縮至300mL左右，通臭氧處理4小時。然后同上，集中1000mL臭氧處理的溶液，加入800克50～100目硅膠，常溫低壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。干法上樣于圖2所示承接器2中。于圖2淋洗液貯器中”1”加入淋洗液組分e＝100％正己烷4升，在0.5MPa壓力下淋洗。待組分e全部流出后，依次加入淋洗液組分f(正己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)5升，組分g(正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)4升，組分h(正己烷∶乙酸乙酯＝1∶2)8升，承接后分別對位于餾分A～D。整個淋洗過程約2小時。
收集各段淋洗液，餾分A～D經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，餾出的溶劑或淋洗液精餾后可反復(fù)使用，避免直接排放造成污染。濃縮液經(jīng)-40℃真空冷凍干燥，分離得到淋洗液A～D中各種化合物。高效液相色譜分析與粗產(chǎn)物各組分相對照，A～B中不含紫杉醇，C中含約1％的紫杉醇，D餾分用部分收集器收集的餾分約25％部分含99.5～99.9％的紫杉醇。產(chǎn)物D的部分一次收集物質(zhì)譜分析表明，其質(zhì)量為853.4。分離得到的紫杉醇為白色結(jié)晶狀粉末。熔點為215.6℃，旋光度為-49°(甲醇溶液中)。
權(quán)利要求
1.一種使用臭氧處理制備高純度紫杉醇的方法，以紫杉醇粗產(chǎn)品為原料，采用分析純正構(gòu)烷烴、乙酸乙酯為溶劑或淋洗液試劑，其特征是在于先將紫杉醇原料溶解于乙酸乙酯溶液中，然后經(jīng)過臭氧處理，再加入硅膠，蒸發(fā)至干后，干法上樣，使用中壓快速分離制備色譜柱分離上述產(chǎn)物，依次經(jīng)過下述4種組分梯度淋洗液進(jìn)行淋洗處理a.100％正己烷，b.正己烷∶乙酸乙酯＝1.5∶1～2∶1，c.正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1～1.5∶1，d.正己烷∶乙酸乙酯＝0.5∶1～0.75∶1；對應(yīng)于各段淋洗餾分分別為A、B、C、D，承接餾分A、B、C、D；常溫真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、濃縮、冷凍至干，從D餾分中獲取高純度紫杉醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫杉醇臭氧處理純化方法，其特征在于采取如下步驟稱取10～51％紫杉醇10～30克，溶于200～400mL乙酸乙酯溶劑中，制成1～5.1％紫杉醇溶液；直接通入100～300mL/min流量的臭氧處理3～6小時；集中500～1000mL臭氧處理的溶液，加入60～100克50～100目硅膠，常溫低壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；干法上樣于承接器中；于淋洗液貯器中加入淋洗液組分a4～8升，在0.03～0.8Mpa壓力下淋洗；待組分a全部流出后，依次加入淋洗液組分b2-6升，組分c2-16升，組分d4-6升，承接各段餾分A～D；整個淋洗過程約2～3小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫杉醇臭氧處理純化方法，其特征在于采取如下步驟10～51％紫杉醇10～30克溶于200～400mL乙酸乙酯，制成1～5.1％紫杉醇溶液；加入10～30克硅膠，常溫低壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，轉(zhuǎn)移至預(yù)處理柱處理，預(yù)處理柱長50～80cm，柱φ2～8cm，下端有聚四氟乙烯活塞，活塞上端填充0.5克玻璃纖維；填料硅膠和活性炭纖維尺寸大小分別為50～300目和100～200目，裝柱前經(jīng)110℃活化24小時至3天，使其充分干燥，以除去吸附的過量水分；用1～2升乙酸乙酯淋洗，收集淋洗液，濃縮至300mL左右，通臭氧處理3～6小時；集中1000mL臭氧處理的溶液，加入60～100克50～100目硅膠，常溫低壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；干法上樣于承接器中；于淋洗液貯器中加入淋洗液組分a4～8升，在0.03～0.8Mpa壓力下淋洗；待組分a全部流出后，依次加入淋洗液組分b2-6升，組分c2-16升，組分d4-6升，承接各段餾分A～D；整個淋洗過程約2～3小時。
全文摘要
本發(fā)明是一種臭氧處理制備高純度紫杉醇的方法。它以紫杉醇粗產(chǎn)品為原料,可采用臭氧直接處理和后臭氧處理兩種方式。直接方式是將臭氧直接通入溶有紫杉醇原料的溶液,然后經(jīng)過中壓快速分離制備色譜柱,經(jīng)淋洗處理,分離得到99.4～99.9%的紫杉醇。后臭氧方式是將紫杉醇粗產(chǎn)物經(jīng)層析硅膠填充柱用淋洗液預(yù)處理后,再用臭氧處理,經(jīng)過中壓快速分離制備色譜柱,經(jīng)淋洗處理,分離得到99.5～99.9%的紫杉醇。該方法工藝簡單,容易分離掉紫杉醇的伴生物,適用于較大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07D305/00GK1240789SQ9911375
公開日2000年1月12日 申請日期1999年5月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月28日
發(fā)明者陳建民, 薛軍, 張黎, 卜海山, 王康躍, 鮑余欽 申請人:復(fù)旦大學(xué)