專利名稱：抗肝癌單克隆抗體HAb25及其單鏈抗體和雙功能抗體的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明主要涉及基因工程。
按照世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，全世界每年就有100余萬患者死與肝癌，而我國肝癌的發(fā)病率占全世界的40％。目前國外的Shouval及Dunk等和國內(nèi)的謝弘等都報道了抗肝癌單克隆抗體，同時也有抗鐵蛋白單克隆抗體的報道，其中的一些單克隆抗體用131I標記后，進行了有效的臨床肝癌放射免疫顯像。然而對于基因工程抗體而言，雖然抗結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤的基因工程鼠/人嵌合抗體、單鏈抗體等已有報道，但抗肝癌的基因工程抗體國內(nèi)外目前尚未見報道。
單克隆抗體早已用于腫瘤的治療研究，但隨著研究的深入，鼠源性單克隆抗體暴露出許多不足之處，主要在于①單克隆抗體分子量大，穿透能力低，不易穿透腫瘤毛細血管；②鼠源性單克隆抗體免疫原性高，人體應用會產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)，限制了它的重復使用。
本發(fā)明的目的是利用基因工程將單克隆抗體改造成單鏈抗體，用于克服上述缺點，進一步構(gòu)建雙功能抗體又賦予了抗體新的功能，使其具有導向殺傷活性，這使對肝癌的診斷和治療研究又向前推進了一步。
本發(fā)明實施的技術(shù)方案一.抗肝癌單克隆抗體HAb25的制備用外科手術(shù)切除的新鮮的原發(fā)性肝細胞肝癌標本制備肝癌細胞懸液為免疫原免疫BALB/C小鼠，采用腹腔免疫途徑，選擇了腹腔巨噬細胞或胸腺細胞作為飼養(yǎng)細胞。將免疫后的小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合，獲得雜交瘤細胞，用石蠟切片進行免疫組織化學方法篩選，凡與正常肝細胞石蠟切片不反應而與肝癌切片反應的予以保留，得到可持續(xù)分泌抗體的抗肝癌單克隆抗體HAb25雜交瘤細胞株，將HAb25雜交瘤細胞株接種于小鼠腹腔，收集腹水，腹水內(nèi)蛋白經(jīng)硫酸胺沉淀和陽離子常壓液相色譜純化，獲得HAb25活性蛋白。HAb25經(jīng)檢測證明具有較強的特異性和較高的親和力，具體表現(xiàn)在1.肝細胞肝癌石蠟切片陽性反應率為84％(79/94)，與癌周肝、肝炎、肝血管瘤、肝囊腫和肝轉(zhuǎn)移瘤無交叉反應，與肝硬化只有5.7％(3/53)的交叉反應。
2.經(jīng)膠體金標記后，在4℃下與肝癌細胞作用1小時后，37℃下培養(yǎng)0、5、10、20、30、60、120分鐘后，在電經(jīng)電鏡下觀察到抗體通過胞飲、被覆內(nèi)陷、絨毛折斷吞噬、糖萼內(nèi)陷及直接擴散途徑內(nèi)化到肝癌細胞
3.HAb25經(jīng)131I標記后，注入荷人肝癌裸鼠，72小時可在腫瘤部位清晰顯像(ECT)，T/N值為6.84。
4.HAb25經(jīng)131I標記后以3-5mci/人注入5名疑為肝癌的病人，其中4例在ECT下可顯像。HAb25和藥物的免疫交聯(lián)物對荷人肝癌裸鼠有一定治療作用。
二、抗肝癌單鏈抗體(scFv25)的制備從HAb25雜交瘤細胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR法擴增出單克隆抗體HAb25的輕、重鏈可變區(qū)基因(VL，VH)，經(jīng)分析是重排的IgV區(qū)基因。將VL和VH通過人工合成的多肽Linker連接起來，形成一個分子量只有全抗體1/6的活性抗體分子。具體說明如下1.取HAb25雜交細胞株，提取總RNA，經(jīng)Oligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加輕、重鏈引物經(jīng)PCR擴增出VL和VH，克隆入pUC19質(zhì)粒載體并進行序列分析，與已知IgV序列比較，有較高的同源性，并有新抗體的一定變異，成功的獲得了HAb25的輕、重鏈可變區(qū)基因VL、VH。
2.單鏈抗體的構(gòu)建先將人工合成的短肽Linker克隆入pUC19克隆載體，構(gòu)建成pUC19-Linker，進一步將VL克隆入pUC19-Linker，構(gòu)建成pUC19-Linker-VL，再將VH克隆入pUC19-Linker-VL，構(gòu)建成pUC19-VH-Linker-VL，即重組抗肝癌單鏈抗體克隆載體pUC19-scFv25，然后將scFv25亞克隆入pET15b，構(gòu)建成抗肝癌單鏈抗體的重組原核表達載體pET15b-scFv25。
3.scFv25的誘導表達重組pET15b-scFv25原核表達載體宿主菌經(jīng)IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導表達，收集菌體→提取包涵體→變性→復性→進一步純化，獲得抗肝癌單鏈抗體scFv25活性蛋白。
4.scFv25的活性測定scFv25與SMMC-7721肝癌細胞作用封閉抗原后加親本抗體HAb25，作用后加FITC標記的羊抗鼠IgG，以親本抗體自身及無關抗體作對照。流式細胞儀測定結(jié)果顯示，scFv25可封閉親本抗體53％的親和活性。
優(yōu)點單鏈抗體分子量小、穿透能力強、免疫原性低、半衰期短、血循環(huán)及全身廓清快和容易基因工程大量生產(chǎn)等優(yōu)點，是一種非常具有臨床應用潛力的基因工程抗體。
三、抗肝癌單鏈雙功能抗體的制備利用基因工程手段將具有對肝癌細胞特異結(jié)合活性的HAb25單鏈抗體與PE40(假單胞桿菌外毒素)或人腫瘤壞死因子α(TNFα，由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的免疫種屬特異性的腫瘤細胞殺傷因子)基因偶聯(lián)，構(gòu)建抗肝癌雙功能抗體，并克隆入原核表達載體進行表達。
1.pBV220-scFv25-PE40抗肝癌單鏈免疫毒素的構(gòu)建，表達及其細胞毒作用將保持親本抗體HAb25對肝癌細胞特異結(jié)合活性的scFv25基因，與PE切除第4-252氨基酸的突變子PE40基因偶聯(lián)，構(gòu)建抗肝癌單鏈免疫毒素scFv25-PE40，然后克隆入原核表達載體pBV220，構(gòu)建成重組pBV220-scFv25-PE40抗肝癌單鏈免疫毒素原核表達載體。其具體實施步驟如下(1)抗肝癌單鏈免疫毒素的構(gòu)建構(gòu)建成pBV220scFv25，然后再將PE40基因克隆入pBV220scFv25中，使PE40基因緊接于scFv25的3’端，構(gòu)建成pBV220scFv25-PE40原核表達載體。
(2)pBV220scFv25-PE40的誘導表達及純化重組pBV220scFv25-PE40表達載體，經(jīng)42℃熱誘導表達，收集菌體并提取包涵體，再經(jīng)變性，復性，進一步純化，獲得純度達到電泳純的抗肝癌單鏈免疫毒素scFv25-PE40。
(3)抗肝癌單鏈免疫毒素scFv25-PE40的免疫活性測定以scFv25-PE40為一抗，以鼠抗PE40抗體為二抗，以FITC標記的羊抗鼠IgG為三抗，對HCC-9204肝癌細胞涂片進行間接免疫熒光染色，結(jié)果顯示，scFv25-PE40能夠與肝癌細胞特異性結(jié)合。
(4)細胞毒性實驗按MTT法進行抗肝癌scFv25-PE40對HCC-9204細胞的毒性實驗，結(jié)果顯示，抗肝癌scFv-PE40對肝癌細胞具有明確的選擇性殺傷作用。
2.重組pGEX 4T-1-scFv25-TNFα抗肝癌單鏈雙功能抗體的構(gòu)建，表達及其導向治療作用(1)將TNFα基因克隆入pGEX 4T-1-scFv25，構(gòu)建重組pGEX 4T-1-scFv25-TNFα原核表達載體。
(2)抗肝癌scFv25-TNFα的純化重組pGEX 4T-1-scFv25-TNFα宿主菌經(jīng)IPTG誘導表達，收集菌體→提取包涵體→變性→復性→GST親和層析純化→凝血酶消化和進一步純化，獲得抗肝癌雙功能抗體scFv25-TNFα活性蛋白。
(3)間接免疫熒光染色結(jié)果顯示，scFv25-TNFα較好地保持了親本抗體的特異性結(jié)合活性；MTT實驗顯示，scFv25-TNFα對肝癌細胞SMMC-7721的細胞毒作用明顯；在荷人肝癌裸鼠體內(nèi)進行的導向治療實驗顯示，scFv25-TNFα可使2mm直徑的肝癌包塊完全緩解，所以scFv25-TNFα有較大的臨床應用潛力。
抗肝癌基因工程重組免疫毒素具有以下特點分子量小，易于穿透血管進入腫瘤中心發(fā)揮作用，抗瘤效力較高；以融合蛋白形式存在，分子穩(wěn)定性好；由于已取除毒素的受體結(jié)合域，只保留了生物毒性部分，有效降低了毒副作用；重組免疫毒素也具有容易通過基因工程大量生產(chǎn)的特點。上述工作為進一步的基礎研究和臨床應用奠定了基礎。
權(quán)利要求
1.抗肝癌單克隆抗體HAb25及其單鏈抗體和雙功能抗體，其特征在于(1)抗肝癌單克隆抗體HAb25以外科手術(shù)切除的新鮮的原發(fā)性肝細胞肝癌標本制備的肝癌細胞懸液為免疫原免疫BALB/C小鼠。將免疫后的小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合，獲得雜交瘤細胞，雜交瘤細胞用免疫組織化學方法篩選，得到可持續(xù)分泌抗體的抗肝癌單克隆抗體HAb25雜交瘤細胞株，將該細胞株接種于小鼠腹腔，收集腹水，腹水內(nèi)蛋白經(jīng)硫酸胺沉淀和陽離子常壓液相色譜純化，獲得HAb25活性蛋白。(2).抗肝癌單鏈抗體(scFv25)①HAb25輕、重鏈可變區(qū)基因(VL，VH)的克隆從上述雜交瘤細胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR法擴增出單克隆抗體HAb25的輕、重鏈可變區(qū)基因，經(jīng)分析是重排的IgV區(qū)基因。②抗肝癌單鏈抗體scFv25的構(gòu)建先將人工合成的短肽Linker克隆入pUC19克隆載體，構(gòu)建成pUC19-Linker，進一步將VL克隆入pUC19-Linker，構(gòu)建成pUC19-Linker-VL，再將VH克隆入pUC19-Linker-VL，構(gòu)建成pUC19-VH-Linker-VL，即重組抗肝癌單鏈抗體克隆載體pUC19-scFv25，然后將scFv25亞克隆入pET15b，構(gòu)建成分子量只有全抗體1/6的抗肝癌單鏈抗體的重組原核表達載體pET15b-scFv25。③pET15b-scFv25的誘導表達重組pET15b-scFv25原核表達載體宿主菌經(jīng)IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導表達，收集菌體→提取包涵體→變性→復性→進一步純化，獲得抗肝癌單鏈抗體scFv25活性蛋白。(3)抗肝癌雙功能抗體①抗肝癌單鏈免疫毒素(scFv25-PE40)的構(gòu)建、表達將PE40基因克隆入pUC19-scFv25中，構(gòu)建成pUC19-scFv25-PE40重組抗肝癌單鏈免疫毒素克隆載體，然后再將scFv25-PE40亞克隆入原核表達載體pBV220中，構(gòu)建成pBV220-scFv25-PE40，即重組抗肝癌單鏈免疫毒素原核表達載體pBV220-scFv25-PE40。上述載體宿主菌經(jīng)42℃誘導表達，收集菌體→提取包涵體→變性→復性→進一步純化，獲得抗肝癌單鏈免疫毒素scFv25-PE40活性蛋白。②抗肝癌雙功能抗體(scFv25-TNFα)的構(gòu)建、表達將TNFα基因克隆入pUC19-scFv25中，構(gòu)建成pUC19-scFv25-TNFα重組抗肝癌雙功能抗體克隆載體，然后再將scFv25-TNFα亞克隆入原核表達載體pGEX 4T-1中，構(gòu)建成pGEX4T-1-scFv25-TNFα，即重組抗肝癌單鏈雙功能抗體原核表達載體pGEX 4T-1-scFv25-TNFα。上述載體宿主菌經(jīng)IPTG誘導表達，收集菌體→提取包涵體→變性→復性→GST親和層析純化→凝血酶消化和進一步純化，獲得抗肝癌雙功能抗體scFv25-TNFα活性蛋白。
全文摘要
抗肝癌單克隆抗體HAb25及其基因工程單鏈抗體和雙功能抗體,主要涉及基因工程技術(shù)。其主要技術(shù)特征是,首先利用雜交瘤技術(shù)制備出對人肝癌細胞具有特異結(jié)合活性的鼠源性單克隆抗體HAb25;進而通過基因工程技術(shù)將HAb25改造構(gòu)建成抗肝癌單鏈抗體scFv
文檔編號C07K16/30GK1241574SQ9811290
公開日2000年1月19日 申請日期1998年7月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月2日
發(fā)明者劉彥仿 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學