專(zhuān)利名稱：低聚糖的合成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及合成低聚糖的方法，尤其是涉及低聚糖的固相或聯(lián)合合成(combinatorial synthesis)的方法。本發(fā)明提供了一種新型的連接體-樹(shù)脂，連接體-糖，或樹(shù)脂-連接體-糖絡(luò)合物，在一個(gè)實(shí)施方案中該絡(luò)合物使得糖的殘基能被連接到一可溶或不溶聚合物載體上以用作固相合成低聚糖地基礎(chǔ)。在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的絡(luò)合物使得低聚糖能被連接到一固體聚合物載體上以用作分析試劑。
背景技術(shù)：
低聚糖構(gòu)成了生物活性聚合物的一個(gè)主要類(lèi)別，涉及到如細(xì)胞的分化(cellular differentiation)，荷爾蒙細(xì)胞識(shí)別以及細(xì)胞-細(xì)胞粘著等各種生化過(guò)程(Lasky,1992；Varki,1993)，尤其是病毒-寄主細(xì)胞(Gambaryan等，1995)和細(xì)菌-寄主細(xì)胞的吸附(Boren等，1993)。因此強(qiáng)烈地暗示著如癌癥，心血管失調(diào)，微生物感染，移植排斥以及自免疫失調(diào)等疾病與低聚糖有關(guān)。碳水化合物與生物活性肽的共軛也被證明能穩(wěn)定肽使其不降解，并在更特定環(huán)境下有助于肽越過(guò)生物障礙(Lee,1989；Fisher,1991；Rodriguez,1989)。因此，以容易而有效的方法合成低聚糖的能力目前正在成為有機(jī)化學(xué)中一個(gè)極其重要的領(lǐng)域。
迄今為止合成低聚糖所用的高勞動(dòng)強(qiáng)度的溶液相法要求極其專(zhuān)業(yè)化的知識(shí)和高度的化學(xué)技巧。這一狀況在肽的合成方面有反映，直到Merrifield等于30年前(Merrifield,1963)提出并發(fā)展了肽的固相合成法(Solid Phase Peptide Synthesis,SPPS)。在SPPS中，將所需序列的第一氨基酸固定在不溶樹(shù)脂上使得能夠使用大量過(guò)量的試劑以達(dá)到第二個(gè)氨基酸的偶合。偶合步驟末，殘余下來(lái)的任何未用完的材料可以簡(jiǎn)單地通過(guò)洗滌樹(shù)脂珠而除去。這一技術(shù)意味著化學(xué)家可以使得每一偶合反應(yīng)達(dá)到量化的產(chǎn)率，而且由于所形成的肽中間產(chǎn)物仍然附著在樹(shù)脂上，不再需要每個(gè)?；襟E后的凈化操作。SPPS使得肽和多肽的合成可以象常規(guī)研究和合成工具那樣操作，且允許肽的大規(guī)模的聯(lián)合合成以篩選潛在的藥物。
多年來(lái)，化學(xué)家們?cè)噲D將這一固相方法轉(zhuǎn)移到低聚糖的合成上來(lái)，取得了不同程度的成功。第一次嘗試大約是在25年前(Frechet和Schuerch,1971；Frechet和Schuerch,1972；Guthrie等，1971；Guthrie等，1973)。然而，臭氧調(diào)節(jié)的(mediated)脫保護(hù)產(chǎn)物是醛-取代的糖苷。Danishefsky及其同事們描述了Lewisb抗原(Randolph等，1995)和N-連接的糖肽(Roberge等，1995)的通過(guò)起先借助甲硅烷基醚連接將低聚糖的第一個(gè)糖元連接到1％的二乙烯基苯-苯乙烯共聚物載體上的固相合成。在此情況下附著在樹(shù)脂上的那部分糖是烯糖，通過(guò)環(huán)氧化雙鍵得到樹(shù)脂上的活化，所得到的烯糖殘基通過(guò)環(huán)氧化物的親核開(kāi)環(huán)起作糖供體的作用。由于那時(shí)糖化學(xué)家們還沒(méi)有比色法以監(jiān)視樹(shù)脂上的糖基化作用，評(píng)價(jià)反應(yīng)過(guò)程的唯一的方法是通過(guò)低聚糖-樹(shù)脂鍵的溶解(lysisi)和隨后對(duì)分裂產(chǎn)物的分析，通常是通過(guò)薄層色譜法。分裂Danishefsky的甲硅烷基醚連接體所需的四-n-丁基銨氟化物調(diào)節(jié)的脫保護(hù)條件既危險(xiǎn)又緩慢。結(jié)合系留(tethered)烯糖的樹(shù)脂上活化的要求，使得整個(gè)策略和方法遠(yuǎn)不夠理想。
在另一個(gè)方法中，Douglas及其同事們描述了采用聚乙二醇-ω-單甲基醚共聚物和琥珀?；颚?α＇-二氧二醚(dioxyxylyldiether)連接體合成D-甘露戊糖的方法(Douglas等，1995)。反應(yīng)在溶液相中進(jìn)行，未用完的反應(yīng)物的去除是通過(guò)低聚糖-聚合物絡(luò)合物的沉淀以及隨后的洗滌來(lái)完成的。在后一例子中，低聚糖-聚合物鍵的分裂是通過(guò)催化氫化來(lái)完成的，該方法需要將共軛體暴露在latm的H2中48小時(shí)以達(dá)到可觀的產(chǎn)率。同樣這太慢而無(wú)法有效地監(jiān)視各個(gè)糖基化反應(yīng)。Yan等人報(bào)告了在Merrfield樹(shù)脂上的亞砜調(diào)節(jié)的糖基化反應(yīng)，使用苯硫酚連接體來(lái)附著第一個(gè)糖的殘基(Yan等，1994)。這一方法得到了(1-6)-連接的低聚糖的結(jié)構(gòu)，適于用來(lái)合成α-和β-糖苷連接。然而，硫代糖苷的連接在樹(shù)脂上使得在這一方法中無(wú)法使用相似的糖供體。
近來(lái)Rademann和Schmidt報(bào)道了使用三氯亞氨逐乙酸酯(trichloroacetimidate)糖供體得到通過(guò)烷基硫代系留的附著在樹(shù)脂上的糖(Rademann和Schmidt,1996)。然而，同樣，這一方法無(wú)法使用優(yōu)越得多的硫代糖苷糖供體。同時(shí)，Adinolfi等描述了二糖的合成，使用聚乙烯醇-聚苯乙烯樹(shù)脂，通過(guò)琥珀酸間隔基將第一個(gè)糖連接到聚合物載體上(Adinolfi等，1996)。然而，這一連接體所顯示出來(lái)的酸不穩(wěn)定性意味著第一個(gè)糖不能通過(guò)糖苷位置連接到樹(shù)脂上。
上面用例子說(shuō)明了固相合成中的關(guān)鍵因素是固相載體和起始合成子之間的連接體的本性。該連接體必須對(duì)偶合和脫保護(hù)條件具有優(yōu)良的穩(wěn)定性，而在固相低聚糖的合成中，該連接體應(yīng)能快速而有效地分裂以允許對(duì)各個(gè)偶合反應(yīng)過(guò)程的監(jiān)視。分裂最好是通過(guò)使用相對(duì)無(wú)毒的化學(xué)試劑來(lái)達(dá)成。
這樣，很明顯，在這一領(lǐng)域仍然需要簡(jiǎn)單有效而經(jīng)濟(jì)的固相合成低聚糖的方法。
已有報(bào)道在SPPS法中使用聯(lián)氨-不穩(wěn)定伯氨基-保護(hù)基團(tuán)，N-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)乙基(Dde)來(lái)保護(hù)賴氨酸側(cè)鏈(Bycroft等，1993)。當(dāng)2-乙?；?雙甲酮的2-(3-甲基丁酰)雙甲酮類(lèi)似物用4-氨基芐醇來(lái)縮合以得到4-[N-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-3-甲基-丁基]-氨基]芐酯(ODmab)時(shí)，這一基團(tuán)被改性以在SPPS法中用作羧基保護(hù)基團(tuán)(Chan等，1995)。
有報(bào)道說(shuō)這兩個(gè)基團(tuán)對(duì)SPPS過(guò)程中廣泛使用的脫保護(hù)條件，即三氟乙酸(TFA)或二甲基甲酰胺(DMF)中20％的哌啶，是穩(wěn)定的。乙酯，4-[N-(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)乙基)氨基]芐酯(ODab)對(duì)20％的哌啶-DMF顯示出微小但顯著的不穩(wěn)定性。Dde和ODmab均連接在氨基酸上的基團(tuán)上，而不是直接連接在固相載體上。尚未有人建議其在固相低聚糖合成中的使用。
現(xiàn)在我們已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)類(lèi)似于Dde和ODmab的保護(hù)基團(tuán)可以偶合到聚合物載體上，從而產(chǎn)生一個(gè)固定糖的系統(tǒng)。為此，我們采用不同的糖供體已經(jīng)將N-和O-糖苷固定在固體載體和合成的低聚糖上。連接體顯示出對(duì)在現(xiàn)代合成化學(xué)中所遇到的大多數(shù)酸和仲/叔堿優(yōu)異的穩(wěn)定性，而且是快速而有效地與胺，肼或伯氨分裂。
Bannwarth等人獨(dú)立地開(kāi)發(fā)了與Dde保護(hù)基團(tuán)不同的固相連接體，他們用它來(lái)固定用于聯(lián)合的文庫(kù)合成(combinatorial librarysynthesis)的氨基酸和伯氨(Bannwarth等，1996)。然而，這一連接體的合成既費(fèi)時(shí)又低效，而且該連接體對(duì)仲堿，如哌啶只是顯示出有限的穩(wěn)定性。尚未有人認(rèn)為該連接體可以用于低聚糖的合成。我們開(kāi)發(fā)的連接體顯示出比Bannwarth等人的連接體高得多的穩(wěn)定性。
發(fā)明概述
一方面，本發(fā)明提供了一種固相合成低聚糖的載體，該載體包括
a)樹(shù)脂，
b)共價(jià)連接在樹(shù)脂上的連接體，和
c)一個(gè)或多個(gè)通過(guò)連接體共價(jià)連接在樹(shù)脂上的糖基團(tuán)，
其中該連接體是2-取代-1,3-二氧代環(huán)烷烴化合物，并且
所述的載體具有如下化學(xué)式Ⅰ
Ⅰ
其中，R1和R2可以相同或不同，且各自是氫或C1-4烷基；
R′是氨基糖，葡基胺，或是低聚糖的葡基胺；通過(guò)烷基-，取代烷基-，芳基-，取代芳基-，環(huán)烷基-，或取代環(huán)烷-氨基基團(tuán)偶合的單或低聚糖；或通過(guò)羧烷基-，取代羧烷基-，羧芳基-，取代羧芳基-，羧環(huán)烷基-，或取代羧環(huán)烷基-氨基基團(tuán)偶合的單或低聚糖。
R″是直接偶合在樹(shù)脂載體上、或者也可以是通過(guò)合適的共價(jià)連接偶合在樹(shù)脂載體上的烷基，取代烷基，芳基，取代芳基，環(huán)烷基，或取代環(huán)烷基間隔基團(tuán)，它在低聚糖合成和分裂條件下是穩(wěn)定的。
與樹(shù)脂的共價(jià)連接可以合適地由-CONH-,-O-,-S-,-COO-,-CH=N-,-NHCONH-,-NHCSNH，或-NHNH-基團(tuán)提供，如間隔基團(tuán)-CONH-樹(shù)脂，間隔基團(tuán)-O-樹(shù)脂，間隔基團(tuán)-S-樹(shù)脂，間隔基團(tuán)-CO2-樹(shù)脂，間隔基團(tuán)-CH=N-樹(shù)脂，間隔基團(tuán)-NHCONH-樹(shù)脂，間隔基團(tuán)-NHCSNH-樹(shù)脂，間隔基團(tuán)-NHNH-樹(shù)脂。其他可能的共價(jià)連接基團(tuán)對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的。
優(yōu)選R1和R2均是甲基。
優(yōu)選R＇是低聚糖-O-CH2-(C6H4)-NH，單糖-O-CH2-(C6H4)-NH，氨基-低聚糖-CO2CH2-(C6H4)NH，或氨基-單糖-CO2CH2-(C6H4)-NH基團(tuán)。
在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，2-取代-1,3-二氧代環(huán)烷烴連接體是官能化Dde,Ddh或ODmab。在一個(gè)非常特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體包括樹(shù)脂，連接體，和單糖，低聚糖，氨基糖或氨基-低聚糖。
另一方面，本發(fā)明提供了一個(gè)用來(lái)固相合成的載體，包括樹(shù)脂和連接基團(tuán)，其中連接體是具有如下通式Ⅱ的2-取代-1,3-二氧代環(huán)烷烴
Ⅱ
其中，X是OH或NH2；
R1和R2可以相同或不同，且各自是氫或C1-4烷基；優(yōu)選R1和R2均是甲基；且
R″是直接偶合在樹(shù)脂載體上、或是通過(guò)合適的共價(jià)連接選擇性地偶合在樹(shù)脂載體上的烷基-，取代烷基-，芳基-，取代芳基-，環(huán)烷基-，或取代環(huán)烷氨基間隔基團(tuán)，在低聚糖合成和分裂條件下它是穩(wěn)定的。共價(jià)連接可以合適地由-CONH-,-O-,-S-,-COO-,-CH=N-,-NHCONH-,-NHCSNH-，或-NHNH-基團(tuán)提供，如間隔基團(tuán)-CONH-樹(shù)脂，間隔基團(tuán)-O-樹(shù)脂，間隔基團(tuán)-S-樹(shù)脂，間隔基團(tuán)-CO2-樹(shù)脂，間隔基團(tuán)-CH=N-樹(shù)脂，間隔基團(tuán)-NHCONH-樹(shù)脂，間隔基團(tuán)-NHCSNH-樹(shù)脂，間隔基團(tuán)-NHNH-樹(shù)脂。其他可能的共價(jià)連接基團(tuán)對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的。
在第三方面，本發(fā)明提供了一種連接體-糖復(fù)合物，包含具有如上所述的通式Ⅱ的連接體基團(tuán)和一個(gè)如上所述的R′的糖基團(tuán)。
在第四方面，本發(fā)明提供了一種連接體化合物，該化合物帶有適于通過(guò)共價(jià)鍵將伯氨附著到樹(shù)脂上的官能團(tuán)，該共價(jià)鍵在低聚糖的合成和分裂條件下是穩(wěn)定的，所述的化合物具有如下通式Ⅲ
Ⅲ
其中，X是OH或NH2；
R1和R2可以相同或不同，且各自是氫或C1-4烷基；且
R″是烷基-，取代烷基-，芳基-，取代芳基-，環(huán)烷基-，或取代環(huán)烷基間隔基團(tuán)，該基團(tuán)帶有能與官能化的樹(shù)脂反應(yīng)的官能團(tuán)。
優(yōu)選連接體化合物是6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸或其酯。優(yōu)選該酯是芐酯，甲酯，叔丁酯。
就本說(shuō)明書(shū)的目的而言，本說(shuō)明書(shū)中關(guān)于取代基定義中的術(shù)語(yǔ)“取代的”是指被取代基本身被一個(gè)基團(tuán)取代，而這個(gè)基團(tuán)不改變?cè)撊〈偟幕瘜W(xué)特性。優(yōu)選這樣的取代基是鹵素，硝基，氨基，羥基，和硫羥；優(yōu)選鹵素是氯和碘。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員對(duì)具有相似大小和電荷特征并能在給定條件下用作替代物的其他合適的取代基是知道的。
就本說(shuō)明書(shū)的目的而言，如果在室溫下暴露在氨，肼或伯氨化合物的水溶液或DMF溶液中之后該化合物的失重少于10％，那么就認(rèn)為該化合物“對(duì)低聚糖的合成和分裂條件是穩(wěn)定的”。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員能夠決定某特定化合物在使用適于其特定目的的條件下是否足夠穩(wěn)定以用于本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的連接體化合物可以在樹(shù)脂上合成，也可以在溶液中合成。
本發(fā)明還提供了一組用于固相合成或聯(lián)合合成低聚糖的試劑盒，根據(jù)本發(fā)明，包括如上所述的或是
a)樹(shù)脂-連接體-糖載體，
b)連接體-糖絡(luò)合物，或是
c)樹(shù)脂-連接體載體。
該試劑盒也可以選擇性地包括一種或多種其他試劑，如保護(hù)劑，脫保護(hù)劑，和/或適于固相或聯(lián)合合成的溶劑。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員能知道這些合適的其他試劑。根據(jù)所需的用途可以選用不同類(lèi)型的試劑盒。
樹(shù)脂可以是任何能在水和/或有機(jī)溶劑中溶脹的樹(shù)脂，且含有如下取代基的一種鹵素，羥基，羧基，SH,NH2，甲?；?，SO2NH2，或NHNH2，例如甲基二苯甲基胺(methylbenzhydrylamine)(MBHA)樹(shù)脂，氨或羧基tentagel樹(shù)脂，4-硫代戊基芐基AM樹(shù)脂(4-sulphamyl-benzyl AM resin)。其他合適的樹(shù)脂對(duì)本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。
本發(fā)明還提供了一種固相合成低聚糖的方法，包括依次將單或低聚糖基團(tuán)連接到上述載體上的步驟。類(lèi)似地，單或低聚糖結(jié)構(gòu)單元可以是如上所述的。
該方法對(duì)聯(lián)合合成應(yīng)用尤其有用。
連接體化合物可以在溶液中合成或在起始糖基團(tuán)偶合前直接在樹(shù)脂上逐步合成，或先在溶液相合成連接體-起始糖共軛體，然后偶合到固體載體上，然后依次將隨后的糖附著上去。優(yōu)選該第二和所有隨后的糖基團(tuán)在低聚糖鏈中的最后那個(gè)糖被部分脫保護(hù)之后偶合到低聚糖鏈-樹(shù)脂共軛體上去。
本發(fā)明相應(yīng)地提供了一種合成具有如上所述化學(xué)式Ⅰ的連接體基團(tuán)的方法，包括將2-取代-1,3-二氧代環(huán)己烷化合物用二羧酸進(jìn)行C-酰化的步驟。優(yōu)選該二羧酸是通過(guò)形成酯被單保護(hù)的。更優(yōu)選該反應(yīng)被碳二亞胺活化并被N,N＇-二甲基氨基哌啶催化。
反應(yīng)產(chǎn)物可以選擇性地與4-氨基芐醇反應(yīng)以形成4-氨基芐基衍生物。
本發(fā)明還提供了一種合成樹(shù)脂-連接體載體的方法，包括在合適的溶劑中溶脹樹(shù)脂，用二羧酸處理該溶脹樹(shù)脂，和使如此制得的樹(shù)脂與2-取代-1,3-二氧代環(huán)烷烴化合物反應(yīng)的步驟。優(yōu)選在連接體的合成和樹(shù)脂-連接體載體的合成中，2-取代-1,3-二氧代環(huán)烷烴化合物均是5,5-二甲基-1,3-環(huán)己二酮。也優(yōu)選二羧酸是己二酸。
連接在樹(shù)脂-連接體單元上的第一個(gè)糖可以是未保護(hù)的，部分保護(hù)的或完全保護(hù)的糖苷，氨基糖苷，或醚-或氨基-連接的糖，其中偶合通過(guò)一非糖苷位置發(fā)生。
單或低聚糖供體結(jié)構(gòu)單元可以是任何活化糖，包括但不限于原酸酯，硫代原酸酯，氰亞烷基衍生物，1-O-酰基糖，氨基糖，亞氨逐乙酸酯(acetimidates)，三氯亞氨逐乙酸酯，硫代糖苷，氨基糖苷，氨基-低聚糖，低聚糖的糖基胺，糖基硫氰酸酯，戊烯基糖苷，戊烯酰糖苷(pentenoylglycosides)，異戊二烯基糖苷(isoprenyl glycosides)，烯糖，二氨基四甲基磷酸酯(tetramethyl-phosphoro diamidates)，糖二氮雜環(huán)丙烯(sugar diazirines)，硒基糖苷，二硫代磷酸酯，糖基二烷基亞磷酸酯，糖基亞砜和糖基氟化物。
優(yōu)選偶合到樹(shù)脂上的第一個(gè)糖是氨基糖，氨基糖苷，或氨基低聚糖或低聚糖的糖基胺。
優(yōu)選部分糖脫保護(hù)是通過(guò)使用?；停郊子位?，芐基型，乙縮醛型，或各種甲硅烷基和/或光不穩(wěn)定的保護(hù)性基團(tuán)以及永久性保護(hù)基團(tuán)得到的。這使得能通過(guò)在單個(gè)糖供體上使用兩個(gè)正交(orthogonal)羥基保護(hù)基團(tuán)而合成分支的低聚糖。
合成的低聚糖可以用氨，肼或伯胺如丁基胺或環(huán)己胺與樹(shù)脂分裂。就制備氨基糖苷而言，優(yōu)選使用有機(jī)溶劑中的氨或合適的伯胺。就制備酰肼而言，優(yōu)選使用水或有機(jī)溶劑中的肼。就制備低聚糖而言，優(yōu)選使用水或有機(jī)溶劑中的氨，然后酸化。如果連接體含有4-氨芐基部分，在如上所述的分裂以后釋放出的第一個(gè)糖仍然被氨芐基團(tuán)保護(hù)；如果需要，可以通過(guò)氫化來(lái)除去。
本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員能理解低聚糖可以保留在樹(shù)脂上以用作分析或制備試劑，例如在親和色譜法或大規(guī)模的親和分離中。附圖的詳細(xì)描述


圖1所示為固相低聚糖合成所需方法的一般的表示。
圖2說(shuō)明了使用固相方法的低聚糖的文庫(kù)的合成的“分離-偶合-重組”方法的一般的表達(dá)。
圖3所示為本發(fā)明的Dde基連接體的合成，第一個(gè)糖的殘基的附著和糖-連接體共軛體偶合到樹(shù)脂載體上。還顯示了另一種直接在樹(shù)脂上合成連接體的方法。
圖4所示為本發(fā)明的Ddmab基連接體的合成，第一個(gè)糖的殘基的附著和糖-連接體共軛體偶合到樹(shù)脂載體上。
圖5所示為結(jié)合在樹(shù)脂上的肼調(diào)節(jié)的脫保護(hù)產(chǎn)物中低聚糖-連接體鍵的分裂。
圖6所示為一個(gè)糖羥基的選擇性脫保護(hù)和與下一個(gè)糖供體的偶合的一般表示。
圖7所示為將氨基-低聚糖固定的Dde-衍生的載體上。
圖8所示為固相合成的活化糖供體的列表。
圖9所示為不同保護(hù)的硫代糖苷和部分保護(hù)的氨基糖苷的合成。
圖10所示為4-氨芐基改性的連接體的三氯亞氨逐乙酸酯活化。
圖11所示為氨調(diào)節(jié)的氨基糖苷的分裂與分裂后的酸化以產(chǎn)生游離的碳?xì)浠衔铩?br> 圖12所示為使用硫代糖苷作為糖供體的低聚糖合成的一般方法的一個(gè)特定實(shí)施例。
圖13所示為使用硫代糖苷作為糖供體的低聚糖合成的大概方法的另一個(gè)特定實(shí)施例。
圖14所示為與4-氨芐基調(diào)節(jié)的連接體結(jié)合的單糖的分裂。
圖15所示為與樹(shù)脂結(jié)合的完全保護(hù)的三糖的一個(gè)實(shí)施例。
圖16所示為未保護(hù)的氨基糖的固定。
發(fā)明的詳細(xì)描述
此處使用了如下縮寫(xiě)
Bn 芐基
Bu 丁基
DCM 二氯甲烷
Dde N-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)乙基
Ddh-OH 6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸
DMAPN,N’-二甲基氨基吡啶
DMF N,N’-二甲基甲酰胺
DMTST 二甲基(甲基硫代)锍三氟甲烷磺酸酯
EEDQ1-異丁基氧羰基-2-異丁基氧-1,2-二氫喹啉
EtOAc 乙酸乙酯
EtOH 醇
FAB-MS快速原子轟擊質(zhì)譜儀
HRMS 高分辨率質(zhì)譜儀
MBHA 甲基二苯甲基胺樹(shù)脂(methyl benzyhydrylamineresine)
Me甲基
MeOH 甲醇
NMR 核磁共振
ODmab 4-{N-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-3-甲基丁基]-氨基}芐醇
PEG 聚乙二醇
tBu 叔丁基
TFA 三氟乙酸
THF 四氫呋喃
TLC 薄層色譜
TNBS 2,4,6-三硝基苯磺酸
本發(fā)明是基于將Dde-,Ddh或ODmab-基連接體固定到聚合物載體上以系留任何糖或低聚糖基團(tuán)的。這一點(diǎn)已經(jīng)通過(guò)N-和O-糖苷偶合到連接體上得以說(shuō)明，該連接體已被用作在偶合到樹(shù)脂上之后的低聚糖的合成。這些連接體的性質(zhì)以及其固定任何類(lèi)型的糖的潛能，使得任何糖供體均可以隨后用于低聚糖的合成，從而允許快速而有效的偶合程序。合適的糖供體包括但不限于原酸酯，硫代原酸酯，氰亞烷基衍生物，1-O-酰基糖，亞氨逐乙酸酯，三氯亞氨逐乙酸酯，硫代糖苷，氨基糖苷，氨基-低聚糖，低聚糖的糖基胺，糖基硫氰酸酯，戊烯基糖苷，戊烯酰糖苷，異戊二烯基糖苷，烯糖，二氨基四甲基磷酸酯，糖二氮雜環(huán)丙烯，硒基糖苷，二硫代磷酸酯，糖基二烷基亞磷酸酯，糖基亞砜和糖基氟化物。
連接體的穩(wěn)定性是指在糖保護(hù)中能使用正交羥基保護(hù)基團(tuán)。這些基團(tuán)包括但不限于，?；停郊子涡?，芐基型，乙縮醛型，或各種甲硅烷基和光不穩(wěn)定的保護(hù)性基團(tuán)。
連接體合成的容易性是指連接體上的第二官能團(tuán)可以是鹵素，醇，硫醇或仲胺，例如，
X=鹵素，OH,COOH,SH,NHR
相似地，連接體合成的容易性還意味著任何官能化的樹(shù)脂均可以用來(lái)固定連接體，例如MBHA樹(shù)脂，氨基或羧基tentagel樹(shù)脂，4-硫代戊基芐基AM樹(shù)脂等。
雙甲酮與，例如單保護(hù)的二羧酸的C-?；饔猛ㄟ^(guò)碳二亞胺活化、在干的DCM中用DMAP催化縮合可以很容易的達(dá)到。除去酯保護(hù)和第一氨基糖殘基的偶合產(chǎn)生糖-連接體共軛體，該共軛體通過(guò)碳二亞胺調(diào)節(jié)的縮合作用可以很容易地偶合到氨基官能化的樹(shù)脂載體上。這一反應(yīng)可以使用常規(guī)的胺試驗(yàn)如TNBS或水合茚三酮來(lái)監(jiān)視，以確保定量酰化?；蛘?，連接體可以直接在樹(shù)脂上合成，然后向連接體-樹(shù)脂共軛體上引入第一糖殘基。兩種方法均示于圖3。
如果第一個(gè)糖的殘基和樹(shù)脂之間需要醚型連接，那么用4-氨基芐醇改性連接體以產(chǎn)生ODmab型本體使得這一化學(xué)絡(luò)合物形成作用可行，如圖4所示。
在羥基的選擇性脫保護(hù)之后，用任何上述的糖供體偶合第二個(gè)糖的殘基，如圖8所示。一部分樹(shù)脂可以或是用醚，肼或是用伯胺分裂，如圖5所示，分裂混合物用TLC分析以監(jiān)視反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)的結(jié)束是通過(guò)單糖的消失來(lái)指示的。繼續(xù)進(jìn)行隨后的脫保護(hù)和偶合隨后的糖的殘基直到完成所需的低聚糖，如圖1所示。然后除脫保護(hù)性基團(tuán)，并或是用氨，肼，或是用伯氨在合適的溶劑中將低聚糖從樹(shù)脂載體上分裂開(kāi)來(lái)。
本發(fā)明的樹(shù)脂-連接體系統(tǒng)對(duì)聯(lián)合低聚糖文庫(kù)的合成(如圖2所示)以及單或低聚糖的固定(如圖7所示)是理想的。
下面通過(guò)結(jié)合下列非限制性的實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明。實(shí)施例1-5特別保護(hù)的硫代糖苷型糖供體的合成(圖9)1 乙基2,3,4,6-四-O-乙?；?1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷
在CH2Cl2(150ml)中于室溫下將半乳糖五乙酸酯(38.00g,97.43mmol)，(乙基硫代)三甲基硅烷(19.60g,146.15mmol)和三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯(23.60g,106.20mmol)的混合物攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)混合物用CH2Cl2(150ml)稀釋并用1M的Na2CO3溶液(300ml)，水(300ml)洗滌，用MgSO4干燥，濃縮。殘余物用1∶1(v/v)的己烷/二異丙醚結(jié)晶得到乙基2,3,4,6-四-O-乙?；?1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(34.00g,89％)。Rf0.43(己烷/EtOAc1∶1)；FAB MS C16H24O9S(392.3)m/z(％)415[M+Na]+(100),393[M+H]+(20),331(56)。2 乙基4,6-O-苯亞甲基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷
在無(wú)水MeOH(150ml)中于室溫下將乙基2,3,4,6-四-O-乙?；?1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(10g,25.51mmol)，和甲醇鈉(200g,3.7mmol)的混合物攪拌2hr。將反應(yīng)混合物用Amberlite IRA 120(H+)離子交換樹(shù)脂中和并蒸發(fā)。殘余物收集在1∶？的苯甲醛/甲酸(21.2ml)混合物中并在室溫下攪拌90分鐘。反應(yīng)混合物用醚(200ml)稀釋并在-15℃保持2小時(shí)。收集所形成的沉淀并以CHCl3/乙醇10∶3(v∶v)用色譜純化得到乙基4,6-O-苯亞甲基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(8.1g,64.5％)Rf0.64(CHCl3/乙醇10∶3)。3 乙基2,3-二-O-芐基4,6-O-苯亞甲基-β-D-吡喃半乳糖苷
在0℃下往60％的氫化鈉(2.65g,66.34mmol)的60mlDMF懸浮液中滴加60mlDMF中的乙基4,6-O-苯亞甲基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(6.90g,22.11mmol)。將混合物在室溫下攪拌1hr，然后在0℃下滴加芐基溴(11.34g,66.34mmol)。將混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)，并從殘余物中蒸餾出二甲苯(2×50ml)。將殘余物收集在醚(300ml)中并用2×200ml水洗滌。有機(jī)層用MgSO4干燥，蒸發(fā)并從MeOH中結(jié)晶得到乙基2,3-二-O-芐基4,6-O-苯亞甲基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(8.90g,82％)。Rf0.51(己烷/EtOAc1∶1v/v)；1H NMR(CDCl3)δ7.55-7.25(m,15H,15Ar-H),5.47(s,1H,CHAr),4.88-4.75(4d,4H,2CH2Ar),4.44(d,1H,H-1,J1,2=10.89Hz),4.30(dd,1H,H-6＇),4.16(d,1H,H-4),3.97(dd,1H,H-3),3.88(t,1H,H-2),3.60(dd,1H,H-6),3.35(d,1H,H-5),2.90-2.40(m,2H,CH2S),1.33(t,3H,Me)；FAB MS C29H32O5S(492.40)m/z(％)515[M+Na]+(100),493[M+H]+(41),431(53)。4 乙基2,3,6-三-O-芐基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷
在0℃下于THF(60ml)中攪拌粗乙基2,3-二-O-芐基4,6-O-苯亞甲基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(5.4g,10.97mmol)，氰基氫硼化鈉(6.89g,109.7mmol)和幾滴甲基橙指示劑的混合物。慢慢地加入用HCl飽和的THF直到得到永久的粉紅色。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌20分鐘，然后用干NH3中和并蒸發(fā)。將殘余物收集在CHCl3(100ml)中并用飽和NaHCO3溶液(50ml)洗滌，用MgSO4干燥，蒸發(fā)。將殘余物溶解于MeOH(50ml)中，回流10分鐘并蒸發(fā)。將粗產(chǎn)物用1,2-二氯乙烷/乙酸乙酯10∶0.5作為流動(dòng)相的色譜純化得到乙基2,3,6-三-O-芐基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(4.14g,75％)。Rf0.43(1,2-二氯乙烷/EtOAc10∶0.5v/v)；1HNMR(CDCl3)δ7.40-7.26(m,15H,15Ar-H),4.88,4.76,4.73,4.71(4d,4H,2CH2Ar),4.57(s,2H,CH2Ar),4.42(d,1H,H-1,J1,2=9.64Hz),4.10(m,1H,H-4),3.76(dd,1H,H-3),3.67(t,1H,H-2),3.55(m,2H,H-6),2.75(m,2H,CH2S),2.50(bs,1H,OH),1.31(t,3H,CH3)；FAB MS C29H34O5S(494.61)m/z(％)627[M+Cs]+(70),517[M+Na]+(30),495[M+H]+(12)。5 乙基2,3,6-三-O-芐基-4-溴乙?；?1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷
在0℃下于干燥CH2Cl2(60ml)中攪拌乙基2,3,6-三-O-芐基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(4.14g,8.38mmol),對(duì)稱可力丁(sym.Collidine)(3.65g,30.16mmol)，和4-二甲基氨基哌啶的混合物，并在15分鐘內(nèi)滴加溴乙酰溴(2.53,2.57mmol)的CH2Cl2溶液。將反應(yīng)混合物用CH2Cl2(100ml)稀釋并用5％的鹽酸溶液(3×30ml)和飽和NaHCO3溶液(30ml)洗滌。溶液用MgSO4干燥，蒸發(fā)。將殘余物用己烷/EtOAc2∶1作為流動(dòng)相的色譜純化得到乙基2,3,6-三-O-芐基-4-溴乙?；?1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(4.84g,94％)。
1HNMR(CDCl3)δ7.40-7.25(m,15H,15 Ar-H),4.80-4.50(m,6H,3CH2Ar),4.45(d,1H,H-1,J1,2=9.53Hz),2.73(m,2H,CH2S),1.30(t,3H,CH3)；FAB MS C31H35BrO6S(615.56)m/z(％)638[M+Na]+(15),616[M+H]+(32),509(80),463(21),419(18)。實(shí)施例6-10部分保護(hù)的糖基胺的合成(圖9)6 2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基疊氮化物
將1,2,3,4,6-五-O-乙?；拎肴樘?1.17g,3mmol)溶解在干燥的CH2Cl2(15ml)中，然后在氮?dú)庀碌渭尤谆坠柰榛B氮化物(416mg,3.6mmol)和SnCl4(0.18ml)。在室溫下攪拌混合物24小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物用CH2Cl2(40ml)稀釋?zhuān)肕gSO4干燥，蒸發(fā)。殘余物用己烷/EtOAc8∶7(v∶v)作為流動(dòng)相的色譜純化得到2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基疊氮化物(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosly azide)(1.05g,94％)。Rf0.74(己烷/EtOAc8∶7v/v)；1HNMR(CDCl3)δ5.41(d,1H,H-4),5.17(t,1H,H-2),5.04(dd,1H,H-3),4.60(d,1H,H-1,J1,2=10.09Hz),4.19(m,2H,H-6),4.00(m,1H,H-5),2.15-1.98(4s,12H,4OAc)；FAB MSC14H19N3O9(373.32)m/z(％)396[M+Na]+(100),374[M+H]+(35),331(23)。7 4,6-O-苯亞甲基-β-D-吡喃半乳糖基疊氮化物
在無(wú)水MeOH(100ml)中于室溫下將2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基疊氮化物(19.35g,51.79mmol)，和甲醇鈉(200mg,3.7mmol)的混合物攪拌2hr。將反應(yīng)混合物用Amberlite IRA120(H+)離子交換樹(shù)脂中和并蒸發(fā)。殘余物收集在1∶1的苯甲醛/甲酸(52ml)的混合物中并在室溫下攪拌90分鐘。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)并將殘余物收集在醚(60ml)中并在-15℃保持2小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾收集所形成的沉淀并在室溫下干燥得到4,6-O-苯亞甲基-β-D-吡喃半乳糖基疊氮化物(11.8g,78％)。Rf0.64(CHCl3/乙醇10∶1.5)。8 2,3-二-O-芐基-4,6-O-苯亞甲基-β-D-吡喃半乳糖基疊氮化物
在0℃下往60％的氫化鈉(6.21g,155.38mmol)的60mlDMF懸浮液中滴加60mlDMF中的4,6-O-苯亞甲基-β-D-吡喃半乳糖基疊氮化物(11.8g,40.27mmol)。將混合物在室溫下攪拌1hr，然后在0℃下滴加芐基溴(26.57g,155.38mmol)。將混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。將混合物蒸發(fā)，并從殘余物中蒸餾出二甲苯(2×50ml)。將殘余物收集在醚(500ml)中并用2×100ml水洗滌。有機(jī)層用MgSO4干燥并蒸發(fā)，得到粗產(chǎn)物甲基2,3-二-O-芐基-4,6-O-苯亞甲基-β-D-吡喃半乳糖基疊氮化物(19.4g)。9 2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基疊氮化物
在0℃下于THF(80ml)中攪拌粗2,3-二-O-芐基-4,6-O-苯亞甲基-β-D-吡喃半乳糖基疊氮化物(9.00g,19.02mmol)，氰基氫硼化鈉(12.00g,190.2mmol)和幾滴甲基橙指示劑的混合物。慢慢地加入用HCl飽和的THF直到得到永久的粉紅色。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌20分鐘，然后用干NH3中和并蒸發(fā)。將殘余物收集在CHCl3(100ml)中并用飽和NaHCO3溶液(50ml)洗滌，用MgSO4干燥并蒸發(fā)。將殘余物溶解于MeOH(50ml)中，保持回流10分鐘并蒸發(fā)。將粗產(chǎn)物用1,2-二氯乙烷/EtOAc10∶0.4作為流動(dòng)相的色譜純化得到2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基疊氮化物(6.50g,72％)。Rf0.42(1,2-二氯乙烷/EtOAc10∶0.4v/v)；1HNMR(CDCl3)δ7.40(m,15H,15Ar-H),4.90-4.55(m,6H,3CH2Ar),4.06(m,1H,H-4),3.82-3.70(m,3H,H-3,H-2,H-5),3.65(dd,1H,H-6＇),3.60(d,1H,H-1,J1,2=8.64Hz),3.51(dd,1H,H-6)；FAB MS C27H29N3O5(475.40)m/z(％)608[M+Cs]+(10),498[M+Na]+(65),476[M+H]+(25),433(75),341(20)。10 2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基胺
在室溫、氮?dú)庀掠贛eOH(31ml)中將2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基疊氮化物(3.00g,6.31mmol)，丙烷-1,3-二硫醇(3.40g,31.50mmol)，和三乙基氨(3.50g,31.5mmol)的混合物攪拌10小時(shí)。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)并用CHCl3/EtOH10∶0.3v/v的色譜純化得到2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基胺(2.66g,94％)。Rf0.38(CHCl3/EtOH10∶0.3v/v)；FAB MS C27H31NO5(449.33)m/z(％)472[M+Na]+(75),450[M+H]+(100)。實(shí)施例11在溶液中合成糖基胺-Ddh-芐基酯共軛體(圖3)11 N-(芐基6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯-6-基)2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基胺
在室溫下于CH2Cl2(2.0m1)中將芐基6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯(932mg,2.60mmol),2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡基胺的混合物攪拌2天。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)并用己烷/EtOAc1∶1作為流動(dòng)相的色譜純化得到N-(芐基6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯-6-基)2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基胺(N-(benzyl6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)-hexanoate-6-yl)2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl amine)(1.70g,95％)。Rf0.32(己烷/EtOAc1∶1v/v)；1HNMR(CDCl3)δ7.37-7.26(m,5H,5Ar-H),5.40-5.00(m,7H,7糖質(zhì)子)，3.10,2.85(2t,4H,2CH2),2.38(2s,4H,Dde2 CH2),2.06-1.98(4s,12H,4OAc),1.80(m,4H,2CH2),1.02,1.00(2s,6H,Dde2 CH3)；FAB MS C35H45NO13(687.23)m/z(％)710[M+Na]+(35),688[M+H]+(100),356(60)。實(shí)施例12在溶液中合成完全保護(hù)的糖基胺-Ddh共軛體，脫保護(hù)一個(gè)“完全保護(hù)的氨-Ddh酯共軛體”(圖3)12 N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基胺
在室溫下在Pd/C(10％)(200mg)上于MeOH(20ml)中氫化N-(芐基6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯-6-基)2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基胺(1.27g,1.84mmol)10小時(shí)。濾掉催化劑，將濾液蒸發(fā)并用CHCl3/MeOH10∶0.5v/v作為流動(dòng)相的色譜純化得到N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基胺(1.10g,98％)。Rf0.38(CHCl3/MeOH10∶0.5v/v)；1HNMR(CDCl3)δ5.40-5.00(m,7H,7糖質(zhì)子)，3.15,2.86(2t,4H,2CH2),2.45(2s,4H,Dde2 CH2),2.10-1.98(4s,12H,4OAc),1.80-1.65(m,4H,2CH2),1.02,1.00(2s,6H,Dde2CH3)；FAB MS C28H39NO13(597.33)m/z(％)620[M+Na]+(55),598[M+H]+(100)。實(shí)施例13在溶液中合成糖基胺-Ddh-甲基酯共軛體(圖3)13 N-(甲基6-(4,4-二甲基2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯-6-基)2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基胺
重復(fù)反應(yīng)11，不同之處在于使用的是甲基6-羥基6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯而不是芐基6-羥基6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯。產(chǎn)率92％。Rf0.28(己烷/EtOAc1∶1v/v)；FAB MS C29H41NO13(611.45)m/z(％)624[M+Na]+(100),612[M+H]+(34)。實(shí)施例14在溶液中合成糖基胺-Ddh-叔丁酯共軛體(圖3)14 N-(叔丁基6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯-6-基)2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基胺
重復(fù)反應(yīng)11，不同之處在于使用的是叔丁基6-羥基6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯而不是芐基6-羥基6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯。產(chǎn)率96％。Rf0.35(己烷/EtOAc1∶1v/v)；FAB MS C32H47NO13(653.37)m/z(％)676[M+Na]+(80),677[M+H]+(100)。實(shí)施例15在溶液中合成Ddh-羥基芐基酯(圖3)15 芐基6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯
向攪拌的單-芐基己二酸酯(2.36g,10mmol)的干CH2Cl2溶液中加入5,5-二甲基-1,3-環(huán)己二酮(1.4g,10mmol)、N,N＇-二環(huán)己基碳二亞胺(2.1g,10.1mmol)和4-二甲基氨基吡啶(1.22g,10mmol)。將所得到的溶液在室溫下攪拌18小時(shí)。冷卻溶液并過(guò)濾除去沉淀的N,N＇-二環(huán)己基脲。將濾液蒸發(fā)并將殘余物重新溶解在EtOAc(50ml)中并用1M的KHSO4洗滌。用鹽水(92×10ml)洗滌有機(jī)萃取物，干燥(MgSO4)并蒸發(fā)生成白色/黃色非晶形的粉末。急驟硅膠色譜(Flash silicachromatography)(EtOAc/己烷1∶2v/v)得到白色結(jié)晶固體芐基6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯(3.00g,84％)。1HNMR(CDCl3)δ18.10(s,1H,OH),7.30(s,5H,5Ar-H),5.06(s,2H,CH2Ar),3.00(t,2H,CH2),2.47(s,2H,Dde CH2),2.35(t,2H,CH2CO2),2.29(s,2H,Dde CH2),1.65(m,4H,2CH2),1.01(s,6H,2CH3)；FAB MSC21H26O5(358.18)m/z(％)359[M+H]+(100),267(40)；對(duì)HRMS(FAB)的測(cè)定值m/z 359.1858，對(duì)C21H27O5的計(jì)算值(M+H),359.1850。實(shí)施例16通過(guò)脫保護(hù)Ddh-OH酯合成Ddh-OH(圖3)16 6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸
室溫下在Pd/C(10％)(150mg)上于MeOH(20ml)中氫化芐基6-羥基6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯(1.50g,4.19mmol)10小時(shí)。濾掉催化劑，將濾液蒸發(fā)，得到6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸(1.10g,98％)。Rf0.35(己烷/EtOAc2∶1v/v)；FAB MS C14H20O5(268.12)m/z(％)313[M+2Na]+(34),291[M+Na]+(100),269[M+H]+(16)。實(shí)施例17在溶液中合成Ddh-OH甲基酯(圖3)17 甲基6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)己基)-己酸酯
重復(fù)反應(yīng)15，不同之處在于使用的是單-甲基己二酸酯而不是單芐基己二酸酯，得到甲基6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯(2.39g,85％)。Rf0.32(EtOAc/己烷1∶2v/v)；FAB MS C15H22O5(282.22)m/z(％)305[M+H]+(100),283[M+H]+(66)。實(shí)施例18在溶液中合成Ddh-OH叔丁酯(圖3)18 叔丁基6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯
重復(fù)反應(yīng)15，不同之處在于使用的是單-叔丁基己二酸酯而不是單芐基己二酸酯，得到叔丁基6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯(2.62g,81％)。Rf0.36(EtOAc/己烷1∶2v/v)；FAB MS C18H28O5(324.41)m/z(％)347[M+H]+(100),325[M+H]+(43),267(80)。實(shí)施例19通過(guò)脫保護(hù)Ddh-OH叔丁酯合成Ddh-OH(見(jiàn)16，圖3)19 6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸
將叔丁基6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯(100mg,0.30mmol)溶解在CH2Cl2/TFA的1∶1混合物(2ml)中并在室溫下攪拌1小時(shí)。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)得到6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸(0.81g,98％)。實(shí)施例20由環(huán)酐合成Ddh-OH(見(jiàn)16，圖3)20 6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸
在室溫下于無(wú)水吡啶(50ml)中將戊二酐(2.28g,20mmol)，雙甲酮(2.8g,20mmol),4-二甲基氨基吡啶(3.99g,30mmol)的混合物攪拌24小時(shí)。蒸發(fā)反應(yīng)混合物并將殘余物收集在CHCl3(100ml)中，用5％HCl溶液(3×25ml)、飽和NaHCO3溶液洗滌，在MgSO4上干燥并蒸發(fā)。以醚/乙酸(10ml∶1滴)作為流動(dòng)相的色譜純化殘余物得到6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸(2.28g,45％)。實(shí)施例21在溶液中用Ddh-OH合成完全保護(hù)的糖基胺-Ddh共軛體(見(jiàn)12，圖3)2l N-(6-4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基胺
在回流下于無(wú)水乙醇中將6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸(400mg,1.49mmol)、2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基胺(259mg,0.74mmol)的混合物攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)并用CHCl3/MeOH10∶0.5v/v的色譜純化得到N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基胺(410mg,92％)。實(shí)施例22在溶液中用Ddh-OH合成部分保護(hù)的糖基胺-Ddh共軛體(圖3)22 N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基胺
重復(fù)反應(yīng)21，區(qū)別是使用的是2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基胺而不是2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基胺，得到N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基胺(299mg,90％)。Rf0.34(CHCl3/MeOH10∶0.1v/v)FAB MS C37H43NO7(613.41)m/z(％)649[M+2Na]+(34),626[M+Na]+(100),614[M+H]+(65)。實(shí)施例23在溶液中合成Ddh-氨芐基連接體(圖4)23 N-(6-4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)4-氨基-芐醇
重復(fù)反應(yīng)21，區(qū)別是使用4-氨基芐醇而不是2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基胺，得到N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)4-氨基芐醇(259mg,94％)。Rf0.40(EtOAc/己烷/乙酸2∶1∶0.1v/v/v)；FAB MS C21H27NO5(373.43)m/z(％)418[M+2Na]+(24),396[M+Na]+(100),374[M+H]+(35)。實(shí)施例24在溶液中合成Ddh-氨芐基叔丁酯連接體(圖4)24 N-(叔丁基6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯-6-基)4-氨基芐醇
在回流下于無(wú)水乙醇中將叔丁基6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯(400mg,1.23mmol)和4-氨基芐醇(605mg,4.92mmol)的混合物攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)并用CHCl3/MeOH9∶1作為流動(dòng)相的色譜純化得到N-(叔丁基6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酯-6-基)4-氨基芐醇(395mg,75％)。Rf0.52(CHCl3/MeOH9∶1v/v)FAB MS C25H35NO5(429.53)m/z(％)452[M+Na]+(100),430[M+H]+(32),372(64)。實(shí)施例25在溶液中合成Ddh-氨芐基叔丁酯三氯亞氨逐乙酸酯活化的連接體(圖4)25 N-(叔丁基6(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯-6-基)4-氨芐基三氯亞氨逐乙酸酯
在0℃下于CH2Cl2(5ml)中攪拌N-(叔丁基6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯-6-基)4-氨基芐醇(500mg,1.16mmol)和三氯乙腈(503mg,3.49mmol)的混合物，并加入1,8-二氮雜二環(huán)(5.4.0)十一-7-烯(1,8-diazabicyclo(5.4.0)undec-7-ene)(5mg,0.03mmol)。將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌90分鐘，在室溫下攪拌2小時(shí)，然后蒸發(fā)。殘余物用EtOAc/己烷1∶1作為流動(dòng)相的色譜純化得到N-(叔丁基6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯-6-基)4-氨芐基三氯亞氨逐乙酸酯(580mg,87％)。Rf0.41(EtOAc/己烷1∶1v/v)；FAB MS C27H35Cl3N2O5(573.94)m/z(％)595[M+Na]+(100),753[M+H]+(40),515(39),430(54)。實(shí)施例26通過(guò)三氯亞氨逐乙酸酯活化合成完全保護(hù)的糖(糖-連接體鍵不在糖苷的位置)-Ddh-氨芐基叔丁酯共軛體(圖4)26 芐基2-乙酰氨基-3-O-乙酸基-6-O-芐基-2-脫氧-4-O-[N-(叔丁基6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯-6-基)4-氨芐基]-α-D-吡喃葡糖苷
在20℃、氮?dú)庀孪蚱S基2-乙酰氨基-3-O-乙?；?6-O-芐基-2-脫氧-α-D-吡喃葡糖苷(155mg,0.35mmol)的CH2Cl2(6ml)溶液中加入N-(叔丁基6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯-6-基)4-氨芐基三氯亞氨逐乙酸酯(400mg,0.70mmol)。加入三氟甲烷磺酸的醚溶液(0.1M,0.06ml)，將混合物在20℃下攪拌30分鐘。反應(yīng)用5％的NaHCO3溶液(0.25ml)中止。將混合物過(guò)濾并將濾液蒸發(fā)后，粗產(chǎn)物用EtOAc/己烷2∶1v/v作為流動(dòng)相的色譜純化得到芐基2-乙酰氨基-3-O-乙?；?6-O-芐基-2-脫氧-4-O-[N-(叔丁基6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯-6-基)4-氨芐基]-α-D-吡喃葡糖苷(210mg,71％)。Rf0.37(EtOAc/己烷2∶1v/v)；FAB MS C49H62N2O11(855.01)m/z(％)877[M+Na]+(100),855[M+H]+(35),797(73)。實(shí)施例27通過(guò)三氯亞氨逐乙酸酯活化合成完全保護(hù)的糖苷(糖-連接體鍵在糖苷的位置)-Ddh-氨芐基連接體-樹(shù)脂(圖4)27 [N-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)4-氨芐基]2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖苷MBHA樹(shù)脂共軛體
在20℃、氮?dú)庀孪?,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖(121mg,0.35mmol)的CH2Cl2(6ml)溶液中加入N-(叔丁基6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯-6-基)4-氨芐基三氯亞氨逐乙酸酯(400mg,0.70mmol)。加入三氟甲烷磺酸的醚溶液(0.1M,0.06ml)，將混合物在20℃下攪拌30分鐘。反應(yīng)用5％的NaHCO3溶液(0.25ml)中止。將混合物過(guò)濾后將蒸發(fā)濾液。將未純化殘余物收集在5ml的CH2Cl2/TFA混合液(1∶1)中，在室溫下攪拌1小時(shí)并蒸發(fā)。將所得的酸溶解在CH2Cl2(5ml)中，加入N,N’-二異丙基碳二亞胺(128mg,1mmol)，將混合物與MBHA樹(shù)脂(100mg)(在DMF中溶脹20分鐘)一起緩慢攪拌30分鐘。實(shí)施例28通過(guò)DMTST促進(jìn)的糖基化合成完全保護(hù)的糖苷(糖-連接體鍵在糖苷的位置)-Ddh-氨芐基芐基酯共軛體(見(jiàn)26，圖4)28 [N-[芐基(6-(4,4-二甲基2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯]-6-基4-氨芐基]-2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖苷
在室溫下攪拌于CH2Cl2(10ml)中的N-[芐基(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯]-6-基4-氨基芐醇(500mg,1.08mmol)，甲基2,3,4,6-四-O-乙?；?1-硫代-β-D-吡喃葡糖苷(400mg,1.08mmol)的混合物并加入DMTST(835mg,3.24mmol)。將溶液在室溫下攪拌1小時(shí)并用飽和NaHCO3溶液(3ml)洗滌，在MgSO4上干燥并蒸發(fā)。將殘余物用己烷/EtOAc1∶1v/v作為流動(dòng)相的色譜純化得到[N-[芐基(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯]-6-基)4-氨芐基]2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖苷(610mg,75％)。Rf0.47(己烷/EtOAc1∶1v/v)；FAB MS C42H51NO14(793.83)m/z(％)816[M+Na]+(100),794[M+H]+(25),702(66)。實(shí)施例29通過(guò)DIPCDI活化合成完全保護(hù)的糖苷(糖-連接體鍵在糖苷的位置)-Ddh-氨芐基連接體-樹(shù)脂共軛體(見(jiàn)27，圖4)29 [N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)4-氨芐基]-2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖苷MBHA樹(shù)脂共軛體
在室溫下在Pd/C(10％)(200mg)上于MeOH(20ml)中氫化[N-[芐基(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯-6-基4-氨芐基]-2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖苷(500mg,0.63mmol)10小時(shí)。濾掉催化劑，將濾液蒸發(fā)。將殘余物溶解在CH2Cl2(5ml)中，加入N,N’-二異丙基碳二亞胺(128mg,1mmol)，將混合物與MBHA樹(shù)脂(200mg)(在DMF中預(yù)溶脹20分鐘)一起緩慢攪拌30分鐘。實(shí)施例30在溶液中用Ddh-OH叔丁酯合成部分保護(hù)的糖基胺-Ddh共軛體(見(jiàn)22，圖3)30 N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基胺
在回流下于無(wú)水乙醇(10ml)中攪拌叔丁基6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯(400mg,1.23mmol)和2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基胺(276mg,0.61mmol)的混合物2小時(shí)。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)。殘余物收集在CH2Cl2/TFA的混合物(1∶1)(10ml)中并在室溫下攪拌1小時(shí)。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)并用CHCl3/MeOH 10∶0.1v/v作為流動(dòng)相的色譜純化得到N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基胺(280mg,73％)。Rf0.34(CHCl3/MeOH 10∶0.1v/v)FAB MS C37H43NO7(613.41)m/z(％)649[M+2Na]+(34),626[M+Na]+(100),614[M+H]+(65)。實(shí)施例31完全保護(hù)的糖基胺-Ddh-樹(shù)脂共軛體的合成，其中樹(shù)脂的偶合是最后步驟(圖3)31 N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基胺-MBHA共軛體
將總胺官能度為0.084mmol的MBHA樹(shù)脂(取代率0.42mmol/g)(200mg)在DMF中溶脹20分鐘。然后將樹(shù)脂用新鮮DMF洗滌，將N-(6-(4,4-地甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基胺(200mg,4當(dāng)量)和N,N＇-二異丙基碳二亞胺(53μl,4當(dāng)量)加入DMF(5ml)并將樹(shù)脂緩慢攪拌30分鐘。TNBS試驗(yàn)略顯正值，所以使用上述條件，進(jìn)行雙偶合(double coupling)，這次產(chǎn)生負(fù)的TNBS試驗(yàn)結(jié)果。將樹(shù)脂用DMF、甲醇，最后用醚洗滌。然后將樹(shù)脂放在KOH上于真空下干燥過(guò)夜。實(shí)施例32完全保護(hù)的糖(糖-連接體鍵不在糖苷的位置)-Ddh-樹(shù)脂共軛體的合成，其中樹(shù)脂的偶合是最后步驟(見(jiàn)27，圖4)32 芐基2-乙酰氨基3-O-乙?；?6-O-芐基-2-脫氧-4-O-[N-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)4-氨芐基]-α-D-吡喃葡糖-MBHA樹(shù)脂共軛體
將芐基2-乙酰氨基-3-O-乙?；?6-O-芐基-2-脫氧4-O-[N-(叔丁基6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯-6-基)4-氨芐基]-α-D-吡喃葡糖(290mg,0.33mmol)溶解在CH2Cl2/TFA的混合物(1∶1)中并在室溫下攪拌1小時(shí)。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)，并采用步驟31的方法將化合物結(jié)合到MBHA樹(shù)脂上去。實(shí)施例33帶有選擇性樹(shù)脂偶合的Ddh-氨芐基連接體-樹(shù)脂共軛體的合成(連接體上有未保護(hù)的羥基基團(tuán))(圖10)33 N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)4-氨基芐醇-MBHA樹(shù)脂共軛體
將總胺官能度為0.042mmol的MBHA樹(shù)脂(100mg)在DMF中溶脹20分鐘。然后將樹(shù)脂用新鮮DMF洗滌，將N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)4-氨基芐醇(63mg,4當(dāng)量)和1-異丁基氧-羰基-2-異丁基氧-1,2-二氫喹啉(EEDQ)(51mg,4當(dāng)量)加入DMF(5ml)溶液，并將樹(shù)脂緩慢攪拌24小時(shí)。TNBS試驗(yàn)略顯正值，所以使用上述條件，進(jìn)行雙偶合，這次產(chǎn)生負(fù)的TNBS試驗(yàn)結(jié)果。將樹(shù)脂用DMF(5×10ml)洗滌。實(shí)施例34在活化發(fā)生在樹(shù)脂上時(shí)合成Ddh-氨芐基三氯亞氨逐乙酸酯活化的連接體-樹(shù)脂共軛體(圖10)34 N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸酯-6-基)4-氨芐基三氯亞氨逐乙酸酯-MBHA樹(shù)脂共軛體
在0℃下攪拌于CH2Cl2(1ml)中用三氯乙腈(50mg,0.33mmol)處理的實(shí)施例33的樹(shù)脂，并加入1,8-二氮雜二環(huán)(5.4.0)十一-7-烯(1mg,0.003mmol)。將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌90分鐘，在室溫下攪拌2小時(shí)，然后濾掉樹(shù)脂并用DMF(5×10ml)洗滌。實(shí)施例35當(dāng)糖的偶合是最后步驟時(shí)，完全保護(hù)的糖(糖-連接體鍵不在糖苷的位置)-Ddh-樹(shù)脂共軛體的合成(見(jiàn)32，圖4)35 芐基2-乙酰氨基-3-O-乙?；?6-O-芐基-2-脫氧4-O-[N-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)4-氨芐基]-α-D-吡喃葡糖苷-MBHA樹(shù)脂共軛體
在室溫下將實(shí)施例34的樹(shù)脂添加到芐基2-乙酰氨基-3-O-乙酰基-6-O-芐基-2-脫氧-α-D-吡喃葡糖苷(75mg,0.16mmol)的CH2Cl2(1ml)溶液中。加入三氟甲烷磺酸的醚溶液(0.1M,60μl)并將混合物攪拌30分鐘。反應(yīng)用三乙胺(120μl)中止并用DMF(5×10ml)洗滌。實(shí)施例36固相合成樹(shù)脂-Ddh-或Ddh-氨芐基連接體的第一步(圖3)36 己二酸-MBHA樹(shù)脂共軛體
將總胺官能度為0.42mmol的MBHA樹(shù)脂(1.0g)在DMF中溶脹20分鐘。然后將樹(shù)脂用己二酸(1.41g,10mmol)和N,N＇-二異丙基碳二亞胺在CH2Cl2(10ml)中的混合物處理60分鐘。在DMF中進(jìn)行第二次偶合得到負(fù)的水合茚三酮試驗(yàn)結(jié)果。樹(shù)脂用DMF(5×10ml)洗滌。實(shí)施例37固相合成樹(shù)脂-Ddh-或Ddh-氨芐基連接體的第二步(圖3)37 6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-MBHA樹(shù)脂共軛體
向?qū)嵤├?6的樹(shù)脂中加入5,5-二甲基-1,3-環(huán)己二酮(280mg,2.0mmol)、N,N＇-二異丙基碳二亞胺(283mg,2.00mmol)和4-二甲基氨基吡啶(244mg,2.00mmol在CH2Cl2(10ml)中的混合物并在室溫下攪拌18小時(shí)。樹(shù)脂用DMF(5×10ml)洗滌。實(shí)施例38固相合成完全保護(hù)的糖基胺-Ddh-樹(shù)脂共軛體(見(jiàn)31,圖3)38 N(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基胺-MBHA樹(shù)脂共軛體
使實(shí)施例37的樹(shù)脂與2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基胺(712mg,2.00mmol)在DMF(5ml)中于室溫下反應(yīng)兩天。樹(shù)脂用DMF(5×10ml)洗滌。實(shí)施例39固相合成部分保護(hù)的糖基胺-Ddh-樹(shù)脂共軛體(圖3)39 N(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃葡糖基胺-MBHA樹(shù)脂共軛體
使實(shí)施例37的樹(shù)脂與2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃葡糖基胺(900mg,2.00mmol)在無(wú)水乙醇中在回流下反應(yīng)2小時(shí)。樹(shù)脂用DMF(5×10ml)洗滌。實(shí)施例40固相合成Ddh-氨芐基連接體-樹(shù)脂共軛體(見(jiàn)33，圖10)40 N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)4-氨基芐醇-MBHA樹(shù)脂共軛體
使實(shí)施例37的樹(shù)脂和4-氨基芐醇(246mg,2.00mmol)的混合物在無(wú)水乙醇中在回流下攪拌2小時(shí)，然后用DMF(5×10ml)洗滌。實(shí)施例41分裂完全保護(hù)的糖基胺-Ddh樹(shù)脂共軛體提供完全保護(hù)的糖基胺(圖11)41 通過(guò)NH3處理，分裂N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基胺-MBHA樹(shù)脂共軛體。
將實(shí)施例38的樹(shù)脂(10mg)用飽和NH3/MeOH溶液(0.2ml)在室溫下處理5分鐘。濾掉樹(shù)脂，蒸發(fā)濾液，以量化產(chǎn)率得到2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基胺。實(shí)施例42分裂完全保護(hù)的糖基胺-Ddh-樹(shù)脂共軛體提供完全保護(hù)的還原糖42 通過(guò)NH3處理，分裂N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)2,3,4,6-O-乙?；?β-D吡喃葡糖基胺-MBHA樹(shù)脂共軛體，提供還原碳氧化合物的衍生物(圖11)。
將實(shí)施例38的樹(shù)脂(10mg)用飽和NH3/MeOH溶液(0.2ml)在室溫下處理5分鐘。濾掉樹(shù)脂，蒸發(fā)濾液。將樹(shù)脂溶解在丙酮/水的10∶1v/v的混合物(0.2ml)中，用乙酸(20μl)酸化并在室溫下攪拌1小時(shí)。蒸發(fā)溶液以量化產(chǎn)率得到2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖。實(shí)施例43完全保護(hù)的糖-Ddh連接體-樹(shù)脂共軛體的碳?xì)浠衔锩摫Ｗo(hù)(圖12)43 N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)β-D-吡喃葡糖基胺-MBHA樹(shù)脂共軛體
將實(shí)施例38的樹(shù)脂與甲醇鈉(200mg,3.70mmol)一起在無(wú)水甲醇(5ml)中于室溫下緩慢攪拌1小時(shí)。將樹(shù)脂用無(wú)水甲醇(5×10ml)、DMF(5×10ml)、醚(5×10ml)洗滌并在高真空下干燥1小時(shí)，得到附著在樹(shù)脂上的未保護(hù)的β-D-吡喃葡糖基胺。將樹(shù)脂樣品(5mg)用NH3/MeOH(實(shí)施例41)分裂，所得產(chǎn)物用TLC和質(zhì)譜分析，證實(shí)了量化的脫保護(hù)。實(shí)施例44在固體載體上合成二、三和四糖的文庫(kù)(library)(圖12)44 單、二和三-O-(2,3,4-三-O-芐基α,β-L-吡喃巖藻糖基)(1→2),(1→3),(1→4),(1→6)-[N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)]β-D-吡喃葡糖基胺-MBHA樹(shù)脂共軛體的混合物
將無(wú)水的CH2Cl2(10ml)中的實(shí)施例43的樹(shù)脂和乙基2,3,4-三-O-芐基-1-硫代-β-L-吡喃巖藻糖苷(fucopyranoside)(950mg,2mmol)的混合物用二甲基-(甲基硫代)-锍三氟甲烷磺酸鹽(DMTST)(1.50mg,5.81mmol)在室溫下處理1小時(shí)。樹(shù)脂用無(wú)水的CH2Cl2(5×10ml)洗滌。實(shí)施例45從樹(shù)脂上分裂二、三和四糖的文庫(kù)提供低聚糖的糖基胺(圖12)45 單、二和三-O-(2,3,4-三-O芐基α,β-L-吡喃巖藻糖基)(1→2),(1→3),(1→4),(1→6)-β-D-吡喃葡糖基胺的混合物
將實(shí)施例44的樹(shù)脂用NH3/MeOH(10ml)處理5分鐘。濾掉樹(shù)脂，蒸發(fā)濾液，得到二糖、三糖和四糖的混合物。FAB MS二糖C33H41NO9(595.66)，三糖C60H69NO13(1012.16)，四糖C87H97NO17(1429.66)m/z(％)618[Mdi+Na]+(41),596[Mdi+H]+(57),1034[Mtri+Na]+(56),1012[Mtri+H]+(100),1450[Mtetra+Na]+(8),1428[Mtetra+H]+(10)。實(shí)施例46第二糖-糖基胺-Ddh連接體-樹(shù)脂共軛體的合成(圖13)46 O-(2,3,6-三-O-芐基-4-O-溴乙酰基-α,β-D-吡喃半乳糖基)(1→4)-[N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)]2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基胺-MBHA樹(shù)脂共軛體
將實(shí)施例39的樹(shù)脂和乙基2,3,6-三-O-芐基-4-O-溴乙?；?1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(1.25g,2mmol)的混合物在無(wú)水的CH2Cl2(10ml)中用二甲基-(甲基硫代)-锍三氟甲烷磺酸鹽(DMTST)(1.50g,5.81mmol)在室溫下處理1小時(shí)。樹(shù)脂用干燥的CH2Cl2(5×10ml)洗滌。實(shí)施例47第二糖-糖基胺-Ddh連接體-樹(shù)脂共軛體的選擇性脫保護(hù)(圖13)47 O-(2,3,6-三-O-芐基-α,β-D-吡喃半乳糖基)(1→4)-[N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)]2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基胺-MBHA樹(shù)脂共軛體
將實(shí)施例46的樹(shù)脂與甲醇鈉(200mg,3.70mmol)一起在無(wú)水甲醇(5ml)中于室溫下緩慢攪拌1小時(shí)。將樹(shù)脂用無(wú)水甲醇(5×10ml)、DMF(5×10ml)、醚(5×10ml)洗滌并在高真空下干燥1小時(shí)，得到附著在樹(shù)脂上的部分未保護(hù)的二糖。將樹(shù)脂樣品(5mg)用NH3/MeOH分裂(實(shí)施例41)，所得產(chǎn)物用TLC和質(zhì)譜分析，證實(shí)了量化的脫保護(hù)。實(shí)施例48第二糖-糖基胺-Ddh連接體-樹(shù)脂共軛體的分裂提供二糖的糖基胺(圖13)48 O-(2,3,6-三-O-芐基-α,β-D-吡喃半乳糖基)(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基胺
將實(shí)施例47的樹(shù)脂用NH3/MeOH(10ml)處理5分鐘。濾掉樹(shù)脂，蒸發(fā)濾液，得到二糖的端基異構(gòu)的混合物。FAB MS C54H59NO10(882.01)m/z(％)904[M+Na]+(100),880[M+H]+(41)。實(shí)施例49碳?xì)浠衔?Ddh-氨芐基連接體-樹(shù)脂共軛體的分裂提供氨芐基保護(hù)的碳?xì)浠衔?圖14)49 4-氨芐基β-D-吡喃葡糖苷
將實(shí)施例29的樹(shù)脂用NH3/MeOH(5ml)處理過(guò)夜。濾掉樹(shù)脂，蒸發(fā)濾液，得到4-氨芐基β-D-吡喃葡糖苷。Rf0.55(CHCl3/MeOH/H2O 10∶4∶0.5v/v/v)；FAB MS C13H19NO5(269.28)m/z(％)402[M+Cs]+(25),292[M+Na]+(50),270[M+H]+(18)。實(shí)施例504-氨芐基保護(hù)的碳?xì)浠衔锏拿摫Ｗo(hù)(圖14)50 β-D-吡喃葡糖
在室溫下在Pd/C(10％)(50mg)上于MeOH(5ml)中氫化4-氨芐基β-D-吡喃葡糖苷(11Omg,0.40mmol)4小時(shí)。濾掉催化劑并蒸發(fā)濾液以定量產(chǎn)率得到D-葡萄糖。實(shí)施例51低聚糖的固定(圖15)51 用6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-MBHA樹(shù)脂共軛體制取O-[O-(2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基(1→4))-2,3,6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基(1→4)]-2,3,6-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基胺
使實(shí)施例37的樹(shù)脂與O-[O-(2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基(1→4))-2,3,6-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基(1→4)]-2,3,6-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基胺(1.80g,2.00mmol)在DMF(5ml)中于室溫下反應(yīng)2天。樹(shù)脂用DMF(5×10ml)洗滌。實(shí)施例52氨基糖-Ddh-樹(shù)脂共軛體的合成(圖16)52 N-(6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸-6-基)D-葡糖胺-MBHA樹(shù)脂共軛體
使實(shí)施例37的樹(shù)脂與葡糖胺(350mg,2mmol)在DMF(20ml)中于室溫下攪拌2天。濾掉樹(shù)脂，用DMF/水4∶1(5×10ml)、DMF(5×10ml)、甲醇(5×10ml)、醚(5×10ml)洗滌，并在高真空下干燥過(guò)夜。
對(duì)本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，很明顯，雖然為了清楚和理解，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了一定程度的詳細(xì)描述，但是可以對(duì)此處所描述的實(shí)施方案和方法作出許多種調(diào)整和改變而不脫離此發(fā)明所公開(kāi)的發(fā)明概念的范圍。
下面列出的是所引用的文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)通過(guò)此引用文獻(xiàn)而被并入本文。參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1．一種固相合成低聚糖的載體，該載體包括
a)樹(shù)脂，
b)共價(jià)連接在樹(shù)脂上的連接體，和
c)一個(gè)或多個(gè)通過(guò)連接體共價(jià)連接在樹(shù)脂上的糖基團(tuán)，
其中該連接體是2-取代-1,3-二氧代環(huán)烷烴化合物，且
所述的載體具有如下化學(xué)式Ⅰ
Ⅰ
其中，R1和R2可以相同或不同，且各自是氫或C1-4烷基；優(yōu)選R1和R2均是甲基；
R′是氨基糖，葡基胺，或是低聚糖的葡基胺；通過(guò)烷基-，取代烷基-，芳基-，取代芳基-，環(huán)烷基-，或取代環(huán)烷氨基-偶合的單或低聚糖；或通過(guò)羧基烷基-，取代羧基烷基-，羧基芳基-，取代羧基芳基-，羧基環(huán)烷基-，或取代羧基環(huán)烷基-氨基基團(tuán)偶合的單或低聚糖；
R″是直接偶合在樹(shù)脂載體上、或選擇性地通過(guò)合適的共價(jià)連接偶合在樹(shù)脂載體上的烷基-，取代烷基-，芳基-，取代芳基-，環(huán)烷基-，或取代環(huán)烷基間隔基團(tuán)，所述的共價(jià)連接在低聚糖合成和分裂的條件下是穩(wěn)定的。
2．如權(quán)利要求1所述的載體，其中R1和R2均是甲基。
3．如權(quán)利要求1或2所述的載體，其中R′是低聚糖-O-CH2-(C6H4)-NH，單糖-O-CH2-(C6H4)-NH，氨基-低聚糖-CO2CH2-(C6H4)NH，或氨基-單糖-CO2CH2-(C6H4)-NH基團(tuán)。
4．如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的載體，其中與樹(shù)脂的共價(jià)連接是由-CONH-,-O-,-S-,-COO-,-CH=N-,-NHCONH-,-NHCSNH，或-NHNH-基團(tuán)提供的。
5．如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的載體，其中連接體是官能化Dde,Ddh或ODMab。
6．如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的載體，包括樹(shù)脂，連接體，和單糖，低聚糖，氨基糖或氨基-低聚糖。
7．一種用來(lái)固相合成的載體，包括樹(shù)脂和連接基團(tuán)，其中連接體是具有如下通式Ⅱ的2-取代-1,3-二氧代環(huán)烷烴
Ⅱ
其中，X是OH或NH2；
R1和R2可以相同或不同，且各自是氫或C1-4烷基；且
R″是直接偶合在樹(shù)脂載體上、或是通過(guò)共價(jià)連接選擇性地偶合在樹(shù)脂載體上的烷基-，取代烷基-，芳基-，取代芳基-，環(huán)烷基-，或取代環(huán)烷氨基間隔基團(tuán)，所述的共價(jià)連接在低聚糖合成和分裂條件下是穩(wěn)定的。
8．一如權(quán)利要求7所述的載體，其中R1和R2均是甲基。
9．一如權(quán)利要求7或8所述的載體，其中與樹(shù)脂的共價(jià)連接是由-CONH-,-O-,-S-,-COO-,-CH=N-,-NHCONH-,-NHCSNH，或-NHNH-基團(tuán)提供的。
10．一種連接體-糖絡(luò)合物，其中連接基團(tuán)是如權(quán)利要求1或2所定義的基團(tuán)，且糖是如權(quán)利要求1或6所定義的。
11．一種化合物，該化合物帶有適于通過(guò)共價(jià)鍵將伯氨附著到樹(shù)脂上的官能團(tuán)，該共價(jià)鍵在低聚糖的合成和分裂條件下是穩(wěn)定的，所述的化合物具有如下通式Ⅲ
Ⅲ
其中，X是OH或NH2；
R1和R2可以相同或不同，且各自是氫或C1-4烷基；且
R″是烷基-，取代烷基-，芳基-，取代芳基-，環(huán)烷基-，或取代環(huán)烷基間隔基團(tuán)，該基團(tuán)帶有能與官能化的樹(shù)脂反應(yīng)的官能團(tuán)。
12．如權(quán)利要求11所述的化合物，其中R1和R2均是甲基。
13．如權(quán)利要求11或12所述的化合物，其中R″上的官能團(tuán)是羧基。
14．如權(quán)利要求11所述的化合物，該化合物是6-羥基-6-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己基)-己酸或其酯。
15．如權(quán)利要求14所述的化合物，其中的酯是芐酯，甲酯或叔丁酯。
16．如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的載體，其中連接體是根據(jù)權(quán)利要求11至15中任一項(xiàng)所述的化合物。
17．如權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的載體，其中連接體是根據(jù)權(quán)利要求11至15中任一項(xiàng)所述的化合物。
18．如權(quán)利要求10所述的連接體-糖絡(luò)合物，其中連接體是根據(jù)權(quán)利要求11至15中任一項(xiàng)所述的化合物。
19．一組用于固相合成或聯(lián)合合成低聚糖的試劑盒，包括
a)根據(jù)權(quán)利要求1至5或16中任一項(xiàng)所述的樹(shù)脂-連接體-糖載體，
b)根據(jù)權(quán)利要求10或17所述的連接體-糖絡(luò)合物，或
c)根據(jù)權(quán)利要求7至17中任一項(xiàng)所述的樹(shù)脂-連接體載體，
并且選擇性地也包括一種或多種保護(hù)劑，脫保護(hù)劑，和/或適于固相或聯(lián)合合成的溶劑。
20．一種固相合成低聚糖的方法，包括依次將單或低聚糖基團(tuán)連接到如權(quán)利要求1至9或16所述的載體上的步驟。
21．一種合成如權(quán)利要求1所述的通式Ⅰ的連接體基團(tuán)的方法，包括用二羧酸C-?；?-取代-1,3-二氧代環(huán)己烷化合物的步驟，和選擇性地，將C-酰化反應(yīng)的產(chǎn)物與4-氨基芐醇反應(yīng)以形成4-氨基芐衍生物。
22．如權(quán)利要求21所述的方法，其中該二羧酸是被酯的形成而單保護(hù)的。
23．如權(quán)利要求21或22所述的方法，其中的C-?；磻?yīng)是被碳二亞胺活化的且是被N,N＇-二甲基氨基吡啶所催化的。
24．一種合成如權(quán)利要求6至9中任一項(xiàng)所述的樹(shù)脂-連接體載體的方法，包括在合適的溶劑中溶脹樹(shù)脂，用二羧酸處理該溶脹樹(shù)脂，和使如此制得的產(chǎn)物與2-取代-1,3-二氧代環(huán)烷烴化合物反應(yīng)的步驟。
25．如權(quán)利要求21至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中2-取代-1,3-二氧代環(huán)烷烴化合物是5,5-二甲基-1,3-環(huán)己二酮。
26．如權(quán)利要求21至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中的二羧酸是己二酸。
全文摘要
基于具有通式(Ⅰ)的2－取代－1,3－二氧代環(huán)烷基連接體能用來(lái)將O－糖苷和N－糖苷型偶合到聚合物載體上的發(fā)現(xiàn),本發(fā)明提供了一種固相合成低聚糖的系統(tǒng)。本發(fā)明提供了固相合成低聚糖的試劑、試劑盒和方法。
文檔編號(hào)C07C257/06GK1234790SQ9719916
公開(kāi)日1999年11月10日 申請(qǐng)日期1997年8月26日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月26日
發(fā)明者伊斯特萬(wàn)·托特, 久治·戴卡尼, 巴里·凱拉姆 申請(qǐng)人:阿爾開(kāi)密亞有限公司