專利名稱：細胞有絲分裂發(fā)生和運動發(fā)生的肽拮抗劑和它們的治療用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的化合物及包含這些新化合物的藥物組合物，它們在控制或者治療增殖性疾病(如癌)，抗腫瘤生長和/或腫瘤轉(zhuǎn)移及牛皮癬，控制或者治療炎癥、過敏、自身免疫、病毒和心血管疾病中是有用的藥劑。這些新的化合物具有抑制識別所有細胞受體和胞質(zhì)轉(zhuǎn)導物內(nèi)幾種包含磷酸酪氨酸的基元的獨特特性，這種抑制是通過存在于胞質(zhì)轉(zhuǎn)導物和不同信號轉(zhuǎn)導過程中的其它效應物蛋白中的廣譜SH2域和對銜接子轉(zhuǎn)導物Grb2的SH2域的高度特異親和性實現(xiàn)的，銜接子轉(zhuǎn)導物Grb2是有絲分裂發(fā)生和運動發(fā)生途徑的關鍵組分，這一最后的活性導致侵入和轉(zhuǎn)移。本發(fā)明也涉及這些化合物的產(chǎn)生方法和使用這些化合物進行治療的方法。
背景技術：
從受體到核的胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導途徑以細胞外的生長因子與它們的包埋在細胞膜上的受體的相互作用開始，并且和細胞內(nèi)復雜的生物化學反應鏈有關，這種生物化學過程還不完全了解，其能將信號傳遞到核以便刺激適當?shù)纳锓磻?。在引起有絲分裂發(fā)生的信號轉(zhuǎn)導中，激活的受體以某種方式將信號轉(zhuǎn)送到胞質(zhì)或膜錨定的蛋白質(zhì)，如在這種機制中表現(xiàn)出關鍵作用的蛋白質(zhì)，即p21ras蛋白質(zhì)。接下來，這些蛋白質(zhì)將信號以多種途徑進一步轉(zhuǎn)導到細胞核。已經(jīng)在幾種人類腫瘤中檢測到了激活的ras原癌基因。激活的頻率十分高；例如，激活ras基因發(fā)生在30％的所有人類促紅細胞生成的腫瘤和90％多的外分泌的胰腺的腫瘤上。在一般情況下，原癌基因?qū)е抡５鞍踪|(zhì)的產(chǎn)生(象酪氨酸激酶受體和轉(zhuǎn)導物)，這些物質(zhì)和細胞的信號轉(zhuǎn)導緊密相關。幾種癌基因是突變的或過量表達的形式或是染色體轉(zhuǎn)移的嵌和基因，這些基因編碼在信號轉(zhuǎn)導機制中起作用的蛋白質(zhì)，并引起組分激活的信號蛋白質(zhì)的增加，這些蛋白質(zhì)引起無限制的細胞生長，結(jié)果導致腫瘤形成。人們正在從細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的各組分的性質(zhì)和它們的用途方面闡明細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，公開了一套越來越多的具有吸引力的靶，這些靶成為抗腫瘤療法概念上新的探討。
從激活的受體到細胞核的信號轉(zhuǎn)導似乎和幾種在可能的多種途徑中相互作用，或多或少地相互連接的蛋白質(zhì)有關。在相關的主要分子過程類型中，特別有關的是1)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化作用(激酶活性)；2)識別作用(特異性蛋白質(zhì)域之間的物理聯(lián)系)；3)蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸磷酸化作用(激酶活性)；4)特異性酶(磷酸酯酶)的脫磷酸作用，這是因為酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化作用也都是通過反作用調(diào)節(jié)的。這些過程在信號轉(zhuǎn)導途徑的網(wǎng)中可以發(fā)生不只一次。在這些主要的相互作用中，在腫瘤探討上具有吸引力的靶是磷?；睦野彼嵊蚝汀灏|(zhì)轉(zhuǎn)導物″的識別。
第一步，生長因子(例如EGF，F(xiàn)GF，PDGF，HGF，…)通過和其受體的相互作用而激活其受體(一種橫越細胞膜的蛋白質(zhì))，導致了受體分子間的相互接近。確實，受體分子彼此接近，使得在細胞內(nèi)以胞內(nèi)域的水平上發(fā)生相互磷酸化，這種磷酸化過程是通過一個分子的激酶域在鄰近分子的胞質(zhì)部分的幾個酪氨酸殘基上進行操作而完成的，或通過相關的酪氨酸激酶進行磷酸化。一旦受體的胞質(zhì)區(qū)在酪氨酸上有幾個磷酸化的位點，分子的識別可以在這些磷酸化的位點和幾種其它蛋白質(zhì)的適當?shù)膮^(qū)之間發(fā)生。
這些蛋白質(zhì)是″胞質(zhì)轉(zhuǎn)導物″；確實，它們使信號轉(zhuǎn)導途徑繼續(xù)，這種信號轉(zhuǎn)導途徑連接結(jié)合所說的受體的配基和控制基因轉(zhuǎn)錄的細胞核因子的調(diào)節(jié)作用，因而最終使生物反應(如細胞增值)發(fā)生(J.Schlessinger和A.Ullrich，神經(jīng)元，1992，9，383；J.Schlessinger，生物化學發(fā)展趨勢1993，18，273.)。它們都具有命名為SH2(Src同源性2)的結(jié)構域，在一級結(jié)構上具有高度的同源性，甚至在三級結(jié)構上是非常保守的。這些短的(大約100個氨基酸)SH2結(jié)構域在結(jié)合包含蛋白片斷的磷酸酪氨酸的非催化區(qū)中起作用(T.Pawson和G.D.Gish，細胞，1992，71，359)。最近幾年對SH2結(jié)構域的結(jié)構和作用的興趣與研究迅速增加。對SH3結(jié)構域(Src同源3)已經(jīng)產(chǎn)生了類似的興趣，其特征不在功能上，而是其在胞質(zhì)轉(zhuǎn)導物中經(jīng)常伴隨SH2結(jié)構域的存在。
SH3結(jié)構域是具有高度同源性的非催化區(qū)，并且此區(qū)對富含甘氨酸-脯氨酸的區(qū)域具有親和性。認為SH2和SH3區(qū)在信號轉(zhuǎn)導的分子內(nèi)識別過程中具有關鍵作用。含有蛋白質(zhì)的SH2的一個組包含具有內(nèi)源酶活性的蛋白質(zhì)，因此賦予了除SH2結(jié)構域之外的催化域(激酶區(qū)或其它)，如蛋白質(zhì)Src、Abl、Syc、PTPlC、PLCg、GAP、vav。
另一個組包括的SH2含有缺乏任何已知的催化域的蛋白質(zhì)，這種SH2似乎具有吸收賦予催化性質(zhì)的受體的其它蛋白質(zhì)的銜接子功能。例如，p85在激活的(磷酸化的)受體和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)之間提供了連接。另一個有關的銜接子實施例是Grb2(生長因子受體結(jié)合蛋白2)，其連接磷?；荏w(EGF-R，PDGF-R，HGF-R，…)和在p21ras上具有鳥嘌呤核苷酸交換活性的蛋白質(zhì)，激活與有絲分裂發(fā)生直接相關的系統(tǒng)(如ras)。其它的包含銜接子的SH2似乎是Shc、Crk、Nck.。一些所提到的轉(zhuǎn)導物(特別是Grb2)和受體(如HGFR)上的這些相關的結(jié)合位點(特別是包含HGF受體的Tyr 1356的位點)似乎和細胞運動發(fā)生、侵入及最終的轉(zhuǎn)移強烈相關。
特定的SH2結(jié)構域能夠識別磷?；睦野彼?、所說的受體或其它一些中間蛋白質(zhì)的側(cè)翼序列。相當保守的結(jié)構的核心元件是反平行β-片層(是位于兩個α-螺旋之間的夾層)和一個從此夾層突出出來的小的β-片層；X光和NMR研究澄清了這種結(jié)構(G.Waksman，D.Kominos，S.C.Robert son，N.Pant，D.Baltimore，R.B.Birge，D.Cowburn，H.Hanafusa，B.J.Mayer，M.Overduin，M.D.Resh，C.B.Rios，L.Silverman和J.Kuriyan，自然，1992，358，646；G.Waksman，S.E.Shoelson，N.Pant，D.Cowburn和J.Kuriyan，細胞，1993，72，779；M，Overduin，C.B.Rios，B.J.Mayer，D.Baltimore和D.Cowburn，細胞，1992，70，697)和與結(jié)合肽的復合物形式(類似在Src SH2結(jié)構域的情況下)。無論如何，幾個轉(zhuǎn)導物中環(huán)和轉(zhuǎn)角不同，這可能涉及識別的特異性。分析磷?；荏w與胞質(zhì)轉(zhuǎn)導物的相互作用，我們發(fā)現(xiàn)1)幾種受體中，每一種都和相同的蛋白質(zhì)連接；和2)它們中的每一種都以一定程度的區(qū)域?qū)Ｒ恍缘嘏c蛋白質(zhì)連接，即對于幾種受體，含有轉(zhuǎn)導物的不同的SH2結(jié)合受體胞質(zhì)域的不同磷酸酪氨酸殘基(J.A.Escobedo，D.R.Kaplan，W.M.Kavanaugh，C.W.Turck和L.T.Williams，Mel.細胞生物學，1991，11，1125；A.Kashishian，A.Kazlauskas和J.A.Cooper，EMBO J.，1992，11，1373；C.-H.Heldin，EMBO J.，1992，11，4251)。這種高的特異性源于圍繞磷酸酪氨酸的序列，特別是在下游，對于每個轉(zhuǎn)導物都產(chǎn)生不同的識別基元(W.J.Fantl，J.A.Escobedo，G.A.Martin，C.W.Turck，M.del Rosario，F(xiàn).McCormick和L.T.Williams，細胞，1992，69，413)。已經(jīng)完成了磷肽文庫以便分析幾種胞質(zhì)轉(zhuǎn)導物的序列特異性，并確定了相關的共有序列(Z.Songyang，S.E.Shoelson，M.Chaudhuri，G.Gish，T.Pawson，W.G.Haser，F(xiàn).King，T.Roberts，S.Ratnof sky，R.J.Lechleider，B.G.Neel，R.B.Birge，J.E.Faj ardo，M.M.Chou，H.Hanafusa，B.Schaffhausen和L.C.Cantley，細胞，1993，72，767)。
的確，對于肝細胞生長因子(HGF)的受體，這是初始培養(yǎng)中肝細胞強大的促細胞分裂原和體內(nèi)肝臟再生的主要介體(P.M.Comoglio，肝細胞生長因子-擴散因子(HGF-SF)和C-Met受體。I.D.Goldberg和E.M.Rosen編輯(Basel)，瑞士Birkauser Verlag，1993，131-165)，所有胞質(zhì)轉(zhuǎn)導物的相互作用似乎集中在和兩個相近的磷酸酪氨酸殘基有關的同一個“超位點”上(C.Ponzetto，A.Bardelli，Z.Zhen，P.dalla Zonca，F(xiàn).Maina，S.Giordano，A.Graziani，G.Panayotou和P.M.Comoglio，細胞，1994，77，261)。
生長因子受體結(jié)合蛋白質(zhì)2(Grb2)是一個比較小的銜接子，只由兩側(cè)有兩個SH3結(jié)構域的SH2結(jié)構域構成，并且Grb2和另一個蛋白質(zhì)體內(nèi)形成復合物(SoS)，通過它的SH3結(jié)構域和位于SoS的C-末端結(jié)構域的一段富含脯氨酸的31個氨基酸的序列結(jié)合，這樣其能夠和ras系統(tǒng)相互作用。Grb2及與SoS以復合物形式存在的SH2，能夠通過它的SH2結(jié)構域與不同受體或轉(zhuǎn)導物的特異性酪氨酸磷?；稽c聯(lián)系。另外，胞質(zhì)蛋白質(zhì)Shc的磷?；问侥芙Y(jié)合Grb2的SH2結(jié)構域(S.E.Egan，B.W.Giddings，M.W.Brooks，L.Buday，A.M.Sizel和和R.A.Weinberg，自然，1993，363，45)。在HGFR上證明了Grb2/SoS復合物與Ras系統(tǒng)的關連(A.Graz iani，D.Gramagl ia，P.dalla Zonca和P.M.Comoglio，J.Biol.Chem.，1993，268，9165)，并且其它受體(EGFR，IRS-1)的類似情況也有力地支持了這一點，并且在不同生物品種中也是如此(J.Schlessinger和A.Ullrich，神經(jīng)元，1992，9，383 J.Schlessinger，Trends Biochem.Sci.，1993，18，273P.Polakis和F.McCormick，生物化學雜志，1993，268，9157)。另外，已知蛋白質(zhì)SoS為″交換子″、鳥嘌呤核苷酸分離的刺激物(GDS)，并且在其和Grb2復合的活性形式中，能夠促進GDP從失活Ras-GDP復合物中快速釋放(C.F.Albright，B.W.Giddings，J.Liu，M.Vito和R.A.Weinberg，EMBO J.，1993，12，339)。因此p21Ras可以迅速地獲得GTP以形成活性Ras-GTP，這樣其可以充當將信號向下游傳遞給核的Ras系統(tǒng)的效應物(通過MAP激酶的級連)。錨定在膜上的復合物Ras-GTP是活性形式，其充當效應物，以便將有絲分裂發(fā)生信號傳遞到核。交換子(GDS或SoS)活性增加它的水平，而GAP(GTPase激活蛋白質(zhì))活性降低其水平。生長因子受體的刺激作用影響這兩種調(diào)節(jié)酶，并且它們的活性依賴于其它調(diào)節(jié)因子。這兩種調(diào)節(jié)酶(GDS和GAP)在不同細胞類型中對Ras系統(tǒng)具有不同的影響。確實，上述提到的Ras系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用需要適于錨定在膜上的p21Ras的成熟形式(C.J.Marshall，科學，1993，259，1865)。在這些情況中，細胞培養(yǎng)結(jié)果已經(jīng)證實了Ras系統(tǒng)是一個預防有關癌轉(zhuǎn)化的有價值的靶(J.B.Gibbs，A.Oliff，和N.E.Kohl，細胞，1994，77，175)。在繼續(xù)信號轉(zhuǎn)導途徑上(Ras的下游)，Ras系統(tǒng)的活性形式(即是Ras GTP)和其自己的效應物的N-末端相互作用(這種效應物最近鑒定為絲氨酸/蘇氨酸激酶Raf)，這樣通過″促細胞分裂原激活的蛋白質(zhì)激酶(MAPs)″開始了磷酸化作用的級聯(lián)系統(tǒng)。事實上，Raf導致直接的磷酸化作用，因而使MAP激酶激酶激活，這種酶反過來激活MAPK，導致核中轉(zhuǎn)錄作用(轉(zhuǎn)錄因子AP1)的激活(M.S.Marshall，生物化學發(fā)展趨勢，1993，18，250)。
發(fā)明概述已知在一種更長序列之內(nèi)包含基元YpVNV的肽能抑制胞質(zhì)轉(zhuǎn)導物Shc或Grb2或p85和激活的(磷?；?HGF受體之間的結(jié)合(國際專利申請PCT/EP94/01943)。我們的新發(fā)現(xiàn)如下1)此肽從磷酰化酪氨酸開始，縮短了從羧基末端(即從庚肽)到四肽的下游序列，對轉(zhuǎn)導物Grb2的親和性意外地增加，因此對Grb2-HGF受體復合物形成的抑制作用也增加。確實，這是一個意外的結(jié)果，因為從有關SH2識別作用的文獻可知磷肽的親和性隨著長度的減少(例如從12到5個氨基酸)而降低(甚至60倍)(G.B.Cohen等，細胞，1995，80，237；S.E.Shoelson等，EMBO J.，1993，12，795；E.Piccione等，生物化學，1993，32，3197)，并且在一種情況下，認為親和力需要至少5個氨基酸長度(W.J.Fantl等，細胞，1992，69，413)。
2)磷?；野彼岬陌被鶊F的?；艽蟪潭壬显黾恿怂f的活性。這些酰基基團可以是甲?；?、乙酰、丙酰、或更為復合的一種(如氨酰基、或生物素-6-氨基己酰、或肉豆蔻酰、辛酰、環(huán)己乙?；鶊F)，這些復合?；峁┯糜谔岣呒毎┤氲挠H脂性錨。從我們所查閱的文獻可知，幾乎所有的用于SH2識別作用的磷肽都在N-末端含有一個游離的氨基基團。
3)所說的肽能夠以很高的親和性結(jié)合并阻斷Grb2和幾種其它的轉(zhuǎn)導物(如Shc，p85，Src，GAP，PLCg，Zap70，Syc，Stat)，阻止它們通過其SH2結(jié)構域和無論哪種酪氨酸磷?；荏w結(jié)合，這些受體如HGF-R、PDGF-R、EGF-R、它們的截短的或突變的的含有細胞質(zhì)域(如erbB2)的形式、Tpr-MET、MET家族的其它成員(如SEA和RON)、IRS-1、酪氨酸磷?；D(zhuǎn)導物或銜接子(如bcr-Abl，Shc，Src，Syc，Stat)。因為其它序列已表明是高度特異性的，所以這些肽的這種沒有預料的特性是前所未有的。
4)另外發(fā)現(xiàn)了甚至比四肽基元更短的肽(包含磷酸酪氨酸)或模擬(mimetic)類似物(如對膦酰(phosphono)甲苯基丙氨酸、對膦酰二氟甲苯基丙氨酸)保持了它們抑制Grb2-SH2與磷?；疕GF受體相結(jié)合的活性，這是完全未預料到的。絕對沒有預料到短至三肽的磷肽具有SH2識別的高度親和性。已知在其它序列上，膦酰甲苯基丙氨酰衍生物是磷酸酯酶抗性的，但弱于相應的磷酸鹽類似物很多(6-10倍)(S.M.Domchek等，生物化學，1992，31，9865)；我們意想不到地發(fā)現(xiàn)所說的特異性肽的膦酰甲苯基丙氨酰類似物與抑制Grb2-SH2識別的親本磷酸鹽大約等效。
5)也發(fā)現(xiàn)了磷酸酪氨酸形式的肽或它們的模擬類似物(其中磷酸酪氨酸由對膦酰甲苯基丙氨酸或?qū)Ⅴ６妆交彼崽娲?是細胞運動性的強烈的抑制物，并且除了作為抗腫瘤劑之外，作為抗轉(zhuǎn)移劑也是有用的。
盡管不希望受到理論束縛，但這種抑制作用很可能是競爭抑制的結(jié)果，其中磷肽或其模擬物與磷酰化受體或SH2結(jié)構域相同結(jié)合位點的磷?；D(zhuǎn)導物競爭。這一結(jié)合的抑制可能有效地將TK受體或磷?；D(zhuǎn)導物從此效應物蛋白質(zhì)所利用的信號轉(zhuǎn)導途徑中分開。因為本領域已知這種策的主要弊端是這一阻斷點可能被過多的信號轉(zhuǎn)導途徑忽略，不得不考慮本發(fā)明化合物空前的抑制幾種類型的SH2識別的能力，作為有效降低失調(diào)的信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡的關鍵因子。
因此，本發(fā)明的目的是提供小分子化合物，該小分子化合物能夠干擾含有磷酸酪氨酸的受體或轉(zhuǎn)導物與其它錨定在膜上的SH2結(jié)構域或?qū)ιL和運動/擴散信號關鍵的胞質(zhì)轉(zhuǎn)導物的締合，因此能夠減少如在腫瘤和牛皮癬中發(fā)現(xiàn)的失控的增值的水平，并且能夠抑制與轉(zhuǎn)移極其相關的細胞侵入。
本發(fā)明的新化合物已顯示出特別抑制Grb2轉(zhuǎn)導物與HGF受體、其它生長因子受體(例如EGFR，PDGFR，erbB2/neu，F(xiàn)GFR)及其它酪氨酸磷?；霓D(zhuǎn)導物(例如Src，bcr-abl，Stat，IRS-1)磷酸酪氨酸?？课稽c的結(jié)合。另外，所說的化合物也以不同的效力抑制含有磷酸酪氨酸?？课稽c的蛋白質(zhì)與含有其它SH2的轉(zhuǎn)導物(例如p85-PI3K、PLCg、Src、Shc、Stat、Zap70、Abl、Syc、PTPlC)相結(jié)合。發(fā)明詳述在一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明包括以鹽或非鹽形式存在的具有下式所示結(jié)構的肽和模擬肽(peptidomimetic)化合物
其中Y是H、R-C(＝O)NH-，這里R可以是H、CH3、低級烷基或長鏈烷基、線性支鏈的或環(huán)狀的、或者N-取代的氨基酸或肽殘基，優(yōu)選的是R-C(＝O)-Gly、R-C(＝O)-Thr-、R-C(＝O)-Ala-Thr(其中R是如上所限定的)，較長的N-取代的肽殘基含有上述的基元；X是-OPO3H2，，或其模擬物，該模擬物優(yōu)選地選自(但不限于)下列基團-CH2PO3H2、-CF2PO3H2、-CHFPO3H2、-CH2SO3H、-CF2SO3H、-CHFSO3H、-SPO3H2、-OPSO2H2，、-SPSO2H2、-OPS2OH2、-OP(CH3)O2H、-SP(CH3)O2H、-OP(CH3)SOH、-OP(CF3)O2H、-OP(CHF2)O2H、-SP(CH3)O2H、-SP(CHF2)O2H或它們的低級烷基酯；A是低級烷，優(yōu)選地是CH3-、CH3CH2-、(CH3)2CH-、(CH3)3C-、CH3CH2CH(CH3)-、(CH3)2CHCH2-；B是H-、CH3-或低級烷基；Z是H、-COOH、-CONHR2、-COR2，這里R2＝H、-NK2、-NHR3，這里R3是-CH3低級烷(優(yōu)選地是CH2CH(CH3)2)、或以羧酸形式或酰胺化形式存在的氨基酸或二肽(優(yōu)選地是-Val-NH2、-Val-OH、-Val-Lys-NH2、-Val-Lys-OH、-Val-Lys(eN-Ac)-NH2、-Val-Lys(eN-Ac)-OH、-Val-Ser-NH2、-Val-Ser-OH、-Val-G ln-OH、-Val-Gln-NH2)。
低級烷基一般指C1-C6烷基，例如C1-C4烷基，如甲基、乙基、異丙基、正丙基、正丁基、s-T基、戊基或己基。長鏈烷基可以是，例如C7-C30烷基、如C10-C30烷、 C12-C30烷基、C18-C30烷基或C20-C30烷基；或C7-C25烷基、C10-C25烷基、C10-C20烷基、C10-C18烷基或C12-C25烷基。不論哪一種情況、烷基基團可以是線性支鏈的或環(huán)狀的。
基團-OPO3H2的功能性衍生物是此基團的結(jié)構類似物，當其作為基團X加入到化學式(I)中時，以與-OPO3H2本身相同的方式或類似的方式發(fā)揮作用。
在本發(fā)明中，所說的″功能性衍生物″是磷酰衍生物，其模擬基團-OPO3H2(當其作為X基團加入到通式(I)中時)的作用。在限定Y時限定的N-取代的氨基酸或肽殘基，合適的是式R-C(＝O)-Z-的殘基，其中Z是單氨基酸殘基或兩個或多個氨基酸殘基鏈，例如二肽或三肽，或寡肽。Z的例子包括-Gly-、-Thr-和-Ala-Thr-。在限定Y時包含N-取代的氨基酸或肽部分的多肽殘基是更長鏈的肽殘基，這種肽殘基在其鏈中包含N-取代的部分，例如上文限定的式R-C(＝O)-Z-。
也包括含有上文提到的基元的更長的肽。
按照本發(fā)明，典型的氨基酸側(cè)鏈應該是L構型的，已經(jīng)確定在每一個位置的D類似物具有大大降低的活性。確實，含有未磷?；睦野彼岬乃峒暗牧纂幕蛩鼈兊哪M物形式也包括在本專利中，因為它們在體內(nèi)是磷?；?，所以作為實際上活性形式的前體。
本發(fā)明的代表性化合物且特別要求的化合物如下(Ac代表乙?；?FCE 28405Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Lys-NH2-Ex.4(SEQ ID No.1)FCE 28782Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Lys(Ac)-NH2-Ex. 5(SEQ ID No.2)FCE 28539Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-OH-Ex.6(SEQ ID No.3)FCE 28540Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.1(SEQ ID No.4)FCE 28404H2O3PO-Ph-CH2-CH2-CO-Val-Asn-Val-OH-Ex.7FCE 29021Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-NHCH2CH(CH3)2-Ex.3FCE 29022Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-NH2-Ex.8FCE 29018Ac-Tyr(PO3H2)-Val-NHCH2CH2CONH2-Ex.9FCE 28615Ac-Phe(CH2PO3H2)-Val-Asn-Val-Lys-NH2-Ex.10(SEQ ID No.5)FCE 28995Ac-Phe(CH2SO3H)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.12(SEQ ID No.6)FCE 29406Ac-Phe(p-CH2PO3H2)-Val-Asn-NH2-Ex.11FCE 29408Ac-Phe(p-CH2PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.2(SEQ ID No.7)FCE 28785Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Ser-NH2-Ex.13(SEQ ID No.8)FCE 28883Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Gln-NH2-Ex.14(SEQ ID No.9)FCE 291286-生物素酰氨基-己?；?Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.20(SEQ ID No.10)FCE 29091Ac-Tyr(PO3Me2)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.18(SEQ ID No.11)FCE 29116Ac-Tyr(PO3HMe)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.18(SEQ ID No.12)FCE 29145Ac-Tyr(PO3Et2)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.19(SEQ ID No.13)FCE 28702Ac-Tyr(PO3H2)-Ile-Asn-Gln-Ser-NH2(EGFR/Y1068)-Ex.15(SEQ ID No.14)FCE 28703Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Ile-Glu-NH2(IRS1/Y895)-Ex.16(SEQ ID No.15)FCE 28737Ac-Tyr(PO3H2)-Ile-Asn-Ile-Lys-NH2-Ex.17(SEQ ID No.16)FCE 29267Ac-Tyr(PO3H2)-Gly-Asn-NH2-Ex.21FCE 29268Ac-Phe(p-CH2PO3H2)-Gly-Asn-NH2-Ex.22FCE 29409Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Gln-NH2-Ex.23FCE 29410Ac-Tyr(PO3H2)-Val-D-Asn-NH2-Ex.24FCE 29411Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Hse-NH2-Ex.25FCE 29413Ac-Tyr(PO3H2)-D-Val-Asn-NH2-Ex.26FCE 29414Ac-Tyr(PO3H2)-Abu-Asn-NH2-Ex.27FCE 29415Ac-Tyr(PO3H2)-terLeu-Asn-NH2-Ex.28FCE 29421Ac-Tyr(PO3H2)-Ala-Asn-NH2-Ex.29FCE 29475Ac-Tyr(PO3H2)-Aib-ASn-NH2-Ex.30
FCE 29402 CH3-(CH2)12-CO-Gly-Gly-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.31(SEQ ID No.17)FCE 29403 CH3-(CH2)12-CO-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.32(SEQ ID No.18)FCE 29404 CH3-(CH2)6-CO-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.33(SEQ ID No.19)FCE 29405 C6H11-CH2-CO-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.34(SEQ ID No.20)FCE 29407 CH3-CO-CH2-CH2-CO-Phe(p-CH2PO3H2)-Val-Asn-NH2-Ex.35本發(fā)明的化合物在中性pH的溶液中具有化學穩(wěn)定性，并且根據(jù)所說的肽的性質(zhì)，通過加入酸或堿可以形成藥學上可接受的鹽。本發(fā)明將包括所有這些形式。合適的鹽包括堿鹽，如堿金屬鹽(例如鈉或鉀鹽)和銨鹽；和酸加成鹽，如鹽酸鹽、醋酸鹽、三氟乙酸鹽。
可以根據(jù)標準的方法，如Escobedo，J.A.，等，分子細胞生物學111125-1132(1991)或Turck，C.W.肽研究5156-160(1992)描述的那些方法(例如，利用受保護的預磷?；野彼釟埢?合成本發(fā)明的肽。另外可以通過未保護的酪氨酸并在固相或液相進行肽延長之后，將其磷?；?，而制備所說的磷肽。
具體地說，使用通過液相或固相方法(這些方法對本領域技術人員是已知的)制備所說的肽(Schroeder等，″肽″，Vol.I，學院出版社1965，或Bodanszky等，″肽合成″，國際科學出版社，1966，or McOmie(編輯)″有機化學中保護基團″，Plenum出版社，1973，或Barany等，″肽分析，合成，生物學″2，第1章，學院出版社，1980)。這樣，本發(fā)明包括制備一種本發(fā)明的肽的方法，這種方法包括由單一氨基酸和/或兩個或多個氨基酸殘基預先形成的肽化學合成所說的肽。
當希望制備其中的酪氨酸殘基是磷?；碾臅r，可以在固相合成期間引入預磷酰化的受保護的酪氨酸殘基，或當此肽吸附在固體支持物上時，可以將受保護的預先形成的肽的酪氨酸殘基磷?；?。
在固相合成時，可以使用任何手動或自動肽合成儀，并可以以分段的方式在樹脂支持物上利用Boc或Fmoc策略裝配此肽。
用作起始材料的所有試劑是市售的或可以按照本領域已知的方法產(chǎn)生和純化。
采用在0.05％三氟乙酸中的線性梯度的乙腈經(jīng)反向高效液相色譜在C18-Vdac柱上純化去保護的肽，并通過低壓凍干分離此肽。獲得的所有磷肽為多水合的聚三氟乙酸。在所有產(chǎn)物中此肽含量是65至90％，通過在1＝215-220nm時的HPLC峰相對積分，色譜純度超過95％。
進行有關酸水解產(chǎn)物的氨基酸分析(在11O℃下，6N HCl O.1％苯酚中22小時)。另外，可以先合成包含非磷酰化酪氨酸的肽，接下來經(jīng)酶促或通過化學方法(在這種情況下，必須恰當?shù)乇Ｗo和磷?；噭┠馨l(fā)生敏感反應的其它官能團)在酪氨酸殘基上引入磷酸基團。
在此說明書中，所用的氨基酸和保護基團的縮寫是基于IUPAC-IUB委員會有關生物化學命名法的建議(參見歐洲生物化學，vol 138，9-37，1984)。具體地說，在本文中使用下列縮寫B(tài)oc，T-丁氧基碳酰；tBu，T-丁基；Bzl，苯甲基；C1Z，4-氯芐氧基碳酰；DIC，二異丙碳二亞胺；DCM，二氯甲烷；DIEA，二異丙乙胺；DMF二甲基甲酰胺；DMS，二甲基硫化物；Dnp，二硝基苯酚；ECC，氯碳酸乙酯；Fmoc，9-芴基甲氧碳酰；NMM，N-甲基嗎啉；NMP，N-甲基2-吡咯烷酮；RP-HPLC，反相高效液相色譜；TBTU，2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基uronium四氟硼酸鹽；Trt，三苯甲基。
可以通過結(jié)合抑制實驗(如在實驗部分所示的BIAcore分析)評估本發(fā)明的肽抑制胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導物與酪氨酸激酶受體或其它酪氨酸磷?；D(zhuǎn)導物相結(jié)合的能力。
本發(fā)明的肽對受體酪氨酸激酶(如肝細胞生長因子受體(HGF-R))介導的生物反應的干擾，提供了其生物效應的另外證明。如實驗部分所示的在本發(fā)明范圍內(nèi)的代表性化合物的消脹中，本發(fā)明的肽能夠干擾細胞運動、細胞增殖、細胞侵入和HGF-R介導的管再生。
本領域的專家公知這些生物反應和致瘤性疾病的發(fā)生絕對相關。因此，可以在處理接收治療的人體或動物體時(例如在治療致瘤性疾病時)，使用本發(fā)明的肽。
本發(fā)明的肽是磷?；暮头橇柞；?。此肽的活性形式通常是磷?；?，但以非磷?；男问绞┯么穗牟⑹勾穗脑诨颊唧w內(nèi)變成磷?；赡苁怯欣摹＿@是因為當此肽為非磷?；瘯r，更容易吸收到細胞中。
同樣可以通過任何腸胃外的途徑向患者施用本發(fā)明的肽，或?qū)⒈景l(fā)明的肽進行適當?shù)鼐Y合，以便增加酶的穩(wěn)定性和細胞滲透性。
可以采取皮下、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)施用的任何選擇；所使用的劑量和施用的頻率取決于各種因素。這些因素包括施用的目的、治療的患者的年齡和體重、患者的狀態(tài)。給出了治療的有效量。然而，對于每種施用途徑，以每次10至1000毫克，優(yōu)選地是每次50至500毫克的量施用此肽?？梢詫⒋穗闹苽涑伤幬锝M合物。所說的藥物組合物也包含藥學上的可接受載體或稀釋劑。依據(jù)施用的途徑，可以使用任何合適的載體或稀釋劑?；衔锏纳餃y定本發(fā)明的新化合物已顯示出特別抑制Grb2轉(zhuǎn)導物與HGF受體的磷酸酪氨酸停靠位點的結(jié)合；所說的化合物也抑制含有磷酸酪氨酸?？课稽c的蛋白質(zhì)與含有其它SH2的轉(zhuǎn)導物(如p85-PI3K、PLCg、Src)的結(jié)合。表1和表2列出了這一抑制活性的例子。BIAcore分析用BIAcore儀器經(jīng)生物特異性相互作用分析確定親合力(Jonsson，U.等，生物技術，1991，11，520-527；Jonsson，U.等，在F.Turner(編輯的)，生物傳感器的進展，vol.2 JAI出版社，London，1992，p.291-336；Karlsson，R.，等，免疫學方法雜志，1991，145，229-246)。通過測量所說的磷肽抑制SH2結(jié)構域與固定化的磷肽(FCE 28942 6-生物素酰氨基-己?；?Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Gly-Glu-His-Tyr-(PO3H)-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-(PO3H)-Val-Asn-Val-Lys-OH(SEQ ID No.21)或FCE 289496-生物素酰氨基-己酰基-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Gly-Glu-His-Tyr-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr(PO3H)-Val-Asn-Val-Lys-OH)(SEQ ID No.22))相互作用的能力確定了相對親和力，這種固定化的磷肽包含人類肝細胞生長因子受體的Y1349和Y1356。表1和表2顯示了這些測量的結(jié)果，以所說的轉(zhuǎn)導物與長生物素化的磷肽(此磷肽固定在抗生物素蛋白裝載的薄片上，代表所考慮的轉(zhuǎn)導物的HGF受體結(jié)合位點)的結(jié)合抑制的百分數(shù)表示。表1報道了與Grb2-SH2相互作用的抑制有關的數(shù)據(jù)，表2報道了與其它轉(zhuǎn)導物(p85、PLCg、Src)有關的抑制數(shù)據(jù)。也在另一個系統(tǒng)中使用BIAcore技術檢測了更多的活性化合物，即它們抑制下列Grb2-SH2或p85-SH2與以全活性的磷?；问酱嬖诓⒐潭ㄔ诒∑系腍GF受體的整個胞質(zhì)部分締合的能力。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這一最新的更具代表性的但費勁的方法完全相當于原先使用固定化的長磷肽的方法。
表1.代表性化合物對與Grb2-SH2結(jié)構域締合的抑制力Grb2-SH2識別的抑制％20mM 1mMFCEH-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Lys-OH 651928407 (參照)SEQ ID NO.23)PCEAc-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-LVs-NH2877728405 (SEQ ID No.1)PCEAc-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-OH 100 8228539 (SEQ ID No.3)FCEAc-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2100 7728540 (SEQ ID No.4)FCE Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-NHCH2CH(CH3)2935629021FCEAc-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-NH2804529022FCEAc-Phe(p-CH2PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2905029408 (SEQ ID No.7)表2.代表性化合物對與其它轉(zhuǎn)導物SH2締合的抑制力其它的SH2識別的抑制％化合物濃度PLCγ(C+N)SH2 p85 N-SH2 src SH240mM 20mM 40mM 20mM40mM 20mMPCE Ac-Tyr(PO3H2)- 8177 93 75 69 4928540 Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.4)PCE AcTyr(PO3H2)- 6060 63 50 35 1429022 Val-Asn-NH2結(jié)合抑制的評價A)BIAcore分析固定化的生物素化的磷肽Biacore系統(tǒng)提供了一種可靠的和具有再現(xiàn)性的方法以研究高分子之間的相互作用。在精確控制的條件下(如溫度和流速)實時測量結(jié)合作用。Panayotou等(1993)已經(jīng)描述了BIAcore生物傳感器的構造和操作原理。所用的方案如下用于這些實驗的SH2結(jié)構域通過Pharmacia柱(SephadexG-50預填充系統(tǒng))脫鹽，以便完成緩沖液和BIAcore連續(xù)緩沖液(這種緩沖液由20mM Hepes、150mM NaCl、3.4mM EDTA、0.005％Tween 20和4mMDTT(pH7.4)組成)的交換。使用傳感器薄片(SA5 Pharmacia)(其中鏈霉抗生物素蛋白固定在羧甲基葡萄聚糖層上)進行實驗。將生物素化的磷肽FCE28949(SEQ ID NO.22)和28942(SEQ ID NO.21)(或單獨含有HGF受體磷酸酪氨酸1356，或含有HGF受體磷酸酪氨酸1349和1356)以5ml/秒的流速固定在鏈霉抗生物素蛋白化的薄片上50秒。使用短的0.1％SDS脈沖(4秒)除去沒有特異結(jié)合的磷肽。以檢測的競爭磷肽的濃度范圍(大多數(shù)情況下為20mM和1mM)混合GST-SH2結(jié)構域融合蛋白，并將其以5ml/分鐘在連續(xù)溫度25℃時注射到所說的表面上，120秒。用4秒0.1％SDS的脈沖除去和此表面結(jié)合的物質(zhì)，從而使信號降低到背景水平。
B)BIAcore分析固定化的GST/HGF-R融合蛋白如上文描述的分析生物素化的磷肽的方法進行此分析。然而，在這些實驗中純化的GST/HGF-R直接固定在BIAcore薄片上。在用1∶1的N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和N-乙基-N-(3二甲基氨丙基)-碳二亞胺氫氯化物(EDC)(Pharmacia)的混合物激活后，將GST/HGF-R(0.5毫克/毫升)固定在傳感器薄片表面上。用乙醇胺(1.0M)封閉過量的反應基團。
以所說的化合物干擾HGF-R介導的生物反應的能力為基礎，評價了此化合物的生物效應，這些生物反應包括(a)細胞運動(b)細胞增殖(c)細胞侵入(d)管再生。所說的化合物對細胞運動的作用在HGF刺激下，MDCK細胞遷移(Stoker，M.，E.Gherardi，M.Perryman，和J.Gray.自然1987 327239-242)。這種效應由轉(zhuǎn)導運動信號的HGF-R介導。利用新的原位電穿孔技術(稱為細胞活力法(cell zapping))在MDCK細胞中引入所說的肽來檢測此化合物抑制HGF介導的細胞運動的能力(參見下文的實驗方法部分)。使用生物素化的肽最初監(jiān)測所說的肽到細胞中的有效運輸。在胞內(nèi)運輸后，用熒光素化的抗生物素蛋白追蹤生物素化的肽。這種方法表明此肽對細胞無毒性，并穩(wěn)定至少24小時。為了評價此化合物對HGF-R介導的細胞運動的效應，使用含有電穿孔化合物的MDCK細胞進行擴散(scatter)分析。另外，將這些細胞接種在Transwell裝置(Costar)中，并刺激它們使之通過HGF穿過滲透性的膜(參見下文的實驗方法部分)。

圖1A和圖2描述了代表化合物對細胞運動的效應。這些實驗表明化合物(例如FCE 29408(SEQ ID NO.7))有效地阻止細胞運動，而在磷酸酪氨酸類似物(FCE 29606 Ac-Phe-Val-Asn-Val-OH(SEQ ID NO.24)的位置上的帶有苯基丙氨酸的相關的肽(陰性對照)則不能。此化合物對細胞增殖的作用HGF刺激上皮細胞增值，這種作用由HGF-R介導(Medico，E.，Mongiovi，A.，Huff，J.，Jelinek，M.，F(xiàn)ollenzi A.，Gaudino，G.，Parsons J.T.GridComoglio P.M.，細胞分子生物學，1996，在出版中)。使用細胞增值測定法(Amersham)監(jiān)測此化合物對HGF-R介導的細胞增殖的作用(參見下文的實驗方法部分)。通過細胞活力法將肽運送到MDCK細胞中。然后測量含有所說的化合物細胞摻入胸腺嘧啶核甙類似物5-溴-2脫氧尿苷(BrdU)。圖1C描述了代表化合物對細胞增值的作用。這些實驗表明和陰性對照FCE29606(SEQ ID NO.24)相比，所說的化合物有效地阻止細胞增值，如FCE29408(SEQ ID NO.7)所示。所說的化合物對細胞侵入的作用HGF/SF受體在組成型活性Tpr-MET蛋白質(zhì)中具有轉(zhuǎn)化相應物(Ponzetto，C.，Bardelli，A.，Zhen，Z.，Maina，F(xiàn).，Dalla Zonca，P.，M.(1994)細胞77，1-20.)。Tpr-MET轉(zhuǎn)化的細胞在體內(nèi)是高度致瘤的，并且在體外侵入胞外基質(zhì)。使用化學侵入測定法評價所說的化合物對Tpr-MET介導的細胞侵入的作用(參見下文的實驗方法部分)。經(jīng)細胞活力法將肽運輸?shù)郊毎鸗pr-MET轉(zhuǎn)化的細胞中，監(jiān)測含有此化合物的細胞侵入組成的基本膜(Matrigel)的能力。圖1B描述了代表化合物對細胞侵入的作用。這些實驗表明和陰性對照FCE 29606(SEQ ID NO.24)比較，這些化合物有效地阻止了細胞侵入，如報道的FCE 29408(SEQ ID NO.7)。所說的化合物對管再生的作用管再生是一個復雜的形態(tài)過程，其中上皮細胞本身組成三級結(jié)構。在模擬胞外基質(zhì)的環(huán)境中培養(yǎng)MDCK細胞，在HGF刺激的基礎上其形成管(Medico，E.，Mongiovi，A.，Huff，J.，Jelinek，M.，F(xiàn)ollenzi A.，Gaudino，G.，Parsons J.T.和Comoglio P.M.，Mel.Biol.of the細胞，1996，在出版中)。為了測驗所說的化合物對這種現(xiàn)象的作用，通過細胞活力法用將要評價的化合物補充MDCK(參見下文的實驗方法部分)。每日監(jiān)測用膠原基質(zhì)包被的并在HGF的存在下生長的單層細胞，以便觀察管的發(fā)生。圖3的顯微照片表明了培養(yǎng)兩天的電穿孔MDCK的外觀。而對照肽(陰性對照FCE29606Ac-Phe-Val-Asn-Val-OH(SEQ ID NO.24))使細胞以正常管的結(jié)構組裝，F(xiàn)CE 29408(SEQ ID NO.7)完全抑制了HGF誘導的管再生。
下文描述了具體說明本發(fā)明的實施例，而無意于把本發(fā)明限制在實施例中。
附圖中圖1描述了本發(fā)明的代表性化合物(FCE 29408)(SEQ ID NO.7)對細胞運動(圖1A)、細胞侵入(圖1B)、細胞增殖(圖1C)的作用。每個圖的縱座標表明了運動(1A)、侵入(1B)和增殖(1C)抑制的百分比。使用FCE 29606(SEQID NO.24)作為如實驗部分所解釋的陰性對照。
圖2是描述如實驗部分所討論的FCE 29408(SEQ ID NO.7)對細胞運動的生物作用的顯微照片。
圖3是描述如實驗部分所所說明的由HGF誘導的管再生的抑制的顯微照片，并且此圖顯示了培養(yǎng)兩天的電穿孔MDCK的外觀。
實施例1Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 28540)(SEQ ID NO.4)的制備通過手工固相合成法經(jīng)下列氨基酸(按加入的順序)的順序結(jié)合，在樹脂上合成保護的肽Fmoc-Val-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Tyr-OH。在最后一次結(jié)合后在固相中將酪氨酸殘基磷?；?使用亞磷酰胺化學和連續(xù)氧化)。接下來進行酸處理使側(cè)鏈去保護并從樹脂上解吸下來。更詳細地講，將0.56g(0.25mmol.)的Fmoc-2，4-二甲氧基-4-(羥甲氧基)二苯甲胺-氨甲基共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)樹脂(Knorr)(0.45mmol/g)進行下列包括1)至5)各步的循環(huán)1)NMP洗滌2)哌啶的(20％)NMP3)NMP，其后為DCM，再其后為NMP4)1預先形成的Fmoc-氨基酸的1-氫氧基苯并三唑酯的NMP溶液(0.5mmol)5)NMP，其后為DCM，再其后為NMP洗液和試劑的體積為10至20ml。
每個步驟有必要重復多次，以使樹脂完全反應(步驟2，4)或從樹脂上完全替代原先的試劑(步驟1，3，5)。在每一個DCM洗滌循環(huán)后取出樹脂樣品，并經(jīng)茚三酮實驗檢查反應的完全性。
在使用之前經(jīng)Fmoc-氨基酸(0.5mmol)、1-氫氧基苯并三唑(0.5mmol.)、DIEA(1mmol)和TBTU(0.5mmol)在NMP中反應生成Fmoc-氨基酸的1-氫氧基苯并三唑酯。
對每一個氨基酸殘基重復1至5步反應循環(huán)，以給出標題化合物序列。按照順序加入下列保護的氨基酸Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Tyr-OH。在最后循環(huán)之后，用DCM洗滌幾次肽基樹脂并干燥。相對于起始樹脂獲得了0.19g重量。
在25℃下用30eq.的1H-四唑和10eq.的二叔丁基-N，N-二異丙基-亞磷酰胺的蒸餾THF溶液處理肽基樹脂1.5小時，接下來在25℃下用30eq.的叔丁基氫過氧化物的甲苯溶液處理1.5小時，可在仍然吸附在此樹脂的肽上直接獲得酪氨酸殘基的磷酸化。在用20％的哌啶-DMF除去N-末端的Fmoc-保護基團后，通過用5eq.的醋酸酐和5eq.的DEA的NMP溶液在25℃下處理肽基樹脂30分鐘獲得N-末端的乙?；?。在室溫下，將0.79克的肽基樹脂和20毫升的三氟乙酸/水(95∶5)的混合物振蕩1.5小時。用二乙基醚沉淀去保護的肽，并通過過濾收集。
經(jīng)反向高效液相色譜在C18-Vdac(Hesperia，CA)柱(2，2×25cm)上以0.05％三氟乙酸通過利用線性梯度的5至32.5％的乙腈水溶液純化粗制的肽45分鐘。獲得含有此產(chǎn)物純化形式的組分，真空蒸發(fā)乙腈并將余下的溶液低壓凍干。以99.9％的色譜(HPLC)純度獲得64毫克的標題化合物。
氨基酸的比率Val 2(2)；Asx 1.2(1)；Tyr 0.9(1)。肽含量88％。FAB質(zhì)譜；m/z 615[MH]+。(MW614.6)實施例2Ac-Phe(P-CH2PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 29408)(SEQ ID NO.7)的制備從4-(2，4-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧乙酰氨基-正亮氨?；?4-甲基二苯甲胺-聚苯乙烯樹脂(Rink MBHA)開始，在此樹脂上以如實施例1描述的類似方式裝備磷甲基肽，按照下列順序加入保護的氨基酸Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe(p-CH2PO3Et2)-OH。通過用5eq.的醋酸酐和5eq.的DIEA的NMP溶液在25℃下處理肽基樹脂30分鐘獲得N-末端的乙?；Ｈ鐚嵤├?的描述進行樹脂的切割并除去保護基團(除磷酸乙基基團外)。將270毫克粗制的肽懸浮在配有1毫升三甲基溴硅烷的回流DCM中2小時。在溶劑蒸發(fā)后，通過如實施例1描述的RP-HPLC(只是乙腈梯度為5-43.5％)純化完全去保護的肽，得到98.0％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Val 2(2)；Asx 1.3(1)。肽含量100％。FAB質(zhì)譜；m/z 613[MH]+。(MW 612.6)實施例3Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-NHCH2CH(CH3)2(FCE 29021)的制備對標題化合物的制備考慮了不同的合成策略。從相應的N-烷基酰胺的天冬氨酸衍生物開始，通過使側(cè)鏈的羧基基團與產(chǎn)生酰胺的樹脂連接，在α-羧基基團上已經(jīng)引入了天冬酰胺N-烷基酰胺，以便在切割后產(chǎn)生b-酰胺基團。
通過使Fmoc-Asp(t.Bu)-OH(10mmol)和異丁醇胺(11mmol)經(jīng)帶有10eq.NMM和10eq.ECC的混合酸酐方法反應4小時，之后由TFA/水(95∶5)將t-異丁醇去保護。
從Fmoc-4-甲氧基-4-(g-羧丙氧基)-二苯甲胺-丙氨酰氨甲基-聚苯乙烯樹脂(DOD)開始，以如實施例1描述的類似方式在此磷?；鸵阴；臉渲涎b備磷肽，按照下列順序加入氨基酸Fmoc-Asp-NH-CH2CH(CH3)2、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Tyr-OH。利用此樹脂在37℃下由TFA/H2O/DMS(95∶5∶5)進行2小時的切割。在溶劑蒸發(fā)后，通過如實施例1描述的RP-HPLC純化完全去保護的肽，得到99.8％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Asx 0.9(1)；Val 1(1)；Tyr 1.1(1)。肽含量73％。FAB質(zhì)譜；m/z 572[MH)+。(MW 571.6)實施例4Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Lys(AC)-NH2(FCE 28405)(SEQ ID NO.1)的制備通過如實施例1描述的類似方式獲得98.9％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Lys 1(1)；Val 1.73(2)；Asx 1.27(1)；Tyr 0.87(1)。肽含量83％。FAB質(zhì)譜；m/z 785[MH]+。(MW 784.8)實施例6Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-OH(FCE 28539)(SEQ ID NO.3)的制備通過如實施例1描述的類似方式獲得標題化合物，只是使用了4-羥甲基苯甲氧基甲基-共聚多(苯乙烯-1％二乙烯基苯)樹脂(Wang)。將這種情況下的第一個氨基酸FmocVal(Boc)OH通過將溶解在DMF中的對稱酸酐(通過帶有6當量DIC的12當量氨基酸衍生物的DCM溶液處理20分鐘而產(chǎn)生)在催化量的DMAP存在的情況下與此樹脂反應2小時，而裝載到此樹脂上。按照實施例1描述的類似方法繼續(xù)進行制備。得到99.8％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Val 1.6(2)；Asx 1(1)；Tyr 0.7(1)。肽含量83％。FAB質(zhì)譜；m/z 616[MH]+。(MW 615.6)實施例7
H2O3PO-Ph-CH2-CH2-CO-Val-Asn-Val-OH(FCE 28404)的制備通過如實施例6描述的類似方式使用樹脂和引入第一個氨基酸和將如實施例1描述的類似方式用于余下的合成來獲得標題化合物，只是使用自動合成儀(應用生物系統(tǒng)肽合成儀430A)。得到99.0％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Val 1.9(2)；Asx 1(1)。肽含量41％。FAB質(zhì)譜；m/z 559[MH]+。(MW 558.5)實施例8Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-NH2(FCE 29022)的制備通過如實施例1描述的類似方式獲得標題化合物，但使用了Fmoc-4-甲氧基-4-(g-羧丙氧基)-二苯甲胺-丙氨酰氨甲基-聚苯乙烯樹脂(DOD)。使用此樹脂，用TFA/H2O/DMS(95∶5∶5)混合物在37℃下進行切割2小時。在溶劑蒸發(fā)后，通過如實施例1描述的RP-HPLC純化完全去保護的肽，得到98.7％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Val 1(1)；Asx 1.3(1)；Tyr 0.9(1)。肽含量81％。FAB質(zhì)譜；m/z 516[MH]+。(MW 515.5)實施例9Ac-Tyr(PO3H2)-Val-NHCH2CH2CONH2(FCE 29018)的制備通過實施例8描述的類似方式獲得標題化合物，但使用Fmoc-bAlaOH代替天冬酰胺衍生物。得到97.0％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Val 1(1)；Tyr 1.3(1)。肽含量56％。FAB質(zhì)譜；m/z 473[MH]+。(MW 472.4)實施例10Ac-Phe(CH2PO3H2)-Val-Asn-Val-Lys-NH2(FCE 28615)(SEQ ID NO.5)的制備通過如實施例2描述的類似方式獲得標題化合物，但使用了Fmoc-2，4-二甲氧基-4-(羥甲氧基)二苯甲胺-氨甲基共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)樹脂(Knorr)。得到99.1％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Lys1(1)；Val 1.7(2)；Asx 1.1(1)。肽含量95％。FAB質(zhì)譜；m/z 741[MH]+。(MW 740.8)實施例11Ac-Phe(P-CH2PO3H2)-Val-Asn-NH2(FCE 29406)的制備通過如實施例2描述的類似方式以98.4％的色譜(HPLC)純度獲得標題化合物。氨基酸的比率Asx 1(1)；Val 0.8(1)；。肽含量100％。FAB質(zhì)譜；m/z 514[MH]+。(MW 513.5)實施例12Ac-Phe(CH2SO3H)-Val-Asn-Val-NH2FCE 28995)(SEQ ID NO.6)的制備通過如實施例2描述的類似方式獲得標題化合物，但使用了Fmoc-4-甲氧基-4-(g-羧丙氧基)-二苯甲胺-丙氨酰氨甲基-聚苯乙烯樹脂(DOD)，并且使用FmocPhe(CH2SO3H)OH代替二乙基磷酰甲基衍生物。使用此樹脂由TFA/H2O/DMS(95∶5∶5)混合物在37℃下進行切割2小時。得到97.0％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Val 2(2)；Asx 1.1(1)。肽含量69％。FAB質(zhì)譜；m/z 613[MH]+。(MW 612.7)實施例13Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Ser-NH2(FCE 28785)(SEQ ID NO.8)的制備通過如實施例1描述的類似方式獲得99.1％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Ser 1(1)；Val 2.0(2)；Asx 1.2(1)。肽含量97％。FAB質(zhì)譜；m/z 702[MH]+。(MW 701.7)實施例14Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Gln-NH2(FCE 28883)(SEQ ID NO.9)的制備通過如實施例1描述的類似方式獲得96.5％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Glx 1(1)；Val 1.7(2)；Asx 1.2(1)；Tyr 0.7(1)。肽含量80％。FAB質(zhì)譜；m/z 743[MH]+。(MW 742.4)實施例15Ac-Tyr(PO3H2)-Ile-Asn-Gln-S-NH2(FCE 28702)(SEQ ID NO.14)的制備通過如實施例1描述的類似方式獲得99.3％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Ser 0.9(1)；Glx 1(1)；Asx 1.1(1)；Ile 0.8(1)；Tyr 0.7(1)。肽含量92％。FAB質(zhì)譜；m/z 745[MH]+。(MW 744.7)實施例16Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Ile-Glu-NH2(FCE 28703)(SEQ ID NO.15)的制備通過如實施例1描述的類似方式獲得99.0％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Asx 1(1)；Glx 0.9(1)；Ile 0.8(1)；Val 0.9(1)；Tyr 0.8(1)。肽含量93％。FAB質(zhì)譜；m/z 796[MNa]+，758[MH]+，515[Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-NH2]+。(MW 744.7)實施例17Ac-Tyr(PO3H2)-Ile-Asn-Ile-Lys-NH2(FCE 28737)(SEQ ID NO.16)的制備通過如實施例1描述的類似方式獲得93.0％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Lys 1(1)；Ile 1.77(2)；Asx 1.17(1)；Tyr 0.8(1)。肽含量78％。FAB質(zhì)譜；m/z 771[MH]+。(MW 770.8)實施例18Ac-Tyr(PO3Me2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 29091)(SEQ ID NO.11)的制備和Ac-Tyr(PO3HMe)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 29116)(SEQ ID NO.12)的制備通過如實施例1描述的類似方式獲得標題化合物，但使用了Fmoc-4-甲氧基-4-(g-羧丙氧基)-二苯甲胺-丙氨酰氨甲基-聚苯乙烯樹脂(DOD)，并且使用FmocTyr(PO3Me2)OH代替酪氨酸衍生物，因此省略了磷酸化步驟。使用此樹脂由TFA/H2O/DMS(95∶5∶5)混合物在37℃下進行切割2小時。得到這兩種化合物的化合物，并由RP-HPLC分離。
得到97.0％色譜(HPLC)純度的Ac-Tyr(PO3Me2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE29091)。氨基酸的比率Val 2(2)；Asx 1.1(1)；Tyr 0.9(1)。肽含量83％。FAB質(zhì)譜；m/z 643[MH]+。(MW 642.63)得到98.0％色譜(HPLC)純度的Ac-Tyr(PO3HMe)-Val-Asn-Val-NH2(FCE29116)。氨基酸的比率Val 2(2)；Asx 1.1(1)；Tyr 1.0(1)。肽含量84％。FAB質(zhì)譜；m/z 651[MNa]+，667[MK]+。(MW 628.6)實施例19BocTyrOBzl的制備通過將BocTyrOH(2克，7mmol)和芐基乙醇(0.873毫升，8.4mmol)與DCC(1.8克，8.75mmol)和DMAP(85毫克，0.7mmol)在0℃下反應1小時，并于室溫下在THF中放置1夜。在過濾DCU后，在真空中濃縮溶劑，殘渣溶解在EtOAc中，并由5％的NaHCO3溶液和飽和的NaCl溶液洗滌幾次。干燥(Na2SO4)并濃縮有機相。由硅膠層析法純化粗制的物質(zhì)(洗脫液石油醚/乙酸乙酯從9/1到8/2v/v)，最終得到1.5克標題化合物(57％產(chǎn)量)。H1NMR(200MHz，CDCl3)d(ppm)＝7.4-6.65(m，9H，芳族化合物)，5.1(d，2H，COOCH2F)，4.6(m，1H，N-CH-CO)，3.0(d，2H，CH-CH2-F)，1.4(s，9H，tBu)。
BocTyr(PO3Et2)OBzl的制備在氬氣中和50℃下，通過將BocTyrOBzl(371毫克，1mmol)和二乙基磷酸鹽(258毫克，1.5mmol)與過量的NaH(60％的礦物油溶液)在干燥的1，4-二氧六環(huán)中反應3.5小時制備標題化合物。在真空中濃縮溶劑，殘渣溶解在EtOAc中，并由5％的NaHCO3溶液、10％檸檬酸溶液及飽和的NaCl溶液洗滌幾次。干燥(Na2SO4)并濃縮有機相，得到254毫克的油(50％產(chǎn)量)，這些油在沒有純化的情況下用于下面的步驟。質(zhì)譜m/z 508[MH]+，530[MNa]+。H1NMR(200Mhz，CDCl3)d(ppm)＝7.4-6.85(m，9H，芳族化合物)，5.1(d，2H，COOCH2-F)，4.6(m，1H，N-CH-CO)，4.3-4(m，4H，P-O-CH2-CH3)，3(t，2H，CH-CH2-F)，1.4(m，15H，CH3-CH2+tBu)。
BocTyr(PO3Et2)OH的制備通過粗制的BocTyr(PO3Et2)OBzl(1mmo)和甲酸銨(4mmol)與炭上的10％Pd在50℃下于甲醇/醋酸混合物中反應20分鐘制備標題化合物。在過濾催化劑后，在真空中濃縮溶劑，殘渣溶解在EtOAc中，并由飽和的NaCl溶液洗滌幾次。干燥(Na2SO4)并濃縮有機相，得到270毫克的油(70％產(chǎn)量)，這些油在沒有純化的情況下，用于下面的步驟。質(zhì)譜m/z 409[MNa]+。H1NMR(200Mhz，DMSO-d6)d(ppm)＝7.3-7(dd，4H，芳族化合物)，4.1(m，4H，P-O-CH2-CH3)，3-2.7(m，2H，CH-CH2-F)，1.4-1.2(m，15H，CH3-CH2+tBu)。
Ac-Tyr(PO3Et2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 29145)(SEQ ID NO.13)的制備通過如實施例18類似的方式獲得標題化合物，但使用了BocTyr(PO3Et2)。通過由1.5當量DIEA和5當量醋酸酐在DMF中25℃下處理粗制的H-Tyr(PO3Et2)-Val-Asn-Val-NH22小時而進行N-乙?；５玫?0.0％色譜(HPLC)純度的最終化合物。氨基酸的比率Val 2(2)；Asx 1.17(1)；Tyr 0.87(1)。肽含量83％。FAB質(zhì)譜；m/z 671[M-H]+。(MW 670.1)實施例206-生物素酰氨基-己?；?Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 29128)(SEQ ID NO.10)的制備通過如實施例8描述的類似方式獲得標題化合物，但以生物素化代替乙?；?。在由20％的哌啶-DMF除去N末端的Fmoc保護基團后，通過由3.3eq 6-磺基丁二酰亞胺酰基(生物素酰氨基)己酸鹽和幾滴N-甲基嗎啉在DMF中25℃下處理肽基樹脂70小時(直到由茚三酮實驗檢測已反應完全)而獲得N末端生物素化。得到98.8％色譜(HPLC)純度的最終化合物。氨基酸的比率Val2(2)；Asx 1.2(1)；Tyr 1.0(1)。肽含量97％。FAB質(zhì)譜；m/z 912[M]。(MW 912.02)實施例21Ac-Tyr(PO3H2)-Gly-Asn-NH2(FCE 29267)的制備通過如實施例1描述的類似方式獲得標題化合物，但使用了4-(2，4-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧乙酰氨基-正亮氨?；?4-甲基二苯甲胺-聚苯乙烯樹脂(Rink MBHA)。得到98.6％色譜(HPLC)純度的此化合物。氨基酸的比率Asx 1(1)；Gly 0.9(1)；Tyr 0.8(1)。肽含量77％。FAB質(zhì)譜；m/z 474[MH]+。(MW 473.4)實施例22Ac-Phe(P-CH2PO3H2)-Gly-Asn-NH2(FCE 29268)的制備通過如實施例2描述的類似方式獲得100％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Asx l(1)；Tyr 0.9(1)。肽含量88％。FAB質(zhì)譜；m/z 472[MH]+。(MW 471.4)實施例23Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Gln-NH2(FCE 29409)的制備通過如實施例1描述的類似方式獲得標題化合物，但使用了4-(2，4-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧乙酰氨基-正亮氨?；?4-甲基二苯甲胺-聚苯乙烯樹脂(Rink MBHA)。得到99.3％色譜(HPLC)純度的此化合物。氨基酸的比率Glx 1(1)；Val 0.8(1)；Tyr 0.8(1)。肽含量81％。FAB質(zhì)譜；m/z 530[MH]+。(MW529.5)實施例24Ac-Tyr(PO3H2)-Val-D-Asn-NH2(FCE 29410)的制備通過如實施例23描述的類似方式獲得99.0％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Asx 1(1)；Val 0.8(1)；Tyr 0.9(1)。肽含量87％。FAB質(zhì)譜；m/z 516[MH]+。(MW 515.5)
實施例25Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Hse-NH2(FCE 29411)的制備通過如實施例23描述的類似方式獲得86.5％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Val 0.8(1)；Tyr 1(1)。肽含量88％。FAB質(zhì)譜；m/z 503[MH]+。(MW 502.5)實施例26Ac-Tyr(PO3H2)-D-Val-Asn-NH2(FCE 29413)的制備通過如實施例23描述的類似方式獲得99.1％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Asx 1(1)；Val 0.7(1)；Tyr 0.8(1)。肽含量82％。FAB質(zhì)譜；m/z 516[MH]+。(MW 515.5)實施例27Ac-Tyr(PO3H2)-Abu-Asn-NH2(FCE 29414)的制備通過如實施例23描述的類似方式獲得99.7％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Asx 1(1)；Tyr 0.9(1)。肽含量87％。FAB質(zhì)譜；m/z 502[MH]+。(MW 501.4)實施例28Ac-Tyr(PO3H2)-terLeu-Asn-NH2(FCE 29415)的制備通過如實施例23描述的類似方式獲得98.7％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Asx 1.2(1)；terLeu 1(1)；Tyr 1.0(1)。肽含量77％。FAB質(zhì)譜；m/z 530[MH]+。(MW 529.5)實施例29Ac-Tyr(PO3H2)-Ala-Asn-NH2(FCE 29421)的制備通過如實施例23描述的類似方式獲得98.9％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Asx 1(1)；Ala 0.73(1)；Tyr 0.7(1)。肽含量83％。FAB質(zhì)譜；m/z 488[MH]+。(MW 487)實施例30Ac-Tyr(PO3H2)-Aib-Asn-NH2(FCE 29475)的制備通過如實施例23描述的類似方式獲得97.2％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Asx 1(1)；Tyr 0.8(1)。肽含量77％。FAB質(zhì)譜；m/z 502[M-H]+。(MW 501.44)
實施例31CH3-(CH2)12-CO-Gly-Gly-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 29402)(SEQ ID NO.17)的制備通過如實施例8描述的類似方式獲得95％毛細管電泳純度(EF)的標題化合物。氨基酸的比率Val 2(2)；Asx 1.1(1)；Tyr 1.0(1)；Gly 1.9(2)。肽含量94％。FAB質(zhì)譜；m/z 897[M]。(MW 897.0)實施例32CH3-(CH2)12-CO-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 29403)(SEQ ID NO.18)的制備通過如實施例8描述的類似方式獲得95％毛細管電泳純度(EF)的標題化合物。氨基酸的比率Val 1.7(2)；Asx 1(1)；Tyr 0.8(1)。肽含量87％。FAB質(zhì)譜；m/z 783[MH]+。(MW 782.9)實施例33CH3-(CH2)6-CO-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 29404)(SEQ ID NO.19)的制備通過如實施例8描述的類似方式獲得72％毛細管電泳純度(EF)的標題化合物。氨基酸的比率Val 1.8(2)；Asx 1(1)；Tyr 0.9(1)。肽含量87％。FAB質(zhì)譜；m/z 699[MH]+。(MW 698.7)實施例34的制備C6H11-CH2-CO-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 29405)(SEQ ID NO.20)的制備通過如實施例8描述的類似方式獲得75％毛細管電泳純度(EF)的標題化合物。氨基酸的比率Val 1.8(2)；Asx 1(1)；Tyr 1.0(1)。肽含量96％。FAB質(zhì)譜；m/z 697[MH]+。(MW 696.7)實施例35CH3-CO-CH2-CH2-CO-Phe(P-CH2PO3H2)-Val-Asn-NH2(FCE 29407)的制備通過如實施例2描述的類似方式獲得88.3％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸的比率Asx 1(1)；Val 0.8(1)。肽含量99％。FAB質(zhì)譜；m/z 570[MH]+。(MW 569.7)
實施例366-生物素酰氨基-己?；?Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Gly-Glu-His-Tyr-(PO3H)-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr(PO3H)-Val-Asn-Val-Lys-OH(FCE 28942)(SEQ ID NO.21)的制備在MilliGen 9050肽合成儀上由帶有第一個氨基酸(Fmoc-L-Lys(Boc)OH，此氨基酸已經(jīng)通過酯鍵吸附在此樹脂上)的4-羥甲苯氧乙酰氨甲基-聚乙烯乙二醇-聚苯乙烯樹脂開始進行鏈裝配(1.1克；0.18mmol/克)。將此樹脂進行下列包括1至6步處理內(nèi)雙偶合的循環(huán)1)通過使用20％哌啶-DMF除去Fmoc-保護基團，7分鐘；2)以DMF洗滌，12分鐘；3)用4當量的Fmoc-氨基酸衍生物的DMF溶液進行第一次偶合，30分鐘；4)以DMF洗滌，8分鐘；5)用4當量的Fmoc-氨基酸衍生物的DMF溶液進行第二次偶合，30分鐘；6)以DMF洗滌，8分鐘；以從羧基末端到氨基末端的順序?qū)γ恳话被釟埢貜?到6步反應循環(huán)，以給出標題化合物的序列，其中使用下列保護側(cè)鏈的氨基酸衍生物Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-His(Boc)-OPfp、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OPfp、Fmoc-L-Thr(tBu)-OR(其中的R是氫或Pfp)。
在每個循環(huán)中，除了Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Tyr-OH、Fmoc-Gly-OH(在肽鏈的2和4位置上)外，使用Fmoc-氨基酸五氟苯酯(此化合物偶合成1-1-羥基苯并三唑酯，恰好在使用前通過Fmoc-氨基酸、TBTU、1-羥基苯并三唑(每個4當量)和N-甲基嗎啉(8當量)的反應形成)進行第一次偶合反應(第3步)。在每個循環(huán)中，除了Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-His(Boc)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH外，使用1-羥基苯并三唑酯(其恰好在使用前通過如上述的描述而形成，通過使用它們自身的五氟苯酯而偶合成)進行第二次偶合反應(第5步)。
在最后的循環(huán)后，洗滌幾次肽基樹脂并將此樹脂干燥。和開始的樹脂比較，獲得了1.2克的重量。在25℃下用30eq.的1H-四唑和10eq.的二叔丁基-N，N-二異丙基-亞磷酰胺的蒸餾THF溶液處理肽基樹脂1.5小時，接下來在25℃下用30eq.的叔丁基氫過氧化物的甲苯溶液處理1.5小時，可在仍然吸附在此樹脂的肽上直接獲得酪氨酸殘基的磷酸化。在用20％的哌啶-DMF除去N-末端的Fmoc-保護基團后，通過由3.3eq 6-磺基丁二酰亞胺基(生物素酰氨基)己酸鹽和幾滴N-甲基嗎啉在DMF中25℃下處理肽基樹脂70小時(直到由茚三酮實驗檢測已反應完全)而獲得N末端生物素化。和開始的樹脂比較獲得1.5克的重量。在室溫下，將0.70克的肽基樹脂和8毫升的三氟乙酸/水/EMS(95∶2.5∶2.5)的混合物振蕩1.5小時。用二乙基醚沉淀去保護的肽，并通過過濾收集。
經(jīng)反向高效液相色譜在C18-Vdac(Hesperia，CA)柱(2，2×25cm)上以18ml/分鐘的流速，通過13.25％(25分鐘)、16％(35分鐘)、18.75％(30分鐘)、21.5％(10分鐘)的乙腈(溶解在0.05 NAcONH4水溶液)連續(xù)的逐步等度條件洗脫，在220nm的波長下使用UV檢測器。和并含有純化形式的組分，在真空中蒸發(fā)乙腈，余下的溶液低壓凍干兩次。獲得91.5％色譜(HPLC)純度的標題化合物(12毫克)。氨基酸比率Lys 1(1)；Asx 2.37(2)；Gly 6.00(6)；Ile 0.9(1)；Thr 1.00(1)；Ala 1.00(1)；His 1.73(2)；Glx 1.10(1)；Val 3.63(4)；Tyr 1.83(2)。肽含量82％。FAB質(zhì)譜；m/z 2627.2[M+H]+；m/z 2625.5[M-H]-；(MW 2627.74)實施例376-生物素酰氨基-己酰Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Gly-Glu-His-Tyr-Val-His-Val-Asn-ALA-Thr-Tyr-(PO3H)-Val-Asn-Val-Lys-OH(FCE 28949)(SEQ ID No.22)的制備通過如實施例36類似的方式獲得91.8％色譜(HPLC)純度的標題化合物。氨基酸比率Lys 1(1)；Val 3.67(4)；Asx 2.4(2)；Tyr 1.83(2)；Thr 1.0(1)；Ala 1.07(1)；His 1.6(2)；Glx 1.1(1)；Ile 0.93(1)；Gly 6.3(6)。肽含量68％。FAB質(zhì)譜；m/z 2547.1[M+H]+；2545[M-H]-。(MW2547.8)實施例38H-Tyr(PO3H2)-Val-Ash-Val-Lys-OH(FCE 28407)(作為參照)(SEQ ID NO.23)的制備通過如實施例6描述的類似方式獲得標題化合物，但使用了自動合成儀(應用生物系統(tǒng)肽合成儀430A)及實施例1描述的磷酸化步驟。獲得99.0％色譜(HPLC)純度的此化合物。氨基酸比率Lys 0.8(1)；Val 1.6(2)；Asx1(1)。肽含量80％。FAB質(zhì)譜；m/z 702[MH]+。(MW 701.7)實施例39Ac-Phe-Val-Asn-Val-OH(FCE 29606)(作為參照)(SEQ ID NO.6)的制備通過如實施例6描述的類似方式使用樹脂和引入第一個氨基酸和將實施例1描述的類似方式用于其它合成步驟來獲得標題化合物。獲得97.6％色譜(HPLC)純度的此化合物。氨基酸比率Val 2(2)；Asx 1.4(1)；Phe 0.9(1)。肽含量98％。FAB質(zhì)譜；m/z 520[MH]+。(MW 519.6)實施例40使用細菌表達系統(tǒng)制備重組SH2結(jié)構域為了迅速地產(chǎn)生大量純化的功能性蛋白質(zhì)。使用了實質(zhì)上如D.B.Smith和K.S.Johnson(基因，1988，67，31)描述的方法。通過聚合酶鏈式反應獲得作為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白的SH2結(jié)構域，并將其克隆到pGEX細菌表達載體(Pharmacia)中。在細菌表達之后，使用谷胱甘肽-瓊脂糖-色譜迅速純化融合蛋白。所用方案如下將pGEX載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞(xL-1 Blue)在37℃下10ml LB中振蕩培養(yǎng)過夜，然后用其接種含有氨芐青霉素(100克/毫升)的1升LB培養(yǎng)基。37℃充分通氣下生長3-4小時，直到OD600達到0.5至0.6。通過加入最終濃度為0.2-0.4mM的IPTG誘導重組蛋白質(zhì)的表達，在37℃下再生長4-8小時。然后通過以2000g離心15分鐘沉淀細菌細胞，在PBS中洗滌兩次，并于冰上溶解在含有蛋白酶抑制物的40毫升LB緩沖液(100mM Tris pH7.4，150mM NaCl，5mM EDTA，10％甘油，1％Triton X-100)中。將這些細胞進行溫和的超聲處理，然后置于冰上30分鐘。通過在4℃下以14.000rpm離心裂解物20分鐘除去細胞碎片。在4℃將上清液與在EB緩沖液中預洗2小時的5毫升谷胱甘肽瓊脂糖(Pharmacia)旋轉(zhuǎn)溫育，使重組蛋白質(zhì)進行親和結(jié)合。然后用EB洗滌這些小珠4次，50mM Tris-HCl次[pH8.0]洗滌兩次。通過和50毫升20mM谷胱甘肽的Tris-HCl[pH8.0]溶液競爭，將所說的蛋白質(zhì)從小珠上洗脫下來，并以1毫升收集組分，使用蛋白質(zhì)測定試劑(Pierce)分析這些組分中的蛋白質(zhì)含量。然后將純化的GST融合蛋白用于BIAcore和生物化學分析。
實施例41用桿狀病毒表達系統(tǒng)制備重組HGF-R將作為GST融合蛋白的人類HGF-R cDNA的胞內(nèi)結(jié)構域插入到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體PVL 1393(Invitrogen，San Diego，CA)中。通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法將重組載體和BsuI消化的BacPak6病毒DNA(Clontech實驗室，Palo Alto，CA)共轉(zhuǎn)染到草地夜蛾昆蟲細胞(Sf9)(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)中。通過斑點印跡雜交和噬斑測定法鑒定和純化陽性克隆。使用重組病毒感染10-1，10-2，10-3，10-6稀釋倍率的Sf 9細胞。一周后，將感染的細胞提取物在尼龍濾器上印跡并由放射標記的全長人類HGF-R cDNA探測。接下來通過噬斑測定純化含有HGF-R cDNA基因的病毒。分離單一的病毒克隆并用于大規(guī)膜的Sf9細胞感染。通過Western印跡法監(jiān)測病毒克隆的表達，接下來將高水平表達克隆用于大規(guī)模的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。實質(zhì)上按照有關SH2結(jié)構域的描述進行GST/HGF-R融合蛋白的純化。
實施例42吸附細胞原位電穿孔細胞活力法為了有效地將蛋白質(zhì)引入到吸附細胞中，使用了新的原位電穿孔方法(L.Raptis和K.L.Firth，DNA和細胞生物學，1990，9，615-621)。對于傳統(tǒng)的電穿孔方法，這種技術是優(yōu)選的，這是因為(1)通過胰蛋白酶處理，細胞膜沒有改變(2)細胞膜不易受到脫離底物的增加的應力的影響(3)細胞生存能力高于正常的電穿孔方法(4)在電穿孔后，可以通過顯微鏡檢查直接檢測細胞的變化。電穿孔裝置(Epizap EZ-11.咨詢科學研究所，Kingston，Ontario，CA)由給電容器充電和放電的回路及一個將脈沖傳送給所說的細胞的裝置組成。后一個裝置由涂上一層導電的，可以透明也可以不透明的銦-錫氧化物的玻片、鋁陰性電極和鋁陽性電極組成。實驗前一天，將玻片放置在10厘米的陪替氏培養(yǎng)皿中，并由乙醇消毒。將MDCK細胞接種在導電表面上。應用脈沖之前，除去生長培養(yǎng)基(DMEM 10％FCS)，并用電穿孔緩沖液(10mM磷酸鈉pH7.0，140mM NaCl，1mM KCl)洗滌兩次。接下來將同樣的加入了接收檢驗的將引入的化合物(為溶解在電穿孔緩沖液中1mM溶液)的緩沖液加入到所說的細胞中。按照下列參數(shù)進行單一脈沖的電穿孔50-100V和1-20mF。脈沖后，用生長培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，并在37℃下恢復2小時。電穿孔后2小時，通過加入臺盼藍評價細胞的生存能力。
實施例43轉(zhuǎn)孔遷移和侵入測定使用Costars培養(yǎng)室轉(zhuǎn)孔(transwell))(6.5mM，Costar公司，劍橋，馬薩諸塞)測定了細胞侵入的刺激作用。在transwells的上室底部使用了聚碳酸酯膜(孔的大小為8mm)。在通過如實施例47描述的方法用接收評價的化合物電穿孔后，將200毫升含有105細胞的培養(yǎng)基放置在上室的聚碳酸酯膜上。將1毫升的DMEM 5％FCS(單獨或含有刺激因子(400個單位高度純化的HGF))加入到下室中。將此平板在37℃下H2O飽和的5％CO2中培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，機械除去聚碳酸酯膜濾器上面的細胞。在檢測細胞侵入性時，用1.2毫克/毫升基質(zhì)膠(matrigel)(類似上皮基礎膜結(jié)構并含有IV型膠原、野芝麻鹼和其它基礎膜結(jié)構組分)涂敷聚碳酸酯膜濾器(協(xié)作研究公司，Waltham，MA)。評價細胞侵入時，將培養(yǎng)延長到48小時。在室溫下，將已經(jīng)遷入到濾器底面的細胞用11％的glutheraldeyde固定15分鐘，蒸餾水洗滌三次，用0.1％結(jié)晶紫-20％甲醇在室溫下染色20秒。在自來水洗滌三次和室溫下干燥后，通過將濾器浸入到300毫升10％的醋酸中溶解結(jié)晶紫(室溫下5秒鐘)。以590nm的吸收率評價溶解的結(jié)晶紫的濃度。
實施例44細胞增殖的測定通過胸腺嘧啶核甙類似物(5-溴2-脫氧尿苷(BrdU))的加入由細胞增值測定方法(Amersham)測定細胞增值的刺激作用。在通過如實施例47描述的方法用被評價的化合物電穿孔后，將MDCK細胞接種在微型滴定板中，以便達到次級鋪滿(subconfluence)，在DMEM 0.2％FCS中饑餓24-48小時，然后用純化的重組HGF刺激。6小時后，加入BrdU，并使之進一步結(jié)合2小時。通過特異性的單克隆抗體和過氧化物酶-綴合次級抗體檢測結(jié)合的BrdU。和色原過氧化物酶底物一道培養(yǎng)產(chǎn)生可溶性的綠色染料，測定410nm的吸收率。
實施例45
管再生測定改良傳統(tǒng)的管再生測定法(Medico等，1996)，以便在原位完成電穿孔細胞的測定。在傳導玻片的DMEM 10％FCS中使MDCK細胞生長至鋪滿。在通過如實施例47用被評價的化合物電穿孔后，由含有2％膠原(主要是I型(Seromed))混合物的人工胞外基質(zhì)包被MDCK細胞。在純化的重組HGF存在下，將包被的單層細胞培養(yǎng)4-5天。每隔一日將補充有HGF的培養(yǎng)基更新一次。每天通過倒置光學顯微鏡(Leica)以400X的放大率觀察來監(jiān)測管再生。在HGF刺激兩天后，管結(jié)構變得明顯。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名Pharmacia和Up john S.p.A.
(B)街通Via Robert Koch 1.2(C)城市米蘭(E)國家意大利(F)郵區(qū)代碼(ZIP)20152(ii)發(fā)明名稱細胞有絲分裂發(fā)生和運動發(fā)生的肽拮抗劑和它們的治療用途(iii)序列數(shù)24個(iv)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點
(B)位置5(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Lys-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO1Xaa Val Asn Val Xaa15(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置5(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Lys(Ac)-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO2Xaa Val Asn Val Xaa15(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置4(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa Val-OH″(xi)序列描述SEQ ID NO3Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點
(B)位置4(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO4Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Ac-Phe(CH2PO3H2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置5(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Lys-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO5Xaa Val Asn Val Xaa15(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Ac-Phe(CH2SO3H)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置4(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO6Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Ac-Phe(P-CH2PO3H2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點
(B)位置4(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO7Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置5(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是S-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO8Xaa Val Asn Val Xaa15(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置5(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Gln-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO9Xaa Val Asn Val Xaa15(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征；(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是6-生物素酰氨基-己?；?Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點
(B)位置4(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO10Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3Me2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置4(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO11Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3HMe)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置4(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO12Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3Et2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點
(B)位置4(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO13Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置5(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是S-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO14Xaa Ile Asn Gln Xaa15(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置5(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Glu-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO15Xaa Val Asn Ile Xaa15(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點
(B)位置5(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Lys-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO16Xaa Ile Asn Ile Xaa15(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是CH3-(CH2)12-CO-Gly″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置3(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置6(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO17Xaa Gly Xaa Val Asn Xaa15(2)SEQ ID NO18信息(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是CH3-(CH2)12-CO-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置4(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO18Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是CH3-(CH2)6-CO-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置4(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO19Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是C6H11-CH2-CO-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置4(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO20
Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特征(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是6-生物素酰氨基-己?；?Gly″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置10(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Tyr(PO3H)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置17(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Tyr(PO3H)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置21(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Lys-OH″(xi)序列描述SEQ ID NO21Xaa Gly Gly Gly Gly I1e Gly Glu His Xaa Val His Val Asn Ala Thr15 10 15Xaa Val Asn Val Xaa20(2)SEQ ID NO22信息(i)序列特征(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是6-生物素酰氨基-己?；?Gly″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置17(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Tyr(PO3H)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置21(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Lys-OH″(xi)序列描述SEQ ID NO22Xaa Gly Gly Gly Gly Ile Gly Glu HisTyr Val HisVal Asn Ala Thr15 10 15Xaa Val Asn Val Xaa
20(2)SEQ ID NO23信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是H-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置5(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Lys-OH″(xi)序列描述SEQ ID NO23Xaa Val Asn Val Xaa15(2)SEQ ID NO24信息(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點
(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Xaa是Ac-Phe″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞修飾的位點(B)位置4(D)其它信息/產(chǎn)物＝″其它″/注釋＝″Val-OH″(xi)序列描述SEQ ID NO24Xaa Val Asn Xaa權利要求
1)一種下式(I)的肽或其藥學上可接受的鹽
其中Y是氫、R-C(＝O)NH-，其中R是氫、低級烷基或者長鏈烷基，這兩種烷基是線性的或支鏈的或環(huán)狀的、N-取代的氨基酸或肽殘基或多肽殘基或包括N-取代的氨基酸或肽部分的多肽殘基；X是-OPO3H2或其功能性衍生物；A是低級烷基；B是H-或低級烷基；Z是H、-COOH、CONHR2、-COR2(其中R2＝H、-NH2、-NHR3(其中R3是低級烷基，以羧酸形式或酰胺化形式存在的氨基酸或二肽))。
2)按照權利要求1的化合物，其中所說的N-取代的氨基酸或肽殘基是R-C(＝O)-Gly-、R-C(＝O)-Thr-或R-C(＝O)-Ala-Thr-(其中R如權利要求1中所限定的)。
3)按照權利要求1或2的化合物，其中所說的-OPO3H2的功能性衍生物選自-CH2PO3H2、-CF2PO3H2、-CHFPO3H2、-CH2SO3H、-CF2SO3H、-CHFSO3H、-SPO3H2、-OPSO2H2、-SPSO2H2、-OPS2OH2、-OP(CH3)O2H、-SP(CH3)O2H、-OP(CH3)SOH、OP(CF3)O2H、-OP(CHF2)O2H、-SP(CF3)O2H、-SP(CHF2)O2H和其低級烷基酯。
4)按照以上任一權利要求的化合物，其中A是CH3-、CH3CH2-、(CH3)2CH-、(CH3)3C-、CH3CH2CH(CH3)-或(CH3)2CHCH2-。
5)按照以上任一權利要求的化合物，其中所說的R3是-CH2CH(CH3)2-或選自-Val-NH2、-Val-OH、-Val-Lys-NH2、-Val-Lys-OH、-Val-Lys(eN-Ac)-NH2、-Val-Lys(eN-Ac)-OH、-Val-Ser-NH2、-Val-Ser-OH、-Val-Gln-OH和-Val-Gln-NH2。
6)按照以上任一權利要求的化合物，這種化合物能夠和胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導物結(jié)合。
7)按照權利要求6的化合物，這種化合物能夠抑制胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導物與受體酪氨酸激酶或者與另一種酪氨酸磷?；D(zhuǎn)導物結(jié)合。
8)按照權利要求7的化合物，其中所說的胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導物選自由下列物質(zhì)組成的組Grb-2、Shc、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的p85亞單元、Src、ras GTP酶活化蛋白(GAP)、磷脂酶Cγ(PLCγ)、ZAP70、Syc和Stat，并且其中所說的受體酪氨酸激酶選自由肝細胞生長因子受體(HGF-R)、血小板衍生的生長因子受體(PDGF-R)、表皮生長因子受體(EGF-R)和它們截短的或突變的保留有細胞質(zhì)域的形式組成的組。
9)按照權利要求7的化合物，其中所說的轉(zhuǎn)導物選自由下列物質(zhì)組成的組Grb-2、Shc、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的p85亞單元、Src、rasGTP酶活化蛋白(GAP)、ZAP70、Syc和Stat。
10)按照權利要求8的化合物，其中所說的胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導物是Grb-2，受體酪氨酸激酶是HGF-R或它的相關形式(如Tpr-MET)和此家族的其它成員(如SEA和RON)。
11)按照權利要求1的化合物，這種化合物選自FCE 28405 Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Lys-NH2(SEQ ID No.1)FCE 28782 Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Lys(Ac)-NH2(SEQ ID No.2)FCE 28539 Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-OH(SEQ ID No.3)FCE 28540Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.4)FCE 28404H2O3PO-Ph-CH2-CH2-CO-Val-Asn-Val-OHFCE 29021Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-NHCH2CH(CH3)2FCE 29022Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-NH2FCE 29018Ac-Tyr(PO3H2)-Val-NHCH2CH2CONH2FCE 28615Ac-Phe(CH2PO3H2)-Val-Asn-Val-Lys-NH2(SEQ ID No.5)FCE 28995Ac-Phe(CH2SO3H)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.6)FCE 29406Ac-Phe(p-CH2PO3H2)-Val-Asn-NH2FCE 29408Ac-Phe(p-CH2PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.7)FCE 28785Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Ser-NH2(SEQ ID No.8)FCE 28883Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Gln-NH2(SEQ ID No.9)FCE 291286-生物素酰氨基-己?；?Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.10)FCE 29091Ac-Tyr(PO3Me2)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.11)FCE 29116Ac-Tyr(PO3HMe)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.12)FCE 29145Ac-Tyr(PO3Et2)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.13)FCE 28702Ac-Tyr(PO3H2)-Ile-Asn-Gln-Ser-NH2(EGFR/Y1068) (SEQID No.14)FCE 28703Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Ile-Glu-NH2(IRS1/Y895) (SEQ ID No.15)FCE 28737Ac-Tyr(PO3H2)-Ile-Asn-Ile-Lys-NH2(SEQ ID No.16)FCE 29267Ac-Tyr(PO3H2)-Gly-Asn-NH2FCE 29268Ac-Phe(p-CH2PO3H2)-Gly-Asn-NH2FCE 29409Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Gln-NH2FCE 29410Ac-Tyr(PO3H2)-Val-D-Asn-NH2FCE 29411Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Hse-NH2FCE 29413Ac-Tyr(PO3H2)-D-Val-Asn-NH2FCE 29414Ac-Tyr(PO3H2)-Abu-Asn-NH2FCE 29415Ac-Tyr(PO3H2)-terLeu-Asn-NH2FCE 29421Ac-Tyr(PO3H2)-Ala-Asn-NH2FCE 29475Ac-Tyr(PO3H2)-Aib-Asn-NH2FCE 29402CH3-(CH2)12-CO-Gly-Gly-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.17)FCE 29403CH3-(CH2)12-CO-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.18)FCE 29404CH3-(CH2)6-CO-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.19)FCE 29405C6H11-CH2-CO-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.20)FCE 29407CH3-CO-CH2-CH2-CO-Phe(p-CH2PO3H2)-Val-Asn-NH2
12)一種制備如以上任一權利要求所要求的化合物的方法，該方法包括由單個的氨基酸和/或兩個或多個氨基酸殘基預先形成的肽化學合成式(I)的肽。
13)按照權利要求12的方法，其中在固相合成期間將預磷酰化保護的酪氨酸殘基引入到此肽中。
14)按照權利要求12的方法，其中當受保護的預先形成的肽吸附在固體支持物上時，此肽的酪氨酸殘基是磷?；?。
15)按照權利要求12至14任一之方法，該方法包括將所說的肽轉(zhuǎn)化成其藥學上可接受的鹽。
16)一種藥物組合物，該組合物包含生理學上可接受的載體或稀釋劑和作為活性成分的權利要求1至11之任一所要求的化合物。
17)一種通過治療法用于治療人或動物體的按照權利要求1至11之任一的化合物。
18)一種用于治療致瘤性疾病的權利要求17所要求的化合物。
19)權利要求1至11之任一所要求的化合物在制造用于治療致瘤性疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及肽和式(Ⅰ)的模擬肽化合物及包含它們的藥物組合物,它們在控制或者治療增殖性疾病(如癌);抗腫瘤生長和/或腫瘤轉(zhuǎn)移及牛皮癬;控制或者治療炎癥、過敏、自身免疫、病毒和心血管疾病中是有用的藥劑。這些新的化合物具有抑制識別所有細胞受體和胞質(zhì)轉(zhuǎn)導物內(nèi)幾種包含磷酸酪氨酸的基元的獨特特性,這種抑制是通過存在于胞質(zhì)轉(zhuǎn)導物和不同信號轉(zhuǎn)導過程中的其它效應物蛋白中的廣譜SH2域和對銜接子轉(zhuǎn)導物Grb2的SH2域的高度特異親和性實現(xiàn)的,銜接子轉(zhuǎn)導物Grb2是有絲分裂發(fā)生和運動發(fā)生途徑的關鍵組分,這一最后的活性導致侵入和轉(zhuǎn)移。本發(fā)明也涉及這些化合物的產(chǎn)生方法和使用這些化合物進行治療的方法。
文檔編號C07K5/02GK1185785SQ97190189
公開日1998年6月24日 申請日期1997年2月10日 優(yōu)先權日1996年2月15日
發(fā)明者C·巴蒂斯蒂尼, P·吉奧達諾, S·德·洛薩, F·科拉迪, P·科莫格里奧, A·巴德里 申請人:法瑪西雅厄普約翰公司