專利名稱：人白細胞抗原dr4亞型蛋白的拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物的新用途。
背景技術(shù)：
人類白細胞抗原分子(HLA)-DR是人體主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibility complex，MHC)II類分子中最具有代表性的一個類型，它通過MHCII類分子限制的T細胞對外來多肽抗原的識別，在機體的免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用。近年來，針對HLA-DR和T細胞受體進行了大量相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)其影響類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胃癌、慢性乙型肝炎以及肺結(jié)核等多種惡性疾病的發(fā)病(Stastny P.Association of the B-cell alloantigen DRw4 with rheumatoid arthritis.N Engl JMed 1978，298869-871.；Gregersen PK，Silver J，Winchester RJ.The shared epitopehypothesis-an approach to understanding the molecular genetics of rheumatoid arthritissusceptibility.Arthritis Rheum 1987，301205-1213.；Thomson W，Harrison B，Ollier B，Wiles N，Payton T，Barrett J，Symmons D，Silman A.Quantifying the exact role ofHLA-DRB1 alleles in susceptibility to inflammatory polyarthritis-Results from a large，population-based study.Arthritis Rheum 1999，42(4)757-762.；杜子明，黃愛玲，黃文輝，陳盛強.HLA-DR4與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性探討.現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)生物工程學(xué)雜志.2004，10(2)130-131.；張素芳，史成章.胃癌及癌前病變中樹突狀細胞浸潤、HLA-DR抗原表達的臨床意義.腫瘤防治研究2004，31(5)261-263.劉俊，蔣業(yè)貴，王宇明.HLA-DR、-DQ在慢性乙型肝炎肝組織中的表達及其意義.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報2004，26(7)572-579.；劉志輝，羅一魯，周琳，許婉華，馮蝶儀，譚耀駒，何霞，宋長興，傅瑜，劉忠泉.HLA-DR基因與中國南方漢族部分人群肺結(jié)核易感基因的研究.中華結(jié)核和呼吸雜志2004，27(6)390-393.)。HLA-DR家族的成員之一HLA-DR4(人白細胞抗原DR4亞型蛋白)，已被證明與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis)、某些癌癥的發(fā)病機理有著密切的聯(lián)系。它在體內(nèi)的基本生理作用是與病原體的特定多肽片斷結(jié)合，再與之一起被人體內(nèi)的T細胞受體(T Cell Receptor)識別，引發(fā)其后的一系列免疫反應(yīng)，但是在病理條件下，HLA-DR4也會與某些內(nèi)源性多肽結(jié)合，引起體內(nèi)組織片段的自降解，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此，尋求針對HLA-DR4的藥物具有極其重要的現(xiàn)實意義。
式I化合物，其中，Ar選自苯基，乙酰苯基，C1-C8烷基取代苯基，C1-C8烷基取代-1H-苯并咪唑，雜環(huán)基或烷基取代雜環(huán)基；Q1，Q2選自O(shè)，S或NH；n1，n2為0-6的整數(shù)，m為0-3的整數(shù)；R選自C1-C8烷基或烷氧基。這類化合物通過組合合成的方法合成、分離得到，目前未見關(guān)于用途的相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供式I化合物的新用途。
本發(fā)明發(fā)明人通過實驗證實，式I化合物能內(nèi)源性抗原肽對HLA-DR4限制性T細胞的活化，可以作為HLA-DR4拮抗劑的應(yīng)用； Ar選自苯基，乙酰苯基，C1-C8烷基取代苯基，C1-C8烷基取代-1H-苯并咪唑，雜環(huán)基或烷基取代雜環(huán)基；Q1，Q2選自O(shè)，S或NH；n1，n2為0-6的整數(shù)，m為0-3的整數(shù)；R選自C1-C8烷基或烷氧基。
優(yōu)選的情況，該式I化合物具體為式II化合物或式III化合物，式II中Ar為4-乙酰苯基；Q1，Q2為O；n1＝n2＝0，m＝1；R為CH3。
式III中Ar為5-甲基-1H-苯并咪唑；Q1為S，Q2為NH；n1＝n2＝1，m＝0；R為OCH3。
式I化合物可以與酸形成各種可藥用的鹽，如鹽酸鹽等。
將式I化合物或其水合物、鹽與藥物可接受的輔劑，如載體、賦形劑等組合，可以制備為抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胃癌、慢性乙型肝炎以及肺結(jié)核等的藥物。
HLA-DR4與外源性抗原肽HA(流感紅血球凝集素)結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，PDB代碼為1J8H，多種研究表明HA與RA的發(fā)病存在密切聯(lián)系，并且它與HLA的結(jié)合能力比內(nèi)源性多肽強10倍以上，是理想的HLA-DR4抑制劑結(jié)合位點(Hennecke J，Wiley DC.Structure of a complex of the human alpha/beta T cell receptor(TCR)HA1.7，influenzahemagglutinin peptide，and major histocompatibility complex class II molecule，HLA-DR4(DRA*0101 and DRB1*0401)insight into TCR cross-restriction and alloreactivity.J ExpMe.2002，195(5)571-581.；Edward F.Rosloniec，Karen B.Whittington，Dennis M.Zaller，Andrew H.Kang.HLA-DRl(DRB1*0101)and DR4(DRB1*0401)Use the Same anchorResidues for Binding an immunodominant Peptide Derived from Human Type IICollagen.The Journal of Immunology，2002，168253-259.)。HA肽308-317位共十個氨基酸殘基，對應(yīng)于HLA上P1-P10十個位點。對結(jié)合口袋進行化學(xué)環(huán)境分析可知殘基側(cè)鏈與HLA-DR4作用的有1位的Y，4位的Q，6位的T，7位的L，和9位的L。其中P1位點的作用最為重要，它與Y308芳香性側(cè)鏈的互補結(jié)合對HA的定位起到了導(dǎo)向的作用。P4位點的重要性僅次于P1，雖然口袋相對較淺，但底部具有一個由三個氮原子形成的弱正電中心，與Q311側(cè)鏈末端的負電氧原子形成氫鍵，穩(wěn)定了結(jié)合。
本發(fā)明所選用的化合物具有兩種藥效片段，不僅在理論上能拮抗HLA-DR4，而且，通過實驗證實，這些化合物的拮抗活性優(yōu)于目前研究較多的變構(gòu)肽型抑制劑，并且，由于小分子抑制劑具有不易被降解和較大的改造空間等優(yōu)點，應(yīng)用前景十分廣闊。


圖1為化合物1的活性抑制圖；圖2為化合物3的活性抑制圖。
具體實施例方式
實施例1、1、實驗材料根據(jù)式I的結(jié)構(gòu)，購買如表1的五個符合該結(jié)構(gòu)式的化合物(樣品從上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司(www.sinoreagent.com)購買)，以DMSO作為溶劑溶解。
表1化合物表

CII用常規(guī)固相合成技術(shù)合成，以水為溶劑溶解；抗原提呈細胞APC用Priess細胞，HLA-DR4-限制T細胞采用3838細胞(Fridkis-HareliM，Rosloniec EF，F(xiàn)uggerL，Strominger JL.Synthetic peptides that inhibit binding of the collagen typeII261-273 epitope to rheumatoid arthritis-associated HLA-DRl and-DR4molecules and collagen-specific T-cell responses.Hum Immunol 2000，61(7)640-650.)。
2、實驗方法應(yīng)用MTT檢測法檢測這5種化合物分子阻斷內(nèi)源型抗原肽CII對HLA-DR4限制性T細胞的活化，抗原提呈細胞APC使用的是Priess細胞，HLA-DR4-限制T細胞采用的是3838細胞。實驗步驟如下1)以3000rad照射8分鐘激活后，再用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)Priess細胞，計數(shù)并計算稀釋倍數(shù)，以保證在96孔板的每個孔中Priess細胞數(shù)量達到2*104個；2)對應(yīng)各孔中分別加入終濃度為50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL的五種化合物分子溶液10μL；3)各孔中分別加入終濃度為10μg/mL的內(nèi)源型抗原肽CII溶液和細胞數(shù)量同樣為2*104個/孔的3838細胞；4)以5μg/mL的刀豆蛋白A(ConA)作為陽性對照，以等體積無血清1640培養(yǎng)液作為陰性對照，每種濃度設(shè)三個平行孔。
5)在37℃，5％CO2條件下孵育24小時，然后每孔加入MTT溶液，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)4小時。
6)停止培養(yǎng)，肉眼可見每孔有不同程度的紫色結(jié)晶出現(xiàn)。將96孔板離心，吸出上清液，棄掉；每孔加入DMSO 150uL溶解結(jié)晶物，酶標(biāo)儀在490nm下測定吸光值(Bio-Red 500；Bio-Red，Richmond，VA，USA)，結(jié)果如表2。
表2 MTT法實驗數(shù)據(jù)表


化合物1和化合物3的活性抑制圖分別如圖1和圖2所示。
以上結(jié)果表明，上述五個化合物均表現(xiàn)出一定的抑制活性，其中化合物1和化合物3在濃度分別達到12.5mg/L(2*10-5M)和6.25mg/L(1*10-5M)時即具有顯著的抑制活性，優(yōu)于目前所知的所有變構(gòu)肽的抑制活性，并且這兩個化合物在測定濃度范圍內(nèi)均無明顯毒性反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.式I化合物作為HLA-DR4拮抗劑的應(yīng)用； 其中，式I中Ar選自苯基，乙酰苯基，C1-C8烷基取代苯基，C1-C8烷基取代-1H-苯并咪唑，雜環(huán)基或烷基取代雜環(huán)基；Q1，Q2選自O(shè)，S或NH；n1，n2為0-6的整數(shù)，m為0-3的整數(shù)；R選自C1-C8烷基或烷氧基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的，其特征在于所述Ar為4-乙酰苯基；Q1，Q2為0；n1＝n2＝0，m＝1；R為CH3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的，其特征在于所述Ar為5-甲基-1H-苯并咪唑；Q1為S，Q2為NH；n1＝n2＝1，m＝0；R為OCH3。
全文摘要
本發(fā)明公開了人白細胞抗原DR4亞型蛋白(HLA－DR4)的拮抗劑。本發(fā)明人通過實驗證實，式I化合物能內(nèi)源性抗原肽對HLA－DR4限制性T細胞的活化，可以作為HLA－DR4拮抗劑的應(yīng)用；式I中Ar選自苯基，乙酰苯基，C1－C8烷基取代苯基，C1－C8烷基取代－1H－苯并咪唑，雜環(huán)基或烷基取代雜環(huán)基；Q1，Q2選自0，S或NH；n1，n2為0－6的整數(shù)，m為0－3的整數(shù)；R選自C1－C8烷基或烷氧基。本發(fā)明所選用的化合物不僅在理論上能拮抗HLA－DR4，而且，通過實驗證實，這些化合物的拮抗活性優(yōu)于目前研究較多的變構(gòu)肽型抑制劑，并且，由于小分子抑制劑具有不易被降解和較大的改造空間等優(yōu)點，應(yīng)用前景十分廣闊。
文檔編號A61P35/00GK1935133SQ20051010352
公開日2007年3月28日 申請日期2005年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月19日
發(fā)明者來魯華, 劉瑩, 劉振明, 李博, 栗占國, 李霞, 張翠華, 陳巧林 申請人:北京大學(xué)