專利名稱：白細胞介素-1受體拮抗劑的細胞內(nèi)同種型的制作方法
技術領域：
本發(fā)明的領域本發(fā)明為生物技術領域。它敘述一種對IL-1a和IL-1B兩者均有活性的白細胞介素-1(IL-1)新拮抗劑，一種新的DNA編碼的IL-1拮抗劑和以DNA重組技術獲得IL-1拮抗劑的方法。它也敘述這種IL-1新拮抗劑在由于IL-1產(chǎn)生而導致的病理方面的預防，治療和診斷的用途。
本發(fā)明的背景有兩種截然不同的白細胞介素-1編碼基因命名為IL-1a和IL-1B，它們分別編碼IL-1a蛋白和IL-1B蛋白。
白細胞介素IL-1a和IL-1B為多效性的細胞因子，它們雖然在序列上顯示很少的相似性但對不同的組織和對人類的許多病理，特別是在組織的免疫應答和炎癥的過程產(chǎn)生種種相似的效用。
兩種蛋白具有的分子量約為17.5KDa，并均曾以具有分子量約為31KDa的較大的前體分子在以前合成過。
IL-1為強的炎癥和致熱的細胞因子，通常對組織具有有利的作用但也能有極為不良的作用。
例如它們能夠參與自動免疫病理癥狀的發(fā)病機制，如紅斑狼瘡和特別是例如在風濕性關節(jié)炎中它們做為介質對組織造成損害。
IL-1的許多生理效應和那些在膿毒癥過程中所觀察到的相似。近來的研究表明IL-1以1至10ng/kg劑量靜脈給藥可引起發(fā)熱、困倦、厭食、周身性肌痛，關節(jié)痛和偏頭痛。
因為IL-1具有多效性的生理活性，許多生理活性對組織產(chǎn)生負性影響，所以IL-1的有力的效應必須在嚴格地生理控制之下。
IL-1的合成被抗炎的細胞介質，前列腺素和糖皮質激素所抑制，同時IL-1多水平抑制作用的存在對嚴格控制此介質是需要的。
IL-1是到現(xiàn)在為止所敘述過的受體多肽拮抗劑中僅有的一種細胞因子IL-1族至今第三個已知成份是IL-1受體(IL-1ra)的拮抗劑。
所有三種組分(IL-1a，IL-1B，IL-1ra)均能識別并與細胞表面上的同一受體(IL-1R)結合IL-1a和IL-1B結合在IL-1R上可傳遞信號而IL-1ra則不能。
有兩種類型的IL-1受體，稱為IL-1RI和IL-1RII。IL-1ra為一種多肽，它結合于IL-1RI而與IL-1RII的親和力弱，沒有激動活性。
IL-1ra在不同的細胞類型中，包括單核吞噬細胞，多形核細胞(PMN)和成纖維細胞，被IgG，細胞因子和細菌產(chǎn)物誘導產(chǎn)生。
至今有兩種IL-1ra的分子形式已被鑒定和克隆1)分泌的IL-1ra(sIL-1ra)含有一個25個氨基酸的典型前導序列，給出一種152個氨基酸的成熟蛋白質；2)細胞內(nèi)IL-1ra(icIL-1ra)缺乏一個前導序列，因此預示此蛋白質存留于細胞內(nèi)。
sIL-1ra和icIL-1ra由相同的基因產(chǎn)生。icIL-1ra轉錄物系從兩者之一的起始點和從剪接到位于sIL-1ra的第一個外顯子中的內(nèi)部剪接接受位點的第一個供選擇的外顯子產(chǎn)生。因此，預計的蛋白質除它們的NH2末端外是等同的，sIL-1ra NH2末端的前21個氨基酸在icIL-1ra中被四個氨基酸所代替。
sIL-1ra和icIL-1ra轉錄編碼的表達受不同的調(diào)控。icIL-1ra的生物顯著性仍不清楚。
考慮到IL-1涉及到許多疾病的病理，用于限制IL-1不良效應的可購得的藥物的需要是明顯的。
本發(fā)明的概要本發(fā)明的一個目的是提供對IL-1a和IL-1B及它們的組合有活性的一種IL-1拮抗劑。
本發(fā)明的進一步的目的是提供一種IL-1拮抗劑DNA序列編碼和用DNA重組技術獲得這種新拮抗劑的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供實質上純化形式的拮抗劑以適合用于在需要抑制IL-1病理時有活性的藥物組份。
本發(fā)明的其余目的和有利之處將在下列的敘述中表明。
圖和序列表的扼要說明

圖1敘述icIL-1raII(SEQ ID NO8和SEQ ID NO9)的DNA序列和蛋白質序列與典型的sIL-1ra(icIL-1raISEQ ID NO6)和sIL-1ra(SEQ ID NO4和SEQ ID NO5)相比較非共同的部分，它也敘述IL-1ra共同部分(SEQ IDNO13和SEQ ID NO14)的DNA序列和蛋白質編碼。
圖2敘述icIL-1raII在不同細胞類型中表達的RT-PCR分析。
圖3敘述重組的icIL-1raII Western印跡分析。
圖4敘述icIL-1raII對內(nèi)皮細胞中IL-1誘導的E-選擇蛋白表達的效用。
SEQ ID NO1報道用于RT-PCR中稱為IRA5寡核苷酸的序列。
SEQ ID NO2報道相當于用于RT-PCR中的B-肌動蛋白cDNA 69-70核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO3報道用于RT-PCR反向互補于430-449核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO4報道sIL-1ra非共同部分的DNA序列編碼。
SEQ ID NO5報道sIL-1ra非共同部分的氨基酸序列。
SEQ ID NO6報道icIL-1raI非共同部分三個氨基酸的DNA序列編碼。
SEQ ID NO7報道icIL-1-raI非共同部分三個氨基酸。
SEQ ID NO8報道icIL-1raII非共同部分的DNA序列編碼。
SEQ ID NO9報道icIL-1raII非共同部分的氨基酸序列。
SEQ ID NO10報道IL-1ra共同部分的DNA序列編碼。關于與序列制備的＂Patentin EPO＂程序有關的問題，為了容許第一個氨基酸編碼為Glu并更為了避免在序列里面形成停止的編碼，在序列的第一個位置上加上一個G核苷酸。
SEQ ID NO11報道IL-1ra共同部分的氨基酸序列。
SEQ ID NO12報道代表icIL-1raII與其它IL-1ras非共同片段的21個氨基酸的序列。
SEQ ID NO13報道完整的icIL-1raII的DNA序列編碼。
SEQ ID NO14報道完整的icIL-1raII的氨基酸序列。
本發(fā)明的說明此新的IL-1拮抗劑是在icIL-1ra DNA編碼骨中將新的63個堿基對(bp)序列嵌入icIL-1ra第一個特定的外顯子與sIL-1ra的內(nèi)部受點的第一個外顯子之間產(chǎn)生的。
通過RT-PCR實驗，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)此新的轉錄物可在活化的單核細胞和成纖維細胞中和在多形核細胞(PMN)中表達。
在COS細胞中的表達揭示此新的拮抗劑通常為細胞內(nèi)的并在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中具有的分子量(MW)大約為25KDa。
此新重組體拮抗劑顯示IL-1的抑制活性。
為了明確和容易的原因，在本申請中，現(xiàn)在已知的icIL-1ra以icIL-1ra型I(icIL-1raI)來表示，而此處敘述的和本發(fā)明目的物新拮抗劑則限定為icIL-1ra型II(icIL-1raII)。
依據(jù)本發(fā)明的拮抗劑可有利地用于預防、治療或診斷用途的病理實例為風濕性關節(jié)炎、膿毒性休克、急性脊髓單核細胞白血病、器管移植抗主體的免疫反應，獲得性免疫缺損綜合癥(AIDS)，潰瘍性結腸炎和所有全身性自動免疫疾病。
本發(fā)明的體現(xiàn)為對具有發(fā)展為需要IL-1抑制作用病理高危險性的人或已經(jīng)顯示如膿毒病理的人給以藥理活性量icIL-1raII的用法。
上述項目的一個實例為等候外科手術的病人。
可以應用與活性成份相和諧的任何給藥途徑，但特別可取的途徑是非腸道給藥，因為它可在短時間內(nèi)發(fā)生全身的效應。
為此，剛好在外科手術前、外科手術當中或手術后在靜脈內(nèi)大劑量給藥是更可取的途徑。icIL-1raII給藥的劑量依賴于基于病人的年齡、體重和個體應答的藥物處方。
劑量可以在0.05和30mg/kg體重之間而可取的劑量為0.1和10mg/kg體重之間。
非腸道使用的藥物配方可制備成含有有效成份和適宜載體的可注射劑型。非腸道給藥的載體為在技藝上眾所周知的，例如包括水、鹽水溶液、林格溶液和右旋糖。
載體中可含有小量的賦形劑以維持溶液的穩(wěn)定性和等滲性。
上述溶液的制備可依照通常的形式進行，可取的是icIL-1raII的含量將在1mg/ml和10mg/ml之間。
進一步的病理實例其中依據(jù)本發(fā)明的新拮抗劑可以有利地用于預防、治療、診斷目的的有風濕性關節(jié)炎，膿毒性休克、急性脊髓單核細胞白血病、器官移植對主體的免疫反應，獲得性免疫缺損綜合癥(AIDS)，潰瘍性結腸炎和所有全身性自動免疫疾病。
本發(fā)明以特定的體現(xiàn)為參考加以敘述，但說明的內(nèi)容可能被精于技藝的人所做的修飾和替代均不認為是超出權利要求的目的和意義的范圍。
在下列的部分中將敘述一些獲得本發(fā)明的方法，雖然等同的材料和方法也可以應用。因此，下列的實例是純屬于說明而不是局限此發(fā)明。
實施例1icIL-1raII的克隆和特性材料和方法試劑下列可購得的商品試劑用于細胞的培養(yǎng)和分離用于臨床的無熱源鹽水和蒸餾水RPMI1640培養(yǎng)基；DMEM培養(yǎng)基；M199培養(yǎng)基；L-谷氨酰胺；珀可(Percoll)；菲可-海帕克(Ficoll-Hipaque)；無菌收集的胎牛血清；由牛腦制備的內(nèi)皮細胞生長補料(ECGS)；肝素。
所有試劑含有的內(nèi)毒素均少于0.125EU/ml，以鱟變形細胞裂解物試驗核對。
細胞人循環(huán)PMN和單核細胞是由健康供給者的外周血液用等滲(285mOsm)珀克連續(xù)(單核細胞為46％PMN為62％)梯度離心分離，如Colotta F.，Peri G.，Villa SA.，Mantovani A.，Rapid killing of actinomycin D treatedtumour cells by human mononuclear cells.J.Immunol.132936，1984所敘述的方法。細胞在界面回收，在鹽水中洗兩次并在培養(yǎng)基中再懸浮。
PMN和單核細胞的回收率高于90％且純度高于98％，用考查染色的細胞離心細胞的形態(tài)來評價。常規(guī)用于PMN和單核細胞的細胞培養(yǎng)基為含2mM L-谷氨酰胺和10％FCS的RPMI 1640。
人內(nèi)皮細胞(EC)得自臍靜脈并如文獻中詳述的方法培養(yǎng)(Allavena P.，Paganin C.，Martin-Padura I.，Peri G.，Gaboli M.，Dejana E.，Marchisio P.C.，Mantovani A.，Molecules and Structures involvedin the adhesion of natural killer cells to vascular endothelium，J.Exp.Med.，173439，1991)。
第二次至第五次傳代的融合細胞常規(guī)地使用含有10％FCS并以ECGS(50μg/ml)和肝素(100μg/ml)補料的M199培養(yǎng)基維持。
COS細胞在含有10％FCS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)同時8387成纖維細胞在含有10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
在適當?shù)奶幚硪院?，以下述方法觀察細胞的IL-1ra mRNA或IL-1ra蛋白。
RT-PCR整體RNA用稍加修改的異硫氰酸胍方法提取。
RT-PCR系按Colotta F.，Polentarutti N.，Sironi M.，MantovaniA.，J.Biol.Chem.，26718278，1992所述的方法進行。
簡要地，1μg整體RNA以2.5mM隨機六聚體緩沖劑(5mM MgCl2，50mMKCl，10mM Tris-HCl；pH8.3)，1mM各種三磷酸去氧核苷酸，1單位/ml RNase抑制劑和2.5單位/ml moloney小鼠白血病病毒逆轉錄酶(Perkin ElmerCetus.Norwalk，CT)，逆轉錄在逆轉錄酶上。
樣品在25℃孵育10分鐘隨后在42℃孵育45分鐘。然后，將為了擴增cDNAs編碼icIL-1raI或icIL-1raII而設計的特異引物時，和作為內(nèi)控的人B-肌動蛋白加入到cDNA反應中。
擴增是以2mM MgCl2，50mM KCl各種三磷酸去氧核苷酸0.2M，2.5單位/100ml Taq聚合酶(Perkin Elmer Cetus)和4mg/ml的每種特異引物下進行。擴增(30循環(huán))是在自動加熱循環(huán)器(Perkin Elmer Cetus)中于95℃，55℃和72℃各進行1.5分鐘。
擴增產(chǎn)物與分子量標準(Boehringer Mannheim，Mannheim，德國)一起通過1％溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠。
寡核苷酸系以亞磷酰胺法結合成。用于選擇性擴增icIL-1ra的寡核苷酸序列與Haskill S.等，Natl.Acad.，USA，883681，1991中所敘述的一致。
特別是，作者使用寡核苷酸GM397(此處以IRA1表示)和GM368(IRA 4)。
對于icIL-1raII的擴增作者使用IRA 4和IRA 5(SEQ ID NO1)，它們特異性地識別包括在此處敘述的icIL-1raII序列中的超外顯子。
對于B-肌動蛋白的擴增，正向寡核苷酸在SEQ ID NO2中報道，相當于B-肌動蛋白cDNA的60-79核苷酸。
反向寡核苷酸在SEQ ID NO3中報道，與430-449核苷酸互補。擴增產(chǎn)物用雙脫氧鍵終止法進行亞克隆(TA Cloning System，Invitrogen，SanDiego，CA)和序列。
COS細胞中icIL-1ra產(chǎn)物的表達icIL-1raI和icIL-1raII的含有5’-非翻譯區(qū)的32bp的cDNAs，完全開放讀框，和3’-非翻譯區(qū)的6bp(包括停止密碼)系以寡核苷酸IRA 4和IRA 5用RT-PCR如上詳述的方法得到，然后連回到pSF5表達載體中，逆轉錄的保真性和擴增由側序加以證實。
正確取向含有cDNA的質粒以CsCl梯度純化然后用如Sambrook J.等Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989所敘述的鈣沉淀法轉染至COS細胞中。
兩天后，培養(yǎng)上清液和超聲的細胞裂解液用如下詳述的ELISA或免疫印跡法考察，以空的質粒(未轉染的)做為對照。
免疫活性IL-1ra的鑒定商品化ELISA測試(Amersham，Buckinamshire，UK)用于鑒定sIL-1ra和icIL-1ra。兩只兔和一只山羊的多克隆抗血清用于Western印跡分析。
COS細胞裂解液樣品和上清液在12.5％SDS-PAGE上是電泳然后印跡在硝基纖維素膜上(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。
原抗體和次級抗體的孵育是按照標準方案進行的，原抗體為抗-IL-1ra兔多克隆抗體。
次級抗體為山羊抗-兔免疫球蛋白部分連于辣根過氧化物酶(Amersham)上。免疫活性蛋白部分帶系按照制造者的說明用基于化學發(fā)光的操作(ECLDetection，Amersham)顯示的。
E-選擇蛋白在EC上的IL-1-誘導的表達融合的EC在96孔板(Falcon)中加入經(jīng)特異的ELISA分析(Amersham)評價，相當于25至100ng重組IL-1ra(為icIL-1raI也可為icIL-1raII)量的轉染COS細胞裂解液孵育30分鐘。
以等量的由模擬轉染細胞得到的COS裂解液平行使用做為對照。其次，EC在0.1-1ng/ml人重組IL-1B中暴露6小時。E-選擇蛋白的表達系以抗-E-選擇蛋白單克隆抗體BBIG-ES做為原抗體和以與辣根過氧化物酶共軛的兔抗小鼠Ig抗血清為次抗體用貼壁EC做ELISA分析來測定。樣品的O.D.系用分光光度計(Flow)在405波長檢測孔板來測定。
結果icIL-1raII的鑒定為了用RT-PCR得到icIL-1ra(圖1)全部編碼序列設計了特異的寡核苷酸引物(如圖1指明的IRA 1和IRA 4)。由人PMN擴增的產(chǎn)物被亞克隆和測序。
除以前已知icIL-1ra序列外，本發(fā)明者還分離到一些克隆它們的序列與發(fā)表的icIL-1ra編碼序列等同，但顯著例外的是在icIL-1ra序列132和133核苷酸之間有63bp的額外序列。給出所敘述的icIL-1ra外顯子-內(nèi)含子界線，額外序列是嵌在icIL-1ra的第一個無前導區(qū)外顯子和sIL-1ra的第一個外顯子的內(nèi)部接受位點之間(圖1)。
預測的氨基酸序列示于圖1。
此新的蛋白(此后稱之為icIL-1ra型II)在NH2末端的前三個氨基酸與典型的icIL-1ra(icIL-1ra型I)是共同的，跟著是一個21個氨基酸的新序列。這兩個蛋白的其余部分是等同的。
奇怪的是，與sIL-1ra的第一個外顯子的內(nèi)部接受位點的連接處經(jīng)常產(chǎn)生相同的氨基酸，即谷氨酸，sIL-1ra和icIL-1raI兩者和icIL-1raII都是如此。(圖1)嵌入的額外序列的氨基酸的最顯著的特點為出現(xiàn)七個甘氨酸，其中六個是連續(xù)的。甘氨酸殘基的兩側均與谷氨酸殘基相接。icIL-1raII由180個氨基酸組成。
icIL-1raII的整體親水性模式與icIL-1raI相似，仍舊在NH2末端缺少疏水性前導肽。
icIL-raII的表達用一對特殊設計的寡核苷酸(IRA 5和IRA 4，圖1)，帶有期望的33bp擴增產(chǎn)物進行RT-PCR分析來鑒定icIL-1raII轉錄物。
如圖2所示，轉錄物編碼icIL-1raII在PMA-，IL-1-和TNF-活化的成纖維細胞中可以測出。在LPS-處理的單核細胞中明顯地有一個弱的但可測出的帶。
無論是未處理的還是活化的PMN(圖2)也顯示一個很弱的期望大小的帶。
圖2指明的擴增產(chǎn)物的特異性以亞克隆和測序肯定。
重組icIL-1raII的表達
COS細胞以DNA序順編碼icIL-1raII轉染，并與編碼icIL-1raI比較。其次，細胞裂解液和上清液用Western印跡來考察。
用于這些試驗的多克隆抗血清可很好地等同識別icIL-1raII和icIL-1raI(圖3)。大多數(shù)的，如果不是所有的，icIL-1raII和icIL-1raI在細胞裂解液中發(fā)現(xiàn)。
重組icIL-1raI主要以22KDa帶移動，而icIL-1raII顯示近似25KDa的質量。
重組icIL-1raII對IL-1B的抑制活性考察了重組icIL-1raII對IL-1的抑制活性。為此目的作者選擇了IL-1-誘導的E-選擇蛋白在內(nèi)皮細胞的表達，因為此分析方法是靈敏(誘導可測得的量在100pg/ml IL-1，或少于此數(shù)值)和快速(與IL-1孵育6小時)。
模擬轉染的COS細胞的裂解液并不顯著地減弱IL-1的活性。
icIL-1raII沒有激動活性。
如圖4所示，重組icIL-1raII以劑量一依據(jù)形式抑制IL-1的活性。
這些數(shù)據(jù)提供了icIL-1raII的確是IL-1抑制劑的證據(jù)。
討論本發(fā)明敘述了一種icIL-1ra新的分子形式。此新的分子是在icIL-1ra的第一個無前導外顯子與sIL-1ra第一個外顯子的內(nèi)部接受位點之間嵌入63bp生成的。
因為形成的蛋白質除了位于NH2末端的額外21個氨基酸外與典型的icIL-1ra是部分等同的，發(fā)明人建議把這個新的形式稱為IL-1ra型II，而把典型的icIL-1ra序列稱為icIL-1ra型I。
RT-PCR試驗表明icIL-1raII轉錄物在單核細胞和成纖維細胞中是可誘導的。在COS細胞中表達的重組的icIL-1raII具有表觀近似25KDa的分子量和與在相同實驗條件下表達的icIL-1raI產(chǎn)生的作用相比具有IL-1抑制劑活性。
icIL-1ra和sIL-1ra編碼轉錄物系以相同的基因用微分剪接方法產(chǎn)生的。icIL-1ra的產(chǎn)生是由另外的一個嵌在含有sIL-1ra前導序列的第一個外顯子內(nèi)部接受位點之中的外顯子的轉錄起始的。
本發(fā)明者得到的結果建議一個IL-1ra基因的新結構，此結構中有一個額外的外顯子位于典型icIL-1ra和sIL-1ra各自的第一個外顯子之間。用這個新的外顯子產(chǎn)生一個多肽分子，它仍舊缺乏信號多肽，在N末端嵌入21個氨基酸而不同于icIL-1raI，仍舊保留對IL-1抑制的能力。
另外的剪接的應用來產(chǎn)生不同的IL-1ra分子好像是可高度調(diào)節(jié)的。icIL-1raII轉錄物系在成纖維細胞中用IL-1，TNF和佛波醇酯誘導的，在單核細胞中用LPS誘導。在成纖維細胞中發(fā)現(xiàn)佛波醇酯選擇性地誘導icIL-1ra轉錄物。而IL-1和TNF可誘導sIL-1ra和icIL-1ra mRNAs兩者。在單核細胞中，IL-13擴大sIL-1ra和icIL-1raI的轉錄物，而不能誘導icIL-1raII。
最后，PMN，在其中sIL-1ra和icIL-1ra可基本的表達和誘導，如RT-PCR指出的，只表達很少的轉錄物。總之，這些數(shù)據(jù)表明產(chǎn)生三種IL-1ra形式的誘導微分剪接的機制是對外部信號應答的微分調(diào)控。
此處敘述的額外序列的氨基酸序列意外的是它包含七個甘氨酸殘基，其中六個是連續(xù)的。
富含甘氨酸的序列存在于不同生物活性的分子中，包括心鈉清除受體，HOX11同源框基因，中間纖維角蛋白和涉及著絲粒結合或RNA剪接的核蛋白。
然而除甘氨酸殘基外，這些蛋白質與icIL-1raII在富含甘氨酸區(qū)側旁的氨基酸序列之間沒有明顯的同源性。
IL-1系統(tǒng)顯示非常程度的復雜性，含有兩個激動劑，兩個受體，其中之一為IL-1的抑制劑，和一個受體拮抗劑，對于拮抗劑，考慮到所得結果，至少可能存在三種不同形式的分子。
雖然IL-1ra細胞內(nèi)形式的生物顯著性尚未明確的確立，但此處報道的數(shù)據(jù)指出以另外的剪接，對選擇的外部刺激的應答可以產(chǎn)生兩種帶有不同N末端的不同icIL-1ra形式。
IL-1控制水平的多向性和復雜性指出絕對需要對此細胞因子對炎癥潛能的緊密生理控制。
圖的說明圖1icIL-1raII的DNA序列和預測的蛋白質序列與典型icIL-1ra(icIL-1raI)和sIL-1ra的對比。
圖1的上部顯示特定地代表sIL-1ra，icIL-1raI和icIL-1raII的DNA和蛋白質序列。圖1下部顯示IL-1ra三種形式中共同的序列。
每個分子的完全序列是由各自特定部分與共同部分連接產(chǎn)生的。為清楚起見，icIL-1ra的DNA序列從發(fā)表的5’未翻譯序列的核苷酸91開始的，只報道3’未翻譯序列的6bp。
共同的IL-1ra序列從位于sIL-1ra第一個外顯子中的內(nèi)部接受位點開始，相當于完整的icIL-1raI序列的核苷酸133和sIL-1ra完整序列的核苷酸88。
箭頭表示用于RT-PCR分析的前向(IRA 1和IRA 5)和反向(IRA 4)寡核苷酸，如在內(nèi)容中所敘述的那樣。寡核苷酸IRA5只識別icIL-1raII DNA。
圖2不同細胞類型中icIL-1raII表達的RT-PCR分析逆轉錄了從8387成纖維細胞(板A)，單核細胞(B)和PMN(C)的RNAs。每種DNA合成反應分成兩份樣品，一份樣品用寡核苷酸IRA 5(前方)和IRA 4(反向)擴增，為了測定icIL-1raII的轉錄物；另一份樣品用B-肌動蛋白特異的寡核苷酸擴增(見材料與方法部分)。
擴增產(chǎn)物系通過溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠考察。相當于B-肌動蛋白的擴增產(chǎn)物報道于標準的左邊，相當于icIL-1raII(在右邊)的擴增產(chǎn)物用箭頭指示。這些帶的特異性經(jīng)亞克隆和測序肯定。
圖3重組icIL-1raII的Western印跡分析用DNAs編號icIL-1raI(2)或icIL-1raII(3)或一種不合有DNA(1)的空載體轉染的COS細胞裂解液用抗-IL-1ra兔多克隆抗體經(jīng)免疫印跡法來考察。提出了分子量的標準。
圖4icIL-1raII對內(nèi)皮細胞上IL-1-誘導的E-選擇蛋白表達的影響用如材料和方法部分所詳細解釋的方法，內(nèi)皮細胞以0.1或1ng/ml的人IL-1B處理，加入25-100ng/ml的icIL-1raII，或不加icIL-1raII，或加入等量用空載體模擬轉染得到的COS細胞裂解液。
在孵育6小時后，用在貼壁細胞上進行的ELISA試驗考察E-選擇蛋白的表達。
報道的數(shù)據(jù)為IL-1誘導的E-選擇蛋白表達對照的百分數(shù)。
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)名稱應用研究系統(tǒng)ARS股份公司(B)街道約翰B·高斯拉韋街14號(C)城市庫拉索(E)國家荷屬安的列斯群島(F)郵政編碼無(G)電話599-9639300(H)傳真599-9614129(ii)發(fā)明名稱白細胞介素-1拮抗劑(iii)序列數(shù)14(iv)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM PC可兼容的(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件發(fā)行專利#1.0，版本#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特性(A)長度25堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)解剖學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(iv)反義無(ix)特征(A)名稱/要點各種的特征(B)位置1..25(C)其他資料/注＝＂RT-PCR寡核基酸，命名為IRA5＂(xi)序列描述SEQ ID NO1CTGACTTGTA TGAAGAAGGA GGTGG 25(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特性(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)解剖學線性(ii)分子類型DNA(iii)假設無(iv)反義無(ix)特征(A)名稱/要點各種的特征(B)位置1..20(D)其他資料/注＝＂RT-PCR寡核苷酸相當于B-肌動蛋白的60-79＂(xi)序列描述SEQ ID NO2GCGCTCGTCG TCGACAACGG 20(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特性(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)解剖學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(iv)反義無(ix)特征(A)名稱/要點各種的特征(B)位置1..21(D)其他資料/注＝＂RT-PCR反向寡核苷酸互補于430-449＂(xi)序列描述SEQ ID NO3GATAGACAAC GTACATGGCT G 21(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特性(A)長度87堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)解剖學線性(ii)分子類型cDNA(ii)假設無(iv)反義無(ix)特征(A)名稱/要點CDS(B)位置24..86(ix)特征(A)名稱/要求各種的特征(B)位置1..87(D)其他資料/注＝＂sIL-1ra非共同序列＂(xi)序列描述SEQ ID NO4GAATTCCGGG CTGCAGTCAC AGA ATG GAA ATC TGC AGA GGC CTC CGC AGT 50Met Glu Ile Cys Arg Gly Leu Arg Ser1 5CAC CTA ATC ACT CTC CTC CTC TTC CTG TTC CAT TCA G 87His Leu Ile Thr Leu Leu Leu Phe Leu Phe His Ser10 15 20(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特性(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(D)解剖學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Glu Ile Cys Arg Gly Leu Arg Ser His Leu Ile Thr Leu Leu Leu1 5 10 15Phe Leu Phe His Ser20(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特性(A)長度42堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)解剖學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(iv)反義無(ix)特征(A)名稱/要點CDS(B)位置33..41(ix)特征(A)名稱/要點各種的特征(B)位置1..42(D)其他資料/注＝＂細胞內(nèi)IL-1ra型I的非共同序列＂(xi)序列描述SEQ ID NO6CAGAAGACCT CCTGTCCTAT GAGGCCCTCC CC ATG GCT TTA G 42Met Ala Leu1(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特性(A)長度3個氨基酸(B)類型氨基酸(D)解剖學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO7Met Ala Leu1(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特性(A)長度105堿基對
(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)解剖學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(iv)反義無(ix)特征(A)名稱/要點CDS(B)位置33..104(ix)特征(A)名稱/要點各種的特征(B)位置1..105(C)其他資料/注＝＂細胞內(nèi)IL-1ra型II非共同的序列＂(xi)序列描述SEQ ID NO8CAGAAGACCT CCTGTCCTAT GAGGCCCTCC CC ATG GCT TTA GCT GAC TTG TAT 53Met Ala Leu Ala Asp Leu Tyr1 5GAA GAA GGA GGT GGA GGA GGA GGA GAA GGT GAA GAC AAT GCT GAC TCA 101Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Glu Asp Asn Ala Asp Ser10 15 20AAG G 105Lys(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特性(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(D)解剖學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO9Met Ala Leu Ala Asp Leu Tyr Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu1 5 10 15Gly Glu Asp Asn Ala Asp Ser Lys20(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特性(A)長度474堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)解剖學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(iv)反義無(ix)特征(A)名稱/要點CDS(B)位置1..468(ix)特征(A)名稱/要點各種的特征(B)位置1..474(D)其他資料/注＝＂IL-1ra共同序列；為了軟件的緣故在第一個位置加入G，這樣可使第一個密碼子編碼Glu并因此在序列內(nèi)部可避免產(chǎn)生停止密碼子＂(xi)序列描述SEQ ID NO10GAG ACG ATC TGC CGA CCC TCT GGG AGA AAA TCC AGC AAG ATG CAA GCC48Glu Thr Ile Cys Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala1 5 10 15TTC AGA ATC TGG GAT GTT AAC CAG AAG ACC TTC TAT CTG AGG AAC AAC96Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn20 25 30CAA CTA GTT GCT GGA TAC TTG CAA GGA CCA AAT GTC AAT TTA GAA GAA144Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu35 40 45AAG ATA GAT GTG GTA CCC ATT GAG CCT CAT GCT CTG TTC TTG GGA ATC192Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile50 55 60CAT GGA GGG AAG ATG TGC CTG TCC TGT GTC AAG TCT GGT GAT GAG ACC240His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr65 70 75 80AGA CTC CAG CTG GAG GCA GTT AAC ATC ACT GAC CTG AGC GAG AAC AGA288Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg85 90 95AAG CAG GAC AAG CGC TTC GCC TTC ATC CGC TCA GAC AGT GGC CCC ACC336Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr100 105 110ACC AGT TTT GAG TCT GCC GCC TGC CCC GGT TGG TTC CTC TGC ACA GCG384Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala115 120 125ATG GAA GCT GAC CAG CCC GTC AGC CTC ACC AAT ATG CCT GAC GAA GGC432Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly130 135 140GTC ATG GTC ACC AAA TTC TAC TTC CAG GAG GAC GAG TAGTAC 474Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu145(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特性(A)長度156個氨基酸(B)類型氨基酸(D)解剖學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO11Glu Thr Ile Cys Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala1 5 10 15Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn20 25 30Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu35 40 45Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile50 55 60His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr65 70 75 80Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg85 90 95Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr100 105 110Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala115 120 125Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly130 135 140Val Met Vai Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu145 150 155(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特性(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈(D)解剖學線性(ii)分子類型肽(iii)假設無(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/要點肽(B)位置1..21(D)其他資料/注＝＂細胞內(nèi)IL-1ra型II的非共同部分＂(xi)序列描述SEQ ID NO12Ala Asp Leu Tyr Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Asp1 5 10 15Asn Ala Asp Ser Lys20(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特性(A)長度579堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)解剖學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(iv)反義無(ix)特征(A)名稱/要點CDS(B)位置34..573(ix)特征(A)名稱/要點各種的特征
(B)位置1..579(D)其他資料/注＝＂細胞內(nèi)IL-1ra型II＂(xi)序列描述SEQ ID NO13CAGAAGGACC TCCTGTCCTA TGAGGCCCTC CCC ATG GCT TTA GCT GAC TTG TAT 54Met Ala Leu Ala Asp Leu Tyr1 5GAA GAA GGA GGT GGA GGA GGA GGA GAA GGT GAA GAC AAT GCT GAC TCA102Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Glu Asp Asn Ala Asp Ser10 15 20AAG GAG ACG ATC TGC CGA CCC TCT GGG AGA AAA TCC AGC AAG ATG CAA150Lys Glu Thr Ile Cys Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln25 30 35GCC TTC AGA ATC TGG GAT GTT AAC CAG AAG ACC TTC TAT CTG AGG AAC198Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn40 45 50 55AAC CAA CTA GTT GCT GGA TAC TTG CAA GGA CCA AAT GTC AAT TTA GAA246Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu60 65 70GAA AAG ATA GAT GTG GTA CCC ATT GAG CCT CAT GCT CTG TTC TTG GGA294Glu Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly75 80 85ATC CAT GGA GGG AAG ATG TGC CTG TCC TGT GTC AAG TCT GGT GAT GAG342Ile His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu90 95 100ACC AGA CTC CAG CTG GAG GCA GTT AAC ATC ACT GAC CTG AGC GAG AAC390Thr Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn105 110 115AGA AAG CAG GAC AAG CGC TTC GCC TTC ATC CGC TCA GAC AGT GGC CCC438Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro120 125 130 135ACC ACC AGT TTT GAG TCT GCC GCC TGC CCC GGT TGG TTC CTC TGC ACA486Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr140 145 150GCG ATG GAA GCT GAC CAG CCC GTC AGC CTC ACC AAT ATG CCT GAC GAA534Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu155 160 165GGC GTC ATG GTC ACC AAA TTC TAC TTC CAG GAG GAC GAG TAGTAC 579Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu170 175 180(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特性(A)長度180個氨基酸(B)類型氨基酸(D)解剖學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO14Met Ala Leu Ala Asp Leu Tyr Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu1 5 10 15Gly Glu Asp Asn Ala Asp Ser Lys Glu Thr Ile Cys Arg Pro Ser Gly20 25 30Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln35 40 45Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln50 55 60Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu65 70 75 80Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser85 90 95Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn100 105 110Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe
115 120 125Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys130 135 140Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser145 150 155 160Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe165 170 175Gln Glu Asp Glu180
權利要求
1.選擇地對由白細胞介素a和白細胞介素B或它們的在SEQ ID NO12報道中的氨基酸序列所特定的片段組成的組中至少一種物質具有拮抗活性的純化蛋白質。
2.選擇地對由白細胞介素a和白細胞介素B或它們的SEQ ID NO14報道中的氨基酸序列所特定的片段組成的組中至少一種物質具有拮抗活性的一種純化蛋白質。
3.以重組DNA技術獲得為特性的在權利要求2中所提及的純化蛋白質。
4.具有如權利要求2中所述氨基酸序列的一種IL-1拮抗劑的分離DNA序列編碼。
5.依據(jù)權利要求4以具有SEQ ID NO13所報道的序列事實為特性的分離DNA序列。
6.用具有SEQ ID NO1所報道的序列為探針雜交的分離DNA序列。
7.含有權利要求2中DNA序列編碼的蛋白載體。
8.以依據(jù)權利要求2中的DNA編碼蛋白轉染的細胞培養(yǎng)。
9.以得自哺乳動物細胞的事實為特性，依據(jù)權利要求2所述的細胞培養(yǎng)。
10.用重組DNA技術獲得IL-1拮抗劑的方法，包括a)含有能夠產(chǎn)生權利要求2中蛋白的DNA序列如權利要求8和9所敘述的宿主細胞培養(yǎng)。b)編碼蛋白的收集和分離。
11.以SEQ ID NO13報道的DNA序列事實為特性的用重組DNA技術獲得IL-1拮抗劑的方法。
12.具有按照權利要求2所述蛋白序列的純化蛋白做為醫(yī)用的用途。
13.具有按照權利要求2所述序列的純化蛋白用于對需要抑制IL-1病理有活性的制劑的藥物組份。
14.依據(jù)權利要求13所述的用途，此用途系以選自自動免疫病理組的病理事實為特性。
15.依據(jù)權利要求14所述的用途，此用途系以選自由風濕性關節(jié)炎，膿毒性休克，急性脊髓單核細胞白血病，器官移植對主體的免疫學反應，獲得性免疫缺損綜合癥(AIDS)，潰瘍性結腸炎組成的這個組的病理為特性。
全文摘要
本發(fā)明敘述一種新的對IL-1a和IL-1B兩者均有拮抗活性的白細胞介素-1，一種編碼此IL-1拮抗劑的新DNA序列和用重組DNA技術獲得IL-1拮抗劑的方法；也敘述了這種新IL-1拮抗劑在由于IL-1的產(chǎn)生而引起的病理的預防，治療和診斷中的用途。
文檔編號A61P35/00GK1161058SQ95195664
公開日1997年10月1日 申請日期1995年10月12日 優(yōu)先權日1994年10月13日
發(fā)明者弗朗切斯科·科洛塔, 馬爾塔·穆齊奧, 阿爾貝托·曼托瓦尼 申請人:應用研究系統(tǒng)Ars股份公司